BAHAGIAN 1 Cistanche Deserticola Polysaccharide Menghalang Kehilangan Tulang akibat OVX pada Tikus Dan Osteoklastogenesis yang disebabkan oleh RANKL
Mar 02, 2022
pengenalan
Osteoporosis—penyakit yang dicirikan oleh penurunan jisim tulang, struktur mikro tisu tulang yang tidak normal, peningkatan kerapuhan tulang, dan patah tulang (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, & Ginaldi, 2006)— kini memberi kesan kepada lebih 200 juta orang di seluruh dunia dan membentangkan masalah perubatan dan beban sosioekonomi kepada masyarakat moden (Strom et al., 2011). Rawatan klinikal osteoporosis terutamanya tertumpu pada penggantian hormon, bifosfonat, atau terapi denosumab. Kaedah ini berkesan tetapi menimbulkan kesan sampingan jangka panjang seperti potensi risiko kanser payudara dan patah tulang femur atipikal (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof- Bauer, 2011). Oleh itu, terdapat keperluan mendesak untuk meneroka ubat-ubatan yang bukan sahaja boleh menghalangosteoporosistetapi juga mempunyai sedikit kesan sampingan yang tidak diingini.
Cistanche deserticola(CD), makanan tonik dan perubatan yang digunakan secara meluas di China, dikenali sebagai "ginseng gurun", ialah batang berair kering dengan daun sisikC. deserticolaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) dan mempunyai pelbagai dan berkesanfarmakologiaktiviti, seperti pengawalan imun, anti-pengoksidaan, dan anti-osteoporosishartanah (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Kajian terdahulu mengenai bahan aktif CD pada rawatan osteoporosis tertumpu terutamanya padaphenylethanoidglikosida(Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). Walau bagaimanapun, CD juga mengandungi komponen berkesan lain seperti iridoid, lignan,polisakarida(Wang, Zhang, & Xie, 2012). Aplikasi klinikal perubatan tradisional Cina (TCM) terutamanya merebus air.Polisakaridaadalah komponen larut air dan berkemungkinan besar merupakan komponen farmakodinamik utama TCM. Polisakarida yang diekstrak daripada TCM dilaporkan secara liar mempunyai anti-osteoporosiskesan dan beberapa kesan sampingan yang tidak diingini, yang biasanya digunakan di klinik (cth, polisakarida yang diekstrak daripada Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018), dan Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawaCistanche deserticolapolisakarida(CDP) yang diekstrak daripada CD mungkin merupakan ubat yang berpotensi selamat untuk rawatan osteoporosis.
Lazimnya, penyerapan tulang dan pembentukan tulang mengekalkan keseimbangan dinamik semasa pembentukan semula tulang dalam penyelarasan dengan beberapa jenis sel, termasuk osteoklas, osteoblas, sel lapisan tulang, dan osteosit (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Pemecahan dalam keseimbangan ini boleh mengakibatkan pelbagai penyakit metabolik tulang, sepertiosteoporosis(Zhu et al., 2018) dan osteosklerosis (Ihde et al., 2011). Osteoklas, sebagai sel pembezaan akhir yang diperoleh daripada keturunan mononuklear/makrofaj, adalah satu-satunya sel yang mempunyai fungsi penyerapan tulang (Teitelbaum, 2000). Terdapat dua sitokin utama yang mengambil bahagian dalam pembezaan dan pematangan osteoklas (Koga et al., 2004): faktor perangsang koloni makrofaj (M-CSF) dan pengaktif reseptor faktor nuklear κB (NF-κB) ligan (RANKL). M-CSF mengantara pembezaan sel stem hematopoietik kepada progenitor osteoklas dan menggalakkan pembezaan osteoklas dengan mengawal selia ekspresi reseptor RANK (Takayanagi, 2007). Pengikatan RANKL dan RANK pada permukaan sel osteoklas menghasilkan perkara berikut: (1) pengambilan molekul penyesuai isyarat seperti faktor 6 berkaitan reseptor TNF (TRAF6); (2) pengaktifan berbilang sasaran hiliran, termasuk NF- κB dan kinase protein diaktifkan mitogen (MAPK); dan (3) penyelarasan tahap ekspresi faktor nuklear sel T yang diaktifkan, sitoplasma 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Pengaktifan laluan isyarat ini secara langsung mengawal ekspresi gen osteoklas, termasuk asid fosfatase 5 (Acp5) [pengekodan fosfatase asid tahan tartrat (TRAcP)], matriks metalloproteinase 9 (MMP9), dan cathepsin K (CTSK) (Boyle, Simonet , & Lacey, 2003). Oleh itu, perencatan laluan isyarat berkaitan pembezaan osteoklas yang disebabkan oleh RANKL adalah kaedah terapeutik yang berpotensi untuk osteoporosis.
