Bahagian 1: Kesan Anti-Radang, Antioksidan, Pelembap dan Antimelanogenesis Quercetin 3-O- -D-Glucuronide dalam Keratinosit Manusia Dan Sel Melanoma Melalui Pengaktifan Laluan NF-κB Dan AP{-1
Mar 21, 2022
Untuk maklumat lanjut, hubungitina.xiang@wecistanche.com
Abstrak: Quercetin3-O- -D-glukuronida(Q-3-G), konjugat glukuronida kuersetin, telah dilaporkan mempunyaianti-radangsifat dalam makrofaj yang dirangsang lipopolisakarida, serta sifat antikanser dan antioksidan. Tidak seperti quercetin, yang telah diterangkan secara meluas mempunyai pelbagai aktiviti farmakologi termasuk kesan perlindungan kulit, faedah farmakologi dan mekanisme Q-3-G dalam kulit masih perlu dijelaskan. Kajian ini menumpukan pada pencirian sifat perlindungan kulit, termasuk sifat anti-radang dan antioksidan, Q-3-Terhadap tekanan oksidatif yang disebabkan oleh UVB atau H2O2-, kesan penghidratan danantilanogenesisaktiviti menggunakan sel keratinosit manusia (HaCaT) dan melanoma (B16F10). Q-3-G menurunkan kawal selia ekspresi gen dan sitokin pro-radang seperti cyclooxygenase-2 (COX-2) dan tumor necrosis factor(TNF)- dalam HO, atau UVB- sel HaCaT yang disinari. Kami juga menunjukkan bahawa O-3-Geexhibits mempunyai kesan antioksidan menggunakan ujian penghapusan radikal bebas, sitometri aliran dan peningkatan ekspresi faktor nuklear erythroid 2- faktor berkaitan 2 (Nrf2). Q-3-G mengurangkan pengeluaran melanin dalam sel B16F10 yang disebabkan oleh hormon perangsang -melanocyte ( -MSH). Kesan dan mekanisme penghidratan Q-3-G telah diperiksa dengan menilai gen berkaitan faktor pelembap, seperti transglutaminase-1(TGM-1), filaggrin(FLG) dan sintase asid hyaluronik (HAS)-1. Di samping itu, Q-3-G meningkatkan fosforilasi c-Jun, Jun N-terminal kinase (JNK), kinase 4(MKK4) dan TAK1, yang terlibat dalam MAPKs/AP. -1 laluan, dan fosforilasi IkB , IkB kinase(IKK)- , Akt dan Src, yang terlibat dalam laluan NF-kB. Secara keseluruhan, kami telah menunjukkan bahawa Q-3-G mempunyai sifat anti-radang, antioksidan, pelembab dan antilanogenesis dalam keratinosit manusia dan sel melanoma melalui laluan NF-kB dan AP-1.
Kata kunci: quercetin 3-O- -D-glucuronide;Perlindungan UV; melembapkan; antilanogenesis; AP-1; NF-kB
1. Pengenalan
Kulit, organ terbesar badan, menawarkan penghalang yang memainkan peranan utama dalam melindungi tubuh daripada persekitaran luaran dan faktor yang merosakkan seperti sinaran ultraungu, mikrob berjangkit, dan bahan kimia berbahaya. Penghalang ini juga mengawal keseimbangan dan suhu elektrolit badan dan menghalang kehilangan lembapan [1,2]. Kulit manusia terdiri daripada tiga lapisan: epidermis, dermis dengan pelengkap, dan tisu subkutan [3]. Lapisan epidermis memainkan peranan penting dalam mengekalkan suhu badan.
