Nlrc3 Tikus Kalah Mati Menunjukkan Perubahan Patologi Buah Pinggang Selepas Jangkitan HTNV

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Virus Hantaan (HTNV) menjangkiti manusia dan menyebabkan demam berdarah denganbuah pinggangsindrom(HFRS). Pembangunan model haiwan HFRS yang dicirikan dengan baik boleh mempercepatkan ujian calon vaksin dan ejen terapeutik dan menyediakan alat yang berguna untuk mengkaji patogenesis HFRS. Oleh kerana NLRC3 mempunyai pelbagai peranan imunoregulasi, kami menyiasat kerentanan tikus Nlrc3-/- kepada jangkitan HTNV untuk mewujudkan model HFRS baharu. Nlrc3−/− tikus mengalami penurunan berat badan,pendarahan buah pinggang,dan pelebaran tubul selepas jangkitan HTNV, menyusun semula banyak gejala klinikal HFRS manusia. Selain itu, tikus Nlrc3−/− yang dijangkiti menunjukkan beban virus yang lebih tinggi dalam serum, limpa, dan buah pinggang berbanding tikus C57BL/6 (WT) jenis liar, dan sebahagian daripada mereka menunjukkan lebih banyak gangguan hematologi dan perubahan patologi yang ketara dalam pelbagai organ berbanding tikus WT. Keputusan kami mengenal pasti bahawa tikus Nlrc3−/− yang dijangkiti HTNV boleh mengalami gejala klinikal dan perubahan patologi yang menyerupai pesakit dengan HFRS, mencadangkan model baharu untuk mengkaji patogenesis dan ujian vaksin dan terapeutik calon.

Kata kunci:HFRS, HTNV, NLRC3, pendarahan buah pinggang, pembesaran tubul renal

PENGENALAN

Demam berdarah denganbuah pinggangsindrom (HFRS) menunjukkan nefropati interstisial akut selepas penghantaran zoonosis hantavirus daripada tikus kepada manusia. Penyakit ini terutamanya berlaku di Asia dan Eropah (1, 2). Patogen yang paling lazim menyebabkan HFRS ialah virus Dobrava (DOBV), virus Puumala (PUUV), virus Seoul (SEOV), dan virus Hantaan (HTNV), yang setiap satunya menyebabkan keterukan HFRS yang berbeza. Ciri-ciri penyakit adalah berbeza di Amerika Utara dan Selatan, di mana jangkitan Hantavirus menyebabkan sindrom paru-paru hantavirus (HPS), terutamanya oleh virus Andes (ANDV) dan virus Sin Nombre (SNV) (3).

HFRS berlaku dengan ciri-ciri demam tinggi, hipotensi,kegagalan buah pinggang, dan pendarahan(4). Ia boleh dibahagikan kepada peringkat klinikal fifive: demam, kejutan hipotensi, oligurik, diuretik, dan pemulihan. Episod akut jangkitan HTNV yang membawa kepada HFRS selalunya disertai oleh trombositopenia, leukositosis, anemia, kreatinin serum yang tinggi, dan enzim hati (5). Gejala dan tanda klinikal ini sebahagiannya boleh dijelaskan oleh fakta bahawa HTNV terutamanya menyerang buah pinggang dan menyebabkan kecederaan buah pinggang yang dicirikan oleh nefritis tubulointerstitial akut yang melibatkan penyusupan sel-sel radang (6), akibatnya menyerang beberapa organ lain (7)