Dalam kajian ini, kami bertujuan untuk menentukan kesan rawatan CDP pada ovariectomized (OVX) yang disebabkanosteoporosismodel tetikus dalam vivo dan pada aktiviti osteoklas yang disebabkan oleh RANKL secara in vitro, dengan tumpuan pada ekspresi gen khusus osteoklas dan pengaktifan NFATc1 dan laluan isyarat NF-κB dan MAPKs. Penemuan kami mungkin memberikan pandangan baharu tentang potensi CDP sebagai ubat yang selamat dan berkesan untuk merawat osteoporosis.
Untuk maklumat lanjut sila hubungi:Joanna.jia@wecistanche.com
2. Bahan-bahan dan cara-cara
2.1. Bahan kimia dan pengumpulan sampel
CD (no. 180801) telah dibeli daripada Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, China) dan dikenal pasti oleh Profesor Haibo Huang dari Pusat Pengajian Sains Farmaseutikal, Universiti Perubatan Cina Guangzhou, Guangzhou, China. Tablet Estradiol valerate dibeli dari Bayer (Leverkusen, North-Rhine-Westphalia, Jerman). Medium penting minimum yang diubah suai alfa
( -MEM) dan fetal bovine serum (FBS) diperoleh daripada Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penisilin/streptomycin dan kit pewarnaan TRAcP diperoleh daripada Solarbio (Beijing, China). Tetikus rekombinan M-CSF dan tetikus rekombinan RANKL telah diperoleh daripada Sistem R&D (Minneapolis, MN, Amerika Syarikat). Plat bersalut hidroksiapatit telah dibeli daripada Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). Antibodi utama untuk NFATc1 dan CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK, dan P-JNK (Teknologi Isyarat Sel, Dan- vers, MA, Amerika Syarikat); dan -actin (CWBIO, Beijing, China) juga diperolehi. Reagen lain yang digunakan dalam kajian ini adalah gred analitik, dan air itu telah disucikan oleh sistem penulenan air Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).
2.2. Pengekstrakan CDP
CD itu dikisar hingga menjadi serbuk halus dan dicampur dengan petroleum eter tiga kali untuk mengalahkannya. Sisa pepejal dikumpulkan melalui penapisan dan kemudian dikeringkan pada suhu bilik. Thepolisakaridatelah diekstrak daripada sampel pra-rawatan tiga kali dengan air selama 2 jam, pekat, dimendakan dengan penambahan etanol kontang kepada kepekatan akhir 80 peratus (v/v), dan disimpan pada suhu 4 ◦C selama 24 jam. Mendakan dikumpulkan melalui sentrifugasi pada 3000 rpm selama 20 minit, dilarutkan dalam air suling, dan disucikan (penyingkiran protein bebas) menggunakan kaedah Sevag (Zhao et al., 2019). Yang pulihpolisakaridatelah didialisis, dikeringkan, dan disimpan sehingga digunakan selanjutnya. Tambahan pula, keputusan komposisi kimia menunjukkan bahawa jumlah kandungan gula, asid uronik, sulfat dan protein CDP ialah 67.63 0.98 peratus , 21.05 0.49 peratus , 1.{{7 }}.24 peratus , dan 8.81 0.36 peratus .
Komposisi monosakarida dan analisis inframerah transformasi Fourier CDP ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 1 dan 2.
