Paricalcitol Memperbaiki Kecederaan Akibat Hipoksia Dan TGF- 1-Dalam Pericytes Buah Pinggang

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Jeong-Hoon Lim , Ju-min York, Se-Hyun Oh, Soo-Jee Jeon, Hee-Won Noh, Hee-Yeon Jung, Ji-Young Choi, Jang-Hee Cho, Chan-Duck Kim, Yong-Lim Kim, dan Taman Sun-Hee *

Jabatan Perubatan Dalaman, Pusat Pengajian Perubatan, Universiti Kebangsaan Kyungpook, Hospital Universiti Kebangsaan Kyungpook, Daegu 41944, Korea; jh-lim@knu.ac.kr (J.-HL); jumin18@naver.com (J.-MY);

ttily@nate.com (S.-HO); hot716@naver.com (S.-JJ); hwn1104@gmail.com (HWN); hy-jung@knu.ac.kr (H.-YJ); jyss1002@hanmail.net (J.-YC); jh-cho@knu.ac.kr (J.-HC); drcdkim@mail.knu.ac.kr (C.-DK); ylkim@knu.ac.kr (Y.-LK)

* Surat-menyurat: sh-park@knu.ac.kr; Tel.: tambah 82-53-200-5547; Faks: tambah 82-53-426-9464

Abstrak: Baru-baru ini, peranan pericytes buah pinggang dalam fibrosis buah pinggang telah disiasat. Kajian ini bertujuan untuk menilai kesan paricalcitol ke atas kecederaan akibat hipoksia dan{1}}TGF dalam perisit buah pinggang. Pericytes kultur utama telah dirawat terlebih dahulu dengan paricalcitol (20 ng/mL) selama 90 minit sebelum menyebabkan kecederaan, dan kemudian mereka terdedah kepada TGF- 1(5 ng/mL) atau hipoksia(1 peratus O2 dan 5 peratus CO2) .TGF- 1 meningkat -SMA dan penanda fibrosis lain tetapi mengurangkan ekspresi PDGFR dalam pericytes, manakala paricalcitol membalikkan perubahan. Paricalcitol menghalang TGF{12}}penghijrahan sel pericytes. Hipoksia meningkatkan TGF- 1, -SMA, dan penanda fibrosis lain tetapi mengurangkan ekspresi PDGFR dalam pericyte, manakala paricalcitol membalikkannya. Hipoksia mengaktifkan HF-1o dan molekul hiliran termasuk prolyl hydroxylase 3 dan pengangkut glukosa-1, manakala paricalcitol melemahkan pengaktifan HIF-1 -molekul bergantung dan TGF- 1/Smad laluan isyarat dalam pericytes hipoksik. Pendiaman gen HIF-1a menghilangkan TGF yang disebabkan oleh hipoksia- 1, -SMA upregulation dan PDGFR downregulation. Kesan paricalcitol pada perubahan HIF-1 -bergantung pada penanda fibrosis tidak ketara selepas pembungkaman gen HIF-1 . Di samping itu, hipoksia memburukkan lagi tekanan oksidatif dalam pericytes, manakala paricalcitol membalikkan tegasan oksidatif dengan meningkatkan enzim antioksidan secara HIF-1 -yang bebas. Kesimpulannya, paricalcitol memperbaik perubahan fenotip pericyte kepada myofibroblast dalam pericyte yang dirangsang- 1-TGF. Selain itu, paricalcitol memperbaik ekspresi penanda fibrosis dalam pericytes yang terdedah kepada hipoksia kedua-duanya dalam cara yang bergantung kepada HIF-1 -dan bebas.

Kata kunci: hipoksia; paricalcitol; pericyte; peralihan pericyte-to-myofibroblast; TGF- 1; agonis vitamin D

Pengalaman cistanche sangat baik untuk fungsi buah pinggang

1. Pengenalan

Fibrosis interstisial buah pinggangialah akibat patologi biasa daripada pelbagai jenis kecederaan buah pinggang, dan faktor pertumbuhan berubah(TGF)- 1 ialah penyumbang utama untuk mendorong fibrosis buah pinggang. Hipoksia juga diketahui dikaitkan dengan kehilangan fungsi buah pinggang yang progresif sambil menjejaskan pelbagai populasi sel dalam buah pinggang. Pelbagai faktor humoral daripada sel epitelium tiub yang rosak dan sel radang yang menyusup mencetuskan transformasi sel pemastautin interstisial seperti pericytes kepada myofibroblas. Teknik pengesanan keturunan genetik telah menunjukkan bahawa pericytes adalah asal-usul myofibroblast dalam fibrosis buah pinggang [1]. Fibrosis tubulointerstitial progresif menyebabkan hipoksia buah pinggang, yang memburukkan fibrosis, dengan itu membentuk kitaran ganas [2]. Sel yang terdedah kepada hipoksia mengimbangi faktor penyebab hipoksia (HIF)-1a, yang merupakan faktor transkripsi utama yang diperlukan untuk menyesuaikan diri dengan keadaan hipoksia dengan mengawal selia homeostasis oksigen dan metabolisme sel. HIF-1 diketahui memainkan peranan yang berbeza dalam pelbagai sel buah pinggang [3]. HIF-1 dikaitkan dengan perkembangan penyakit buah pinggang kronik (CKD) dan fibrosis buah pinggang dengan mengaktifkan laluan bergantung- 1-TGF dan mengantara peralihan epitelium-ke-mesenkim [4].

Pericytes, yang merupakan sel mesenchymal bercabang mengelilingi sel endothelial dalam katil kapilari dan venula postcapillary, mempunyai fungsi hemostatik semasa proses angiogenesis dan terlibat dalam peraturan nada vasomotor. Selain itu, pericytes mempunyai peranan penting dalam proses permulaan dan perkembangan penyakit vaskular atau fibrogenik. Bukti terkumpul telah mendedahkan fungsi pericytes buah pinggang, seperti mengawal aliran darah buah pinggang, kestabilan saluran mikro, dan kelangsungan hidup endothelial serta mempunyai peranan penting dalam kecederaan buah pinggang (cth, kecederaan buah pinggang akut [AKI] dan CKD) [2,5, 6].

Kajian terdahulu yang menunjukkan bahawa rangsangan inflamasi mendorong ekspresi CYP2R1 (vitamin D 25-hidroksilase) dan reseptor vitamin D (VDR) dalam pericyte otak [7] membawa kita kepada hipotesis bahawa pengaktif VDR mungkin dikaitkan dengan pengurangan kecederaan pericyte di buah pinggang.