Keratinosit, komponen yang banyak dalam epidermis kulit, berinteraksi rapat dengan yang lain melalui desmosom dan persimpangan ketat yang membolehkan halangan fizikokimia yang berkesan[4]. Walaupun kulit berfungsi sebagai penghalang pelindung, sinaran ultraungu (UV) mempunyai kesan ketara pada kebanyakan sel, termasuk keratinosit, lapisan luar kulit. Sinaran UV boleh menyebabkan penuaan kulit, kerosakan kulit, kedutan dan hiperpigmentasi, yang dianggap sebagai salah satu faktor risiko yang paling sensitif [5]. Cahaya UV terdiri daripada tiga julat panjang gelombang: UVA(320-400 nm), UVB (280-320 nm), dan UVC (200-280 nm). Di samping hidrogen peroksida (H2O2), yang telah diketahui menyumbang kepada tekanan oksidatif, UVB boleh membawa kepada penghasilan spesies oksigen reaktif (ROS) melalui pengaktifan enzim penjana ROS [6]. Pengumpulan ROS yang tidak terkawal dalam sel termasuk keratinosit telah diterangkan menyebabkan pengubahsuaian oksidatif kepada lipid, protein, asid nukleik, dan molekul intrasel lain yang seterusnya membawa kepada pelbagai jenis kerosakan kulit dan proses berkaitan penuaan seperti kematian sel, tekanan oksidatif, dan keradangan [7,8]. Di samping itu, tindak balas tegasan oksidatif diketahui mempengaruhi kerosakan pelbagai komponen selular [9]. Sel-sel kulit yang rosak juga boleh menyebabkan tindak balas keradangan, mengakibatkan kulit rosak secara kronik [10]. Satu jenis kerosakan kulit yang dimediasi oleh UVB atau H2O2-melalui proses biologi ialah ekspresi gen radang seperti siklooksigenase-2 (COX-2) dan sitokin pro-radang [11]. Oleh itu, pembangunan kesan perlindungan kulit yang lebih selamat, lebih teguh dan cekap adalah penting untuk mencegah dan menyekat penyakit yang berkaitan dengan kerosakan kulit yang dimediasi UVB atau H2O2.
Penghidratan kulit juga memainkan peranan penting dalam mengekalkan fungsi normalnya. Khususnya, stratum corneum (SC) mempunyai kesan perlindungan terhadap kehilangan air [12]. Kandungan air stratum korneum mengambil bahagian dalam penyahkuamatan kulit dan pematangan yang betul, manakala air yang tidak mencukupi dalam SC menggalakkan pengumpulan dan disfungsi korneosit [12,13]. Pada peringkat akhir pembezaan keratinosit, membran plasma dan organel selularnya hilang, dan kemudian kemasukan kalsium mendorong transglutaminase (TGM) untuk menghubungkan silang dengan protein lain. Kekurangan atau kehilangan TGM-1 membawa kepada kerosakan silang silang sampul sel. Lamella ichthyosis ialah contoh penyakit yang disebabkan oleh kehilangan TGM-1. Tambahan pula, filaggrin (FLG), matriks keratin yang terbentuk, memainkan peranan dalam pembentukan SC kerana ia bertindak sebagai perancah untuk mengikat protein dan lipid sampul jagung [14] dengan memangkinkan tindak balas silang silang g-glutamyl lysine, ATGM, dan membran. -enzim yang berkaitan, memberikan integriti kepada SC [15]. Selain itu, asid hyaluronik (HA) ialah sejenis faktor kelembapan semula jadi (NMF) yang terlibat dalam pengekalan lembapan dalam kulit dan mempamerkan profil yang berbeza dalam penuaan kulit intrinsik, merupakan agen penyampai ubat, dan merupakan komponen penting matriks ekstraselular. [16,17]. HA memainkan peranan dalam meningkatkan kelembapan kulit dengan mengawal gen synthase asid hyaluronik (HAS); selain itu, asid retinoik (vitamin A) boleh mengawal HA dalam epidermis dengan berkesan [17]. TGM-1, FLG dan HAS-12,3 ialah gen yang dikaitkan dengan pengeluaran NMF [18]. Selain itu, pengaktifan faktor transkripsi seperti