BAHAGIAN 1 Hubungan Kawal Selia Antara Variasi Kualiti Dan Persekitaran Cistanche Deserticola dalam Tiga Ekotaip Berdasarkan Analisis Mikrobiom Tanah

Persekitaran mempengaruhi komposisi dan fungsi mikrobiom tanah, yang secara tidak langsung mempengaruhi kualiti tumbuhan. Dalam kajian ini, penjujukan amplikon 16S digunakan untuk mendedahkan perbezaan dalamkomposisi komuniti mikrob tanah daripadaCistanche deserticoladalam tiga ekotaip (tanah salin-alkali, padang rumput, dan tanah berpasir). melalui analisis korelasi kelimpahan komuniti mikrob, kandungan glikosida phenylethanoid, dan faktor ekologi, hubungan pengawalseliaan antara komuniti mikrob dan variasi kualitiC. deserticolatelah diterangkan. profil fungsi metabolik mikrobiom tanah telah diramalkan menggunakan Tax4Fun. Data menunjukkan bahawa komuniti mikrob tanah bagi ketiga-tiga ekotaip adalah berbeza dengan ketara (AMOVA, P < 0.001),="" dan="" kepelbagaian="" alfa="" komuniti="" mikrob="" tanah="" padang="" rumput="" adalah="" yang="" tertinggi.="" analisis="" mikrobiom="" teras="" menunjukkan="" bahawa="" komuniti="" mikrob="">C. deserticolakebanyakannya mempunyai kemarau, toleransi garam, rintangan alkali, dan rintangan tekanan, seperti Micrococcales dan Bacillales. Penanda bio, iaitu, oceanospirillales (tanah salin-alkali), Sphingomonadales (padang rumput), dan propionibacteriales (tanah berpasir), boleh membezakan tiga komuniti mikrob ekotaip, telah digali melalui LEfSe dan hutan rawak. Keputusan analisis korelasi menunjukkan bahawa 2'-acetylacteoside berkorelasi secara positif dengan oceanospirillales dalam tanah tanah masin-alkali. Profil fungsi metabolik memaparkan metabolisme yang sangat diperkaya (metabolisme karbohidrat dan asid amino) dan laluan pemprosesan maklumat alam sekitar (pengangkutan membran dan transduksi isyarat). secara keseluruhannya, komposisi dan fungsi mikrobiom tanah didapati menjadi faktor penting kepada variasi kualitiC. deserticoladalam ekotaip yang berbeza. Kerja ini memberikan pandangan baharu tentang hubungan kawal selia di kalangan alam sekitar, komuniti mikrob tanah dan variasi kualiti tumbuhan.

Maklumat lanjut sila hubungi:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola mempunyai banyak kesan, klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Cistanche deserticolaialah tumbuhan parasit bukan fotosintetik yang boleh tumbuh di habitat kering, seperti tanah berpasir dan parit sungai kering, serta dalam keadaan tertekan, seperti tanah masin-alkali1. Tumbuhan ini berparasit pada akar psammophyte Haloxylon ammodendron, yang menunjukkan ketahanan yang kuat terhadap keadaan persekitaran yang keras2. Tumbuhan bergantung pada interaksi yang bermanfaat antara akar dan mikroorganisma untuk mendapatkan nutrien, menggalakkan pertumbuhan dan menentang tekanan luar3. Sementara itu, mikrobiom tanah mengawal kitaran biogeokimia makronutrien, mikronutrien dan unsur-unsur lain yang penting untuk pertumbuhan tumbuhan4. Walau bagaimanapun, hubungan antaraC. deserticoladan mikroorganisma tanah rizosfera masih tidak jelas. Akibatnya, mempersembahkan mikrobiom tanah rizosfera daripadaC. deserticolaia perlu.

