Galectin-3 Mempunyai Kesan Anti-Necroptotic Dan Anti-Apoptosis dalam Nekrosis Tubular Akut Akibat Cisplatin

Kenalan: ali.ma@wecistanche.com

Suhail Al-Salama et al

Dos cistanche tubulosa untuk penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel

Abstrak

Latar Belakang/Matlamat:Akutbuah pinggangkecederaan (AKI) ialah beban kesihatan awam dengan peningkatan morbiditi, kematian dan kos penjagaan kesihatan. Ia dikaitkan dengan peningkatan risiko untuk perkembangan kronikbuah pinggangpenyakit dan kematian. Nekrosis tubular akut (ATN) adalah penyebab AKI yang paling biasa. Apoptosis dan nekrosis tisu memainkan peranan penting dalam ATN. Galectin 3 (GAL-3), lektin pengikat beta galactoside, diketahui mempunyai peranan dalam keradangan, apoptosis dan tekanan oksidatif tetapi peranannya dalam nekrosis tiub akut yang disebabkan oleh cisplatin tidak dijelaskan dengan jelas.

Kaedah:Tikus kalah mati C57B6-J dan C57BL-6 –GAL-3 jantan telah digunakan untuk mendorong ATN menggunakan model tetikus cisplatin nekrosis tubular akut. Ekspresi GAL-3, protein apoptosis, nekrotik dan nekroptotik dalambuah pinggangtelah diukur menggunakan teknik ujian imunosorben berkaitan histologi, imunohistokimia dan enzim standard. Data dibentangkan sebagai min ± SE Perbezaan ketara secara statistik (m.s<0.05) were="" calculated="" between="" experimental="" groups="" and="" corresponding="" control="" groups="" by="" one-way="" analysis="" of="">

Keputusan:Terdapat peningkatan ketara dalam GAL-3 dalambuah pinggangtikus liar GAL{1}} yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalannya. Di samping itu, terdapat peratusan ATN yang lebih tinggi, paras urea dan kreatinin plasma yang lebih tinggi, dan paras cathepsin B dan cathepsin D yang lebih tinggi, dalambuah pinggangtikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin daripada tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin. Begitu juga, terdapat tahap protein nekroptosis yang lebih tinggi RIPK1, RIPK3, dan MLKL dalambuah pinggangtikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin daripada tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin. Selain itu, terdapat tahap yang lebih tinggi secara ketarabuah pinggangprotein pro-apoptosis; caspase dibelah-3, PARP, TRAIL dan FAS yang dibelah dalam tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin.

Kesimpulan:GAL-3 boleh menjejaskan kemandirian dan kematian sel melalui interaksinya dengan protein nekroptotik, apoptosis dan pro-kemandirian dalam tubul renal semasa nekrosis tubular akut yang disebabkan oleh cisplatin.

Kata kunci: buah pinggang• Nekrosis tubular akut • Cisplatin • Galectin-3 • Necroptosis • Apoptosis

pengenalan

Akutbuah pinggangkecederaan (AKI) dicirikan oleh pengurangan mendadak dalambuah pinggangfungsi berdasarkan peningkatan paras kreatinin serum, pengurangan pengeluaran air kencing, keperluan untuk terapi penggantian buah pinggang, atau gabungan faktor-faktor ini [1].

Thebuah pinggangGaris panduan amalan klinikal Penyakit Meningkatkan Hasil Global (KDIGO) untuk AKI, mentakrifkan AKI sebagai sama ada peningkatan kreatinin serum sebanyak Lebih daripada atau sama dengan 0.3 mg/dl ( Lebih daripada atau sama dengan 26.5 µmol/l) dalam 48 jam; atau peningkatan kreatinin serum kepada Lebih daripada atau sama dengan 1.5 kali garis dasar, yang diketahui atau diandaikan telah berlaku dalam tempoh 7 hari sebelumnya; atau isipadu air kencing<0.5 ml/kg/h="" for="" 6="" hours="">

Nekrosis tubular akut (ATN) adalah punca biasa AKI [3]. Kesalahan iskemia dan nefrotoksik adalah punca utama ATN [3]. Walaupun kajian meluas mengenai ATN, termasuk kecederaan sel, kematian sel, dan penjanaan semula, mekanisme asas tidak ditakrifkan dengan jelas.

Apoptosis ialah satu bentuk kematian sel terprogram yang dimediasi oleh caspases. Laporan penting telah menunjukkan apoptosis memainkan peranan penting dalam ATN [3, 4]. Sebaliknya, nekrosis adalah satu bentuk kematian sel yang dicirikan oleh permeabilisasi membran plasma awal, pembengkakan organel, dan perpecahan kandungan selular [5]. Nekrosis kerap berlaku apabila sel-sel dicabar dengan tekanan luaran yang berlebihan. Nekrosis secara tradisinya dianggap sebagai pasif dan tidak diprogramkan; Oleh itu, sangat sedikit usaha telah dibuat untuk menyiasat mekanisme nekrosis, walaupun kelazimannya dalam penyakit manusia [5]. Jenis nekrosis yang terkenal ialah nekroptosis [5]. Necroptosis ialah kematian sel bukan apoptosis yang diprogramkan yang disebabkan oleh beberapa rangsangan ekstraselular, seperti faktor nekrosis tumor (TNF) [5]. Ia pada asalnya ditakrifkan sebagai kematian sel yang dicirikan oleh morfologi kematian sel nekrotik dengan pengaktifan serentak serine / threonine-protein kinase 1 (RIPK1) yang berinteraksi dengan reseptor. RIPK1 mengaktifkan serine/treonine-protein kinase 3 (RIPK3) yang berinteraksi dengan reseptor untuk membentuk kompleks yang dipanggil nekrosom [6]. Kemudian, RIPK3 yang diaktifkan mendapat keupayaan untuk memfosforilasi dan mengaktifkan domain seperti domain kinase keturunan bercampur (MLKL) [6]. Molekul MLKL berfosforilasi mampu membentuk oligomer untuk memudahkan pemindahannya ke membran sel melalui pengikatan kepada lipid fosfatidillinositol dan kardiolipin. Oligomer MLKL yang ditranslokasi bertindak sebagai saluran dalam membran sel untuk mendorong sama ada kemasukan natrium dan efluks ion kalium [7] atau sebagai alternatif kemasukan ion kalsium [8]. Dalam kedua-dua cara ini akan membawa kepada kematian sel nekrotik melalui permeabilisasi membran plasma dan pecah, yang membawa kepada tumpahan kandungan intraselular ke dalam organ.

