Bahagian 1: Kesan Acteoside Sebagai Pelindung Sel Untuk Menghasilkan Anjing Klon

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 Bahagian Sains Haiwan & Tenusu, Kolej Pertanian dan Sains Hayat, Universiti Kebangsaan Chungnam, Daejeon, Republik Korea,

2 Jabatan Pendidikan Biologi, Kolej Pendidikan,Universiti Kebangsaan Chonnam, Gwangju, Republik Korea

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com

Sila klik di sini untuk Bahagian 2

Abstrak

Pemindahan nuklear sel somatik (SCNT) adalah teknik makmal yang terkenal. Prinsip SCNT melibatkan pemprograman semula nukleus somatik dengan menyuntik sel somatik ke dalam oosit penerima yang nukleusnya telah dikeluarkan. Oleh itu, sel penderma nukleus dianggap sebagai faktor penting dalam SCNT. Penyegerakan kitaran sel sel penderma nukleus pada peringkat G0/G1 boleh disebabkan oleh perencatan sentuhan atau kebuluran serum. Dalam kajian ini,acteoside, sebatian glikosida fenilpropanoid, telah disiasat untuk menentukan sama ada ia boleh digunakan untuk mendorong penyegerakan kitaran sel, cytoprotection, dan meningkatkan kecekapan SCNT dalam fibroblas janin anjing. Fibroblas janin anjing utama telah dirawat denganacteoside(10, 30, 50 μM) untuk pelbagai tempoh masa (24, 48 dan 72 jam). Penyegerakan kitaran sel pada peringkat G0/G1 tidak berbeza dengan ketara dengan kaedah induksi:acteosiderawatan, perencatan sentuhan, atau kebuluran serum. Walau bagaimanapun, daripada ketiga-tiga rawatan ini, kebuluran serum menyebabkan tahap spesies oksigen reaktif (ROS) meningkat dengan ketara (99.5 ± 0.3 peratus ) dan apoptosis. Hasilnya juga mendedahkan bahawaacteosidemengurangkan proses ROS dan apoptosis termasuk nekrosis dalam fibroblas janin anjing, dan meningkatkan kemandirian sel. Fibroblas janin anjing dirawat denganacteosidetelah berjaya ditangkap pada peringkat G0/G1. Selain itu, embrio yang dibina semula menggunakan sel penderma nukleus yang dirawat dengan acteoside menghasilkan anjing klon yang sihat, tetapi bukan embrio yang dihasilkan menggunakan sel penderma nukleus yang tertakluk kepada perencatan sentuhan. Kesimpulannya,acteosidepenyegerakan kitaran sel teraruh sel penderma nukleus akan menjadi kaedah alternatif untuk meningkatkan kecekapan SCNT taring kerana kesan sitoprotektifnya.

Cistanche acteoside Boleh Meningkatkan Kekebalan

pengenalan

Teknik SCNT telah digunakan untuk menghasilkan haiwan unggul atau dimanipulasi secara genetik untuk tujuan pertanian dan sebagai sumber bioperubatan. Dengan peningkatan keperluan untuk model haiwan penyakit, menyelamatkan haiwan dalam bahaya kepupusan, sel stem untuk perubatan regeneratif, pemindahan organ, dan lain-lain, minat untuk mengklon haiwan menggunakan SCNT telah meningkat sejak kebelakangan ini [1-5]. Walaupun pengeluaran haiwan klon telah berjaya, kecekapan SCNT masih sangat rendah [6]. Punca kecekapan perkembangan embrio SCNT yang rendah termasuk banyak faktor yang berkaitan dengan kualiti oosit penerima, kualiti sel penderma nukleus, dan keadaan ibu tumpang [7-10].

Spesies oksigen reaktif (ROS) dan apoptosis telah diketahui terlibat dalam proses pembiakan wanita termasuk perkembangan oosit dalam vivo dan in vitro [11-14]. ROS mengganggu perkembangan embrio dengan mendorong pemeluwapan sitoplasma, kerosakan DNA, dan apoptosis dalam embrio. Kajian sokongan telah melaporkan bahawa mengurangkan ROS meningkatkan kecekapan pembangunan embrio SCNT semasa kultur in vitro [15-17]. Apoptosis ialah proses fisiologi yang berlaku secara spontan semasa perkembangan embrio praimplantasi normal untuk mengekalkan homeostasis selular dengan membuang sel DNA yang rosak/tidak berfungsi. ROS menyebabkan pemecahan DNA dan meningkatkan blastomer apoptosis yang mengganggu perkembangan embrio. Peristiwa ROS dan apoptosis diperhatikan lebih kerap selepas SCNT berbanding selepas persenyawaan in vitro [18, 19]. Banyak kajian melaporkan bahawa kecekapan pembangunan embrio SCNT diselamatkan dengan mengurangkan tahap ROS dan apoptosis dengan menggunakan antioksidan seperti selenium [20], insulin-transferrin-selenium [17, 21], melatonin [22], dan glutathione [23].

