Bahagian 1 Pengesanan Cistanches Herba (Rou Cong Rong) Produk Perubatan Menggunakan Tandatangan Nukleotida Khusus Spesies

Untuk maklumat lanjut sila hubungi:Joanna.jia@wecistanche.com

Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* dan Shi-lin Chen 3

1 Makmal Utama Bahan Bioaktif dan Penggunaan Sumber Perubatan Herba Cina, Kementerian Pendidikan, Institut Pembangunan Tumbuhan Perubatan, Akademi Sains Perubatan Cina dan Kolej Perubatan Kesatuan Peking, Beijing, China, 2 Perikatan Penyelidikan NHP, Institut Biodiversiti Ontario (BIO), Universiti Guelph, Guelph, ON, Kanada,

3 Makmal Utama Beijing untuk Pengenalpastian dan Penilaian Keselamatan Perubatan Cina, Institut Materia Medica Cina, Akademi Sains Perubatan Cina China, Beijing, China

Cistanche deserticola mempunyai banyak kesan, klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Cistanches Herbaadalah tumbuhan perubatan yang mempunyai sifat detoksifikasi dan biasa digunakan di Asia. Oleh kerana ketidakseimbangan antara bekalan dan permintaan, penzina sering ditambah untuk keuntungan. Walau bagaimanapun, tidak ada pengawasan peraturan kerana alat kawalan kualiti tidak mencukupi untuk mengenal pasti produk yang banyak diproses. Oleh itu, alat molekul baru berdasarkan tandatangan nukleotida dan primer khusus spesies telah dibangunkan. Kawasan ITS2 dari 251Cistanches Herbadan sampel berzina telah diurutkan. Berdasarkan tapak SNP, empat tandatangan nukleotida dalam 30∼37 bp dan enam primer khusus spesies telah dibangunkan, dan mereka telah disahkan oleh campuran eksperimen buatan yang terdiri daripada enam spesies yang berbeza dan nisbah yang berbeza. Kaedah ini juga digunakan untuk mengesan 66Cistanches Herbaproduk di pasaran, termasuk ekstrak dan ubat paten Cina. Hasilnya menunjukkan penggunaan tandatangan nukleotida dalam mengenal pasti penzina dalam campuran. Kajian pasaran mendedahkan 36.4% perzinaan: 19.7% melibatkan perzinaan dengan songaricum Cynomorium atauCistancheSinensis, dan 16.7% melibatkan penggantian dengan Cy. songaricum, Ci. sinensis, atau Boschniakia rossica. Hasilnya juga menunjukkan bahawa Cy. songaricum adalah penzina yang paling biasa di pasaran. Oleh itu, kami mengesyorkan penggunaan tandatangan nukleotida khusus spesies untuk mengawal selia perzinaan dan mengesahkan jaminan kualiti rantaian bekalan produk perubatan, terutamanya untuk produk yang diproses yang DNAnya direndahkan.

Kata kunci: Cistanches Herba, Perubatan paten Cina, tandatangan nukleotida, DNA yang merosot, kawalan kualiti ubat

PENGENALAN

Cistanches Herba(Rou Cong Rong) adalah ubat yang direkodkan Pharmacopoeia yang terkenal di Asia (Suruhanjaya Farmakopoeia Cina, 2015; Konvensyen Farmakopeial Jepun, 2016); ubat ini berasal dari batang succulent keringCistanche deserticolaY. C. Ma atauCistanche tubulosatonik, kerana ia tidak toksik dan boleh diambil untuk jangka masa yang panjang (Li et al., 2016). Selain ituCistanchesHerba dianugerahkan penghormatan dinamakan "Desert Ginseng" kerana nilai perubatannya yang hebat, terutamanya dalam mengukuhkan fungsi seksual lelaki (Zhang dan Su, 2014; Gu et al., 2016). Terdapat lebih daripada 100 ubat paten Cina yang direkodkan dalam Suruhanjaya Pharmacopoeia Cina (2015) dan dalam piawaian rasmi tempatan yang lain (Wang et al., 2012). Apabila populasi individu tua meningkat, terdapat permintaan yang besar untukCistanches Herbadan produk perubatannya. Walau bagaimanapun, sumber bahan mentah menjadi semakin terhad. Malah, dua spesies asalCistanches Herbatelah ditambah kepada Buku Data Merah Tumbuhan China sebagai tumbuhan liar yang dilindungi oleh negara (kategori II) (Fu, 1991). Bahan-bahan perubatan di pasaran terutamanya ditanam di barat laut China.