Dalam projek ini, kami telah menggunakan cisplatin (Cis) untuk mendorong nekrosis tubular akut. Cis mempunyai pelbagai kesan anti-tumor dan telah digunakan untuk merawat pelbagai tumor malignan [9]. Namun begitu, nefrotoksisiti adalah kesan sampingan utama dan dicirikan oleh nekrosis sel tubular renal, kerosakan tisu, disfungsi buah pinggang, dan akut.buah pinggangkegagalan [10]. Walaupun pelbagai langkah telah diambil untuk mengatasi kecederaan buah pinggang, hampir 4-23 peratus pesakit terjejas oleh AKI [11]. Mekanisme kecederaan buah pinggang yang disebabkan oleh cisplatin yang diketahui termasuk apoptosis, tekanan oksidatif, dan tindak balas keradangan akibat kecederaan langsung pada sel epitelium tubular renal dan saluran buah pinggang [12].

Galectin-3 (GAL-3), protein 35 kDa, ialah sejenis chimera unik yang mempunyai satu domain pengecaman karbohidrat (CRD) terminal C yang disambungkan ke domain terminal N (ND) yang panjang [13 ].GAL-3 ditemui pada permukaan sel, sitoplasma dan nukleus sel serta dalam matriks ekstraselular [13].

GAL Intraselular-3 telah terlibat dalam percambahan sel dan mekanisme anti-apoptosis [14, 15]. Ia menjejaskan protein K-Ras dan Akt dan juga mengawal kelangsungan hidup pembezaan, dan kematian [14, 15]. Manakala, GAL ekstraselular-3 mengantara lekatan sel-sel, interaksi dan isyarat sel-matriks, keradangan dan apoptosis [16].

GAL-3 telah ditunjukkan untuk memindahkan sama ada dari sitosol atau dari nukleus ke mitokondria berikutan pendedahan kepada rangsangan apoptosis dan menyekat perubahan dalam potensi membran mitokondria, dengan itu menghalang apoptosis [17]. Kajian juga menunjukkan bahawa GAL-3 boleh menghalang apoptosis yang disebabkan oleh TNF melalui pengaktifan AKT [18]. Kajian lain telah menunjukkan GAL-3 dan Beclin1 terlibat dalam dua laluan terkoordinasi kematian sel terprogram, apoptosis dan autophagy [18]. Dalam projek ini, kami membuat hipotesis bahawa GAL-3 mempunyai peranan perlindungan pada epitelium tubular renal dalam kecederaan tubular akut. Kami telah menggunakan model murine kecederaan tubular akut untuk menyiasat peranan perlindungan GAL-3 dalam kecederaan tubular akut yang disebabkan oleh cisplatin melalui mengukur fungsi buah pinggang (plasma urea dan kreatinin),buah pinggangprotein nekroptosis (RIP-1, RIP-3 dan MLKL), protein nekrosis (Cathepsin D dan Cathepsin B), protein apoptosis (Caspase terbelah-3, PARP, TRAIL dan FAS yang dibelah) , dan penanda kemandirian sel (p-NF-κB, beta-catenin, dan Wnt), menggunakan ujian imunosorben berkaitan enzim standard, penganalisis biokimia, prosedur histologi dan imunohistokimia.

Bahan dan Kaedah

Kami telah menggunakan model eksperimen tetikus akutbuah pinggangkecederaan yang telah diterangkan secara meluas dalam literatur dan digunakan untuk mengkaji akutbuah pinggangkecederaan di makmal di seluruh dunia [19].

Model tetikus nekrosis tubular akut

C57BL/6 dan C57BL/6 –GAL-3 tikus kalah mati (KO) seberat 25-30 g telah digunakan. Tikus dikekalkan mengikut diet standard. Tikus ditempatkan lima setiap sangkar di bawah 12-jadual terang dan gelap selama sekurang-kurangnya 1 minggu sebelum pemberian Cisplatin.

Cisplatin (EBEWE Pharma GmbH Nfg. KG, Unterach, AUSTRIA) baru digunakan pada hari pemberian pada kepekatan 0.5 mg/ml. Tikus diberi sama ada 30 mg/kg berat badan cisplatin [11] atau kenderaan (normal salin) intraperitoneal (IP), selepas itu tikus sekali lagi mempunyai akses percuma kepada makanan dan air. Kaedah euthanasia bermula dengan suntikan intraperitoneal ubat anestetik, termasuk gabungan Ketamin (100 mg/kg) dan Xylazine (10 mg/kg), kemudian buah pinggang dikeluarkan dan sampel darah dikumpulkan 96 jam selepas pemberian cisplatin. Darah dikumpulkan dalam vacutainer EDTA.buah pinggangkemudiannya direseksi, dibasuh dalam salin penampan fosfat ais sejuk (PBS), separuh daripada setiap buah pinggang segera dibekukan dalam nitrogen cecair dan kemudian disimpan dalam peti sejuk -80 darjah. Separuh lagi dimasukkan segera dalam 10 peratus buffer salin formal selama 24 jam. Darah yang dikumpul disentrifugasi pada 3000 RPM selama 15 minit. Plasma dikumpul, diasingkan, dan disimpan pada -80 darjah sehingga analisis selanjutnya.

Pemprosesan Contoh untuk Pengekstrakan Protein

Jumlah protein diekstrak daripadabuah pinggangsampel dengan menghomogenkan dengan penimbal lisis dan mengumpul supernatan selepas sentrifugasi. Untuk jumlah lisat sel, sampel buah pinggang telah dicairkan, ditimbang dan dimasukkan ke dalam penimbal lisis sejuk yang mengandungi 5{{20}} mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mM EDTA, 20 mM -glycerophosphate, 25 mM NaF, 1 peratus Triton X-100, 10 peratus w/v Gliserol dan tablet perencat protease (Roche Complete protease inhibitor tablet koktel). Buah pinggang telah dihomogenkan pada ais oleh homogenizer (IKA T25 Ultra Turrax). Sampel kemudiannya disentrifugasi pada 14000 RPM selama 15 minit pada 4 darjah , supernatan dikumpul, diasingkan dan disimpan pada −80 darjah sehingga analisis lanjut. Pengekstrakan protein nuklear dan sitoplasma dilakukan mengikut protokol yang diterangkan di tempat lain [19]. Secara ringkas, sampel buah pinggang telah dicairkan di atas ais, ditimbang dan dihomogenkan pada ais dengan penimbal mengandungi Tris HCl 10 mmol/l, CaCl2 3 mmol/l, MgCl2 2 mmol/l, EDTA 0.1 mmol/l , Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) 0.5 mmol/l, Sukrosa 0.32 mmol/l, Dithiothreitol (DTT) 1 mmol/l, Nonidet P-40 (NP-40) 0.5 peratus dan koktel perencat Protease 1 peratus . Homogenat telah disentrifugasi pada 800 RPM selama 10 minit. Supernatan dikeluarkan dan disimpan sebagai pecahan sitoplasma. Pelet telah dibasuh dua kali dengan penimbal homogenisasi tanpa NP-40 dan digantung semula dengan penimbal garam rendah yang mengandungi HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1.5 mmol/l, KCl 20 mmol/l, EDTA 0.2 mmol /l. Gliserol 25 peratus , PMSF 0.5 mmol/l dan DTT 0.5 mmol/l. Selepas pengeraman pada ais selama 5 minit, isipadu penimbal garam tinggi yang sama mengandungi HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1.5 mmol/l, KCl 800 mmol/l, EDTA 0.2 mmol/l. Gliserol 25 peratus , PMSF 0.5 mmol/l, DTT 0.5 mmol/l, NP-40 1 peratus, dan koktel perencat protease 1 peratus, telah ditambah, campuran itu diinkubasi di atas ais selama 30 minit, disentrifugasi pada 14000 RPM selama 15 minit pada 4 darjah, dan supernatan disimpan sebagai pecahan nuklear. Jumlah kepekatan protein ditentukan oleh kaedah ujian protein BCA (Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit).