Tikus ialah takungan semula jadi untuk Hantavirus yang secara berterusan menjangkiti haiwan tanpa menyebabkan penyakit (8). Najis mereka, seperti air liur, air kencing, dan najis, menjadi bahan cemar yang berpotensi yang boleh menjangkiti manusia yang menyedut aerosol zarah kecil daripada najis yang tercemar. Hantavirus biasanya menyebabkan jangkitan tanpa gejala pada tikus dewasa BALB/c dan C57BL/6 (9), tetapi penyakit neurologi maut atau jangkitan berterusan pada tikus menyusu dan bayi baru lahir (10, 11). Walaupun keabnormalan nefropati ditunjukkan dalam kera cynomolgus yang dijangkiti PUUV (Macaca fascicularis), haiwan ini hanya menunjukkan proteinuria ringan, penyusupan sel imun, dan kerosakan buah pinggang tiub, serupa dengan kes ringan HFRS (12). Di samping itu, hamster yang dijangkiti HTNV melalui laluan hidung membawa kepada jangkitan tanpa gejala yang berterusan, dicirikan oleh viremia sporadis tetapi tahap tinggi salinan genom virus dalam paru-paru, otak, dan buah pinggang. Ferret yang dijangkiti HTNV dos tinggi melalui suntikan otot menunjukkan penurunan berat badan secara beransur-ansur (5-12 peratus dari semasa ke semasa) tetapi masih utuhfungsi buah pinggang,ketiadaan viremia, dan kekurangan penghantaran virus ke organ. Dalam marmoset, suntikan intramuskular HTNV membawa kepada tahap seroconversion dan pengeluaran antibodi peneutral yang tinggi; secara konsisten, haiwan ini tidak mengalami kerosakan buah pinggang, viremia, atau penghantaran virus kepada organ (13).

Walaupun ketidaksempurnaan mereka, model haiwan menggunakan tikus dan tikus digunakan secara meluas untuk mengkaji patogenesis Hantavirus (14). Yoshimatsu et al. menunjukkan bahawa jangkitan tikus SCID dengan HTNV menyebabkan penyakit pembaziran maut dengan edema pulmonari (15, 16), dan pengurangan neutrofil menghalang perkembangan edema pulmonari, tetapi tiada lesi hemoragik ciri HFRS ditemui (15). Shimizu et al. mendapati bahawa HTNV yang diasingkan daripada pesakit HFRS boleh menjangkiti 6-tikus BALB/c betina berusia seminggu secara intravena, menyebabkan viremia selama 6-9 hari, menunjukkan tanda-tanda penyakit termasuk penurunan berat badan sementara, kedutan rambut, eksudasi buah pinggang (17 ). Dalam model tetikus yang sama, terdapat pendarahan makroskopik di sempadan antarakorteks buah pinggangdan medula, tetapi sama ada perubahan histopatologi yang diperhatikan dikaitkan dengan penurunan fungsi buah pinggang belum diperiksa. Dalam tikus yang dimanusiakan, jangkitan HTNV membawa kepada penurunan berat badan, penurunan aktiviti, bulu kusut, dan kecederaan paru-paru, yang nampaknya paru-paru adalah organ sasaran utama untuk jangkitan virus (18). Oleh itu, model haiwan yang sesuai untuk jangkitan HTNV yang menangkap kebanyakan ciri penyakit HFRS masih diperlukan.

ulasan cistancheuntukpelebaran tubul renal

NLR ialah keluarga reseptor imun semula jadi intraselular yang paling menonjol dan berfungsi dengan fungsi yang berbeza dalam mengawal selia imuniti semula jadi. Walaupun NLR yang paling terkenal (cth, NLRP3) mempamerkan fungsi pengawalseliaan positif dalam pengaktifan keradangan dan imun, subkumpulan NLR yang luar biasa, yang ditakrifkan sebagai NLR perencatan, mempamerkan fungsi perencatan dalam tindak balas keradangan. Untuk memahami mekanisme penindasan imun semula jadi pengantara NLR, ligan untuk NLR yang menghalang seperti NLRC3 dan NLRX1 telah diperiksa (19). NLRC3 ialah pengawal selia negatif yang melemahkan tindak balas interferon jenis I (IFN-I) dengan mengasingkan dan melemahkan perangsang gen interferon (STING) (19). NLRX1, sebagai penjaga gerbang homeostatik pusat antara biologi mitokondria dan tindak balas imunologi, telah terlibat dalam pelbagai jenis penyakit, kedua-dua didorong oleh patogen dan sebaliknya (20). Oleh kerana penyakit HTNV menunjukkan banyak disregulasi keradangan dan pengaktifan imun, kami memilih Nlrc3-/- tikus untuk menyiasat mekanisme molekul penyakit itu.

