Bahagian 1: Echinacoside Melindungi Terhadap MPP plus -Apoptosis Neuronal Terinduksi Melalui Peraturan Laluan ROS/ATF3/CHOP

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com

Sila klik di sini untuk Bahagian 2

spesies (ROS) juga menyumbang kepada perkembangannya [3]. Ciri-ciri yang serupa dengan PD boleh disebabkan oleh beberapa toksin persekitaran, termasuk 1-metil-4-fenil- 1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), sianida, karbon disulfida, dan toluena. MPTP digunakan secara meluas untuk mendorong model haiwan PD, dan metabolit aktifnya, 1-metil-4- ion phenylpyridinium (MPP?), digunakan dalam model sel PD [4, 5]. MPP? secara selektif menghalang rantaian pengangkutan elektron dan menghasilkan pengeluaran ROS yang berlebihan, dengan itu mendorong kematian neuron dan sindrom yang menyerupai PD [6]. Kajian terkini menunjukkan bahawa MPP? mendorong berbilang laluan dalam model PD in vitro, termasuk peningkatan fosforilasi GSK3B (pY206) dan pengumpulan a-synuclein [5], regulasi heme oxygenase-1/ni-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase/paksi ROS [7, 8], peningkatan ekspresi faktor transkripsi aktif 3 (ATF3), dan penangkapan pertumbuhan melalui kerosakan DNA-inducible 153 (GADD153)/C/EBP-homologous protein (CHOP) [9]. Dalam rawatan klinikal, penindasan produk ROS adalah salah satu strategi terpenting untuk kemandirian neuron dan rawatan PD [1].

Echinacoside(ECH, Rajah 1A), semula jadiphenylethanoidterdapat dalam banyak tumbuhan ubatan, merupakan juzuk utamaphenylethanoidglikosidadiasingkan daripada herba tradisional Cina,Cistanchesalsa [10]. Menariknya, kajian terbaru telah menunjukkan bahawaECHmempunyai kesan perlindungan dalam model tetikus PD yang disebabkan oleh MPTP [10, 11].ECHjuga melemahkan apoptosis sel neuroblastoma yang disebabkan oleh faktor nekrosis tumor-a atau 6-hydroxydopamine in vitro [12, 13]. Walau bagaimanapun, mekanisme yangECHmenggalakkan kemandirian neuron dalam model sel PD yang disebabkan oleh MPP masih tidak jelas.

Kami menunjukkan ituECHmengurangkan dengan ketara produk ROS yang disebabkan oleh MPP? dalam sel SH-SY5Y.ECHturut menghalang ekspresi ATF3, CHOP, dan a-synuclein yang disebabkan oleh MPP, serta menyekat pengaktifan protein pro-apoptosis caspase-3 dan poli (ADP-ribose) polimerase (PARP).

Cistancheechinacosidemempunyaineuroprotektifkesan

Bahan dan Kaedah

Reagen

Medium penting minimum Dulbecco (DMEM), serum lembu janin, 0.25 peratus trypsin, 1 peratus penisilin/streptomisin dan reagen TRIzol adalah daripada Life Technologies (Grand Island, NY). Pewarna kromatin bisbenzimide (Hoechst 33342), poli-L-lisin, MPP? iodida dan MPTP adalah dari Sigma (St. Louis, MO). Kit ujian malondialdehid peroksidasi lipid (MDA) dan dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) adalah dari Beyotime Biotech (Haimen, China). ECH ketulenan C98 peratus adalah daripada Bioteknologi Push (Chengdu, China).

Haiwan dan Rawatan

Penyelenggaraan dan rawatan haiwan adalah seperti yang diterangkan sebelum ini [14]. Kami menggunakan tikus C57BL/6 jantan (Shanghai Laboratory Animal Co., Shanghai, China) dengan berat 24–26 g pada usia 10 minggu. Haiwan itu dikekalkan dalam keadaan standard (cahaya 12:12 jam: kitaran gelap, 21 ± 2C, dan kelembapan relatif 40 peratus ) dan membenarkan akses kepada makanan dan air secara ad libitum. Semua prosedur telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Hospital Zhongshan, Universiti Fudan, dan dijalankan mengikut Panduan Institut Kesihatan Nasional untuk Penjagaan dan Penggunaan

Haiwan Makmal.