Pemprosesan Sampel untuk Histologi

Buah pinggang dipotong, dibasuh dengan PBS sejuk ais, dan ditimbang. setiap satubuah pinggangtelah dibahagikan kepada dua bahagian, dan setiap separuh adalah kaset dan diikat terus dalam 10 peratus formalin penimbal. Bahagian telah didehidrasi dalam peningkatan kepekatan etanol, dibersihkan dengan xilena, dan dibenamkan dengan parafin. Bahagian tiga µm disediakan daripada blok parafin dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin dan pewarnaan asid berkala Schiff (PAS) menggunakan prosedur standard [20]. Bahagian bernoda telah dinilai oleh ahli histopatologi yang mengambil bahagian dalam projek ini.

Imunohistokimia

Bahagian lima µm telah dinyahparafinkan dengan xilena dan dihidratkan semula dengan alkohol terperingkat. Bahagian kemudiannya diletakkan dalam Retrieval Solution dengan pH tinggi (pH 9) dalam tab mandi air pada suhu 95oC selama 20 minit. Bahagian kemudiannya dibasuh dengan air suling selama 5 minit diikuti dengan penimbal TBST selama 5 minit. Bahagian kemudian dirawat dengan blok peroksidase selama 10 minit diikuti oleh blok protein selama 10 minit. Bahagian kemudiannya diinkubasi selama satu jam pada suhu bilik dengan antibodi caspase-3 anti-cleaved (Arnab Polyclonal, 1:300, Teknologi isyarat sel, Danvers, MA USA), antibodi PARP anti-cleaved (Arnab Polyclonal, 1: 100, Teknologi isyarat sel, Danvers, MA, USA), antibodi anti-beta-catenin (Arnab Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA), antibodi anti-phospho-NF-κB (Arnab Polyclonal, 1: 100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Wnt-3 (Arnab Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-RIPK1 (Arnab poliklonal,1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), anti-RIPK3 (Arnab polyclonal,1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) dan anti-MLKL 1 (Arnab monoklonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) . Selepas konjugasi dengan antibodi primer, bahagian diinkubasi dengan antibodi sekunder (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, USA) selama 20 minit pada suhu bilik diikuti dengan penambahan kromogen DAB (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, Santa Clara, CA, USA) dan pewarnaan balas dilakukan dengan hematoxylin. Kawalan positif yang sesuai digunakan. Untuk kawalan negatif, antibodi utama tidak ditambahkan pada bahagian. Kawalan positif dan negatif digunakan dalam setiap kelompok slaid berwarna (tidak ditunjukkan dalam angka).

Pelabelan imunofluoresen

Bahagian lima μm telah dinyahparafinkan dengan xilena dan dihidratkan semula dengan alkohol terperingkat. Bahagian diletakkan dalam Retrieval Solution dengan pH tinggi (pH 9) dalam tab mandi air pada suhu 95 darjah selama 20 minit. Bahagian kemudiannya dibasuh dengan air suling selama 5 minit diikuti dengan penimbal TBST selama 5 minit. Bahagian kemudiannya diinkubasi dengan antibodi anti-GAL-3 (Arnab Polyclonal,1:50, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), anti-RIPK1 (Arnab polyclonal,1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), anti-RIPK3 1 (Arnab polyclonal,1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) dan anti-MLKL 1 (Arnab monoklonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) semalaman pada suhu bilik. Bahagian kemudiannya diinkubasi dengan antibodi Alexa Fluor 488 anti-arnab keldai, (Jackson Immune Research Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA, 1:100). Akhirnya, bahagian telah dipasang dalam media pelekap larut air DAPI (Abcam, Cambridge, MA, Amerika Syarikat) dan dilihat dengan mikroskop Olympus Fluorescent. Bahagian kawalan positif yang sesuai telah digunakan. Untuk kawalan negatif, antibodi utama tidak ditambah ke bahagian dan keseluruhan prosedur dijalankan dengan cara yang sama seperti yang dinyatakan di atas. Kawalan positif dan negatif digunakan dalam setiap kelompok slaid berwarna (tidak ditunjukkan dalam angka).

Analisis morfometrik

Analisis morfometrik nekrosis tubular akut telah dilakukan oleh dua penyiasat yang mengambil bahagian dalam kajian ini. Analisis morfometrik caspase terbelah-3, PARP terbelah, RIPK1, RIPK3, MLKL, fosfo-NFK-B, Wnt-3, Beta-Catenin, ungkapan dalam sel tubular renal telah dilakukan menggunakan perisian ImageJ (http: //rsbweb.nih.gov/ij/). Caspase terbelah-3, PARP terbelah, RIPK1, RIPK3, MLKL, phospho-NFK-B, Wnt-3, Beta-Catenin, pelabelan ditentukan dengan mengira bilangan sel positif dalam kuasa tinggi yang dipilih secara rawak medan (HPF) dalam buah pinggang. Purata bilangan sel positif akan ditukar daripada setiap HPF kepada setiap mm2 (Setiap mm2= 4HPF). Kerana, caspase terbelah-3, PARP terbelah, RIPK1, RIPK3 dan Wnt-3, pelabelan, sel telah dipertimbangkan

positif apabila terdapat corak pewarnaan sitoplasma. Untuk pelabelan MLKL, sel dianggap positif apabila terdapat corak pewarnaan membran dan sitoplasma. Untuk phospho-NFK-B dan Beta-Catenin, pelabelan, sel dianggap positif apabila terdapat corak pewarnaan nuklear.