Oleh itu, matlamat kajian ini adalah untuk menilai kesan paricalcitol pada kecederaan akibat hipoksia dan TGF- 1-dalampericytes buah pinggang.

2. Keputusan

2.1. Kesan Perlindungan Paricalcitol pada TGF- 1-Peralihan Pericyte–ke-Myofibroblast Terinduksi

Rangsangan TGF{{0}} meningkatkan ekspresi mRNA bagi penanda profibrotik seperti aktin otot licin alfa (-SMA), fibronektin, vimentin dan matriks metalloproteinase-9 (MMP-9) dalam cara yang bergantung kepada dos (Tambahan Rajah S1). Untuk menilai kesan paricalcitol pada fibrosis yang disebabkan TGF- 1-dalam pericytes, pendedahan TGF- 1 dilakukan selepas prarawatan paricalcitol. Penanda mesenchymal diukur menggunakan PCR masa nyata; ekspresi mRNA -SMA, fibronektin dan vimentin telah meningkat dengan ketara selepas rangsangan TGF- 1 (semua p < 0.{{20}}5)="" (rajah="" 1a–c).="" rawatan="" bersama="" paricalcitol="" melemahkan="" regulasi="" penanda="" mesenchymal,="" seperti="" -sma,="" fibronektin,="" dan="" ungkapan="" vimentin="" (semua="" p="">< 0.05).="" ekspresi="" mrna="" mmp-9,="" yang="" terlibat="" dalam="" degradasi="" matriks="" ekstraselular="" (ecm),="" juga="" telah="" meningkat,="" manakala="" rawatan="" bersama="" paricalcitol="" mengecilkan="" ekspresi="" mmp-9="" (p="">< 0.05)="" (rajah="" 1d="" ).="" sebagai="" penanda="" pericyte,="" paras="" mrna="" reseptor="" faktor="" pertumbuhan="" yang="" diperolehi="" platelet="" beta="" (pdgfr="" )="" telah="" dikurangkan="" selepas="" rangsangan="" tgf-="" 1="" dan="" paricalcitol="" meningkatkan="" ekspresi="" pdgfr="" berbanding="" dengan="" kumpulan="" kawalan="" dan="" tgf-="" 1-yang="" terdedah="" (kedua-duanya="" p="">< 0.05)="" (rajah="" 1e).="" ekspresi="" protein="" -sma="" telah="" meningkat="" dan="" pdgfr="" dikurangkan="" selepas="" rangsangan="" tgf-="" 1="" (kedua-dua="" p="">< 0.05)="" (rajah="" 1f,1g),="" manakala="" rawatan="" bersama="" paricalcitol="" membalikkan="" perubahan="" paras="" protein="" -sma="" dan="" pdgfr="" (kedua-dua="" p="">< 0.05).="" keputusan="" ini="" mencadangkan="" bahawa="" pendedahan="" tgf{38}}="" menyebabkan="" peralihan="" pericyte-to-myofibroblast="" (pmt)="" dan="" rawatan="">

meningkatkan PMT.

2.2. Paricalcitol Attenuated Smad2 Phosphorylation in TGF- 1-Induced Fibrosis in Pericytes

Kami menyiasat mekanisme kesan rawatan paricalcitol pada laluan bergantung kepada Smad dalam TGF- 1-PMT yang disebabkan. Ekspresi protein laluan Smad2 dan Smad3 diukur melalui analisis blot barat (Rajah 2). Tahap p-Smad2 dan nisbah p-Smad2 kepada Smad2 telah meningkat dengan ketara selepas pendedahan TGF{{10}}, dan peningkatan tersebut telah dikurangkan selepas rawatan bersama par1icalcitol (Rajah 2B). Tahap p-Smad3 dan nisbah p-Smad3 kepada Smad3 juga telah meningkat selepas pendedahan TGF- 1 (kedua-dua p < 0.05),="" tetapi="" rawatan="" bersama="" paricalcitol="" tidak="" mengubah="" tahap="" p="" -smad3="" dan="" nisbah="" p-smad3="" kepada="" smad3="" (kedua-dua="" p=""> 0.05) (Rajah 2C).

2.3. Paricalcitol Mengurangkan TGF- 1-Penghijrahan Terdorong Pericytes

Untuk menentukan sama ada TGF- 1 mendorong penghijrahan pericyte dan menilai peranan paricalcitol dalam penghijrahan, kami memeriksa penghijrahan pericyte selepas rangsangan TGF- 1 dengan atau tanpa rawatan bersama paricalcitol. TGF- 1 mempercepatkan penutupan luka dengan ketara berbanding pericytes kawalan dalam ujian migrasi sel calar, manakala rawatan bersama TGF- 1 dan paricalcitol melambatkan penutupan luka calar pericytes (Rajah 3A–C).

Rajah 1. Kesan paricalcitol pada TGF- 1-induced fibrosis. (A–C) TGF- 1 meningkatkan ekspresi mRNA bagi penanda mesenchymal profibrotik, -SMA, fibronektin, dan vimentin, dan paricalcitol mengurangkan penanda fibrotik dalam pericytes. (D) Ekspresi mRNA -9 MMP telah ditingkatkan selepas rangsangan TGF- 1 dan paricalcitol melemahkan ekspresi MMP-9. (E) Ekspresi mRNA (penanda pericyte) PDGFR telah dikurangkan selepas rawatan TGF- 1, dan paricalcitol meningkatkan ekspresi PDGFR. (F,G) Ekspresi protein -SMA dikurangkan dan PDGFR dinaikkan selepas rangsangan TGF- 1. Rawatan bersama Paricalcitol membalikkan perubahan tahap protein -SMA dan PDGFR. Data dibentangkan sebagai cara o ralat piawai. n=4 bagi setiap kumpulan. * p < 0.05="" lwn.="" kawalan;="" **="" p="">< 0.01="" lwn.="" kawalan;="" ***="" p="">< 0.001="" lwn.="" kawalan;="" #="" p="">< 0.05="" lwn.="" tgf-="" 1="" kumpulan="" rawatan;="" ##="" p="">< 0.01="" lwn.="" tgf-="" 1="" kumpulan="" rawatan.="" singkatan:="" -sma,="" aktin="" otot="" licin="" alfa;="" mmp-9,="" matriks="" metalloproteinase-9;="" pdgfr="" ,="" reseptor="" faktor="" pertumbuhan="" yang="" diperolehi="" platelet="">

Rajah 2. Ungkapan Smad2 dan Smad3 dalam TGF- 1- pericytes terdedah. (A,B) TGF- 1 dengan ketara meningkatkan kedua-dua paras p-Smad2 dan nisbah p-Smad2 kepada Smad2 dalam pericytes, dan ia telah menurun selepas rawatan pariccitol. (A,C) Selain itu, TGF{{10}} secara ketara meningkatkan kedua-dua tahap p-Smad3 dan nisbah p-Smad3 kepada Smad3, dan ia tidak diubah selepas rawatan paricalcitol. Data dibentangkan sebagai cara o ralat piawai. n=4 setiap kumpulan. * p < 0.05="" lwn.="" kawalan;="" **="" p="">< 0.01="" lwn.="" kawalan;="" ***="" p="">< 0.001="" lwn.="" kawalan;#="" p="">< 0.05="" lwn.="" tgf-="" 1="" kumpulan="" rawatan.="">

C, kumpulan kawalan; P, kumpulan rawatan paricalcitol; Kumpulan rawatan T, TGF- 1; T tambah P, TGF- 1 dan kumpulan rawatan bersama paricalcitol.