Tikus dibahagikan secara rawak kepada empat kumpulan (10 tikus/kumpulan): kumpulan A, kumpulan kawalan kenderaan, diberi isipadu yang sama (500 lL) garam biasa (NS); kumpulan B, kumpulan kawalan ECH, diberi 20 mg/kg ECH; kumpulan C, kumpulan model MPTP, pra-rawatan dengan jumlah NS yang sama; dan kumpulan D, kumpulan yang dirawat ECH, pra-rawatan dengan 20 mg/kgECH. ECHtelah dibubarkan dalam NS dan dihantar melalui pentadbiran intra-gastrik setiap 24 jam selama 15 hari berturut-turut. Model PD tetikus untuk kumpulan C dan D dihasilkan oleh lima suntikan intraperitoneal berturut-turut sebanyak 30 mg/kg MPTP setiap 24 jam dari hari ke-11 hingga hari ke-15. Tikus telah dibunuh oleh dislokasi serviks atau perfusi yang di narkotik oleh 10 peratus kloralhidrat (3.6 mg/ kg) secara intraperitoneal 24 jam selepas rawatan akhir.

Perfusi dan pemprosesan tisu adalah seperti yang diterangkan sebelum ini [14]. Selepas perfusi intracardiac, sampel otak dikumpul dan diikat dalam 4 peratus paraformaldehid selama 24 jam pada suhu 4C, tertanam dalam parafin, dan bahagian koronal yang merangkumi keseluruhan SNc (koordinat stereotaksik anteroposterior -3.64 hingga -2.92 mm berbanding bregma) dipotong pada 5 lm.

5 ekor lagi haiwan daripada setiap kumpulan telah dibunuh oleh kehelan serviks dan otak tengah ventral dilisiskan dengan cepat dalam 1 peratus penimbal lisis SDS pada ais. Tahap protein CHOP dan ATF3 dalam lysate dianalisis oleh western blotting.

Cistancheechinacosidemempunyai kesan menyegarkanbuah pinggang

Budaya Otak Tengah Ventral Tikus (VM)

Neuron Dopaminergik

Tikus Wistar hamil telah dibeli dari Shanghai Laboratory Animal Co., (Shanghai, China). Neuron DA dalam VM telah diasingkan pada hari embrio 14. VM telah dibedah dan diproses untuk mewujudkan kultur neuron VM DA utama seperti yang diterangkan sebelum ini [15, 16]. Secara ringkasnya, kepingan tisu dikumpulkan dalam larutan garam seimbang Hanks (HBSS) sejuk ais dan diempar pada 1000 rpm pada 4C selama 5 minit. Pelet tisu diinkubasi dalam 750 lL 0.1 peratus trypsin–HBSS selama 15 minit pada suhu 37C dengan 5 peratus CO2. Serum anak lembu janin (FCS; 750 lL) digunakan untuk menyahaktifkan trypsin dan tisu telah dipisahkan dengan triturasi lembut

menggunakan pipet Pasteur yang telah disterilkan. Suspensi sel telah disentrifugasi pada 1000 rpm selama 4 minit pada suhu 4C dan digantung semula dalam medium pembezaan (medium Eagle's ubah suai Dulbecco/F12, 33 mmol/L D-glukosa, 1 peratus L-glutamin, dan 1 peratus FCS, ditambah dengan 2 peratus B27). Sel telah disemai pada plat kultur tisu telaga 24-bersalut poli-D-lisin (Sigma) pada 5 9 104 sel/telaga dalam medium pembezaan 500 lL pada 37C dengan 5 peratus CO2 selama 10 hari untuk berkembang menjadi

neuron DA matang. Neuron VM DA dicirikan oleh imunofluoresensi dengan antibodi anti-b-tubulin isotype III dan antibodi tyrosine hydroxylase (TH) (Rajah S1). Sel telah dirawat dengan 1 mmol/L MPP?, 40 LG/mL ECH, gabungan MPP? dan ECH, atau PBS sahaja sebagai kawalan. Daya maju sel dianalisis dengan reagen CCK-8 selepas 96 jam rawatan.

dan dibentangkan sebagai min ± SD (n {{0}}; **P \0.01 lwn kawalan, #P \ 0.05, ##P \0.01 lwn MPP ? rawatan). C Imej mikroskopik cahaya perubahan morfologi yang disebabkan oleh MPP? atau MPP? dan ECH. a, kawalan PBS; b, 40 lg/mL ECH; c, 1 mmol/L MPP?; d, 1 mmol/L MPP? dan 10 lg/mL ECH; e, 1 mmol/L MPP? dan 20 lg/mL ECH; f, 1 mmol/L MPP? dan 40 lg/mL ECH (bar skala, 200 lm).