Ujian Imunosorben Berkaitan Enzim

buah pinggangkepekatan GAL-3, Cathepsin D, Cathepsin B, Cleaved caspase-3, TRAIL dan FAS ditentukan menggunakan DuoSet enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Kit Pembangunan (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA ) untuk sandwic ELISA, menggunakan prosedur standard mengikut arahan pengilang. Kepekatan PARP yang dibelah buah pinggang ditentukan menggunakan teknologi isyarat sel Elisa (Danvers, MA, USA) untuk sandwic Elisa, menggunakan prosedur standard mengikut arahan pengilang. Kepekatan RIPK1, RIPK3 dan MLKL buah pinggang ditentukan menggunakan MyBioSource (San Diego, CA, USA) kit Elisa untuk sandwic Elisa, menggunakan prosedur standard mengikut arahan pengilang. Bacaan serapan dibuat pada 450 nm, menggunakan 96-spektrofotometer plat telaga (pembaca Elisa plat mikro BioTek ELx800, Winooski, VT, USA). GAL-3, Cathepsin D, Cathepsin B, caspase terbelah-3, TRAIL, RIPK1, RIPK3, MLKL, PARP terbelah dan kepekatan FAS dalam sampel buah pinggang ditentukan melalui interpolasi daripada lengkung standard. Tahap telah dinormalkan kepada jumlah kepekatan protein.

Analisis statistik

Semua analisis statistik dilakukan menggunakan Perisian Graph Pad Prism versi 5. Perbandingan berbilang antara pelbagai kumpulan telah dicapai dengan analisis varians sehala (ANOVA), diikuti oleh ujian julat berbilang post hoc Newman Keuls. Perbandingan antara dua kumpulan dicapai dengan ujian-t Pelajar. Data dibentangkan dalam min ± ralat piawai (SE). Nilai P < 0.05="" dianggap="">

Keputusan

Nekrosis tiub akut yang disebabkan oleh cisplatin

Kumpulan liar GAL-3 yang dirawat cisplatin menunjukkan ATN yang melibatkan (67.29 peratus ± 2.392) parenkim buah pinggang (Rajah 1) dengan kehilangan sempadan berus, pembengkakan sel tiub, sel jatuh intratubular, rembesan intratubular dan mitosis ( Rajah 2B & 3B).

Kumpulan GAL-3 KO yang dirawat cisplatin menunjukkan ATN yang melibatkan (78.54 peratus ± 0.8120) parenkim buah pinggang (Rajah 1) dengan kehilangan sempadan berus, pembengkakan sel tiub, sel jatuh intratubular, rembesan intratubular, dan mitosis (Rajah 2D & 3D).

Terdapat peratusan ATN yang lebih tinggi dalambuah pinggangdalam tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin daripada tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin (P<0.002) (fig.="">

GAL-3 dinyatakan dalam nekrosis tubular akut

Terdapat peningkatan ketara dalam kepekatan pecahan sitoplasma GAL-3 inbuah pinggangdalam kumpulan liar GAL-3 yang dirawat cisplatin (6084 ± 587.3 pg/mg) jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan liar GAL-3 (1620 ± 62.3 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" there="" is="" a="" significant="" increase="" in="" the="" nuclear="" fraction="" concentration="" of="" gal-3="" in="">buah pinggangdalam GAL -3 yang dirawat cisplatin

kumpulan (841.8 ± 41.11 pg/mg) jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan liar GAL-3 (429.2 ± 39.56 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Pewarnaan imunofluoresen wakilbuah pinggangbahagian telah menunjukkan ekspresi GAL yang lebih tinggi-3 dalam tubul renal yang terjejas oleh nekrosis tubular akut (Rajah 4B-D) jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (Rajah 4A).

GAL-3 ialah mediator anti-nekroptotik

Serine/treonine-protein kinase 1 (RIPK1) yang berinteraksi dengan reseptor. Terdapat peningkatan ketara dalam kepekatan RIPK-1 (55.33 ± 3.766 pg/mg) dalambuah pinggangtikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (14.22 ± 1.687 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-1="" concentration="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (39.59="" ±="" 1.808="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-1="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.33="" ±="" 3.766="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Perbandingan berbilang antara empat kumpulan eksperimen menggunakan ANOVA sehala, diikuti dengan ujian post hoc Newman-Keuls adalah signifikan secara statistik (P<>

Pewarnaan imunohistokimia untuk RIPK-1 menunjukkan bilangan sel yang lebih tinggi dengan ketara yang menyatakan RIPK-1 dalambuah pinggangdaripada tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin daripada tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin (P<0.001), (fig.="">

Serine/treonine-protein kinase 3 (RIPK3) yang berinteraksi dengan reseptor. Terdapat peningkatan ketara dalam kepekatan RIPK-3 (616.4 ± 27.07 pg/mg) dalam buah pinggang tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (17.46 ± 7.002 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-3="" concentration="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (203.1="" ±="" 6.443="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-3="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="">buah pinggangdaripada tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin berbanding tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin (616.4 ± 27.07 pg/mg), (P<0.001), (fig.="">

Pewarnaan imunohistokimia untuk RIPK-3 menunjukkan bilangan sel yang jauh lebih tinggi yang menyatakan RIPK-3 dalam buah pinggang tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin berbanding tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin ( P<0.001), (fig.="" 7).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Seperti domain kinase keturunan campuran (MLKL). Terdapat peningkatan ketara dalam kepekatan MLKL (71.46 ± 1.757 pg/mg) dalambuah pinggangtikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (23.30 ± 0.5897pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" mlkl="" concentration="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (40.30="" ±="" 1.090="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" mlkl="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (71.46="" ±="" 1.757="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" immunohistochemical="" staining="" for="" mlkl="" showed="" a="" significantly="" higher="" number="" of="" cells="" expressing="" mlkl="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice=""><0.001), (fig.="" 8).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Cathepsin B. Terdapat peningkatan ketara dalam kepekatan Cathepsin-B dalambuah pinggangtikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin (55.79 ± 4.141 pg/mg) jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (37.99 ± 1.206 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-b="" concentration="" in="">buah pinggangtikus KO GAL-3 yang dirawat cisplatin (85.87 ± 9.220 pg/mg jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (32.81 ± 1.570 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-b="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (85.87="" ±="" 9.220="" pg/mg="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.79="" ±="" 4.141="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Perbandingan berbilang antara empat kumpulan eksperimen menggunakan ANOVA sehala, diikuti dengan ujian post hoc Newman-Keuls adalah signifikan secara statistik (P<>

Cathepsin-D. Terdapat peningkatan ketara dalam kepekatan Cathepsin-D dalambuah pinggangtikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin (5145 ± 286.1pg/mg) jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (4066 ± 107.7 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-d="" concentration="" in="">buah pinggangtikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin (6695 ± 587.7 pg/mg) jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (3914 ± 87.51 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-d="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (6695="" ±="" 587.7="" pg/mg)="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4066="" ±="" 107.7="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="">