Rajah 3. Kesan paricalcitol pada TGF- 1-penghijrahan terdorong dalam pericytes dalam ujian migrasi sel calar dan transwell. (A) Mikrograf cahaya monolayers sel tercalar diambil pada 0, 24, dan 48 jam dengan TGF- 1 dan/atau paricalcitol. (B) Penghijrahan sel calar relatif diukur dari semasa ke semasa menggunakan platform pengimejan langsung Incucyte setiap 4 jam hingga 48 jam selepas penghijrahan sel calar. (C) Penghijrahan sel calar relatif pada 48 jam. n=4 setiap kumpulan. (D) Imej mikroskopik mewakili pericytes yang telah berhijrah (diwarnai dengan {{10}}.1 peratus ungu kristal; pembesaran asal, ×100). (E) Penghijrahan relatif ditentukan dengan membandingkan bilangan pericytes yang berhijrah, dan mereka dikira dalam 10 medan yang dipilih secara rawak dalam setiap kumpulan. n=4 setiap kumpulan. Data dibentangkan sebagai cara o ralat piawai. ** p < 0.01="" lwn.="" kawalan;="" ***="" p="">< 0.001="" lwn.="" kawalan;##="" p="">< 0.01="" lwn="" tgf-="" 1="" kumpulan="" rawatan;###="" p="">< 0.001="" lwn="" tgf-="" 1="" kumpulan="">

Tambahan pula, ujian migrasi transwell dilakukan untuk mengesahkan kesan paricalcitol pada penghijrahan pericyte melalui membran. TGF- 1 meningkatkan mobiliti pericyte dengan ketara, manakala rawatan bersama paricalcitol mengurangkan- 1-peningkatan TGF yang disebabkan oleh penghijrahan (Rajah 3D, E). Secara keseluruhannya, rawatan paricalcitol meningkatkan perubahan migrasi pericyte selepas pendedahan TGF- 1.

2.4. Kesan Perlindungan Paricalcitol pada Fibrosis yang Disebabkan Hipoksia dalam Pericytes

Seterusnya, kami menyiasat perubahan penanda berkaitan pericyte dan fibrosis dalam pericytes yang terdedah kepada hipoksia. Kedua-dua ekspresi gen TGF- 1 dan tahap protein meningkat dengan ketara dalam keadaan hipoksik berbanding dengan keadaan normoksik (kedua-dua p < 0.05)="" (rajah="" 4a,g).="" rawatan="" paricalcitol="" dalam="" pericytes="" yang="" terdedah="" kepada="" hipoksia="" membalikkan="" kedua-dua="" tahap="" gen="" dan="" protein="" tgf-="" 1="" yang="" terkawal="" berbanding="" tanpa="" rawatan="" paricalcitol="" (kedua-duanya="" p="">< 0.05).="" penanda="" mesenchymal,="" seperti="" -sma,="" fibronektin="" dan="" vimentin,="" dan="" mmp{12}}="" menunjukkan="" peningkatan="" ekspresi="" mrna="" dalam="" pericytes="" hipoksik="" (semua="" p="">< 0.05),="" manakala="" rawatan="" paricalcitol="" diterbalikkan="" ekspresi="" mrna="" -sma,="" fibronektin,="" vimentin,="" dan="" mmp{16}}="" yang="" dikawal="" (semua="" p=""><0.05) (rajah="" 4b–e).="" rawatan="" paricalcitol="" juga="" membalikkan="" ekspresi="" protein="" -sma="" dalam="" pericytes="" hipoksik="" (p=""><0.05) (rajah="" 4h).="" ekspresi="" mrna="" dan="" protein="" pdgfr="" telah="" menurun="" dalam="" pericytes="" yang="" terdedah="" kepada="" hipoksia,="" dan="" paricalcitol="" membalikkan="" ekspresi="" mrna="" dan="" protein="" pdgfr="" berbanding="" kedua-dua="" kawalan="" dan="" pericytes="" hipoksik="" (semua="" p=""><0.05) (rajah="" 4f,="" i).="" keputusan="" ini="" menunjukkan="" bahawa="" hipoksia="" mendorong="" pmt,="" yang="" dikaitkan="" dengan="" peningkatan="" tgf-="" 1,="" manakala="" paricalcitol="" mengecilkan="" pmt="" akibat="">

Rajah 4. Kesan paricalcitol pada TGF- 1 dan penanda fibrosis dalam pericytes hipoksik. (A) Hipoksia meningkatkan ekspresi mRNA TGF- 1, manakala rawatan paricitol menurunkan tahap mRNA- 1 TGF. (B-D) Hipoksia meningkatkan ekspresi mRNA penanda mesenchymal profibrotik, -SMA, fibronektin, dan vimentin, manakala paricalcitol mengurangkan penanda fibrotik dalam pericytes. (E) Ungkapan mRNA -9 MMP telah meningkat di bawah keadaan hipoksik dan paricalcitol melemahkan ungkapan MMP-9. (F) Hipoksia menurunkan ekspresi mRNA PDGFR berbanding kawalan normoksik, manakala paricalcitol meningkatkan ekspresi PDGFR berbanding pericyte hipoksik. (G) Hipoksia meningkatkan tahap protein TGF- 1, manakala rawatan paricalcitol menurunkan tahap protein- 1 TGF. (H, I) Rawatan Paricalcitol membalikkan ekspresi protein -SMA dalam pericytes hipoksik. Tahap protein PDGFR telah menurun dalam pericytes yang terdedah kepada hipoksia, dan paricalcitol juga membalikkan ekspresi protein PDGFR. Data dibentangkan sebagai cara o ralat piawai. n=4 setiap kumpulan. * p < 0.05="" vs.="" kawalan="" normoxia;="" ***="" p="">< 0.001="" lwn.="" kawalan="" normoxia;="" #="" p="">< 0.05="" berbanding="" kumpulan="" hipoksia;="" ##="" p="">< 0.01="" lwn="" kumpulan="" hipoksia.="" singkatan:="" -sma,="" aktin="" otot="" licin="" alfa;="" mmp-9,="" matriks="" metalloproteinase-9;="" pdgfr="" ,="" reseptor="" faktor="" pertumbuhan="" yang="" diperolehi="" platelet="">