protein pengaktif-1(AP-1) dan faktor nuklear (NF)-kB terlibat dalam penghasilan bahan pro-radang yang mengoptimumkan penghalang kulit dan penghidratan kulit melalui laluan AP-1 dan NF-kB[19]. Enzim isyarat huluan dalam laluan AP-1 termasuk kinase protein diaktifkan mitogen (MAPK) seperti kinase terminal N c-Jun (JNK), kinase dikawal isyarat ekstraselular (ERK) dan p38, manakala Src, Akt, IkB -kinase (IKKo/ ), dan KBO(IkBa) tergolong dalam laluan NF-KB [20. Kulit juga menghasilkan melanin dalam lapisan epidermis, terutamanya dalam melanosit—sumber utama melanin—yang menyumbang kepada penentuan warna kulit dan melanogenesis [21]. Penyinaran UVB dan -melanocyte-stimulating hormone (o-MSH) boleh merangsang rembesan melanin, dengan itu mencetuskan melanogenesis [22. Semasa melanogenesis, -MSH mengaktifkan protein kinase A (PKA), faktor transkripsi berkaitan mikroftalmia protein (MITF), dan pengikatan unsur tindak balas cAMP (CREB)[23]. Salah satu fungsi melanin dianggap sebagai pencegahan kerosakan kulit oleh UV, termasuk di bawah sinar matahari. Walau bagaimanapun, pengeluaran melanin yang berlebihan atau ketiadaan kandungan melanin yang disebabkan oleh penuaan, hormon perangsang melanosit, dan pendedahan UV menggalakkan jeragat, melasma, lentigin nyanyuk, dan gangguan hiper/hipopigmentasi lain yang boleh memberi kesan negatif pada penampilan dan kulit. kesihatan [24]. Oleh itu, mengawal melanogenesis juga dikehendaki untuk mengekalkan kedua-dua kesihatan dan penampilan kosmetik tubuh manusia.
Quercetinadalah flavonoid jenis flavonol yang diperuntukkan utama yang terdapat dalam sayur-sayuran, buah-buahan, minuman, dan tumbuhan ubatan [25]. Oleh itu, quercetin telah dikaji secara meluas untuk mempunyai faedah farmakologi termasuk anti-radang, anti-aterosklerotik,antioksidan, antikanser dan sifat perlindungan kulit serta berkaitan dengan melanogenesis [24,26-29]. Walau bagaimanapun, beberapa kerja menggunakan kaedah sensitif dan boleh dipercayai telah menunjukkan bahawa quercetin tidak dikesan dalam plasma [30-33] dan hampir tidak ditemui di otak [34,35]. Quercetin, yang secara amnya hadir sebagai bentuk glikosida, diserap dengan baik dan kebanyakannya terhidrolisis dan dimetabolismekan dalam usus kecil, kolon, hati dan buah pinggang menjadi metabolit terkonjugasi [30,36-38]. Hanya metabolit terkonjugasi seperti glukuronida atau sulfat (masing-masing dimetilasi atau tidak dimetilasi), dan bukannya kuersetin aglikon atau glikosidanya, dikesan dalam darah yang beredar. 3/-methyl-quercetin-3-glucuronide, quercetin-3-glucuronide dan quercetin-3'-sulfate telah dikenal pasti sebagai metabolit plasma utama selepas 1.5 jam daripada pengambilan bawang goreng[30, 32]. Metabolit quercetin ini terbentuk dalam usus kecil dan hati oleh enzim biotransformasi termasuk UDP-glucuronyltransferases hasil daripada metabolisme fasa II [29,39,40]. Dilaporkan juga bahawa metabolit terkonjugasi kuersetin terkumpul dalam plasma manusia dalam julat kepekatan 10-'hingga 10- darjah M selepas pengambilan bawang secara berkala dengan makanan selama 1 minggu[41]. Separuh hayat metabolit quercetin agak tinggi, kira-kira 11 hingga 28 jam [29]. Memandangkan sebatian ini telah diperhatikan sebagai bentuk utama metabolit quercetin terkonjugasi, kajian yang memfokuskan pada aktiviti biologi flavonol menggunakan metabolit terkonjugasi ini adalah penting, yang mendorong kami untuk mengkaji aktiviti biologi salah satu metabolit quercetin terkonjugasi. Salah satu metabolit