Kajian terdahulu melaporkan bahawa penggunaan sel penderma yang ditangkap pada peringkat G{{0}}/G1 meningkatkan kecekapan SCNT [7, 9, 24–28]. Kromatin dalam sel penderma pada peringkat G0/G1 telah dianggap paling berkesan untuk kecekapan pembangunan embrio SCNT. Untuk menyegerakkan kitaran sel penderma, perencatan sentuhan, kebuluran serum, dan rawatan kimia telah kerap digunakan [7, 25, 29, 30]. Walau bagaimanapun, kebuluran serum mengurangkan kelangsungan hidup sel dan meningkatkan pemecahan DNA, yang membawa kepada apoptosis [31]. Perencatan kimia adalah satu lagi strategi untuk menangkap kitaran sel pada peringkat G0/G1 menggunakan perencat seperti roscovitine [29, 32], dimetil sulfoksida (DMSO) [33], dan sikloheximide (CHX) [34]. Kecekapan kaedah yang digunakan untuk penyegerakan dipengaruhi oleh jenis dan spesies sel penderma. Untuk penyegerakan sel penderma yang optimum, pelbagai aspek kaedah yang digunakan perlu dinilai dengan teliti.

Acteoside(juga dikenali sebagai verbascoside) [{{0}}(3, 4-dihydroxy phenyl ethyl)-1-OaL-rhamnopyranosyl-(1 / 3)-bD-({{13} }O-caffeoyl)-glucopyranoside] diasingkan daripada bunga violet Syringa vulgaris. Tumbuhan yang mengandungi acteoside telah diketahui mempunyai aktiviti anti-mikrob dan anti-kulat [35-37], dan mencegah keradangan. Malah, acteoside mempamerkan pelbagai aktiviti biologi secara in vitro dan in vivo seperti aktiviti anti-oksidatif, aktiviti anti-apoptosis, sitotoksisiti terhadap pelbagai sel tumor dan penyegerakan kitaran sel pada peringkat G0/G1 sebagai bergantung kepada cyclin. perencat kinase (CDK) [38]. Contohnya Lee et al.[38] melaporkan bahawa rawatan acteoside boleh menghalang pembiakan sel leukemia HL-60 promyelocytic manusia dengan mendorong penahanan kitaran sel pada peringkat G0/G1. Walau bagaimanapun, kesan sel penderma yang dirawat acteoside terhadap kecekapan SCNT taring masih belum dikaji.

Dalam kajian ini, kesan daripadaacteosidepada penyegerakan kitaran sel, ROS, danapoptosispada fibroblas janin anjing telah disiasat. Analisis penyegerakan kitaran sel, ROS, dan apoptosis dilakukan menggunakan pengisihan sel diaktifkan pendarfluor (FACS). Untuk menunjukkan kecekapan sel penderma yang dirawat dengan acteoside, embrio SCNT telah dibiakkan dan dipindahkan ke dalam anjing penerima, dan berjaya menghasilkan anjing klon yang sihat.

cistancheboleh merawatbuah pinggangpenyakit bertambah baikbuah pinggangfungsi

Bahan dan Kaedah

Kenyataan etika

Dalam kajian ini, 44 anjing kacukan betina (berumur 1-6 tahun) digunakan sebagai penderma oosit dan pengganti pemindahan embrio, dan seekor anjing beagle (berumur 2 tahun) digunakan untuk penubuhan garisan sel fibroblast janin. Semua eksperimen haiwan telah diluluskan oleh Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Universiti Kebangsaan Chungnam (Nombor Kelulusan: CNU-00487) dan dilakukan mengikut "Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal" yang diterbitkan oleh IACUC Universiti Kebangsaan Chungnam. Anjing dibesarkan di dalam rumah dalam sangkar berasingan dengan sistem kawalan suhu dan pengudaraan. Anjing diberi makanan komersial sekali sehari dan diberikan air ad libitum. Dalam semua eksperimen haiwan, anjing telah dibius dengan 6 mg/kg ketamin dan xylazine pada mulanya dan dikekalkan dalam keadaan bius dengan 2 peratus isoflurane. Pada akhir pembedahan, antibiotik (Procaine Penicillin G, Benzathine Penicillin G, dan Dihydrostreptomycin sulfate) telah diberikan untuk mencegah sebarang jangkitan. Selepas pembedahan, anjing-anjing itu dipindahkan ke sangkar masing-masing dengan air tawar, dipantau, dan diberikan penjagaan khas daripada doktor haiwan yang bertanggungjawab, supaya rawatan yang diperlukan boleh diberikan jika haiwan memerlukannya.