2.5. Paricalcitol Dilemahkan Smad2 Fosforilasi dalam Pericytes Terdedah Hipoksia

Kami mengkaji peraturan laluan isyarat Smad dalam pericytes semasa hipoksia melalui analisis blot barat. Ungkapan p-Smad2 dan nisbah p-Smad2 kepada Smad2 telah dikawal dengan ketara dalam pericytes yang terdedah kepada hipoksia, manakala paricalcitol membalikkan regulasi laluan Smad2 dalam pericytes terdedah hipoksia (kedua-dua p < 0.{{="" 11}}5)="" (rajah="" 5a,="" b).="" walau="" bagaimanapun,="" paricalcitol="" tidak="" mengubah="" laluan="" isyarat="" smad3="" terkawal="" di="" bawah="" keadaan="" hipoksik="" (p=""> 0.05) (Rajah 5A, C).

Rajah 5. Ungkapan Smad2 dan Smad3 dalam pericytes hipoksik. (A,B) Pendedahan kepada hipoksia secara signifikan meningkatkan kedua-dua tahap p-Smad2 dan nisbah p-Smad2 kepada Smad2 dalam pericytes, dan mereka telah menurun selepas rawatan paricalcitol. (A, C) Hipoksia tidak mengubah kedua-dua tahap p-Smad3 dan nisbah p-Smad3 kepada Smad3, dan mereka tidak berkurangan selepas rawatan paricalcitol. Data dibentangkan sebagai cara o ralat piawai. n=4 setiap kumpulan. * p < 0.05="" lwn.="" kawalan;="" #="" p="">< 0.05="" berbanding="" kumpulan="" hipoksia.="" singkatan:="" nc,="" kumpulan="" kawalan="" normoxia;="" n="" tambah="" p,="" kumpulan="" rawatan="" normoxia="" dan="" paricalcitol;h,="" kumpulan="" hipoksia;="" kumpulan="" rawatan="" h="" ditambah="" p,="" hipoksia="" dan="">

2.6. Paricalcitol Attenuated Hypoxia-Induced Pericyte Injury in a HIF-1A-Dependant Cara

Hypoxia-induced upregulation ekspresi gen HIF-1 berbanding pericytes normoxic, dan cotreatment paricalcitol melemahkan ekspresi HIF-1 (p < 0.05)="" (rajah="" 6a).="" ekspresi="" gen="" yang="" bergantung="" kepada="" hif-1="" -,="" seperti="" prolyl="" hydroxylase="" 3="" (phd3)="" dan="" pengangkut="" glukosa-1="" (glut-1),="" juga="" meningkat="" dalam="" keadaan="" hipoksik="" tetapi="" menurun="" selepas="" rawatan="" bersama="" paricalcitol="" (kedua-dua="" p="">< 0.05)="" (rajah="" 6b,="" c).="" keputusan="" ini="" menunjukkan="" bahawa="" paricalcitol="" mengecilkan="" pengaktifan="" laluan="" bergantung{14}}hif="" semasa="">

Rajah 6. Kesan paricalcitol pada pengaktifan HIF-1 akibat hipoksia dan selepas pembungkaman gen HIF-1 . (A–C) Paricalcitol melemahkan ekspresi gen bergantung HIF-1 dan HIF-1 -(PHD3 dan GLUT-1) ​​yang disebabkan oleh hipoksia. (D) Transfeksi pericytes dengan HIF-1 siRNA (5{{20}} uM, 6 jam) dengan ketara menghalang ekspresi HIF-1 berbanding kumpulan siRNA kawalan dan bukan sasaran . (E–G) Kesan paricalcitol pada TGF- 1, PHD3 dan GLUT-1 telah berkurangan selepas pembungkaman gen HIF-1 . (H, I) Kesan paricalcitol pada -SMA dan PDGFR telah berkurangan selepas pembungkaman gen HIF-1 . Data dibentangkan sebagai cara o ralat piawai. n=4 setiap kumpulan. ** p < 0.01="" lwn.="" kawalan="" normoxia;="" ***="" p="">< 0.{{30}}01="" lwn.="" kawalan="" normoxia;="" #="" p="">< 0.05="" berbanding="" kumpulan="" hipoksia;="" ##="" p="">< 0.01="" lwn="" kumpulan="" hipoksia;="" ###="" p="">< 0.001="" lwn="" kumpulan="" hipoksia;="" dan="" &="" p="">< 0.001="" berbanding="" kumpulan="" sirna="" normoxia="" bukan="" sasaran;="" §="" p="">< 0.05="" berbanding="" kawalan="" hipoksia="" sirna="" bukan="" sasaran;="" †="" p="">< 0.05="" lwn.="" sihif-1="" kumpulan="" hipoksia.="" singkatan:="" hif,="" faktor="" boleh="" didorong="" hipoksia;="" phd3,="" prolyl="" hydroxylase="" 3;="" glut-1,="" pengangkut="" glukosa-1;="" sirna,="" rna="" kecil="" yang="" mengganggu;="" h,="" hipoksia;="" -sma,="" aktin="" otot="" licin="" alfa;="" pdgfr="" ,="" reseptor="" faktor="" pertumbuhan="" yang="" diperolehi="" platelet="">

Untuk menyiasat peranan HIF-1 dalam kecederaan hipoksik dalam pericytes dan tapak aktif paricalcitol, kami menilai kesan pembungkaman gen HIF-1 menggunakan RNA kecil (si) yang mengganggu. Rajah 6D menunjukkan perencatan berkesan HIF-1 oleh HIF-1 siRNA. TGF- 1 tidak meningkat dengan pembungkaman gen HIF-1 dalam pericytes yang terdedah kepada hipoksia, dan rawatan paricalcitol tidak menurunkan paras TGF- 1 dengan ketara selepas pembungkaman gen HIF{{ 9}} (Rajah6G). Di bawah keadaan hipoksik, ekspresi gen yang bergantung kepada HIF-1 -, seperti PHD3 dan GLUT-1, juga tidak meningkat selepas pembungkaman gen HIF-1 . Rawatan paricalcitol mengurangkan lagi ekspresi mRNA PHD3 (Rajah 6E) tetapi tidak mengubah ekspresi mRNA GLUT-1 (Rajah 6F). Ekspresi mRNA -SMA dan PDGFR juga tidak berubah dengan ketara oleh rawatan paricalcitol selepas rawatan dengan HIF{20}} siRNA dalam pericytes hipoksik (Rajah 6H, I).