2.3. Model tikus osteoporosis yang disebabkan oleh OVX
Semua eksperimen haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Universiti Perubatan Cina Guangzhou (diluluskan SYXK 2019-0202). Tikus C57BL/6 betina berusia tiga puluh 6-minggu telah dibekalkan oleh Pusat Haiwan Eksperimen Universiti Perubatan Cina Guangzhou. Selepas penyesuaian selama 1 minggu, satu kumpulan tikus diberi pembedahan palsu (kumpulan Syam), manakala tikus yang tinggal menjalani pembedahan ovariektomi (kumpulan OVX). Selepas pembedahan, tikus dibenarkan pulih selama 1-minggu. Kemudian, tikus yang berjaya dimodelkan dibahagikan secara rawak kepada 5 kumpulan, dengan 6 tikus setiap kumpulan:
(1) Kumpulan Syam: dirawat dengan air suling, (2) Kumpulan OVX: dirawat dengan air suling, (3) Kumpulan OVX E2 (E2): dirawat dengan 0.13 mg/kg tablet estradiol valerate, (4 ) OVX CDP kumpulan dos rendah (CDP-L): dirawat dengan 300 mg/kg CDP, (5) OVX CDP kumpulan dos tinggi (CDP- H): dirawat dengan 600 mg/kg CDP. Air suling, E2, atau CDP ditadbir secara gavage sekali sehari. Semua tikus telah dikorbankan selepas 12- tempoh rawatan minggu (Rajah 1A). Rahim dikumpulkan dan ditimbang, dan tibias kiri dikumpulkan untuk pemeriksaan seterusnya. Sampel darah keseluruhan dikumpul dan disentrifugasi pada 5000 rpm untuk
15 minit pada 4 ◦C. Supernatan serum disedut dan disimpan di
—80 ◦C sehingga analisis lanjut.
2.4. Analisis tomografi komputer mikro (mikro-CT) dan histomorfometri tulang
Tibias kiri difiksasi dengan 4 peratus paraformaldehid selama 48 jam dan seterusnya diletakkan dalam tiub emparan yang mengandungi garam biasa. Sampel tetap telah diimbas dengan instrumen mikro-CT Skyscan 1172 (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgium) menggunakan tetapan berikut: voltan, 80 kV; sumber semasa, 100 μA; Al, penapis 0.5 mm; piksel
saiz, 9.76 μm; dan langkah putaran, 0.6◦. Beberapa parameter bagi
tulang trabekular, termasuk ketumpatan mineral tulang (BMD), pecahan isipadu tulang (BV/TV), permukaan tulang setiap jumlah isipadu (BS/TV), nombor trabekular (Tb. N), dan jarak trabekular (Tb. Sp) diukur menggunakan Perisian CT- Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Imej tiga dimensi dijana menggunakan perisian CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan).
Berikutan analisis mikro-CT, tibias kiri dinyahkalsifikasi dalam larutan EDTA 14 peratus dan dibenamkan ke dalam parafin untuk pembahagian. Sampel telah dihiris kepada bahagian 5 µm menggunakan mikrotom sebelum eksperimen pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E) dan TRAcP. Bahagian yang diwarnai telah diperiksa dan didokumenkan menggunakan mikroskop Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Jepun).
Cistancheboleh meningkatkan ketumpatan tulang dan melegakan osteoporosis
2.5. Analisis serum
Kepekatan kalsium (Ca) dan fosforus (P) ditentukan mengikut arahan kit yang direka oleh Institut Bioengineering Nanjing Jiancheng (Nanjing, China). Tahap TRAcP-5b dan RANKL dalam serum dianalisis menggunakan kit TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, China) dan kit RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, China).
2.6. Ujian osteoklastogenesis in vitro
BMM telah diasingkan daripada tibia dan femur tikus C57BL/6 betina 6-minggu. Sel-sel terpencil telah dibiakkan dalam medium -MEM yang mengandungi 25 ng/mL M-CSF, 10 peratus FBS, dan 1 peratus penisilin/streptomisin. Apabila mencapai pertemuan, BMM (1 104 sel/telaga) telah disemai dalam 96-plat perigi dan dirawat dengan CDP dengan kehadiran RANKL 50 ng/mL. Medium dan CDP diganti setiap 2 hari. Selepas 7 hari, sel telah diperbaiki dengan 4 peratus paraformaldehid dan diwarnai untuk kehadiran TRAcP. Bilangan osteoklas, yang ditakrifkan sebagai sel positif TRAcP dengan tiga atau lebih nukleus, dikira dan didokumenkan menggunakan mikroskop cahaya.
2.7. Ujian percambahan sel
BMM (1 × 104 sel/telaga) telah disemai dalam 96-plat perigi dan diinkubasi semalaman. Selepas ini, sel telah dirawat dengan kepekatan CDP yang berbeza (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, dan 40 µg/mL) selama 48 jam. Pertemuan sel telah dikesan dan dianalisis menggunakan IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA), sistem pengimejan sel hidup dinamik masa nyata jangka panjang.