Bahan kimia

Semua bahan kimia telah dibeli daripada Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) melainkan dinyatakan sebaliknya. Acteoside diperoleh daripada Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. di China.

Pengasingan fibroblas janin anjing

Fibroblas janin anjing diperoleh daripada {{0}}janin berusia sehari. Secara ringkas, seekor burung belang betina telah disemai secara buatan dengan sperma seekor burung belang jantan. Selepas 28 hari, kehamilan dalam beagle betina telah disahkan dan 5 janin telah diperolehi melalui celiohysterectomy. Janin dibasuh tiga kali dalam salin penampan fosfat (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, Amerika Syarikat). Kepala, organ dalaman, dan anggota badan janin dikeluarkan dengan pisau pembedahan dan bahagian badan yang tinggal dicincang dalam PBS. Kepingan janin dibasuh dua kali dengan sentrifugasi pada 400 × selama 5 minit dan dikultur dalam Medium Helang Modified Dulbecco (DMEM; Gibco) ditambah dengan 1 peratus penicillin-streptomycin (produk No. P4458) dan 20 peratus serum lembu janin (FBS; Gibco) pada 39 darjah dalam suasana lembap sebanyak 5 peratus CO2 dan 95 peratus udara. Apabila sel mencapai pertemuan selepas 5-7 hari, mereka dirawat dengan 0.25 peratus trypsin-EDTA (Gibco) selama 2 minit dan dituai. Dua garisan sel fibroblast janin anjing telah ditubuhkan daripada dua janin individu. Sel-sel telah dibekukan dalam 10 peratus DMSO dalam FBS dan disimpan dalam nitrogen cecair pada -196 darjah sehingga ia digunakan.

Rawatan sel

Fibroblas taring beku telah dicairkan dan dikultur sehingga 8{10}} peratus pertemuan. Sel telah dituai dan dilalui 4 hingga 7 kali untuk eksperimen seterusnya. Sel telah disemai pada kepekatan 106/mL dalam hidangan kultur 60 mm. Sel-sel telah dibiakkan dalam (1) DMEM ditambah dengan 10 peratus FBS dan 1 peratus penisilin-streptomisin selama lima hari (perencatan sentuhan), (2) DMEM ditambah dengan 0.5 peratus FBS dan 1 peratus penisilin-streptomisin selama lima hari (kebuluran serum) , atau (3) DMEM ditambah dengan 10 peratus FBS dan 1 peratus penisilin-streptomisin yang mengandungi acteoside pada 10 μM, 30 μM, atau 50 μM selama 24 jam, 48 jam dan 72 jam (rawatan acteoside).

Analisis kitaran sel oleh sitometri aliran

Untuk analisis peringkat kitaran sel, sel telah dituai menggunakan {{0}}.25 peratus trypsin-EDTA dan dibasuh 3 kali dengan PBS secara sentrifugasi. Selepas cucian terakhir, supernatan dibuang dan sel digantung semula dalam 0.3 mL PBS. Untuk penetapan, {{10}}.7 mL etanol mutlak sejuk ditambah setitik pada ampaian sel, dicampur dengan pusaran lembut dan disimpan semalaman pada suhu 4 darjah . Sel tetap telah disentrifugasi dan dibasuh dua kali dengan PBS sejuk. Sel-sel telah digantung semula dalam 0.25 mL PBS ditambah dengan 5 μL 10 mg / mL RNase dan diinkubasi selama 1 jam pada 37 darjah. Kemudian, 10 μL 1 mg/mL propidium iodide (PI) telah ditambah. Kitaran sel dianalisis dengan kuantiti kandungan DNA dalam populasi sel pada fasa G0/G1 (2n), S (antara 2n dan 4n), dan G2/M (4n) menggunakan sitometer aliran FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA , USA).