2.7. Tekanan Oksidatif Akibat Hipoksia yang Dilemahkan Paricalcitol secara HIF-1a-Bebas

Rajah 7menunjukkan kesan paricalcitol ke atas kecederaan tekanan oksidatif dalam perisit yang terdedah kepada hipoksia. Kami mengukur perubahan enzim antioksidan, termasuk superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation peroksidase, dalam perisit hipoksik dengan dan tanpa pembungkaman gen HIF-1 . Dalam pericytes yang terdedah kepada hipoksia, paras enzim antioksidan (SOD1, SOD2, katalase, dan glutation peroxidase) telah menurun, tetapi ia meningkat selepas rawatan paricalcitol (Rajah 7A-D). Selepas pembungkaman gen HIF- 1 dalam pericytes, rawatan paricalcitol mengawal selia ekspresi enzim antioksidan (SOD1, SOD2, katalase dan glutathione peroksidase) di bawah keadaan hipoksik (semua p < 0.05)="" (rajah="" 7e–h).="" tambahan="" pula,="" keputusan="" menunjukkan="" bahawa="" paricalcitol="" juga="" mungkin="" mempunyai="" kesan="" antioksidan="" dalam="" pericytes="" hipoksik,="" dan="" kesan="" ini="" tidak="" bergantung="" kepada="" ekspresi="" hif-1="">

Rajah 7. Kesan paricalcitol pada enzim antioksidan dalam perisit hipoksik dengan atau tanpa pembungkaman gen HIF-1 . (A–D) Enzim antioksidan yang berkaitan dengan tekanan oksidatif (SOD1, SOD2, katalase, dan glutation peroksidase) telah berkurangan dengan ketara dalam pericytes hipoksik, manakala enzim antioksidan telah meningkat selepas rawatan paricalcitol. (E–H) Enzim antioksidan telah meningkat dengan ketara selepas rawatan paricalcitol dalam pericytes hipoksik dengan pembungkaman gen HIF-1 . Data dibentangkan sebagai cara o ralat piawai. n=4 bagi setiap kumpulan. *** p < 0.{{10}}01="" berbanding="" kawalan="" normoxia;="" #="" p="">< 0.05="" berbanding="" kumpulan="" hipoksia;="" ##="" p="">< 0.01="" lwn="" kumpulan="" hipoksia;="" ###="" p="">< 0.001="" lwn="" kumpulan="" hipoksia;="" †="" p="">< 0.05="" lwn.="" sihif-1="" kumpulan="" hipoksia;="" ††="" p="">< 0.01="" lwn.="" sihif-1="" kumpulan="" hipoksia.="" singkatan:="" hif,="" faktor="" boleh="" didorong="" hipoksia;="" sod,="" superoksida="" dismutase;="" sirna,="" rna="" kecil="" yang="" mengganggu;="" h,="">

3. Perbincangan

Kajian ini menunjukkan kesan perlindungan paricalcitol terhadap kecederaan akibat hipoksia dan{1}}TGF dalam pericyte. Perbincangan silang boleh diperhatikan antara fibrosis buah pinggang dan hipoksia tisu, dan ia secara sinergistik menggalakkan perkembangan CKD [2]. Kedua-dua rangsangan TGF- 1 dan pendedahan hipoksia mendorong PMT, dan rawatan paricalcitol meningkatkan perubahan fibrotik dalam pericytes yang cedera. Kesan antifibrotik paricalcitol dikaitkan dengan laluan isyarat Smad2 yang bergantung kepada HIF dan regulasi rendahnya. Selain itu, paricalcitol mempunyai kesan antioksidan dalam perisit yang terdedah kepada hipoksia dengan cara bebas HIF-1 -, yang mungkin juga menghalang PMT.

Paricalcitol, 19-nor-1,25-(OH)2-vitamin D2, ialah analog vitamin D aktif dan mengaktifkan VDR secara selektif. Ia digunakan terutamanya untuk merawat hiperparatiroidisme sekunder, dan kesan antifibrotik dan antioksidan tambahannya telah dibuktikan dalam kajian terdahulu [8-10]. Walaupun pengaktif vitamin D yang tidak selektif juga menunjukkan kesan berfaedah yang sama, seperti anti-radang dan imunomodulasi [11,12], mereka cenderung untuk meningkatkan tahap kalsium dan fosfat serum. Paricalcitol adalah agonis VDR terpilih dan mempunyai kesan yang baik terhadap homeostasis kalsium tanpa meningkatkan tahap elektrolit. Ia telah menunjukkan banyak kesan yang baik terhadap penyakit buah pinggang dalam kajian eksperimen, seperti yang mengenai nefropati diabetik, nefropati obstruktif, dan kecederaan buah pinggang iskemia [13-15]. Pericytes terdapat di mana-mana dalam semua tisu vaskular termasuk buah pinggang dan mempunyai fungsi asas pengantara yang berkaitan dengan penstabilan struktur mikrovaskular, kawalan aliran darah, angiogenesis, dan penyembuhan luka [5,6,16-18]. Pericytes senyap diaktifkan dan diubah oleh beberapa faktor, seperti TGF- 1 dan tekanan oksidatif, yang dikawal selia dalam kecederaan buah pinggang atau keadaan hipoksia [2,6,19]. Pericytes yang diaktifkan dipisahkan daripada kapilari peritubular dan ditukar kepada myofibroblast dan seterusnya menyebabkan fibrosis buah pinggang [2]. Tambahan pula, kami telah menunjukkan kesan perlindungan paricalcitol pada fibrosis yang disebabkan oleh hipoksia dan TGF- 1-dalam pericytes, yang mungkin menyumbang kepada perencatan perkembangan CKD.