Oleh kerana ketidakseimbangan yang besar antara bekalan dan permintaanCistanchesHerba, ramai penzina telah memasuki pasaran; penzina ini tidak konsisten dengan piawaian dan boleh mengancam keselamatan dadah. Penzina yang dikenali termasuk batang succulent kering dari Cynomorium songaricum Rupr. (Cynomorii Herba, Suo Yang dalam bahasa Cina),Cistanchesinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan, dan Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. et Flerov (Sun et al., 2012). Penzina ini mempunyai ciri-ciri morfologi yang serupa dengan ciri-ciriCistanchesHerba, menjadikan pengenalan taksonomi tradisional sukar, terutamanya selepas bahan diproses menjadi produk perubatan. Pengenalpastian mikroskopik tidak tersedia keranaCistanchesHerbatidak mempunyai ciri mikroskopik yang pasti atau unik. Alat kimia analisis semasa tidak mencukupi untuk mengesan perzinaan Cistanches Herba kerana sebatian yang sama juga wujud dalam penzina yang diketahui Ci. salsa (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) dan Ci. sinensis (Liu et al., 2013). Oleh itu, pembangunan kaedah molekul yang pesat untuk pengesahan Cistanches Herba dan produknya sangat diperlukan untuk sistem kawalan kualiti yang betul dalam perubatan paten Cina dan industri produk perubatan lain.

Chen et al. mula-mula mencadangkan spacer dalaman yang ditranskripsikan 2 (ITS2) sebagai kod bar sejagat untuk tumbuhan ubatan (Chen et al., 2010). Sun et al. mengesahkan rantau ITS2 sebagai kod bar DNA yang lebih baik untuk mengenal pastiCistanchesHerba dan penzinanya (Sun et al., 2012). Walau bagaimanapun, ITS2 tidak boleh digunakan untuk membezakan perubatan paten Cina daripada DNA yang merosot. Baru-baru ini, semakin banyak kajian telah menunjukkan bahawa "bar mini" adalah kaedah yang berguna untuk menguatkan DNA yang merosot (Hajibabaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2015). Walau bagaimanapun, tandatangan nukleotida lebih sesuai daripada kod bar mini, kerana bekas merujuk kepada satu atau lebih nukleotida yang unik kepada satu spesies dan boleh digunakan dengan berkesan oleh banyak teknik molekul, seperti probe DNA, mikrofluidik, dan penguatan isoterma yang dimediasi gelung (de Boer et al., 2015). Han et al. membangunkan tandatangan nukleotida untuk Panax ginseng, Angelica Sinensis, dan Lonicera japonica dan berjaya mengenal pasti ubat paten Cina yang berkaitan (Liu et al., 2016; Wang et al., 2016a; Gao et al., 2017).

produk berfungsi yang mengandungiCistanchesHerba. Khususnya, kami (1) membangunkan empat tandatangan nukleotida dan enam pasangan primer khusus untuk membezakan sahihCistanchesHerba dan penzina yang diketahui, (2) mengesahkan empat tandatangan nukleotida dalam eksperimen termasuk campuran baucar taksonomi yang diketahui digunakan untuk menyediakan produk Cistanches Herba yang mengandungi bahan-bahan asli dan berzina, dan (3) melakukan tinjauan pasaran sebanyak 66CistanchesProduk Herba melalui tandatangan nukleotida mereka.