Perbandingan berbilang antara empat kumpulan eksperimen menggunakan ANOVA sehala, diikuti dengan ujian post hoc Newman-Keuls adalah signifikan secara statistik (P<>

GAL-3 ialah mediator anti-Apoptosis

Caspase dibelah-3. Terdapat peningkatan ketara dalam kepekatan Cleaved caspase-3 (4665 ± 330.9 pg/mg) dalambuah pinggangtikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (3193 ± 75.30 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" caspase-3="" concentration="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (3022="" ±="" 78.57="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" caspase-3="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4665="" ±="" 330.9="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="" 10a).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Pewarnaan imunohistokimia untuk caspase terbelah-3 menunjukkan bilangan sel apoptosis yang ketara dalam buah pinggang tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin berbanding tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="" i).cleaved="">

PARP dibelah. Terdapat peningkatan ketara dalam kepekatan PARP Terbelah (1446 ± 56.97 pg/mg) dalambuah pinggangtikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (171.5 ± 3.926 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (236.1="" ±="" 11.86="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Pewarnaan imunohistokimia untuk PARP yang dibelah menunjukkan bilangan sel positif yang ketara lebih tinggi dalam buah pinggang tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin berbanding tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

Ligan pengaruh apoptosis yang berkaitan dengan TNF (TRAIL). Terdapat peningkatan ketara dalam kepekatan TRAIL (120.9 ± 4.748 pg/mg) dalambuah pinggangtikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (86.14 ± 2.879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (120.9="" ±="" 4.748="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Pewarnaan imunohistokimia untuk caspase terbelah-3 menunjukkan bilangan sel apoptosis yang jauh lebih tinggi dalambuah pinggangdaripada tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin daripada tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="">

PARP dibelah. Terdapat peningkatan ketara dalam kepekatan PARP Terbelah (1446 ± 56.97 pg/mg) dalam buah pinggang tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (171.5 ± 3.926 pg/ mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="">buah pinggangtikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalan GAL-3 KO (236.1 ± 11.86 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Pewarnaan imunohistokimia untuk PARP yang dibelah menunjukkan bilangan sel positif yang lebih tinggi dalambuah pinggangdaripada tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin daripada tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

Ligan pengaruh apoptosis yang berkaitan dengan TNF (TRAIL). Terdapat peningkatan ketara dalam kepekatan TRAIL (120.9 ± 4.748 pg/mg) dalam buah pinggang tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (86.14 ± 2.879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="">buah pinggangdaripada tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin berbanding tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin (120.9 ± 4.748 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

lagenda FAS.Terdapat peningkatan ketara dalam kepekatan FAS (332.5 ± 6.395 pg/mg) dalambuah pinggangtikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (77.72 ± 2.805 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" fas="" concentration="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="">buah pinggangtikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalan GAL-3 KO (134.1 ± 3.597 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" fas="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (332.5="" ±="" 6.395="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Perbandingan berbilang antara empat kumpulan eksperimen menggunakan ANOVA sehala, diikuti dengan ujian post hoc Newman-Keuls adalah signifikan secara statistik (P<>

GAL-3 dan isyarat prosurvival

NF-κB.Pewarnaan imunohistokimia untuk fosfor-NF-κB menunjukkan bilangan sel yang lebih tinggi yang diwarnai dengan fosfor-NF-κB dalambuah pinggangdaripada tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin daripada tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin (P<0.001), (fig.="" 12="">

Beta Catenin.Pewarnaan imunohistokimia untuk Beta-catenin menunjukkan bilangan sel yang ketara lebih tinggi yang diwarnai dengan Beta-catenin dalambuah pinggangdaripada tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin daripada tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin (P<0.001), (fig.="" 12="">

Wnt-3a.Pewarnaan imunohistokimia untuk Wnt-3a menunjukkan bilangan sel yang ketara lebih tinggi yang diwarnai dengan Wnt-3a dalam buah pinggang tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin daripada GAL yang dirawat cisplatin-3 Tikus KO (P<0.001), (fig.="" 12="">

Urea plasmaTerdapat peningkatan ketara dalam kepekatan urea plasma (23.88 ± 6.715mmol/L) dalam tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (6.688 ± 0. 6066 mmol/L), (P<0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (8.331="" ±="" 0.5194="" mmol/l),=""><0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (23.88="" ±="" 6.715mmol/l),=""><0.001), (fig.="">

Perbandingan berbilang antara empat kumpulan eksperimen menggunakan ANOVA sehala, diikuti dengan ujian post hoc Newman-Keuls adalah signifikan secara statistik (P<>

Kreatinin Plasma

Terdapat peningkatan ketara dalam kepekatan kreatinin plasma (48.42 ± 3.992 umol/L) dalam tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin jika dibandingkan dengan tikus kawalan liar GAL-3 (13.27 ± 0. 3106 umol/L), (P<0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (13.88="" ±="" 0.4183="" umol/l),=""><0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (48.42="" ±="" 3.992="" umol/l),=""><0.01), (fig.="" 13b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Perbincangan

Akutbuah pinggangkecederaan adalah masalah kesihatan biasa di seluruh dunia. Setiap tahun, terdapat kira-kira 13.3 juta kes akutbuah pinggangkecederaan (AKI). Beban yang semakin tinggi di negara-negara membangun [21]. Di seluruh dunia, terdapat 1.7 juta kematian setiap tahun disebabkan oleh AKI. Daripada itu, sekitar 1.4 juta berlaku di negara berpendapatan rendah dan sederhana [21]. AKI selalunya boleh dicegah dan dirawat dengan hanya sedikit, jika ada, akibat kesihatan jangka panjang. Mengenal pasti mekanisme dan pemain utama yang mengambil bahagian dalam pembangunan AKI akan dicerminkan pada peningkatan penjagaan pesakit dan meminimumkan kematian dan morbiditi.

Kami telah menunjukkan peningkatan ketara dalam kepekatan GAL-3 dalambuah pinggangtertakluk kepada AKI. Kami juga telah menunjukkan ekspresi GAL yang lebih tinggi-3 dalam tubul renal yang terjejas oleh nekrosis tubular akut dalam tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin daripada tubul renal dalam kumpulan kawalan yang dirawat dengan garam. Kedua-dua kepekatan sitoplasma dan nuklear GAL-3 dinaikkan dengan ketara dalam tubul renal berikutan ATN jika dibandingkan dengan tikus yang dirawat dengan garam. Tahap GAL-3 yang meningkat dalam tubul renal yang cedera mencadangkan GAL-3 sebagai pemain penting dalam ATN.