C. deserticolasering digunakan di Asia Timur, Asia Tengah, Afrika Utara dan negara lain sebagai sejenis makanan dan ubat penjagaan kesihatan untuk meningkatkan daya ingatan, meningkatkan fungsi seksual dan melindungi hati5,6. Bahan aktif utamaC. deserticolaialah phenylethanoid glycosides (PhGs), iridoid, lignans dan polisakarida. Di antara komponen ini, PhG adalah komponen aktif7. Kajian terdahulu melaporkan bahawa kandungan PhG dalam ekotaip yang berbezaC. deserticolasangat berbeza, antaranya 2'-asetillakteosida boleh digunakan sebagai penanda kimia untuk membezakanC. deserticoladihasilkan di Xinjiang dan Mongolia Dalam1. Kajian tentang komuniti mikrob telah menunjukkan bahawa komuniti mikrob boleh mengawal metabolisme perumah mereka8,9. Oleh itu, perbandingan hubungan antara komuniti mikrob dan metabolit dalam tanah rizosferaC. deserticoladalam ekotaip yang berbeza diperlukan segera.16S penjujukan amplikon sampel tanah rizosfera tumbuhan telah dilakukan untuk meneroka kepelbagaian komuniti mikrob, memberikan pandangan baharu tentang hubungan antara tumbuhan dan komuniti mikrob tanah10,11. Sebagai contoh, Perkaitan taburan dan dinamik kulat endofit dengan C. songaricum dan N. tangutorum telah disiasat dalam kajian mikrobiom menggunakan penjujukan pemprosesan tinggi11. Dalam kajian ini, kami melakukan penjujukan amplikon rRNA 16S untuk mendapatkan mikrobiom tanahC. deserticoladalam ekotaip yang berbeza. Perbezaan komuniti mikrob tanah dalam pelbagai ekotaip juga telah dibandingkan, dan penanda bio yang boleh membezakan ketiga-tiga ekotaip telah digali. Analisis korelasi kemudiannya dikira melalui kelimpahan komuniti mikrob utama, kandungan PhG dan faktor ekologi, dan hubungan pengawalseliaan diterokai. Akhir sekali, fungsi mikrobiom tanah daripadaC. deserticoladalam ekotaip yang berbeza telah diramalkan.

Bahan dan Kaedah

Penerangan tapak kajian dan persampelan.Menurut penyiasatan feld,C. deserticolamempunyai tiga ekotaip utama, termasuk tanah masin-alkali, padang rumput dan tanah berpasir. Pada April 2017, kami mengumpul sampel tanah yang mewakili ekotaip utamaC. deserticoladi China. Sampel tanah tanah beralkali masin telah dikumpulkan dari Tasik Ebinur (AB1, AB2, AB3) dan Pantai Baicheng (BJ1, BJ2, BJ3, BJ4, BJ5) di wilayah Xinjiang. Sampel tanah padang rumput diambil dari Kampung Tula (TL1, TL2, TL3, TL4, TL5) di wilayah Xinjiang. Sampel tanah tanah Sandy dikumpul dari Alxa (AL1, AL2, AL3, AL4, AL5, AL6) di wilayah Mongolia Dalam dan daerah Minqin (GS1, GS2), daerah Changcheng (GS3, GS4) di wilayah Gansu. Maklumat longitud, latitud dan ketinggian semua titik pensampelan ditunjukkan dalam Jadual 1 dan Rajah 1. Di tapak ladang, kami menggunakan gerudi silinder keluli tahan karat dengan diameter 5 cm untuk mengumpul tanah bersebelahan dengan batang succulent.C. deserticoladan perumahnya, dan segera menyimpannya dalam peti sejuk mudah alih pada –20 darjah . Selepas diangkut ke makmal, sampel tanah disalurkan melalui ayak 2-mm untuk membuang tisu tumbuhan, akar, batu, dsb. dan disimpan pada –20 darjah dalam peti sejuk sebelum eksperimen selanjutnya.

Pengekstrakan DNA dan Penjujukan 16S rRNA.DNA tanah telah diekstrak menggunakan Kit Pengasingan DNA PowerSoil (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA) mengikut manual12. Ketulenan dan kualiti DNA genom telah diperiksa oleh 0.8 peratus elektroforesis gel agarose dan nanodrop.