2.8. Ujian penyerapan hidroksiapatit
BMM ({{0}} sel/telaga) telah disemai dalam plat bersalut hidroksiapatit, dirawat dengan CDP pada kepekatan yang ditunjukkan (0, 5, dan 10 µg/mL), dan dikultur dalam -MEM lengkap mengandungi 25 ng/mL M-CSF dan 50 ng/mL RANKL. Selepas 7 hari, sel telah dibasuh dengan larutan peluntur 10 peratus untuk mengeluarkan komponen sel. Imej kawasan penyerapan hidroksiapatit telah ditangkap menggunakan IncuCyte ZOOM® dan dianalisis menggunakan perisian ImageJ (NIH, Bethesda, MD, Amerika Syarikat) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003).
2.9. Pengasingan RNA dan analisis PCR (RT-qPCR) terbalik transkripsi-kuantitatif masa nyata
BMM ({{0}} sel/telaga) telah disemai dalam plat telaga 6-dan dirangsang dengan RANKL dan M-CSF dengan kehadiran CDP pada kepekatan yang berbeza (0, 5, dan 10 µg/mL) selama 5 hari. Jumlah RNA telah diasingkan daripada sel atau tisu tulang tikus menggunakan reagen TRIzol (Sigma- Aldrich). DNA pelengkap telah disintesis daripada 2 µg jumlah RNA menggunakan kit transkripase terbalik (TransGen Biotech, Beijing, China). Tindak balas RT-qPCR disediakan menggunakan PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) dan dikesan oleh sistem ABI 7500 (Digunakan
Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Parameter berbasikal untuk PCR ditetapkan seperti berikut: 95 ◦C selama 5 minit, diikuti dengan 40 kitaran 95 ◦C selama 15 s, dan 60 ◦C selama 30 saat. Primer khusus yang digunakan ditunjukkan dalam Jadual 1, dan kuantiti setiap gen sasaran telah dinormalisasi kepada GAPDH (kawalan dalaman).
2.10. Analisis Western blot
BMM ({{0}} sel/telaga) telah disemai dalam 6-plat perigi. Untuk percubaan kursus masa yang singkat, sel telah diinkubasi terlebih dahulu dengan kepekatan CDP yang berbeza (0, 5 dan 10 µg/mL) selama 1 jam, dan kemudian dirawat dengan RANKL 50 ng/mL selama 30 minit . Untuk kursus yang lama, sel-sel telah dirangsang dengan 50 ng/mL RANKL pada hari 3, 5, dan 7 dengan kehadiran CDP (0, 5, dan 10 μg/mL). Jumlah protein diekstrak menggunakan penimbal lisis RIPA (CWBIO). Protein dipisahkan oleh 10 peratus SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF. Membran disekat dengan susu skim 5 peratus pada suhu bilik selama 2 jam, diinkubasi dengan primer
antibodi semalaman pada 4 ◦C, dan kemudian dengan sekunder yang sepadan
antibodi selama 1.5 jam. Membran telah dibangunkan menggunakan reagen ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), dan imej diambil menggunakan Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, China).
Cistancheboleh meningkatkan ketumpatan tulang
2.11. Pengesanan translokasi NFATc1 menggunakan ujian imunofluoresensi
BMM telah disemai pada {{0}}liputan telaga, dirangsang dengan RANKL dan M-CSF, dan dirawat dengan 10 µg/mL CDP selama 5 hari. Sel-sel telah dibetulkan dengan 4 peratus paraformaldehid selama 15 minit, dicuci tiga kali dengan PBS dan dipermudahkan dengan 0.1 peratus Triton X-100 selama 10 minit. Sel-sel tersebut dicampur dengan 10 peratus serum kambing (CWBIO) dan diinkubasi selama 2 jam. Selepas itu, sel-sel telah diinkubasi dengan antibodi utama semalaman pada suhu 4 ◦C dan kemudian dengan antibodi sekunder anti-tikus kambing Alexa Fluor 488 (Abcam, Cambridge, MA, Amerika Syarikat) dalam gelap selama 1 jam. Slip penutup telah dibasuh dengan PBS, dipasang dalam Prolong Gold Antifade Reagent dengan 4′, 6-diamidino-2-phenyl in-dole (DAPI) (Solar), dan
diperiksa menggunakan Zeiss LSM 800 dengan mikroskop confocal Airyscan (Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman).
2.12. Analisis statistik
Semua data percubaan telah dianalisis menggunakan perisian statistik SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Data untuk kajian haiwan dan sel dinyatakan sebagai min ± SEM dan min ± SD, masing-masing. Keputusan menggunakan analisis varians sehala atau ujian-t Pelajar. Nilai p < 0.05="" dianggap="" signifikan="" secara="">
Cistancheboleh mengurangkanapoptosisdan meningkatkan tulangketumpatan