Kami juga telah menggunakan tikus KO GAL-3 untuk menyiasat peranan mekanistik GAL-3 dalam ATN. Ini membantu kami melihat dengan teliti modulasi protein pro-apoptosis, pro-necroptotic dan prosurvival dalam kehadiran dan ketiadaan GAL-3 dan menentukan sama ada GAL-3 mempunyai sebarang kesan atau tidak pada perubahan ini .

Kami telah menunjukkan peratusan tubul yang terjejas dengan ketara oleh ATN dalam tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin berbanding tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin. Keputusan kami juga menunjukkan peningkatan ketara dalam cathepsin B dan cathepsin D dalam buah pinggang yang terjejas oleh ATN. Di samping itu, terdapat paras cathepsin B dan cathepsin D yang jauh lebih tinggibuah pinggangtikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin berbanding tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin. Cathepsin memainkan peranan penting dalam laluan isyarat yang mendorong kematian sel apoptosis dan nekrotik, dengan merendahkan substrat yang berbeza dan/atau menyumbang kepada ketidakstabilan mitokondria [22]. Protease lisosom, cathepsin B, dan cathepsin D banyak dinyatakan dalam buah pinggang [23].

Cathepsin B, proteinase sistein yang mempunyai aktiviti optimum dalam persekitaran berasid, mengambil bahagian dalam banyak proses fisiologi dan patologi. Ia mencerna protein struktur dan enzim dalam sel, merendahkan unsur-unsur utama membran bawah tanah, dan mengaktifkan proenzim, hormon, dan faktor pertumbuhan [24]. Peningkatan tahap ekspresi dan pengaktifan cathepsin B telah diperhatikan dalam garis sel epitelium tiub proksimal manusia HK-2 yang menjalani apoptosis [25].

Cathepsin D dinyatakan dengan ketara dalam sel tubular proksimal. Cathepsin D ialah protease aspartik lisosom utama yang bertanggungjawab terhadap degradasi protein dan organel oleh autophagy-lisosomal serta semasa nekrosis selular dan pecah membran lisosom [26]. Cathepsin D meningkat dengan ketara dalam tubul yang cedera berikutan kecederaan iskemia/reperfusi buah pinggang yang menyokong penemuan kami tentang peningkatan ketara dalam cathepsin D dalambuah pinggangdengan nekrosis tubular akut [27].

Paras Cathepsin B dan D yang lebih tinggi dengan peratusan ATN yang lebih tinggi dalambuah pinggangdaripada tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin daripada tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin mencadangkan GAL-3 sebagai pengantara anti-nekrotik.

Kami juga telah menunjukkan tahap protein nekroptosis yang jauh lebih tinggi; RIPK1, RIPK3 dan MLKL masukbuah pinggangtikus yang dirawat cisplatin. Selain itu, kami telah mengenal pasti kepekatan RIPK1, RIPK3 dan MLKL yang jauh lebih tinggi dalam buah pinggang tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin berbanding tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin.

Kajian telah menunjukkan bahawa cisplatin dikaitkan dengan peningkatan tekanan oksidatif [28]. Penjanaan spesies oksigen reaktif (ROS), pengumpulan produk peroksidasi lipid dalambuah pinggang, dan sistem antioksidan yang ditindas dianggap sebagai mekanisme utama AKI yang disebabkan oleh cisplatin [29]. Di dalam sel, cisplatin ditukar kepada bentuk yang sangat reaktif dengan cepat bertindak balas dengan molekul antioksidan yang mengandungi tiol seperti glutation [30]. Cisplatin juga boleh menyebabkan disfungsi mitokondria dan peningkatan pengeluaran ROS melalui rantaian pernafasan yang terjejas [31]. ROS memudahkan autofosforilasi RIPK1 dan menggalakkan pengambilan RIPK-3 dan pembentukan nekrosom [32]. Di samping itu, ROS adalah inducer kritikal kebolehtelapan membran lisosom (LMP) [33].

Cai et al. [34] telah menunjukkan LMP pengantara ROS terlibat dalam induksi nekroptosis dalam sel cakera intervertebral arnab. Begitu juga, RIPK1-penghasilan mitokondria-ROS yang disebabkan oleh LMP dan disfungsi mitokondria akibat daripada gelung maklum balas positif antara Ca2 plus dan JNK, yang membawa kepada nekroptosis sel A549 dan H1299 [35, 36].

Lebih-lebih lagi, telah ditunjukkan bahawa terkawal-RIPK3 dalam nekroptosis mendorong tekanan retikulum endoplasma yang meningkatkan kepekatan Ca2 selular dan ekspresi xanthine oksidase yang membawa kepada penjanaan ROS yang meningkat [37].

Cathepsins B dan D adalah kandungan berfungsi utama yang dikeluarkan daripada lisosom dengan peningkatan LMP semasa proses kematian sel [34]. Pengaktifan Cathepsin B dan D boleh menambah laluan nekroptotik [38]. Jadi nekroptosis boleh diinduksi dengan cara bebas reseptor [39]. Selain itu, laporan telah menunjukkan bahawa terdapat rangsangan tambahan, selain ROS, cathepsin B dan D, untuk induksi nekroptosis dan ini termasuk pengawalseliaan TRAIL, dan protein legenda FAS [40]. Jadi peningkatan ROS sama ada disebabkan oleh cisplatin atau induksi RIPK1 atau RIPK3 boleh menyebabkan peningkatan LMP dan pembebasan cathepsin B dan D yang seterusnya menambah nekroptosis. Begitu juga, peningkatan ROS boleh mengaktifkan RIPK1, pengambilan RIPK3, peningkatan pembentukan nekrosom, fosforilasi MLKL, translokasi MLKL terfosforilasi ke membran sel yang membawa kepada kematian sel nekrotik melalui permeabilisasi membran plasma dan pecah.

Dalam kajian ini, kami percaya bahawa peningkatan ROS, cathepsin B, cathepsin D, TRAIL, dan FAS terlibat dalam induksi nekroptosis dalam ATN.

Untuk menentukan peranan GAL-3 dalam nekroptosis, kami telah mengukur kepekatan RIPK1, RIPk3 dan MLKL dalam kehadiran dan ketiadaan GAL-3 dengan menggunakan GAL-3 liar dan GAL{{5 }} Tikus KO.

Kepekatan RIPK1, RIPK3 dan MLKL yang lebih tinggi dengan ketara dalam tikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin berbanding tikus GAL-3 yang dirawat cisplatin menunjukkan bahawa tindakan mengetuk keluar GAL-3 dikaitkan dengan peningkatan ketara dalam protein nekroptosis, mencadangkan peranan anti-nekroptosis GAL-3.

Selain itu, kami telah menunjukkan tahap protein pro-apoptosis yang jauh lebih tinggi; caspase terbelah-3, PARP terbelah, TRAIL, FAS dan badan apoptosis dalambuah pinggangmengikuti ATN.