Rantau hipervariable V3-V4 bagi gen 16S rRNA bakteria telah dikuatkan dengan primer 338F (ACTCCTACGGGGAGGCAGCAG) dan 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)13. Untuk setiap sampel tanah, 10-jujukan kod bar digit telah ditambahkan pada hujung 5′ primer hadapan dan belakang (Allwegene Company, Beijing)12. PCR dilakukan pada Kecerunan Mastercycler (Eppendorf, Jerman) menggunakan 25 ul isipadu tindak balas yang mengandungi 12.5 ul KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix, 1 µl primer hadapan (5 µM), 1 µl reverse primer (5 µM), 5 µl DNA (jumlah kuantiti templat ialah 30 ng) dan 5.5 µl H2O. Parameter berbasikal adalah seperti berikut: 95 darjah selama 5 minit, diikuti oleh 28 kitaran 95 darjah selama 45 saat, 55 darjah selama 50 saat dan 72 darjah selama 45 saat, dengan lanjutan fnal pada 72 darjah selama 10 minit. Tiga produk PCR bagi setiap sampel telah dikumpulkan untuk mengurangkan bias PCR tahap tindak balas. Produk PCR telah ditulenkan menggunakan Kit Pengekstrakan Gel QIAquick (QIAGEN, Jerman) dan kemudian dikira menggunakan PCR14 masa nyata.

Penjujukan mendalam telah dilakukan pada platform MISeq di Syarikat Allwegene (Beijing). Selepas larian, analisis imej, panggilan asas dan anggaran ralat dilakukan menggunakan Saluran Paip Analisis Illumina Versi 2.614.

Cistanchetubulosa boleh anti-penuaan

Analisis data.Data mentah telah disaring pertama kali dan jujukan telah dialih keluar berdasarkan pertimbangan berikut: jujukan lebih pendek daripada 200 bp dengan skor kualiti rendah (Kurang daripada atau sama dengan 20) dan mengandungi asas samar-samar atau tidak sepadan jujukan primer dan tag kod bar15. Bacaan Qualifed dipisahkan menggunakan jujukan kod bar khusus sampel dan dipangkas dengan Illumina Analysis Pipeline Versi 2.6. Kemudian, set data dianalisis menggunakan QIIME. Jujukan itu dikelompokkan ke dalam unit taksonomi operasi (OTU) pada tahap persamaan 97 peratus 16 untuk menjana lengkung jarang dan mengira indeks kekayaan dan kepelbagaian. Alat Pengelas Projek Pangkalan Data Ribosom digunakan untuk mengelaskan semua jujukan ke dalam kumpulan taksonomi yang berbeza15. Analisis pengelompokan telah dilakukan berdasarkan maklumat OTU daripada setiap sampel menggunakan R untuk mengkaji persamaan antara sampel yang berbeza17. Matriks UniFracdistances antara komuniti mikrob daripada setiap sampel dikira menggunakan pekali Tayc dan diwakili sebagai kaedah kumpulan pasangan tidak berwajaran dengan pokok pengelompokan min aritmetik, yang menerangkan ketidakserupaan (1-keserupaan) antara berbilang sampel18. Seekor kutu pokok berformat Newick juga dihasilkan melalui analisis ini. Kepelbagaian alfa digunakan dalam analisis kerumitan kepelbagaian spesies untuk sampel menggunakan empat indeks, termasuk Chao1, spesies yang diperhatikan, keseluruhan pokok kepelbagaian filogenetik (PD) dan indeks kepelbagaian Shannon. Indeks ini dikira menggunakan perisian QIIME (Boulder, CO, USA) dalam Python (v.1.8.0) (La Jalla, CA, USA)19. Analisis kepelbagaian beta digunakan untuk menilai perbezaan sampel dari segi kerumitan spesies. Kepelbagaian beta dikira menggunakan analisis koordinat utama (PCoA) dan analisis kelompok dalam QIIME20. Analisis varians molekul (AMOVA) dilakukan menggunakan mothur. EdgeR digunakan untuk mengira perbezaan OTU antara kumpulan. Heatmap.2 digunakan untuk melukis peta haba, manakala Ggplot digunakan untuk melukis peta Manhattan.

Penentuan biomarker dan mikrobiom teras.Kaedah analisis diskriminasi linear (LDA) dan hutan rawak (RF) dalam laman web Penganalisis Mikrobiologi21 digunakan untuk menentukan mikrobiom penanda bio.