Kajian ini menunjukkan bahawa model tikus Nlrc3−/− menyerupai kecederaan sistematik yang diperhatikan pada pesakit dengan HFRS, yang dicirikan oleh trombositopenia,pelebaran tubul renal, dan pendarahan.Analisis beban virus mendedahkan bahawa tikus Nlrc3-/- membentangkan beban virus yang lebih tinggi dalam pelbagai tisu, termasuk serum, limpa, dan buah pinggang. Kajian kami mewujudkan model tetikus untuk jangkitan HTNV yang berguna untuk menilai vaksin dan terapeutik calon.

KAEDAH

Saham VVirus

Strain HTNV {{0}} telah disumbangkan oleh Changshou Hang (Pusat Kawalan dan Pencegahan Penyakit China) dan kemudian dipelihara dan dikembangkan di makmal kami. Sel Vero E6 digunakan untuk penyebaran virus, dan titer berjangkit dikira menggunakan dos berjangkit kultur tisu 50 peratus (TCID50) oleh ujian imunofluoresensi (IFA). Penukaran antara TCID50 dan unit pembentuk plak (PSU) adalah berdasarkan pengiraan berikut: 1 PFU ≈0.7×TCID50 (21).

penjanaan Model Tetikus Kalah Mati Nlrc3

Tikus jenis liar C57BL/6J dan model tetikus kalah mati Nlrc3 (Nlrc3−/− ) telah direka dan dibangunkan oleh Shanghai Model Organisms Center, Inc (Shanghai, China). Untuk mendapatkan Nlrc3−/− tetikus, Cas9 mRNA, dan sgRNA telah disediakan oleh transkripsi in vitro. Dua sgRNA disasarkan untuk memadamkan ekson 2-3 gen Nlrc3: 5'- GTTGGTCTAATAAGCATCCTGGG {{10}}', 5'- TCCCATGAACCATGTCAGAAGG -3'. Zygote tikus C57BL/6J telah diterima dan disuntik dengan mRNA dan sgRNA Cas9 yang ditranskripsi secara In vitro dan dipindahkan kepada penerima pseudopregnant. Genotip tikus F0 yang diperoleh telah dikenal pasti dan disahkan oleh PCR dan penjujukan menggunakan pasangan primer: F-5'- GTGATGTCTGCTTACC CCGTCTCC -3'; R-5'- GCCTGTGCCGCCTCTCA -3'. Dengan menyeberang dengan tikus C57BL/6J, tikus F0 positif telah dipilih untuk mendapatkan tikus kalah mati Nlrc3 heterozigot F1. Analisis PCR dan penjujukan mengesahkan tikus F1 yang diperolehi. Untuk mendapatkan Nlrc3−/− tikus heterozigot, tikus heterozigot F1 betina dan jantan telah disilang secara rawak. Tikus berumur 6-8 minggu digunakan untuk semua kajian.

Jangkitan Haiwan dan Penyediaan Sampel

Sebanyak 5×105 PFU HTNV dalam 50 ul media telah diinokulasi melalui laluan intraperitoneal. Tikus dalam kumpulan kawalan menerima jumlah PBS yang sama. Dua puluh hingga dua puluh lima tikus Nlrc3−/− atau WT telah digunakan. Setiap jenis tikus dibahagikan kepada lima kumpulan untuk pensampelan pada 0, 3, 6, 9, dan 12 hari selepas jangkitan. Berat badan dan suhu dubur direkodkan setiap hari. Pada setiap titik masa, empat hingga lima haiwan daripada kedua-dua kumpulan telah dimatikan untuk ujian. Untuk analisis virologi, sampel tisu segar dikumpulkan dari jantung, hati, limpa, paru-paru, buah pinggang dan otak dan kemudian dibekukan pada -80 darjah serta-merta. Tikus telah diserap dengan PBS sejuk, dan organ telah ditetapkan dalam 4 peratus paraformaldehid selama 4 jam untuk analisis histologi dan imunohistokimia. Spesimen darah dikumpul untuk ujian viral load dan pemeriksaan rutin darah, dan serum telah diasingkan untuk analisis biokimia.

Ujian Sitokin

Sebanyak 25 mL serum daripada setiap tetikus telah diuji untuk 13 sitokin berbeza dengan Panel Tindak Balas Anti-Virus LEGENDplex™ Mouse (13-plex) (BioLegend) mengikut arahan pengilang. FACS Calibur cytometer (Becton Dickinson Biosciences, CA) telah digunakan untuk pengesanan. Data telah dianalisis oleh LEGENDplex v8.0. Perisian.