glukuronida yang paling banyak ditemui terutamanya dalam plasma dan tisu termasuk hati, buah pinggang dan otak ialah quercetin 3-O- -D-glucuronide(Q-3-G)(Rajah 1) [31,35,40,42,43], yang mungkin menghasilkan aktiviti yang serupa, lebih kuat atau lebih lemah berbanding dengan sebatian induk dalam model yang berbeza. Q-3-G diangkut ke tisu sasaran melalui plasma untuk menjalankan aktiviti biologinya [39]. O-3-G juga telah ditunjukkan sebagai metabolit yang berkesan dalam plasma tikus selepas pentadbiran lisan quercetin [43]. Dalam kajian lain, Q-3-metabolit yang mengandungi G didapati terkumpul dalam aorta selepas pemberian makanan kaya kuersetin dan telah dikenal pasti sebagai prinsip aktif yang dikesan dalam darah manusia antara 0.{{48} } μM【44】. Selain itu, Q-3-G boleh didapati dalam wain [45] dan dalam tumbuhan ubatan seperti Hypericum hirsutum, Nelumbo nucifera, Oenothera biennis dan kacang hijau [46-49].Q-3-G telah digambarkan sebagai komponen anti-radang di bawah keadaan yang dirangsang LPS dan menunjukkan sifat antioksidan dalam plasma darah [50-52]. Walau bagaimanapun, berbanding dengan sejarah aplikasi yang panjang dan kajian luas quercetin, kajian Q-3-G masih perlu diterokai. Oleh itu, Q-3-G telah dipilih sebagai wakil metabolit quercetin sebagai pemain quercetin dalam vivo yang aktif. Selain itu, peranan Q-3-G pada kesan perlindungan kulit juga belum dijelaskan sepenuhnya. Dalam kajian ini, menggunakan pelbagai penilaian in vitro, kami menyiasat kesan perlindungan kulit Q-3-G terhadap tekanan oksidatif dan keradangan yang disebabkan oleh UVBor H2O{2-, penghidratan kulit dalam HaCaT (garisan sel keratinosit manusia) sel, dan aktiviti antilanogenesis dalam sel B16F10 (garisan sel melanoma murine).
2. Keputusan
2.1.Kesan Anti-Radang dan Antioksidan Q-3-G terhadap UVB atau H2O2-Sel HaCaT yang Dirangsang
Tisu kulit boleh rosak oleh sinaran UV. Sinaran UV mengaktifkan beberapa faktor berbahaya, termasuk tekanan oksidatif, kematian sel apoptosis, keradangan, dan penuaan kulit. Untuk menentukan aktiviti pelindung UV Q-3-G, pada mulanya, kami menilai sama ada Q-3-G mempunyai sebarang kesan ke atas daya maju sel keratinosit manusia. Menggunakan ujian 3-(4-5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-243 tetrazolium bromide (MTT), kami menyiasat kesan sitotoksik daripada O-3-G dalam sel HaCa. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2a, tiada gangguan ketara pada daya maju sel pada kepekatan 2.5-20 uM oleh Q-3-G, yang menunjukkan bahawa O-3-G tidak menunjukkan sitotoksisiti sehingga 20 μM dan tidak membahayakan keratinosit, lapisan cetek sel kulit. Seterusnya, kami menilai kesan perlindungan kulit Q-3-G dalam sel HaCaT yang terdedah kepada UVB. Selepas penyinaran UVB pada 30 mJ/cm², Q{18}}G melindungi HaCaTcells dengan ketara daripada kematian sel akibat UVB dalam cara yang bergantung kepada kepekatan (Rajah 2b). Selaras dengan ujian MTT, menggunakan kamera yang disambungkan kepada mikroskop untuk menangkap morfologi sel HaCaT, Q-3-G dilindungi daripada kematian sel akibat sel HaCaT yang disinari UVB sehingga kepekatan 10 μM（Rajah 2c） . Bilangan sel HaCaT di bawah setiap keadaan ialah 482 untuk kumpulan yang tidak dirawat, 91 untuk kumpulan UVB 30 mJ/cm, 276 untuk kumpulan UVB 30 mJ/cm²plus 5μM O-3-G dan 320 untuk kumpulan UVB 30 mJ/cm² tambah 10μM Q-3-Kumpulan G (Rajah 2d). Keputusan ini mengesahkan bahawa Q-3-G menghalang kerosakan HaCaT akibat UVB dan menyelamatkan kesan perlindungan kulit daripada penyinaran UVB.