Pengesanan ROS oleh sitometri aliran

ROS dalam sel hidup dinilai menggunakan Kit Pengesanan Spesies Oksigen Reaktif Hijau Imej-iT™ Live (Probe Molekul, Eugene, OR, USA). Secara ringkas, sel-sel telah dibasuh dalam PBS selepas mengeluarkan medium kultur, dan 2 mL larutan kerja tert-butil hidroperoksida (TBHP) 100 μM telah ditambah. Selepas pengeraman pada 37 darjah selama 1 jam, penyelesaian kerja TBHP dikeluarkan, dan sel-sel dibasuh perlahan-lahan 3 kali dalam salin penampan fosfat Dulbecco yang hangat (DPBS; Gibco). Sel kemudiannya diinkubasi dalam larutan kerja 25 μM 5-(dan-6)-karboksi-2,7-dichlorodihydro-fluorescein diacetate (karboksi-H2DCFDA) pada 37 darjah selama 30 minit dalam gelap. . Apabila teroksida, karboksi-H2DCFDA memancarkan pendarfluor hijau, memudahkan penilaian ROS oleh sitometri aliran. TBHP, yang merupakan inducer pengeluaran ROS, digunakan sebagai kawalan positif. Nukleus sel telah diwarnai dengan Hoechst 33342. Selepas mencuci 3 kali dengan PBS, sel dituai dengan trypsinization, digantung dalam PBS, dan digunakan untuk mengesan ROS dengan menggunakan sitometer aliran FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, Amerika Syarikat). ). Kadar pembentukan ROS dikira dengan membahagikan bilangan sel positif ROS dengan jumlah bilangan sel dan menukar nilai kepada peratusan.

Analisis apoptosis oleh sitometri aliran

Analisis apoptosis dilakukan menggunakan Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Secara ringkas, sel-sel telah dituai dengan trypsinization dan dibasuh 2 kali dengan PBS sejuk. Selepas itu, 100 μL 1 × penimbal pengikat annexin, 5 μL Alexa Fluor 488 annexin V, dan 1 μL PI telah ditambah ke dalam sel. Selepas pengeraman selama 15 minit pada suhu bilik, 400 μL 1 × penimbal pengikat annexin telah ditambah dan penggantungan sel dicampur perlahan-lahan. Annexin V, yang merupakan protein pengikat fosfolipid yang bergantung kepada Ca2 ditambah mempunyai pertalian tinggi untuk fosfatidilserin (PS). Dalam sel hidup, PS terletak pada membran sitoplasma dalaman dan dipindahkan ke membran sitoplasma luar dalam sel apoptosis. Sel apoptosis dibezakan oleh Annexin V yang dilabelkan dengan Alexa Fluor 488 yang mengikat PS pada membran luar. Di samping itu, PI, yang merupakan pewarna pengikat asid nukleik, mengotorkan sel nekrotik dengan pendarfluor merah. Oleh itu, sel apoptosis dengan pendarfluor hijau, sel nekrotik dengan pendarfluor merah, dan sel hidup dengan sedikit atau tiada pendarfluor dalam sel telah dianalisis menggunakan cytometer aliran FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, Amerika Syarikat). Kadar dikira dengan membahagikan nombor sel sel hidup, nekrotik atau apoptosis dengan jumlah bilangan sel, dan menukar nilai yang dikira kepada peratusan.

Pengumpulan oosit matang in vivo

Untuk mengesan ovulasi dalam setiap anjing, kepekatan progesteron serum (P4) diukur menggunakan DSL-3900Progesteron AKTIF Kit Radioimmunoassay Tiub Bersalut (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, USA). Seperti yang diterangkan sebelum ini [39, 40], hari apabila kepekatan P4 melebihi 4 ng/mL dianggap sebagai hari ovulasi. Pada 72 jam selepas ovulasi, oosit telah diambil dengan laparotomi menggunakan prosedur pembedahan aseptik. Fimbria oviduk didekati melalui celah bursal dan dikanulasi menggunakan jarum keluli mentol bebibir terbalik (18 tolok, 7.5 cm). Kateter intravena (IV) 24 tolok (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seoul, Korea) telah dimasukkan ke dalam isthmus oviduk berhampiran persimpangan uterotubal, dan medium 199 (Gibco) ditambah dengan 1 peratus penisilin-streptomisin dan 5 peratus FBS dimasukkan ke dalam oviduk melalui kateter IV. Oosit segera diangkut ke makmal. Sebanyak 316 oosit telah dikumpulkan daripada 31 ekor anjing.