Ujian RT-PCR Masa Nyata

Sampel tisu daripada setiap tetikus ditimbang dan direndam dalam PBS dan dihomogenkan oleh penghomogen automatik-TissueLyser II (QIAGEN, Jerman), menggunakan Frekuensi 30/s dan Masa 5 min. Untuk jumlah pengekstrakan RNA, 200 homogenat tisu mL dipindahkan kepada 500 mL reagen TRIzol, diikuti dengan pengekstrakan kloroform dan pemendakan isopropanol. 140 mL sampel serum telah dipindahkan ke penimbal AVL 560 mL yang mengandungi RNA pembawa (Qiagen, UK) untuk pengekstrakan RNA menggunakan kit Mini RNA Viral QIAamp (Qiagen, UK). Akhirnya, RNA telah dibubarkan semula dalam air bebas RNase. Ujian RT-PCR masa nyata khusus HTNV dilakukan untuk pengesanan RNA virus daripada setiap sampel. Urutan primer yang disasarkan secara khusus untuk segmen HTNV telah diterima pakai seperti berikut: F-5'- GATCAGTCACAGTCTAGTCA- 3' dan R-5'- TGATTCTTCCACCATTTTGT-3'. One-Step TB Green PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time) (Takara, Jepun) telah digunakan untuk ujian qRT-PCR. Campuran induk akhir (20mL) terdiri daripada 2 mL RNA, 5.6 mL RNase Free dH2O, 0.8mL primer pemajuan dan Songsang (10 mM), 0.8 mL Campuran Enzim 1 Langkah PrimScript 2 dan 10 mL 2×Satu Langkah TB Green RT-PCR Buffer 4. Keadaan kayuhan yang digunakan ialah 42 darjah selama 5 minit, 95 darjah selama 10 saat, kemudian diikuti dengan 40 kitaran 95 darjah selama 0 saat, 65 darjah selama 15 saat, dan 95 darjah selama 0 saat. Reaksi dijalankan dan dianalisis pada platform LightCycler (Roche Diagnostics, USA).

Kuantifikasi Mutlak Beban Viral

Oligonukleotida RNA virus sebagai piawaian RNA diperoleh melalui transkripsi in-vitro daripada DNA menggunakan Kit MAXIscript (Thermo Scientific, UK), yang terdiri daripada 562 asas RNA HTNV yang disasarkan oleh ujian (22), dan kemudian dikira oleh spektrofotometer mikroplate ultramikro ( BioTek Epoch, USA), kepekatan stok RNA standard ialah 800 ng/mL. Untuk menilai beban virus dalam setiap sampel, RNA piawai telah disediakan dengan 10-pencairan bersiri kali ganda, antara 1010 salinan hingga 103 salinan setiap tindak balas. RNA standard kami mempunyai had pengesanan 1010 salinan hingga 101 salinan setiap tindak balas, dan dengan itu kami menetapkan ambang pengesanan untuk ujian ini pada 100 salinan genom setiap tindak balas. Analisis dalam-jalan, lengkung standard telah diwujudkan dengan kecerunan -3.6624, pintasan-Y sebanyak 41.68 kitaran dan nilai R2 sebanyak 0.9996.

Analisis Tahap Protein oleh Western Blotting

Lisat tisu disediakan daripada sampel tisu tikus. Kit ujian protein asid Bicinchoninic (BCA) (Thermo Scientific, UK) digunakan untuk mengesan kepekatan protein. Untuk analisis protein, 30 mg jumlah protein daripada setiap sampel telah dimuat naik pada gel SDS-polyacrylamide dan dipindahkan ke membran NC. Kemudian, larutan susu skim 5 peratus digunakan untuk menyekat pada suhu bilik selama 2 jam. Seterusnya, 1:1000 mencairkan antibodi monoklonal 1A8 terhadap HTNV-NP (disediakan dan disucikan oleh makmal kami) (23, 24) telah ditambah dan diinkubasi pada 4 darjah semalaman. Akhirnya, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder, IgG anti-tikus Arnab HRP-konjugasi, atau IgG anti-arnab tikus konjugasi HRP pada suhu bilik selama 2 jam. Substrat chemiluminescent HRP kemudiannya ditambah untuk mengesan protein. Analisis densitometrik keamatan jalur protein dilakukan dengan menggunakan perisian Image J (NIH, USA). b-actin digunakan sebagai kawalan pemuatan untuk normalisasi.