![i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.](/Content/uploads/2022842169/2022032111072748381b7599e14e8e8a252699414e284f.png "i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.")
Kejadian dan pemburukan keradangan dalam badan kadang-kadang mengaktifkan makrofaj dan melepaskan beberapa sitokin. Keradangan adalah ciri tekanan oksidatif. Kami menyiasat kesan anti-radang Q-3-G terhadap keradangan yang disebabkan oleh UVB atau HO2-. Umum mengetahui bahawa UVB boleh menggalakkan kerosakan DNA dan keradangan dalam sel kulit 【10】. Kami menyinari sel HaCaT dengan UVB 30mJ/cm² dan mengeram sel HaCaT dengan H2O2(500 uM). Kami menggunakan ujian PCR masa nyata untuk memeriksa ekspresi mRNA enzim radang COX-2 dan sitokin pro-radang TNF- . Seperti yang ditunjukkan oleh keputusan dalam Rajah 2e,f, kepekatan 10 μM O-3-G dengan ketara menghalang ekspresi mRNA COX-2 dan TNF- . Akibatnya, Q-3-G menindas tindak balas keradangan yang disebabkan dalam sel HaCaT selepas terdedah kepada penyinaran UVB atau H2O2.
Kami menggunakan 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-asid sulfonic)(ABTS) dan 2,2-diphenyl-lpicrylhydrazyl(DPPH) radical assays—-sistem model yang digunakan secara meluas untuk menyiasat aktiviti penghapusan in vitro sebatian semula jadi—untuk menilai sifat antioksidan Q-3-G pada kepekatan yang berbeza. Sel HaCaT telah dirawat dengan Q-3-G dalam cara yang bergantung kepada kepekatan daripada 2.5-40 μM dengan kehadiran DPPH, dan hasilnya menunjukkan aktiviti penghapusan yang ketara pada lebih daripada 2.5 uM(Rajah 2g) . Ujian ABTS juga menunjukkan dengan ketara kesan Q-3-G pada penghapusan radikal bebas dalam cara bergantung kepekatan dengan nilai IC50 sebanyak 1.75 μM （Rajah 2h）. Asid askorbik （AA）, sebagai kawalan positif, menunjukkan kesan antioksidan terbesar dalam kedua-dua ujian DPPH dan ABTS. Faktor nuklear erythroid 2-faktor berkaitan 2 (Nrf2), salah satu daripada gen yang bergantung kepada unsur tindak balas antioksidan (ARE), telah dilaporkan mengawal selia oksidoreduktase pelindung dan substrat nukleofiliknya, dengan itu menggalakkan enzim antioksidan untuk menghapuskan kerosakan dan pembaikan. sistem [53]. Seterusnya, kami mengkaji tahap ekspresi Nrf2 dalam sel HaCaT yang disinari UVB. Mengukuhkan penemuan di atas, O-3-G meningkatkan tahap ekspresi Nrf2 dengan ketara apabila penyinaran UVB berbanding kawalan dalam cara yang bergantung kepada kepekatan, sehingga 10 uM(Rajah2i), yang membayangkan bahawa Q-3- G memberikan kesan antioksidan secara kimia dan biologi dengan sifat penghapusan radikal bebas dan masing-masing meningkatkan kesan perlindungan isyarat ARE{37}}bergantung kepada Nrf. Tambahan pula, kami juga melakukan sitometri aliran ROS menggunakan dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) dalam keadaan UV. Antioksidan diketahui secara meluas untuk menekan tekanan selular dengan menghalang pengeluaran ROS [54]. Keputusan menunjukkan bahawa rawatan dengan Q-3-G pada kepekatan 5 dan 10 μM mengurangkan tahap ROS akibat UVB（Rajah 2j）. Secara keseluruhannya, data ini menunjukkan bahawa Q-3-Gexertkan sifat pelindung kulit seperti kesan anti-radang dan antioksidan terhadap H2O, atau tekanan oksidatif dan keradangan akibat UVB dalam sel HaCaT.