Pemindahan nuklear sel somatik dan pemindahan embrio SCNT dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [39]. Secara ringkas, untuk mengeluarkan sel kumulus daripada oosit matang in vivo, kumulus-oocyte-complexes (COC) telah dipipet secara berulang dalam 0.1 peratus hyaluronidase. Badan polar pertama dan kromosom metafasa-II telah dikeluarkan melalui aspirasi. Enukleasi telah disahkan dengan pewarnaan dengan Hoechst 33342 (bisbenzimide). Fibroblas janin anjing dirawat dengan 30 μM acteoside selama 48 jam dan kemudian dituai dengan 0.25 peratus trypsin- EDTA. Satu sel, yang mempunyai membran sel licin, dipindahkan ke dalam ruang perivitelline setiap oosit yang dienukleasi. Koplet adalah medium infusi yang diseimbangkan, iaitu 0.26 M manitol medium yang mengandungi 0.1 mM HEPES, 0.5 mM MgSO4, dan 0.05 peratus BSA, dan digabungkan dengan dua denyutan arus terus (69–75 V selama 15 μs) daripada radas Gabungan Sel Elektro (gen NEPA Co., Chiba, Jepun). Kuplet ini diinkubasi dalam medium 199 ditambah dengan 10 peratus FBS selama 1 jam 30 minit. Embrio SCNT bercantum telah diperiksa dan pengaktifan kimia diaruhkan dengan mengeramkannya dalam 10 μM kalsium ionofor (produk No. C7522, Sigma) selama 4 minit. Embrio SCNT telah dibasuh dan kemudian diletakkan dalam medium cecair oviduktal sintetik (mSOF) [41] yang diubah suai yang mengandungi 1.9 mM 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) selama 3 jam 30 minit. Embrio kejuruteraan dipindahkan secara pembedahan ke dalam oviduk pengganti yang disegerakkan oestrus dalam masa 4 jam selepas SCNT. Kehamilan disahkan oleh ultrasonografi pada 26 hari (paling awal) selepas pemindahan embrio.

bahan aktifacteosidedalamcistanche

Kultur in vitro embrio klon

Selepas SCNT, embrio klon dibiakkan dalam 40 μL titisan mikro medium cecair oviduk sintetik (mSOF) yang diubah suai (10 embrio klon setiap mikrotitis) yang ditindih dengan minyak mineral pada 38.5 darjah dalam 5 peratus CO2 dan 95 peratus udara. Perkembangan embrio SCNT diperhatikan dari hari ke-2 hingga hari ke-8.

Analisis DNA mikrosatelit dan mitokondria anjing klon

Jumlah DNA telah diekstrak daripada sel penderma nuklear, dan kulit anjing penderma oosit, anjing pengganti, dan anjing klon oleh Kit Pengekstrakan DNA Genomik G-spin™ (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Korea) mengikut garis panduan pengilang, dan kemudian dielusikan dalam 100 μL penimbal TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0). Jumlah DNA diukur oleh Spektrofotometer BioSpec-nano (Shimadzu Corp., Jepun).

Untuk genotaip mikrosatelit, 7 gen khusus berikut telah dipilih: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 dan FH2079. PCR dilakukan dengan denaturasi awal selama 10 minit pada 95 darjah , 20 kitaran terdiri daripada denaturasi selama 30 saat pada 95 darjah , 30 saat penyepuhlindapan pada 58 darjah (-0.1 darjah /kitaran), 1 minit sambungan pada 72 darjah, dan 15 lagi kitaran terdiri daripada denaturasi selama 30 saat pada 95 darjah, 30 saat penyepuhlindapan pada 56 darjah, 1 minit lanjutan pada 72 darjah, dan lanjutan akhir pada 72 darjah selama 10 minit.

Untuk penjujukan DNA mitokondria, menggunakan jujukan nukleotida lengkap mtDNA anjing (no. kesertaan GenBank: U96639), primer oligonukleotida berikut telah disintesis: Rantau sitokrom b (L14,252 –L14,631) F: ACTGGCATTCATTGACCTCCCAGAGCG,GRC: Subunit cytochrome c oxidase II (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTTCTATTGG; 16S rRNA (L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT, R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; Rantau gelung D (L15,622 – L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. Kitaran PCR untuk analisis ini termasuk: denaturasi awal 95 darjah selama 5 minit, 5 kitaran denaturasi selama 30 saat pada 95 darjah, 40 saat penyepuhlindapan pada 60 darjah (-1 darjah /kitaran), 1 minit sambungan pada 72 darjah, dan 30 kitaran denaturasi seterusnya selama 30 saat pada 95 darjah, 40 saat penyepuhlindapan pada 55 darjah, 1 minit lanjutan pada 72 darjah, dan lanjutan akhir pada 72 darjah selama 10 minit. Serpihan PCR daripada pelbagai eksperimen telah dianalisis menggunakan ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc., USA). Pemasangan jujukan, berbilang penjajaran dan pemangkasan penjajaran untuk kawasan kawalan telah dilakukan dengan perisian BioEdit (v.7.0.5.3).

acteosidedalamcistancheboleh tingkatkan sistem imun