Laman web ini mula-mula melakukan ujian jumlah Kruskal–Wallis faktorial bukan parametrik untuk mengenal pasti ciri dengan kelimpahan perbezaan yang ketara dengan mengambil kira faktor eksperimen atau kelas minat, diikuti oleh LDA untuk mengira saiz kesan bagi setiap ciri yang banyak diferen21. Ciri-ciri tersebut dianggap penting berdasarkan nilai p yang diselaraskan. Potongan nilai adj.p lalai=0.05. Analisis RF dilakukan menggunakan pakej rawakForest5. RF ialah algoritma pembelajaran diselia yang sesuai untuk analisis data berdimensi tinggi. Kaedah ini menggunakan ensemble pokok pengelasan, setiap satunya ditanam melalui pemilihan ciri rawak daripada sampel bootstrap di setiap cawangan22. Analisis mikrobiom teras telah diterima pakai daripada fungsi teras dalam mikrobiom pakej R oleh Penganalisis Mikrobiom

analisis korelasi komuniti mikrob utama, kandungan PhG dan faktor ekologi.Kandungan tujuh glikosida phenylethanoid (PhGs) daripada tiga ekotip C. deserticola, iaitu, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, 2'-acetylacteosid, tubuloside A dan cistanoside F, ditentukan melalui HPLC. Keadaan kromatografi melibatkan lajur Waters C18 (150 mm × 3.9 mm, 4.6 μm), dan fasa mudah alih terdiri daripada asetonitril dan 0.2 peratus asid formik. Tetapan kromatografi adalah seperti berikut: 0–10 min, 10 peratus →15 peratus A; 10–30 min, 15 peratus →40 peratus A. Kadar fow ialah 1 mL/min. Panjang gelombang serapan, isipadu suntikan dan suhu lajur ialah 330 nm, 10 μL dan 27 darjah, masing-masing. Kajian metodologi merujuk kepada kerja eksperimen awal kumpulan rujukan1.

Kajian ini mengumpul 16 stesen meteorologi berhampiran tiga jenis ekologiC. deserticolaXinjiang Bole 51238, Tacheng 51133, Tori 51241, Karamay 51243, Buxail 51156, Yumin 51137, Emin

51145, Gansu Minqin 52681, Yongchang 52674, Wuwei 52679, Gulang 52784, Inner Mongolia Suikou 53419, Hangjinhouqi 53420 dan Wuhai 53512. Data tujuh faktor iklim dari 19081–201tolog berperanan sebagai analisis faktor iklim sub-201.

Redundancy analysis of diferential metabolites and bioclimatic factors was performed by using Canoco 5 software23. Pearson correlation coefcient was calculated for biomarker microbiome abundance, compound con- tent and ecological factor data integration. In this study, the log2 data conversion was uniformly performed before the analysis. SPSS was used to calculate the Pearson correlation coefcient of the six biomarkers, six core micro- biomes, seven main active components of C. deserticola and the ecological factors in the three habitats, and the screening standard was as follows: pearson correlation coefcient (r) >{{0}}.5 dan nilai p < 0.05.="" hubungan="" antara="" faktor="" di="" atas="" telah="" divisualisasikan="" menggunakan="" cytoscape24="" (the="" cytoscape="" consortium,="" san="" diego,="" ca,="" usa,="" versi="" 3.7.0)="" dan="" pheatmap="" (pakej="">

Ramalan profil fungsi mikrob mikrobiom.Tax4Fun25 (pakej R, http:// tax4fun.gobics.de/) telah digunakan untuk meramalkan profil fungsi mikrob mikrobiom dalam sampel tanah. Jadual OTU Biom mikrobiom tanah telah digunakan sebagai fle input untuk imputasi metagenom bagi sampel tanah C. deserticola. Kemudian, kelimpahan kelas gen yang diramalkan telah dianalisis pada peringkat kumpulan Ortologi KEGG (KO) 3. Keputusan daripada Tax4Fun dianalisis dalam doBy (pakej R)26.