![A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)](/Content/uploads/2022842169/202203211108455bff4d0223ef483dbe3172e2d3349d71.png "A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)")
2.2.Kesan Antitimelanogenesis dalam B16F10 dan Kesan Pelembapan dalam Sel HaCaT Q-3-G
Untuk mengkaji kesan O-3-G pada melanogenesis, sel melanoma dirawat dengan -MSH selama 48 jam untuk merembeskan melanin dalam sel B16F10. Dengan menggunakan ujian MTT, kami mula-mula mengesahkan bahawa Q-3-G tidak mempunyai sitotoksisiti dalam sel B16F10 pada kepekatan sehingga 20 μM selama 48 jam (Rajah 3a). Keputusan ini menunjukkan, untuk penilaian seterusnya bahawa kesan O-3-G dalam B16F10 bukan disebabkan oleh kematian sel. Seterusnya, kami menilai B16F10 dengan Q-3-Gand -MSH selama 48 jam untuk menentukan kesan Q-3-G pada melanogenesis. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3b, Q-3-G menghalang rembesan melanin dengan ketara. Arbutin kawalan positif juga mengurangkan rembesan melanin dengan ketara.
Molekul yang berkaitan dengan kelembapan kulit ialah asid hyaluronik (HA). Seperti yang dinyatakan sebelum ini, HA, diedarkan ke seluruh epidermis dan dermis, adalah NMF yang meningkatkan penghidratan kulit [55]. Kami menggunakan ujian PCR transkripsi terbalik (RT-PCR) untuk memeriksa tahap transkripsi HAS-1 selepas 12 jam dengan kepekatan Q-3-G sehingga 30 uM. HAS menggalakkan pengumpulan HA bersaiz sederhana dalam keratinosit [12]. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3c, ungkapan HAS-1 ditingkatkan dengan rawatan dengan Q-3-G sehingga 10 μM. Selain faktor pelembap, kami juga memeriksa ekspresi FLG dan TGM{{ 13}}. Kami menggunakan retinol sebagai kumpulan kawalan positif. Tahap transkripsi FLG dan TGM{14}} meningkat dengan ketara selepas rawatan dengan Q-3-G pada kepekatan sehingga 10 μM (Rajah 3d). Penemuan ini menunjukkan bahawa Q-3-G mempunyai aktiviti pelembab kulit dalam sel HaCaT. Selain itu, menggunakan SB203580 (perencat p38), SP600125(perencat JNK), UO126(perencat ERK) dan Bay11-7082 (perencat NF-kB), kami meneliti penglibatan laluan isyarat MAPK dan NF-kB dalam pelembab faktor Q-3-sel HaCaT yang dirawat G. Berdasarkan O-3-ekspresi gen yang disebabkan oleh G, kedua-dua tahap TGM-1 dan FLG telah dikurangkan melalui rawatan dengan SP600125, perencat JNK (Rajah 3e), menunjukkan bahawa JNK diperlukan untuk meningkatkan ekspresi daripada TGM-1 dan FLG dari segi kesan pelembapan kulit O-3-G. Selain itu, ungkapan FLG juga telah dikurangkan oleh Bay11-7082, perencat IKK dan IkB , menunjukkan bahawa mekanisme farmaseutikal Q-3-G juga boleh tergolong dalam laluan isyarat NF-kB.