Cistanchemempunyai banyak kesan dan boleh meningkatkan fungsi buah pinggang

BAHAN DAN KAEDAH

Koleksi dan Penyediaan Sampel

Secara keseluruhan, 251 sampel dikumpulkan dari Mongolia Dalam, Xinjiang, dan Ningxia, antara kawasan lain; sampel ini termasuk 214Cistanches Herbadan 37 penzina dan diperincikan dalam Jadual Tambahan S1. Sampel baucar yang sepadan telah disahkan oleh ahli taksonomi dan disimpan di Herbarium Institut Pembangunan Tumbuhan Perubatan, Akademi Sains Perubatan Cina, Beijing, China. Sebanyak 35 kumpulan serbuk, rempah, dan ekstrakCistanchesHerba dibeli dari kedai dalam talian dan kedai ubat batu bata di Beijing dan Chengdu (Jadual 1). Secara keseluruhan, 31 kumpulan ubat paten Cina mengandungiCistanchesHerba dibeli dari kedai ubat yang berbeza (Jadual 2), dan komposisi yang diisytiharkan ubat paten Cina yang berbeza ditunjukkan dalam Jadual Tambahan S3. Ciri-ciri morfologi yang berbeza dari bentuk dos yang berbeza ditunjukkan dalam Rajah 1.

Sampel campuran: Serbuk Ci.deserticolaCi.tubulosa, Cy. songaricum, Ci. sinensis, B. rossica, dan O. coerulescens secara buatan dicampur dalam kombinasi yang berbeza (pada nisbah 1:1) sebelum pengekstrakan. Butiran sampel campuran ini ditunjukkan dalam legenda Rajah 3. Di samping itu, serbuk empat penzina bercampur dengan Ci tulen. deserticola pada nisbah berat yang berbeza: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 dan 60000:1 (Jadual 3). Dan kedua-dua produk tulen bercampur dalam perkadaran yang sama.

Decoction: Hirisan Ci. deserticola dan Cy. songaricum digunakan untuk menyediakan rebusan. Potongan (10 g) direbus dalam 300 mL air dua suling untuk 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, dan 240 min dan kemudian digunakan untuk pengekstrakan DNA.

Pengekstrakan DNA, Pengukuhan Reaksi Rantaian Polimerase (PCR), dan Penjujukan

Spesimen, merebus, dan sampel campuran: Sampel (40- 50 mg) telah dikisar menjadi serbuk halus melalui kilang pengadun makmal Retsch MM400 (Retsch Co., Jerman) pada kekerapan 30 Hz. DNA genomik kemudiannya diekstrak dengan Kit DNA Genomik Universal Tumbuhan (Tiangen Biotech Beijing Co., China) mengikut arahan pengeluar. ITS2 dikuatkan oleh primer sejagat 2F / 3R (Chen et al., 2010).

selari setiap kumpulan. Serbuk ubat paten Cina dibasuh dengan 700 μL penampan prawash [100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 20 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0;

700 mM NaCl; 2% polyvinylpyrrolidone (PVP)-40; dan 0.4% β-mercaptoethanol] beberapa kali sehingga supernatant jelas dan tidak berwarna, selepas itu campuran itu disensasikan pada 7500 × g selama 5 minit pada suhu bilik. Precipitate kemudiannya digunakan untuk mengekstrak DNA genomik melalui Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co.) mengikut arahan pengeluar. Pada akhirnya, DNA dari setiap kumpulan tertumpu ke dalam satu tiub. Enam pasangan primer khusus spesies—SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

SCRF/SCRR, dan LDF/LDR—telah direka bentuk melalui Primer Premier

Perisian 6.0 (Premier Co., Kanada) untuk menguatkan Cistanches Herba dan penzinanya (butiran ditunjukkan dalam Jadual 4). PCR dilakukan dalam tindak balas 50 μL-volume yang mengandungi 1 μL daripada

KOD FX (Toyobo Co., Jepun), 25 μL 2 × penimbal PCR, 10 μL dNTPs (2 mM), 1.5 μL setiap primer (10 μM), dan 4 μL (∼50 ng) templat DNA; jumlah yang tinggal terdiri daripada air dua suling. Reaksi telah dilakukan oleh

kitaran haba (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., Amerika Syarikat); program terma disenaraikan dalam Jadual 4. Produk PCR telah diperiksa melalui 3% elektroforesis gel agarose dan disucikan untuk penjujukan dua arah dengan jujukan ABI 3730XL (Applied Biosystems Co.) mengikut kaedah penjujukan Sanger. Kemudian, sensitiviti enam primer telah diuji melalui ujian PCR masa nyata kuantitatif (qRT-PCR) dengan Sistem Masa Nyata CFX96 (Makmal Bio-rad., Amerika Syarikat). Ambang kitaran dikira secara automatik oleh sistem melalui model "PCR Baseline Subtracted Curve Fit". qRT-PCR dilakukan dalam 15 μL-volume reaksi yang mengandungi 7.5 μL SYBR(X)R Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

(Takara Bio Co., Jepun), 1.0 μL setiap primer (10 μM), dan 1.0 μL templat DNA dengan baki isipadu yang terdiri daripada air dua suling. qRT-PCR dilakukan dengan tiga replika teknikal berdasarkan ralat standard yang dikira.