Semasa ATN, permeabilisasi membran lisosom membolehkan pemindahan cathepsin D dan cathepsin B daripada lisosom ke dalam sitosol di mana ia boleh menggunakan fungsi pro-apoptosisnya. Cytosolic cathepsin D membelah protein Bid menjadi tBid yang mencetuskan kemasukan protein Bax ke dalam membran mitokondria. Ini membawa kepada pembebasan cytochrome c dari mitokondria ke dalam sitosol, dan pengaktifan pro-caspases 9 dan 3 [41]. Dalam kajian ini, kedua-dua pewarnaan imunofluoresen dan kepekatan protein telah menunjukkan ekspresi GAL intraselular yang lebih tinggi-3, kedua-dua pecahan sitoplasma dan nuklear, dalam ATN dalambuah pinggangdaripada GAL-3 tikus liar berbanding tikus kawalan.

Jadi tahap protein pro-apoptosis yang lebih tinggi; caspase terbelah-3, TRAIL, FAS dan badan apoptosis masukbuah pinggangtikus GAL-3 KO yang dirawat cisplatin berbanding tikus liar GAL-3 yang dirawat cisplatin mencadangkan peranan anti-apoptosis GAL-3. GAL-3 didapati terlibat secara kritikal dalam apoptosis bergantung pada penyetempatan subselularnya. Kajian telah menunjukkan GAL intraselular-3 boleh menghalang apoptosis [42-44]. Untuk menyokong peranan anti-apoptosis GAL-3, kami telah mengenal pasti bilangan sel yang jauh lebih tinggi yang mengekspresikan protein fosfo-NF-κB, beta-catenin dan Wnt dalam buah pinggang GAL yang dirawat cisplatin{{15} } tikus liar daripada tikus GAL-3 KO. NF-κB ialah faktor transkripsi yang memainkan peranan penting dalam mengawal keradangan, percambahan sel, dan kemandirian sel. Fosforilasi memainkan peranan penting dalam pengaktifan NF-κB hiliran semua rangsangan ini [45]. NF-κB kini diiktiraf sebagai penyumbang penting kepada survival sel dan perlindungan daripada apoptosis [46]. Protein Wnt telah ditunjukkan mempunyai kesan perlindungan pada sel yang cedera melalui fungsi anti-apoptosisnya melalui pengaktifan -catenin dan c-Myc [47].

Wu et al. juga telah menunjukkan peningkatan ketara dalam p-NF-κB dalambuah pinggangdengan ATN [48]. Wang et al. juga telah menunjukkan peraturan peningkatan laluan isyarat Wnt/ -catenin dalam kecederaan buah pinggang akut [49]. Kajian telah menunjukkan NF-κB terlibat dalam aruhan GAL-3 [50] serta GAL-3 terlibat dalam pengaktifan NF-κB [51]. Menariknya, GAL-3 telah didapati sebagai rakan kongsi pengikat novel -catenin [52].

Penemuan ini mencadangkan bahawa peranan anti-apoptosis GAL-3 juga boleh dimediasi melalui pengaktifan laluan NF-κB dan Wnt/ -catenin. GAL-3 nampaknya memautkan laluan transduksi isyarat pro-kemandirian ini yang disiasat dalam kajian kami. Laluan ini juga mempunyai cross-talk antara mereka di pelbagai peringkat. Pemain laluan Wnt/ -catenin memodulasi banyak kesannya melalui interaksi dengan NF-κB dan secara timbal balik NF-κB juga mempengaruhi laluan isyarat Wnt/ -catenin [53]. Oleh itu, dapat difahami bahawa GAL-3 memainkan peranan penyambung pusat dalam laluan transduksi isyarat prosurvival.

Kajian kami menunjukkan bahawa kehadiran atau ketiadaan GAL intraselular-3 dikaitkan dengan perubahan ketara dalam protein proapoptosis, pronecroptotic dan prosurvival dalam ATN yang disebabkan oleh cisplatin dan bahawa paras GAL yang tinggi-3 dalam tubul renal adalah mengantarkan persekitaran anti-apoptosis, antinecroptotic, dan prosurvival yang mungkin membentuk perjalanan penyakit pada masa hadapan. Ini mencadangkan peranan perlindungan untuk GAL-3 dalam ATN yang disebabkan oleh cisplatin akut, yang disokong oleh paras plasma urea dan kreatinin yang jauh lebih rendah dalam GAL-3 tikus liar yang dirawat cisplatin daripada GAL-3 Tikus yang dirawat cisplatin KO (Rajah 13).

Kesimpulan

GAL-3 boleh menjejaskan kemandirian dan kematian sel melalui interaksinya dengan protein nekroptotik, apoptosis dan pro-kemandirian dalam tubul renal semasa nekrosis tubular akut yang disebabkan oleh cisplatin.

Ucapan terima kasih

Sumbangan Pengarang

Semua pengarang menyemak dan meluluskan versi manuskrip yang diserahkan. SA memperkenalkan konsep, mereka bentuk kajian, menganalisis dan mentafsir data, mereka bentuk angka, dan menulis kertas. GJ melakukan eksperimen haiwan dan teknik ELISA, MS melakukan pewarnaan imunohistokimia dan imunofluoresen dan pemprosesan tisu yang berkaitan. HT melakukan eksperimen haiwan dan teknik ELISA. JY melakukan analisis biokimia fungsi buah pinggang dan menyerahkan data yang terhasil.

Kenyataan Pendedahan

Penulis mengisytiharkan tidak mempunyai kepentingan bersaing.

Rujukan

1 Lameire NH, Bagga A, Cruz D, De Maeseneer J, Endre Z, Kellum JA, Liu KD, Mehta RL, Pannu N, Van Biesen W, Vanholder R: Kecederaan buah pinggang akut: kebimbangan global yang semakin meningkat. Lancet 2013;382:170-179.

2 KDIGO: Garis Panduan Amalan Klinikal untuk Kecederaan Buah Pinggang Akut. Int Buah Pinggang 2012;2:1–138.

3 Schumer M, Colombel MC, Sawczuk IS, Globe G, Connor J, O'Toole KM, Olsson CA, Wise GJ, Buttyan R: Bukti morfologi, biokimia dan molekul apoptosis semasa fasa reperfusi selepas tempoh singkat iskemia buah pinggang Am J Pathol 1992;140:831-838.

4 Schumer AT, Davies DR, McLaren AJ, Cerundolo L, Morris PJ, Fuggle SV: Apoptosis dalam kecederaan iskemia/reperfusi allograf buah pinggang manusia. Pemindahan 1998;66:872-876.