Fibrosis buah pinggang adalah ciri patologi biasa CKD tanpa mengira puncanya, dan ia merupakan ciri CKD yang meramalkan fungsi buah pinggang jangka panjang dan perkembangan kepada penyakit buah pinggang peringkat akhir (ESKD) [2,20,21]. Dalam kajian ini, rangsangan TGF- 1, PMT akibat hipoksia, dan rawatan paricalcitol melemahkan proses profibrotik dengan menghalang laluan isyarat TGF- 1/Smad. Myofibroblasts buah pinggang, yang merupakan sel mesenchymal diaktifkan yang menyatakan -SMA, memainkan peranan penting dalam fibrosis buah pinggang melalui penjanaan dan pengumpulan ECM dalam tubulointerstitium yang membentuk parut buah pinggang [6]. Mengenai terapi antifibrotik untuk mencegah perkembangan CKD, penyelidik telah menyiasat sel sasaran utama dan mediator yang dikaitkan dengan percambahan myofibroblast [22-24]. Selain itu, asal sebenar myofibroblast masih belum dapat ditentukan. Mereka diketahui berasal dari pelbagai sel, seperti pericytes, fibroblas pemastautin, sel epitelium, sel endothelial, dan sel mesenchymal stromal [25]. Walau bagaimanapun, terutamanya dalam buah pinggang, Humphreys et al. melaporkan bahawa kebanyakan fibroblas mesenchymal yang diaktifkan ini dilekatkan pada mikrovaskular dan berasal dari pericytes [19]. Menariknya, paricalcitol hanya mengecilkan laluan isyarat Smad2, tetapi bukan laluan Smad3, dalam kedua-dua kecederaan akibat hipoksia dan TGF- 1-pericytes dalam kajian ini. Smad2 dan Smad3 berkongsi 90 peratus persamaan dalam jujukan asid amino mereka, tetapi mereka mempunyai sensitiviti berbeza dalam menyampaikan isyarat TGF- 1 [26]. Walaupun mekanisme yang tepat tentang bagaimana paricalcitol menghalang laluan Smad2 tidak dapat dijelaskan dalam kajian ini, perencatan fosforilasi Smad2 mungkin merupakan mekanisme utama untuk kesan antifibrotik paricalcitol dalam pericytes buah pinggang.

Buah pinggang adalah organ yang hipoksik secara fisiologi, walaupun mempunyai sejumlah besar bekalan darah (20 peratus daripada keluaran jantung pada manusia), kerana shunt oksigen arteri-vena [27-29]. Selain itu, bekalan oksigen ke korteks buah pinggang boleh berubah secara mendadak bergantung pada status perfusi buah pinggang [30]. Oleh kerana ini membawa penggunaan oksigen yang tidak cekap dan kebolehubahan dalam paras oksigen intrarenal, buah pinggang cenderung terdedah kepada kecederaan hipoksik [30]. Dalam fasa akut AKI, sel epitelium tubular renal dan sel endothelial vaskular rosak dan diaktifkan. Ini mengakibatkan regulasi pelbagai sitokin dan kemokin, akibatnya lata inflamasi dimulakan, dan kecederaan bertambah teruk [31-33]. Dalam fasa kronik AKI, AKI memburukkan hipoksia buah pinggang dengan mendorong fibrosis tubulointerstitial, kerana pemendapan ECM yang berlebihan meningkatkan jarak antara kapilari peritubular dan sel epitelium tiub, mengakibatkan penurunan kecekapan resapan oksigen [27]. Jarang kapilari melalui detasmen pericyte dengan penurunan ekspresi faktor vaskular juga merupakan punca penting hipoksia buah pinggang. Hipoksia mengaktifkan laluan isyarat HIF-1, yang membawa kepada penyepaduan berbilang rangkaian isyarat, seperti laluan TGF- /Smad, Notch dan NF-kB, untuk mendorong fibrosis buah pinggang [3]. Kitaran ganas antara fibrosis buah pinggang dan hipoksia ini menyumbang kepada perkembangan CKD. Oleh itu, ini adalah sasaran terapeutik utama dalam kecederaan buah pinggang.

Untuk menilai dengan jelas perubahan hipoksik pericytes dan kesan perlindungan paricalcitol dalam persekitaran yang serupa dengan kecederaan buah pinggang, pericytes terdedah kepada keadaan hipoksik. Pendedahan kepada hipoksia meningkatkan ekspresi gen yang bergantung kepada HIF-1 dan HIF-1 -. HIF-1 menyebabkan fibrosis buah pinggang dan mengurangkan penggunaan oksigen dengan menghalang laluan metabolik dan organel intrasel yang mengambil oksigen [34–36]. Paricalcitol menunjukkan kesan antifibrotik dengan merendahkan HIF-1 , gen bergantung HIF-1 -seterusnya, dan ungkapan TGF- 1 dalam perisit yang terdedah kepada hipoksia. Keputusan pembungkaman gen HIF-1 juga menyokong bahawa HIF-1 akan menjadi sasaran terapeutik utama paricalcitol dalam kecederaan pericyte hipoksik. Sementara itu, ungkapan PHD3 berkurangan selepas rawatan paricalcitol walaupun selepas menyenyapkan HIF-1 , walaupun tahap penurunan telah dilemahkan. Ini mungkin berkaitan dengan fakta bahawa PHD3 bukan sahaja penderia oksigen tetapi juga mendorong apoptosis melalui mekanisme bebas HIF{14}}[37]. Walau bagaimanapun, kajian lanjut mengenai kesan antiapoptotik paricalcitol dalam pericytes diperlukan. Tambahan pula, paricalcitol telah menunjukkan dapat mengurangkan kecederaan tekanan oksidatif dalam perisit yang terdedah kepada hipoksia secara bebas{17}}HIF. Tekanan oksidatif adalah faktor terkenal yang menyumbang kepada fibrosis buah pinggang dan keradangan [38]. Secara keseluruhannya, hipoksia buah pinggang mengaktifkan PMT untuk membangunkan CKD, manakala paricalcitol boleh menyahaktifkan fibrosis dalam keadaan bebas HIF-1 -dan HIF-1 -.

Baru-baru ini, banyak kajian telah melaporkan kepentingan hipoksia dalam peralihan AKI-ke-CKD [39,40]. Fibrosis adalah tindak balas perlindungan penting kepada kecederaan tisu itu sendiri, tetapi fibrosis berlebihan kronik dalam buah pinggang menyebabkan hipoksia dan menghalang proses pembaikan [41]. Untuk pengetahuan kami, ini adalah kajian pertama yang menyiasat hipoksia dan TGF- 1-yang disebabkan PMT serta kesan antifibrotik dan antioksidan paricalcitol dalam pericytes. Kajian ini dijangka menyediakan asas untuk penyelidikan masa depan yang membuktikan kesan terapeutik paricalcitol untuk merawat kecederaan buah pinggang untuk menghalang peralihan AKI-ke-CKD. Walau bagaimanapun, kajian ini mempunyai beberapa batasan. Pertama, kami tidak menilai kesan antifibrotik dan antioksidan paricalcitol dalam eksperimen kultur. Memandangkan pericytes terletak berhampiran dengan sel endothelial kapilari, faktor yang dihasilkan oleh sel endothelial yang cedera boleh menjejaskan kesan paricalcitol [2]. Kedua, mekanisme terperinci kesan perlindungan paricalcitol dan bagaimana ia menghalang fosforilasi Smad2 tidak dinilai. Kajian lanjut diperlukan untuk mengesahkan mekanisme tindakan yang tepat.