Analisis urutan: Urutan telah diedit dan dipasang secara manual melalui CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., Amerika Syarikat).

Urutan ITS dari GenBank telah dianotasi melalui model Hidden Markov (HMM) untuk mendapatkan urutan ITS2 (Keller et al., 2009). Urutan kemudiannya diselaraskan oleh perisian MEGA 5.0 melalui kaedah penjajaran "Muscle" (Edgar, 2004; Tamura et al., 2011).

Cistanchemempunyai banyak kesan dan boleh meningkatkanBuah pinggangFungsi

KEPUTUSAN

Pembangunan Tandatangan Nukleotida dan Pasangan Primer Khusus Spesies untuk Cistanches Herba dan Adulterants

Kadar kejayaan penguatan dan penjujukan PCR bagi 251 sampel adalah 100% apabila pasangan primer 2F/3R digunakan. Panjang sejajar Cy. urutan ITS2 songaricum adalah 229 bp (Rajah Tambahan S1). Analisis urutan dari spesies herbarium dan spesies yang berkait rapat yang diambil dari GenBank (Jadual Tambahan S2) mendedahkan dua tapak polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) untuk Cy. songaricum. Atas dasar SNP, satu Cy. songaricum-specific 30- bp nucleotide signature (5′-caattatttg aggtgcattg taagaagcgt-3') telah dibangunkan (Rajah 2A). Hasil Carian Penjajaran Tempatan Asas (BLAST) dalam NCBI menunjukkan bahawa tandatangan nukleotida ini unik untuk Cy. songaricum (Jadual 5). Dengan analisis yang sama mengenai urutan dari spesies yang berkait rapat, satu hingga dua SNP ditemui dari Ci. sinensis, B. rossica, dan O. coerulescens. Berdasarkan SNP, tandatangan nukleotida untuk tiga penzina lain juga dibangunkan sama, termasuk tandatangan 34 bp (5′-cgatggtctc ccgtgcgcga,ggatgcacgg ccgg-3′) untuk Ci. Sinensis, tandatangan 37 bp (5′- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') untuk B. rossica, dan tandatangan 31 bp (5′-gtctgtcgtg tcggatggtg ttgcttgttg g-3′) untuk O. coerulescens (Rajah 2BD). Analisis BLAST dalam NCBI juga mendedahkan bahawa tandatangan nukleotida ini adalah khusus dan tidak terdapat dalam mana-mana spesies lain (Jadual 5).

Cistanches Herbadan penzinanya boleh dikuatkan secara serentak daripada campuran melalui pasangan primer sejagat 2F/3R. Oleh itu, kami merancang primer khusus spesies untuk penguatan tandatangan nukleotida dengan menyelaraskan urutan ITS2. Empat pasangan primer khusus—SYF1/SYR1, CCRF/CCRR, SCRF/SCRR dan LDF/LDR—telah direka untuk menguatkan tandatangan nukleotida Cy. songaricum, B. rossica, Ci. sinensis, dan O. coerulescens, masing-masing (Jadual 4). Panjang amplicons adalah 123, 72, 131, dan 71 bp, masing-masing.

Di samping itu, sejumlah 214 urutan ITS2 dari bahan-bahan Cistanches Herba eksperimen telah dianalisis. Dua primer khusus pendek—HMRCF/HMRCR dan GHRCF/GHRCR untuk Ci. deserticola dan Ci. tubulosa, masing-masing—telah direka untuk menguatkan kawasan pendek sampel yang diturunkan (Jadual 4). Panjang amplicons adalah 132 dan 134 bp, masing-masing.