Cistanche echinacoside mempunyai kesan menghalang apoptosis

Kultur Sel SH-SY5Y

Sel SH-SY5Y adalah dari Bank Sel Institut Biologi Sel Shanghai (Akademi Sains Cina, Shanghai, China) dan dikultur dalam DMEM ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin, 100 U/mL penisilin, dan 100 U/mL streptomycins. Sel telah dikekalkan dalam inkubator 37C yang dilembapkan yang dibekalkan dengan 5 peratus CO2. MPP? telah dilarutkan dalam air steril dan digunakan serta-merta. ECH telah dibubarkan dalam PBS. Untuk meneroka ekspresi gen dan tahap protein yang berkaitan dengan ROS, sel telah disemai ke dalam 6-plat perigi dan dikultur selama 24 jam. Sel-sel kemudian diberi makan dengan medium segar yang mengandungi MPP?, ECH, gabungan MPP? dan ECH, atau PBS sahaja sebagai kawalan. Selepas 24 jam rawatan, sel-sel telah dilisiskan dengan penimbal lisis SDS 1 peratus (1 peratus SDS, 25 mmol/L EDTA, 45 mmol/L Tris–HCl, pH 6.5) untuk analisis western blot, dan jumlah RNA diasingkan terus dengan Reagen TRIzol.

Untuk menganalisis taburan ATF3 dan CHOP selepas rawatan, kit reagen pengekstrakan nuklear dan sitoplasma (Thermo Fisher, Waltham, MA) digunakan untuk mengekstrak pecahan sitoplasma dan nuklear daripada sel yang dirawat dan kawalan dadah.

Ujian Daya Tahan Sel

Sel SH-SY5Y telah disemai ke dalam 96-plat perigi dan diinkubasi semalaman. Sel-sel diberi makan setiap 24 jam dengan medium lengkap segar yang mengandungi ubat-ubatan yang berbeza dan dikekalkan selama 3 hari. Kemudian daya maju dinilai menggunakan kit kaunter sel CCK8 (Dojindo, Jepun). Data telah dinormalisasi kepada keputusan daripada kawalan PBS dan dibentangkan sebagai min ± SD. Untuk menganalisis daya maju dalam ATF3-knockdown SH-SY5Y (ATF3 shRNA) dan sel kawalan (GFP shRNA), sel telah ditambahkan pada 96-plat telaga dan dikultur selama 14–16 jam. Plasmid shRNA ATF3 atau GFP shRNA telah dipindahkan ke dalam sel SH-SY5Y menggunakan Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Sel-sel telah dirawat dengan 1 mmol/L MPP? atau jumlah PBS yang sama selepas 24 jam pemindahan dan kemudian diinkubasi selama 3 hari. Nombor sel dikira setiap hari. Data dibentangkan sebagai min ± SD.

Konstruk shRNA dan Primer Oligo

Binaan pGV298-ATF3 shRNA (ATF3shRNA) dan GFP kawalan shRNA adalah daripada GeneChem Co. (Shanghai, China). Urutan sasaran ATF3 ialah 50-GCAAAGT G!CCGAAACAAGA-30 daripada kaedah yang diterangkan sebelum ini [17, 18]. Untuk mengesan ekspresi gen yang disebabkan oleh MPP?, gen berkaitan tekanan ROS dan PD yang berkaitan telah dipilih untuk qRT-PCR, dan GAPDH digunakan sebagai kawalan. Semua primer telah disintesis oleh Sangon Biotech Co. (Shanghai, China), dan urutan primer disenaraikan dalam Jadual 1.

PCR Masa Nyata

Jumlah RNA diekstrak dengan reagen TRIzol mengikut arahan pengilang. Transkripsi terbalik dan PCR masa nyata kuantitatif (qRT-PCR) telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini. Tindak balas transkripsi terbalik dilakukan menggunakan kit Sintesis cDNA RevertAid First Strand (Thermo Scientific, Waltham, MA) mengikut arahan pengilang. Kit SYB Premix Ex Taq II (TaKaRa, Dalian, China) telah digunakan untuk qRT-PCR: 20-Sistem tindak balas lL telah digunakan dengan ABI (Life Technologies, Carlsbad, CA). Parameter PCR terdiri daripada langkah-langkah berikut: 95C selama 3 minit, 1 kitaran; 95C selama 5 s dan 60C selama 40 s, 40 kitaran. Data akhir ialah no-

bermoral kepada GAPDH dan dibentangkan sebagai nisbah kepada kawalan. Primer yang digunakan untuk amplifikasi disenaraikan dalam Jadual 1.

Western Blotting

Analisis Western blot telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [19]. Antibodi utama ialah anti-cleaved caspase 3 dan p53 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-GAPDH (Proteintech Group, Chicago, IL), anti-GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Shenyang, China), dan anti- ATF3, anti-PARP, anti-PUMA dan antihistone 3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Antibodi sekunder berlabel peroksidase lobak adalah daripada Makmal Penyelidikan Imun Jackson (Western Grove, PA). Membran PVDF adalah dari EMD Millipore (Billerica, MA) dan substrat ECL adalah dari CWWio (Suzhou, China). Tahap protein relatif berdasarkan tahap kelabu daripada imej telah dianalisis dengan perisian Tanon GIS (Tanon Biotech, Shanghai, China), dan data dibentangkan sebagai nisbah protein sasaran kepada GAPDH.

Cistancheechinacosidemempunyai kesan melindungi hati