Keputusan

Komposisi komuniti mikrob. The 16S rRNA sequencing resulted in 834,323 raw reads, amongst which 522,929 passed the quality and length fltering. The data set comprised 20,511–48,337 (mean: 33,994) sequences per sample. The high-quality reads were clustered using >97 peratus jujukan identiti ke dalam 3541 OTU mikrob (Jadual 1).

Komuniti mikrob secara amnya dikelaskan kepada 19 filum, 46 kelas dan 87 pesanan (Rajah 2a,b dan S1–S3). Pada peringkat filum, Actinobacteria (35 peratus ), Proteobacteria (31 peratus ) dan Firmicutes (15 peratus ) dominan di tanah beralkali masin. Padang rumput didominasi oleh Actinobacteria (37 peratus), Proteobacteria (29 peratus) dan Bacteroidetes (9 peratus). Di tanah berpasir, Actinobacteria (42 peratus ), Proteobacteria (33 peratus ) dan Firmicutes (6 peratus ) adalah dominan. Di peringkat kelas, Actinobacteria (25 peratus ), Gammaproteobacteria (21 peratus ) dan Bacilli (15 peratus ) dominan di tanah beralkali garam, manakala Actinobacteria (22 peratus ), Alphaproteobacteria (16 peratus ) dan Bacilli (8 peratus ) dominan dalam padang rumput. Di tanah berpasir, Actinobacteria(23 peratus), Alphaproteobacteria (20 peratus) dan Gammaproteobacteria (9 peratus) mendominasi. Pada tahap susunan (Rajah 2c–e), Micrococcales (22 peratus), Oceanospirillales (15 peratus) dan Bacillales (15 peratus) adalah dominan di tanah beralkali masin. Micrococcales (11 peratus ) dan Bacillales (8 peratus ) mendominasi di padang rumput. Oleh itu, pesanan bakteria yang paling dominan ialah Micrococcales (10 peratus ) dan Acidimicrobiales (7 peratus).

Kepelbagaian bakteria tanah dalam tiga ekotaip C. deserticola.Ukuran kepelbagaian dalam sampel ( -kepelbagaian) mendedahkan kecerunan kepelbagaian di antara tiga habitat (Rajah 2f dan Jadual S1). Kepelbagaian alfa komuniti mikrob bakteria tanah bagi setiap sampel dianggarkan menggunakan kekayaan komuniti (Chao 1, yang dinyatakan sebagai unjuran jumlah bilangan OTU dalam setiap sampel), spesies yang diperhatikan, keseluruhan pokok PD dan indeks kepelbagaian Shannon. Spesies yang diperhatikan, Chao 1 dan indeks keseluruhan pokok PD mencadangkan bahawa komuniti tanah padang rumput mempunyai kepelbagaian tertinggi, manakala kepelbagaian tanah tanah masin-alkali dan berpasir adalah serupa. Keputusan keluk pembiasan semula (Rajah S1) adalah serupa dengan keputusan di atas.

Acteosidedalamcistanchemempunyai kesan yang baik terhadapbuah pinggang

Keputusan AMOVA (Jadual S2) menunjukkan bahawa p < 0.001,="" yang="" menunjukkan="" perbezaan="" yang="" ketara="" antara="" tiga="" habitat.="" hasil="" pengelompokan="" pokok="" kepelbagaian="" jarak="" bray="" (rajah="" s2)="" daripada="" tiga="" sampel="" tanah="" habitat="" menunjukkan="" bahawa="" sampel="" tanah="" beralkali="" garam="" berkelompok="" rapat,="" dan="" jarak="" antara="" sampel="" tanah="" padang="" rumput="" dan="" berpasir="" adalah="" dekat.="" keputusan="" pcoa="" yang="" tidak="" dikekang="" bagi="" plot="" 2d="" jarak="" unifrac="" yang="" tidak="" berwajaran="" (rajah="" 2g)="" menunjukkan="" bahawa="" sampel="" tanah="" yang="" berbeza="" bagi="" komuniti="" mikrob="" bakteria="" daripada="" habitat="" yang="" berbeza="" adalah="" berkelompok="" dengan="">