2.3. Laluan Isyarat Berkaitan Pelembapan Q-3-G melalui Pengaktifan AP-1 dan NF-kB
Berdasarkan keputusan mRNA sebelumnya, kami membuat hipotesis bahawa penglibatan isyarat AP-1 dan NF-kB pada kesan penghidratan Q-3-G juga boleh berlaku dalam tahap protein. Menggunakan ujian Western blot, kami memeriksa fosforilasi molekul huluan AP-1 dan NF-kB. Pertama, dalam laluan AP-1, fosforilasi c-Jun telah meningkat selepas pengeraman sel HaCaT dengan Q-3-G selama 24 jam (Rajah 4a). Tahap p-INK juga meningkat selepas rawatan dengan Q-3-G pada kepekatan 2.5,5 dan 10 μM. Jumlah bentuk JNK kekal tidak berubah (Rajah 4b). Kami selanjutnya mengkaji fosforilasi MKK4 dan TAK-1, yang merupakan pengawal selia huluan JNK. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3c, selepas rawatan sel HaCaT dengan O-3-G, paras protein p-MKK4 dan p-TAK1 juga dikawal selia.
Selain isyarat NF-kB, Q-3-G meningkatkan fosforilasi p50 dan p65, subunit NF-kB(Rajah 4c). Selain itu, kami menilai pengaktifan IKK dan IkBa, yang juga dinaikkan oleh Q-3-G sehingga 10 uM berbanding kumpulan kawalan (Rajah 4d). Akhirnya, kami menentukan pengaktifan molekul huluan yang terlibat dalam laluan isyarat NF-kB. Fosforilasi Src dan Akt (Ser473) telah dipertingkatkan dengan rawatan O-3-G(Rajah 4e). Secara keseluruhannya, data ini menunjukkan bahawa kesan perlindungan kulit Q-3-G menyasarkan pengaktifan TAK1 dan Src dengan meningkatkan tahap protein, sekali gus meningkatkan aktiviti AP-1 dan NF-kB, masing-masing.
2.4.Kesan Q-3-G pada Pengaktifan Transkrip AP-1 dan NF-kB
Kami menyiasat sitotoksisiti sel Q-3-G dalam sel sel HEK293T embrionik manusia melalui ujian MTT (Rajah 4f). Daya maju sel HEK293T tidak terjejas dengan ketara selepas rawatan dengan Q-3-G（2.5-20 μM） berbanding dengan sel yang tidak dirawat.
Kami menggunakan ujian luciferase untuk menentukan sama ada Q-3-G boleh memodulasi ujian promoter NF-kB dan AP-1. Kami mengesahkan bahawa O-3-G meningkatkan aktiviti luciferase pengantara AP-1-(Rajah 4g) dan aktiviti luciferase pengantaraan NF-kB (Rajah 4h) dalam cara yang bergantung kepada kepekatan. Keputusan ini mengesahkan bahawa pengaktifan AP-1 dan pengaktifan NF-KB ialah sasaran farmakologi penting Q-3-G.
Klik pautan untuk mendapatkan maklumat lanjut:https://www.xjcistanche.com/news/part-2-anti-inflammatory-antioxidant-moistu-55118278.html