Ujian imunohistokimia

Sampel tisu dibenamkan dalam parafin dan dihiris menjadi 4 mm untuk pewarnaan imunohistokimia. Bahagian mengalami deparafinisasi dan penghidratan semula dan penyahaktifan peroksidase endogen. Bahagian tertakluk kepada pengambilan semula antigen dalam penimbal sitrat (PH=6) pada 95 darjah selama 10 minit. Kemudian, 5 peratus serum kambing biasa digunakan untuk menyekat pada suhu bilik selama 40 minit. mAb 1A8 digunakan sebagai antibodi utama untuk antigen HTNV NP dan diinkubasi dengan bahagian tisu pada 4 darjah semalaman. Ini diikuti dengan pewarnaan dengan FITC anti-tikus IgG (Invitrogen) pada 37 darjah selama 1 jam, dan kemudian DAPI selama 10 minit pada suhu bilik. 3DHISTECH (Hungary) digunakan untuk pemerolehan imej dan CaseViewer2.4 untuk analisis data.

Pemeriksaan Histologi

Untuk mengekalkan morfologi sel dan tisu, 4 peratus formalin penimbal neutral digunakan untuk memfikskan sampel tisu untuk analisis histopatologi. Tisu-tisu ini diproses menjadi bahagian 5 mm dan kemudian diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E). Akhirnya, bahagian telah diperiksa oleh mikroskop cahaya, dan imej telah ditangkap oleh 3DHISTECH (Hungary), dianalisis oleh CaseViewer2.4. Tahap lesi dijaringkan secara visual menggunakan sistem gred 4-yang telah ditetapkan: dalam had biasa sebagai 0, minimum sebagai 1, ringan sebagai 2, sederhana sebagai 3, teruk sebagai 4.

Kajian Subjek HaiwanSemua eksperimen haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Eksperimen Makmal Pusat Haiwan Universiti Perubatan Tentera Keempat. (No.20210403).

PerangkaanData dianalisis menggunakan perisian GraphPad Prism 9. Melainkan dinyatakan sebaliknya, semua data dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai (SD). Ujian-t atau ANOVA Sehala digunakan seperti yang dinyatakan dalam legenda angka. Nilai P yang kurang daripada 0.05 dianggap penting.

KEPUTUSAN

Pengesanan Viral Load dalam Pelbagai Organ Nlrc3−/− Tikus Selepas Jangkitan Intraperitoneal Dengan HTNV