perbandingan komuniti bakteria tanah bagi tiga ekotaip c. deserticola.Peta haba dan gunung berapi kelimpahan OTU yang berbeza (Rajah 3b,e,d,h dan Jadual S3) menunjukkan bahawa berbanding dengan sampel tanah berpasir, 24 dan 17 OTU masing-masing diperkaya dan habis dalam tanah beralkali masin pada tahap susunan. Di samping itu, berbanding dengan sampel tanah berpasir, 8 dan 11 OTU masing-masing diperkaya dan habis di padang rumput. Gambar rajah Venn (Rajah 3c,f) menggambarkan bahawa 216 OTU telah habis di tanah berpasir, 8 telah habis dalam salin-alkali

tanah dan 1 OTU bertindih antara tanah masin-alkali dan berpasir. Tambahan pula, 3 OTU telah diperkaya di padang rumput, manakala 161 telah diperkaya di tanah berpasir, termasuk 6 OTU yang bertindih antara padang rumput dan tanah berpasir. Plot Manhattan (Rajah 3a) menunjukkan bahawa Xanthomonadales lebih diperkaya dan berkurangan di tanah beralkali masin berbanding di tanah berpasir, manakala bakteria Xanthomonadaceae WWH73, kumpulan tanah WD2101, Vibrionales dan Verrucomicrobiales berkurangan dengan ketara pada tahap susunan. Membandingkan padang rumput dengan tanah berpasir, Xanthomonadales, kumpulan tanah WD2101, Vibrionales dan Verrucomicrobiales telah berkurangan dengan ketara.

Cistanchedeserticola mempunyai banyak kesan ke atas merawatkencing manis

Penentuan biomarker dan mikrobiom teras dalam tiga ekotaip C. deserticola.Kaedah LEfSe dan RF (Rajah 4a,b,d) telah digunakan untuk mengenal pasti ciri dengan kelimpahan perbezaan yang ketara merentasi sampel tanah, mengira saiz kesan bagi setiap ciri yang banyak berbeza dan menentukan mikrobiom bakteria biomarker dalam tiga habitat pada tahap susunan. . Keputusan yang dibentangkan dalam Jadual S4 mendedahkan bahawa skor LDA bagi Oceanospirillales, Bacillales dan Flavobacteriales adalah yang tertinggi di kalangan mereka yang berada di tanah beralkali masin, manakala skor untuk Sphingomonadales, Gaiellales, Rubrobacterales, Burkholderiales dan Sphingobacteriales adalah yang tertinggi di kalangan mereka di padang rumput. Skor LDA Propionibacteriales, Rhodospirillales, Solirubrobacterales, Rhizobiales, Xanthomonadales dan Pseudonocardiales adalah dominan di tanah berpasir. Dengan mengecualikan pesanan yang tidak ditentukan dan pendua, OTU ini dikelaskan kepada enam pesanan, dan kelimpahannya dilukis dalam peta haba (Rajah 4c).

Kaedah kegigihan telah diterima pakai daripada fungsi teras dalam mikrobiom pakej R untuk mengenal pasti mikrobiom teras dalam tiga ekotaip C. deserticola. Mikrobiom bakteria teras ini mengandungi enam pesanan, termasuk Micrococcales, Bacillales, Rhizobiales, Acidimicrobiales, Streptomycetales dan Sphingomonadales. Dengan mengecualikan pesanan yang tidak dipertahankan dan pendua, OTU ini dikelaskan kepada enam pesanan, dan kelimpahannya dilukis dalam peta haba (Rajah 2h).

Kaedah kegigihan telah diterima pakai daripada fungsi teras dalam mikrobiom pakej R untuk mengenal pasti mikrobiom teras dalam tiga ekotaip C. deserticola. Mikrobiom bakteria teras ini mengandungi enam pesanan, termasuk Micrococcales, Bacillales, Rhizobiales, Acidimicrobiales, Streptomycetales dan Sphingomonadales. Dengan mengecualikan pesanan yang tidak dipertahankan dan pendua, OTU ini dikelaskan kepada enam pesanan, dan kelimpahannya dilukis dalam peta haba (Rajah 2h).