Kesimpulannya, hipoksia atau TGF- 1 mendorong PMT secara bergantung-1 -HIF melalui laluan isyarat Smad2. Paricalcitol memperbaik PMT terkawal melalui penurunan kawal selia -1 -laluan bergantung HIF dan perencatan laluan isyarat TGF- 1/Smad2. Pericytes yang terdedah kepada hipoksia juga menyebabkan kecederaan tekanan oksidatif, yang telah dipertingkatkan disebabkan oleh rawatan paricalcitol dengan meningkatkan enzim antioksida secara HIF-1 -cara bebas. Tambahan pula, keputusan kami mencadangkan bahawa paricalcitol boleh menjadi pilihan terapeutik yang berpotensi dalam rawatan fibrosis buah pinggang dengan menyasarkan biologi pericyte dalam kecederaan yang disebabkan oleh hipoksia dan TGF- 1-.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Pengasingan dan Budaya Pericytes Ginjal Tikus

Tetikus C57BL/6buah pinggangtelah dinyahkapsul, dipotong dadu dan kemudian diinkubasi pada 37 darjah selama 45 minit dengan Liberase (0.5 mg/mL, Roche, Mannheim, Jerman) dan DNase (100 U/mL, New England Biolabs, Hitchin, UK) dalam DMEM/F12 pada suhu 37 .C dalam mandi air goncang. Selepas sentrifugasi, sel digantung semula dalam penimbal lisis RBC pada suhu 4 .C selama 5 minit, dibasuh, digantung semula dalam penimbal BSA 0.5 peratus yang mengandungi EDTA, dan ditapis melalui penapis sel 70- dan 40-mm. Selepas sentrifugasi, pelet digantung semula dalam larutan Percoll 45 peratus (v/v) dan disentrifugasi pada 5525 × g selama 30 minit pada suhu 4 .C (tanpa brek). Lapisan sel kemudiannya dikumpulkan dari lapisan atas larutan Percoll. Selepas sentrifugasi, pelet sel kemudiannya dilabel secara magnetik dengan CD146 (LSEC) MicroBeads dan diasingkan dalam

mengikut arahan pengilang. Sel-sel yang dikumpul kemudiannya dibiakkan

medium pericyte ditambah dengan 2 peratus FBS, 1 peratus PGS, dan 1 peratus P/S (ScienCell, Carlsbad, CA, USA) pada 37 .C dalam 5 peratus CO2 dan 95 peratus keadaan udara. Sel kultur utama yang digunakan dalam kajian ini adalah antara Passage 2 dan 6. Medium pertumbuhan ditukar setiap 3-4 hari.

Kami mengesahkan pericytes kultur melalui sitometri aliran dan pewarnaan penanda khusus pericyte, seperti PDGFR, CD146, dan antigen neuron-glial 2 (NG2) (Tambahan Rajah S2). Dalam analisis pengisihan sel yang diaktifkan pendarfluor, pericytes yang dikultur menunjukkan peningkatan populasi sel positif PDGFR, CD146, dan NG2, dan populasi sel positif CD31 tidak diubah. Dalam analisis pewarnaan imunofluoresensi, pericytes yang dikultur juga menyatakan bersama CD146/PDGFR, CD146/NG2, dan PDGFR/NG2. Daya maju pericyte telah dinilai menggunakan ujian Kit Pengiraan Sel-8 (CCK-8); daya maju pericyte tidak diubah selepas rawatan dengan paricalcitol (20 ng/mL) dan/atau TGF- 1 (5 ng/mL) selama 24 jam.

4.2. Rawatan Sel

Selepas kebuluran faktor pertumbuhan selama 24 jam, pericytes telah dirawat terlebih dahulu dengan atau tanpa paricalcitol (20 ng/mL) selama 90 minit dan seterusnya dirangsang oleh TGF- 1 (5 ng/mL; Sistem R&D, Minneapolis, MN, Amerika Syarikat) selama 48 jam. Untuk hipoksia, pericytes dibiakkan dalam 1 peratus oksigen dan 5 peratus CO2 dalam stesen kerja hipoksia (Invivo2 400, Baker Ruskin, Sanford, ME, USA).

4.3. Pewarnaan Imunofluoresensi Pericytes

Pericytes telah dibiakkan pada slaid ruang dan diikat dengan 3.7 peratus paraformaldehid dalam PBS selama 3{3}} min. Selain itu, pericytes telah dibasuh dengan PBS dan telap dengan 0.3 peratus Triton selama 15 minit. Sel-sel tetap telah diinkubasi dengan antibodi utama kepada PDGFR (1:50), CD146 (1:50), dan NG2 (1:50) semalaman pada 4 .C. Selepas mencuci semula pericytes, mereka diinkubasi dengan antibodi sekunder (Alexa Fluor 488 dan Alexa Fluor 594, Life Technologies, Eugene, OR, USA) selama 2 jam pada suhu bilik. Nukleus telah diwarnakan balas dengan 4/,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dan slaid telah dipasang dengan reagen pelekap antiludar (Molecular Probes). Bahagian-bahagian itu diperiksa oleh mikroskop laser pengimbasan confocal Zeiss menggunakan LSM 5 Exciter (Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman).

4.4. Ujian Daya Tahan Sel

Pericytes telah disemai dalam 96-plat perigi dan diinkubasi menggunakan medium bebas serum selama 24 jam. Selepas kelaparan, pericytes dirawat dengan paricalcitol (20 ng/mL) dan/atau TGF- 1 (5 ng/mL). Daya maju sel telah dianalisis menggunakan ujian CCK-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Jepun) mengikut arahan pengilang. Penyerapan diukur pada 450 nm menggunakan mikroplat (SPARK 10M, Tecan, Durham, NC, USA). Nilai itu dinyatakan sebagai peratusan kawalan.