Pengesahan Tandatangan Nukleotida dan Kaedah Primer Khusus Spesies Berdasarkan Campuran Buatan dan Merebus

Kecekapan penguatan pasangan primer baru telah disahkan daripada campuran. Produk PCR diperolehi melalui setiap pasangan primer untuk setiap spesies yang disasarkan, seperti yang ditunjukkan

nilai cq B. rossica atau O. coerulescens boleh diperolehi walaupun bahagian sampel adalah 30000:1 atau 40000:1, dan hasil penguatan Ci. sinensis, Ci.tubulosa, dan Ci deserticola dapat dikesan apabila nisbah adalah 20000:1. Tetapi tiada keputusan yang boleh dikesan boleh diperolehi untuk Cy. songaricum apabila ia membentuk bahagian 20000:1.

Untuk mengesahkan sama ada kaedah tandatangan nukleotida berfungsi dengan bahan yang diproses, decoctions of Ci. deserticola dan Cy. songaricum telah disediakan. Keputusan menunjukkan bahawa kod bar pendek dari Ci. deserticola boleh dikuatkan, walaupun selepas sampel direbus selama 210 minit. Di samping itu, tandatangan nukleotida Cy. Songaricum boleh dikuatkan selepas sampel direbus selama 150 minit, manakala tiada produk PCR dikesan selepas sampel direbus selama 210 atau 240 min (Rajah 4). Hasil penjujukan menunjukkan bahawa tandatangan nukleotida pendek berjaya diperolehi daripada rebusan.

Tinjauan Pasaran Perzinaan melalui Tandatangan Nukleotida dan Primer Khusus

Kaedah di atas digunakan untuk pengesananCistanchesProduk Herba di pasaran. Tiga puluh lima kumpulan kumpulanCistanchesKepingan Herba, serbuk, dan ekstrak telah dikuatkan dan diurutkan dengan menggunakan enam primer khusus yang direka (hasil elektroforesis gel agarose ditunjukkan dalam Rajah Tambahan S2 dan urutan disenaraikan dalam Helaian Data Tambahan 1). Analisis urutan melalui tandatangan nukleotida mereka mendedahkan bahawa lima kumpulan kepingan adalah sahih. Satu kumpulan keping dan satu kumpulan serbuk digantikan dengan Cy. songaricum dan satu ekstrak digantikan dengan Ci. sinensis. Enam kumpulan serbuk yang lain adalah campuran: lima telah dicemari dengan Cy. songaricum dan Ci. sinensis dan satu telah dicemari dengan Cy. songaricum (Jadual 1). Di samping itu, satu kumpulan keping digantikan dengan Salvia miltiorrhiza.

Herba Cistanches dalam ubat paten Cina tertakluk kepada pelbagai proses yang membuat pengesahan sukar. Keupayaan enam pasangan primer untuk menguatkan kawasan tandatangan nukleotida khusus spesies dari ubat paten Cina telah diuji (hasil elektroforesis gel agarose ditunjukkan dalam Rajah Tambahan S2). Kebanyakan ubat paten Cina mengandungi komponen pelbagai jenis spesies. Sebagai contoh, pil Shihu Yeguang (ZCY34) mengandungi 25 bahan, termasuk Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu), dan Ginseng Radix et Rhizoma (Ren Shen). Daripada bahan-bahan ini, Cistanches Herba boleh dikuatkan secara khusus melalui pasangan primer GHRCF/GHRCR. Penjujukan langsung produk PCR mendedahkan kesan yang sangat bersih. Walau bagaimanapun, jalur yang kelihatan tidak dapat diperolehi dengan pasangan primer HMRCF/HMRCR.

Contoh lain ialah pil Kangguzhi Zengsheng (ZCY44). Terdapat lapan bahan sebagai tambahan kepadaCistanchesHerba dalam perubatan paten Cina ini, tetapi tidak ada band yang dapat dilihat yang diperoleh oleh GHRCF / GHRCR atau HMRCF / HMRCR, yang bermaksud bahawa tidak adaCistanches Herbahadir. Walau bagaimanapun, kawasan berzina Cy. songaricum berjaya dikuatkan oleh pasangan primer tertentu SYF1/SYR1. Keputusan penjujukan menunjukkan tandatangan nukleotida pendek Cy. songaricum berjaya diperolehi.

Cistanchemempunyai banyak fungsi dan mempunyai banyak fungsi dan mempunyaiRadangKesan