5 Degterev A, Huang Z, Boyce M, Li Y, Jagtap P, Mizushima N, Cuny GD, Mitchison TJ, Moskowitz MA, Yuan J: Perencat kimia kematian sel nonapoptosis dengan potensi terapeutik untuk kecederaan otak iskemia. Nat Chem Biol 2005;1:112–119.

6 Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G: Mekanisme molekul nekroptosis: letupan selular yang teratur. Nat Rev Mol Cell Biol 2010;11:700–714.

7 Chen X, Li W, Ren J, Huang D, He WT, Lagu Y, Yang C, Li W, Zheng X, Chen P, Han J: Translokasi protein seperti domain kinase keturunan campuran kepada membran plasma membawa kepada sel nekrotik kematian. Sel Sel 2014;24:105– 121.

8 Cai Z, Jitkaew S, Zhao J, Chiang HC, Choksi S, Liu J, Ward Y, Wu LG, Liu ZG: Translokasi membran plasma protein MLKL trimerized diperlukan untuk nekroptosis yang disebabkan oleh TNF. Nat Cell Biol 2014;16:55–65.

9 Wang Y, Liu Y, Liu Y, Zhou W, Wang H, Wan G, Sun D, ​​Zhang N, Wang Y: Prodrug polimer cisplatin berasaskan pullulan untuk terapi yang disasarkan terhadap karsinoma hepatoselular. Int J Pharm 2015;483:89–100.

10 Pablo N, Dong Z: Nefrotoksisiti Cisplatin: mekanisme dan strategi renoprotektif. Int Buah Pinggang 2008;73:994–1007.

11 Mi XJ, Hou JG, Wang Z, Han Y, Ren S, Hu JN, Chen C, Li W: Kesan perlindungan maltol pada nefrotoksisiti yang disebabkan oleh cisplatin melalui laluan isyarat PI3K/Akt dan p53 pengantara AMPK. Sci Rep 2018;8:15922.

12 Ozkok A, Edelstein CL: Patofisiologi kecederaan buah pinggang akut yang disebabkan oleh cisplatin. Biomed Res Int 2014;2014:1–17.

13 Hughes RC: Rembesan keluarga galektin protein pengikat karbohidrat mamalia. Biochim Biophys Acta 1999;1473:172-185.

14 Liu FT, Patterson RJ, Wang JL: Fungsi intraselular galektin. Biochim Biophys Acta 2002;1572:263- 273.

15 van den Brûle FA, Waltregny D, Liu FT, Castronovo V: Pengubahan corak ekspresi sitoplasma/nuklear galectin-3 berkorelasi dengan perkembangan karsinoma prostat. Int J Cancer 2000;89:361-367.

16 Xue J, Gao X, Fu C, Cong Z, Jiang H, Wang W, Chen T, Wei Q, Qin C: Peraturan galectin-3-apoptosis teraruh sel Jurkat oleh kedua-dua O-glycans dan N-glycans pada CD45. Surat FEBS 2013;587:3986-3994.

17 Matarrese P, Fusco O, Tinari N, Natoli C, Liu FT, Semeraro ML, Malorni W, Iacobelli S: Ekspresi berlebihan Galectin-3 melindungi daripada apoptosis dengan meningkatkan sifat lekatan sel. Int J Cancer 2000;85:545- 554.

18 Oka N, Nakahara S, Takenaka Y, Fukumori T, Hogan V, Kanayama HO, Yanagawa T, Raz A: Galectin-3 menghalang apoptosis apoptosis yang disebabkan oleh ligan yang disebabkan oleh faktor nekrosis tumor dengan mengaktifkan Akt dalam pundi kencing manusia sel karsinoma. Kanser Res 2005;65:7546-7553.

19 Hashmi S, Al-Salam S: Galectin-3 dinyatakan dalam miokardium sangat awal selepas infarksi miokardium. Cardiovasc Pathol 2015;24:213-223.

20 Zhang S, Li R, Dong W, Yang H, Zhang L, Chen Y, Wang W, Li C, Wu Y, Ye Z, Zhao X, Li Z, Zhang M, Liu S, Liang X: RIPK3 mengantara tubular renal apoptosis sel epitelium dalam kecederaan buah pinggang akut yang disebabkan oleh endotoksin. Mol Med Rep 2019;20:1613-1620.

21 Liyanage T, Ninomiya T, Jha V, Neal B, Patrice HM, Okpechi I, Zhao MH, Lv J, Garg AX, Knight J, Rodgers A, Gallagher M, Kotwal S, Cass A, Perkovic V: Akses seluruh dunia kepada rawatan untuk penyakit buah pinggang peringkat akhir: kajian sistematik. Lancet 2015;385:1975-1982.

22 Turk B, Stoka V: Isyarat protease dalam kematian sel: caspases berbanding cysteine ​​​​cathepsins. FEBS Lett 2007;581:2761–2767.

23 Pavlock GS, Southard JH, Starling JR, Belzer FO: Pembebasan enzim lisosom dalam buah pinggang anjing yang direndam secara hipodermik. Kriobiologi 1984;21:521-528.

24 Werle B, Jülke B, Lah T, Spiess E, Ebert W: Fraksi Cathepsin B aktif pada pH fisiologi 7.5 mempunyai kepentingan prognostik dalam karsinoma sel skuamosa paru-paru manusia. Br J Cancer 1997;75:1137–1143.

25 Wang C, Jiang Z, Yao J, Wu X, Sun L, Liu C, Duan W, Yan M, Sun L, Liu J, Zhang L: Penyertaan cathepsin B dalam apoptosis akibat emodin dalam HK-2 sel. Toxicol Lett 2008;181:196–204.

26 Suzuki C, Tanida I, Ohmuraya M, Oliva Trejo JA, Kakuta S, Sunabori T, Uchiyama Y: Kekurangan Cathepsin D dalam Sel Tubular Proksimal Renal Mengakibatkan Peningkatan Sensitiviti terhadap Iskemia/Kecederaan Reperfusi Renal. Int J Mol Sci 2019;20:1711.

27 Lameire N, Van Biesen W, Vanholder R. Kegagalan buah pinggang akut. Lancet 2005;365:417-430.

28 Yu W, Chen Y, Dubrulle J, Stassi F, Putluri V, Sreekumar A, Putluri N, Baluya D, Lai SY, Sandulache VC: Cisplatin menjana tegasan oksidatif yang disertai dengan peralihan pantas dalam metabolisme karbon pusat. Sci Rep 2018;8:4306.

29 Aydinoz S, Uzun H, Cermiketal G: Kesan dos oksigen hiperbarik yang berbeza pada nefrotoksisiti yang disebabkan oleh cisplatin. Kegagalan Buah Pinggang 2007;29:257–263.

30 Siddik ZH: Cisplatin: mod tindakan sitotoksik dan asas molekul rintangan. Onkogen 2003;22:7265– 7279.