4.5. Ujian Penghijrahan Sel Gores

Pericytes disalut ke dalam 96-telaga IncuCyte ImageLock Plates (Essen BioScience, AnnArbor, MI, USA) dan diinkubasi semalaman. Medium telah ditukar kepada medium lengkap dengan mitomycin-C (10 ug / mL, M4287; MilliporeSigma, Burlington, MA, Amerika Syarikat) selama 2 jam untuk menghalang percambahan sel. Setiap monolayer sel telah dicakar menggunakan 96-pin WoundMaker (Sistem Pengimejan Sel Langsung Zum IncuCyte; Essen BioScience) mengikut arahan pengilang. Selepas menggaru, untuk mengkaji kesan paricalcitol pada penghijrahan sel, pericytes telah dirawat terlebih dahulu dengan paricalcitol (20 ng/mL) selama 90 minit dan seterusnya diinkubasi dengan TGF- 1 (5 ng/mL) selama 48 jam. Selepas rawatan, imej diperoleh, disimpan dan didaftarkan dalam sistem perisian IncuCyte setiap 4 jam. Data dianalisis menggunakan metrik bersepadu, dan nilainya dinyatakan sebagai ketumpatan luka relatif.

4.6. Ujian Migrasi Sel Transwell

Pericytes telah dirawat dengan TGF- 1 (5 ng/mL) selama 24 jam selepas prainkubasi dengan paricalcitol (20 ng/mL) selama 90 minit. Selain itu, sel-sel telah ditanggalkan dengan trypsin–EDTA dan disalut pada 24-sisipan Transwell telaga (1 × 104 sel/telaga, saiz liang 8 mm; 6.5 mm

Transwell [#3422], Corning, NY, Amerika Syarikat). Selepas 24 jam, sel-sel yang telah berhijrah ke muka bawah sisipan diikat dengan 3.7 peratus paraformaldehid selama 10 min. Sebaliknya, sel yang berhijrah pada muka bawah telah diwarnai dengan 0.1 peratus ungu kristal (V5265; Sigma– Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) selama 5 minit, dan sel dalam 10 medan yang dipilih secara rawak dikira di bawah mikroskop cahaya pada pembesaran ×100.

4.7. Pemindahan Pericytes dengan HIF-1siRNA

HIF tetikus {{0}} siRNA dan siRNA bukan sasaran (kawalan negatif) telah dibeli daripada Dharmacon (Chicago, IL, Amerika Syarikat). Pemindahan dilakukan menggunakan Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Paisley, UK), mengikut arahan pengilang. Sel-sel pericyte (5.0 × 104) telah disemai 1 hari sebelum pemindahan dan dikultur untuk mencapai 40-50 peratus pertemuan pada hari berikutnya. Dupleks RNAi untuk HIF-1 dicampur dengan Lipofectamine untuk membentuk kompleks transfeksi yang ditambahkan pada sel bersalut. Selepas 6 jam pengeraman, sel-sel telah dirawat dengan paricalcitol (20 ng/mL) selama 90 minit, kemudian dipindahkan ke dalam ruang hipoksia dan hipoksia terdedah selama 24 jam. Sel yang ditransfeksi digunakan untuk tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik masa nyata kuantitatif (qRT-PCR).

4.8. Pengekstrakan RNA dan Analisis PCR Masa Nyata Kuantitatif

Jumlah RNA diekstrak daripada pericytes yang dirawat Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat) mengikut arahan pengilang. Satu mikrogram jumlah RNA telah ditranskripsi secara terbalik dengan menggunakan kit Sintesis cDNA PrimeScript (Takara Shuzo Co., Otsu, Jepun). Semua primer untuk PCR masa nyata (Jadual Tambahan S1) direka menggunakan perisian Primer Express V1.5 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR masa nyata kuantitatif telah dilakukan pada Sistem Pengesanan Jujukan ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) menggunakan SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kesemua sampel dikira menggunakan kaedah Ct perbandingan untuk pengiraan relatif ekspresi gen dan normalisasi berkenaan dengan ekspresi GAPDH.

4.9. Analisis Western Blot

Selepas rawatan, jumlah protein (25 ugs) diasingkan melalui elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida 10 peratus dan dipindahkan ke membran nitroselulosa. Membran telah disekat dengan 10 peratus susu skim selama 1j pada suhu bilik dan diinkubasi semalaman pada 4 darjah dengan antibodi utama terhadap phospho-Smad2 (1:1000, Millipore), Smad2 (1:200, Invitrogen), phospho-Smad3 (1: 1000, Isyarat Sel, Danvers, MA, USA), Smad3 (1:1000, Isyarat Sel), TGF- 1 (1:1000, Santa Cruz, Dallas, TX, USA) dan GAPDH (1:2000, Isyarat Sel). Selepas mencuci, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder konjugasi peroksidase lobak pedas (P0448, Dako, Glostrup, Denmark) selama 1 jam. Membran telah dikesan menggunakan reagen ECL (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) dan divisualisasikan pada sistem ImageQuant™ LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Tokyo, Jepun). Ketumpatan jalur protein dikira menggunakan perisian Scion Image (Scion, Frederick, MD, Amerika Syarikat).

4.10. Analisis statistik

Data dibentangkan sebagai cara o ralat piawai dan diperoleh daripada sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas. Analisis statistik dilakukan menggunakan ujian Kruskal-Wallis bukan parametrik, diikuti dengan analisis posthoc menggunakan ujian Mann-Whitney U dengan pembetulan Bonferroni. Analisis dilakukan menggunakan SPSS (versi 20.0, IBM Corp., Armonk, NY, USA). Nilai p kurang daripada 0.05 dianggap signifikan secara statistik.

Bahan Tambahan: Perkara berikut boleh didapati dalam talian di https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22189751/s1.

Sumbangan Pengarang: Pengkonsepan, J.-HL, dan S.-HP; metodologi, J.-HL, J.-MY dan S.-HP; pengesahan, J.-HL, J.-MY dan S.-HP; Analisis formal, J.-HL dan J.-MY; penyiasatan, J.-HL, J.-MY, S.-HO, dan S.-HP; sumber, J.-MY dan S.-HP; penyusunan data, J.-HL, J.-MY dan S.-HP; penulisan—penyediaan draf asal, J.-HL, J.-MY, dan S.-HP; menulis—menyemak dan menyunting, J.-HL, S.-JJ, HWN, H.-YJ, J.-YC, J.-HC, C.-DK, Y.-LK dan S.-HP; penyeliaan, S.-HP; pentadbiran projek, S.-HP Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan: Kerja ini disokong oleh geran Institut Penyelidikan Bioperubatan, Hospital Universiti Kebangsaan Kyungpook (2019).

Pernyataan Ketersediaan Data: Data yang dibentangkan dalam kajian ini tersedia atas permintaan daripada pengarang yang berkaitan.

Konflik Kepentingan: Pengarang mengisytiharkan tiada percanggahan kepentingan.