Untuk mencirikan kerentanan tikus Nlrc3−/− kepada jangkitan HTNV, sekumpulan tikus Nlrc3−/− telah dijangkiti secara intraperitoneal dengan 5×105 PFUs HTNV setiap tetikus, menggunakan tikus WT sebagai kawalan. Semua haiwan dipantau setiap hari untuk simptom klinikal, suhu, dan perubahan berat badan. Tikus telah dikorbankan pada 3, 6, 9, dan 12 hari selepas jangkitan (dpi) untuk menganalisis pelbagai parameter makmal, beban virus, dan patologi. Nlrc3−/− tikus mula menurunkan berat badan pada 4 dpi, dan sebanyak 6 dpi, penurunan berat badan > 5 peratus daripada berat badan permulaan mereka direkodkan. Sebagai perbandingan, tikus WT tidak menunjukkan penurunan berat badan (Rajah 1A). Tiada demam direkodkan dalam kedua-dua kumpulan (Rajah 1B). Untuk menilai penyebaran dan replikasi HTNV dalam tikus yang dicabar virus, serum dan organ utama (termasuk jantung, hati, limpa, paru-paru, buah pinggang, dan otak) telah dikumpulkan untuk pengiraan mutlak nombor salinan RNA virus. Keputusan menunjukkan bahawa viremia berlaku pada 3 dpi dalam kedua-dua kumpulan (Nlrc3−/− tikus: 943 ± 140 salinan setara per mL; WT tikus: 803 ± 277 salinan per mL). Terutamanya, beban virus serum tikus WT memuncak pada 3 dpi dan menurun dengan cepat selepas itu, manakala dalam tikus Nlrc3−/-, beban virus mengekalkan tahap pertengahan sehingga 6 dpi dan kemudian secara beransur-ansur menurun ke tahap rendah 9 dpi (Rajah 1C). Di samping itu, kami mengumpul keseluruhan darah tikus yang dijangkiti HTNV pada hari 0, 3, 6, dan 9 selepas jangkitan untuk menentukan replikasi virus dalam darah. Keputusan menunjukkan bahawa viral load meningkat pada 3 dpi dan kemudian menurun menunjukkan replikasi virus dalam sel darah. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 1, nombor salinan virus dalam Nlrc3-/- tikus adalah lebih tinggi daripada tikus WT (Nlrc3-/- tikus: 5752 ± 502 salinan setiap mL; tikus WT: 3589 ± 869 salinan setiap mL) pada 3 dpi. Selain itu, 2-beban virus kali ganda lebih tinggi dikesan dalam limpa Nlrc3−/− tikus (3033 ± 175 salinan bersamaan per mg) daripada tikus WT (1520 ± 425 salinan per mg) pada 6 dpi; corak yang sama diperhatikan dalam buah pinggang pada 9 dpi (Nlrc3−/− tikus: 500 ± 87 salinan setara per mg; WT tikus: 270 ± 40 salinan per mg) (Rajah 1C). Secara keseluruhannya, beban virus yang lebih tinggi sederhana dikesan dalam tikus Nlrc3-/- daripada tikus WT.

Seterusnya, kami memeriksa tahap nukleoprotein (NP) HTNV. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2A, C, Nlrc3−/− tikus membentangkan paras antigen virus yang lebih tinggi daripada tikus WT dalam limpa dan buah pinggang. Analisis statistik antigen virus dalam buah pinggang dan limpa ditunjukkan dalam Rajah 2B, D, masing-masing. Tahap antigen virus yang rendah dikesan dalam jantung, hati, paru-paru, dan otak tikus Nlrc3-/- (Tambahan Rajah 2). Tahap protein NP virus dalam jantung, paru-paru, dan otak tikus Nlrc3-/- lebih rendah daripada tikus WT pada tahap protein (Rajah Tambahan 2B, F, H), tetapi kepentingan statistik ditunjukkan antara jantung dan otak kedua-duanya pada mRNA dan tahap protein (Rajah Tambahan 2A, E, I). Penemuan ini mencadangkan bahawa virus aktif

replikasi berlaku dalam darah, limpa, dan buah pinggang Nlrc3−/− tikus selepas jangkitan HTNV. Akhirnya, kami menggunakan imunofluoresensi untuk mengesan tahap ekspresi HTNV NP dalam limpa dan buah pinggang. Keamatan pendarfluor HTNV NP FL lebih tinggi dalam buah pinggangbuah pinggangtubulus (Rajah 2E) dan pulpa merah limpa (Rajah 2F) Nlrc3−/− tikus berbanding tikus WT pada 6 dpi dan 9 dpi. Bersama-sama, keputusan ini menunjukkan bahawa tikus Nlrc3-/- lebih mudah terdedah kepada jangkitan intraperitoneal HTNV.

Ujian Darah Rutin Nlrc3−/− Tikus Selepas Jangkitan HTNV

Telah diterima secara meluas bahawa patologi HFRS sebahagian besarnya dimediasi imun, termasuk kompleks imun, pengaktifan pelengkap, tindak balas sel T (24-26), dan pengeluaran sitokin yang disebabkan oleh HTNV (26, 27), menyebabkan kecederaan berbilang organ. Di samping itu, trombositopenia adalah ciri klinikal biasa pada mereka yang dijangkiti virus demam berdarah (VHF) virus. Oleh itu, kami melakukan ujian hematologi pertama menggunakan darah keseluruhan yang dikumpul daripada tikus Nlrc3−/− dan WT pada 3, 6, 9, dan 12 dpi. Keputusan menunjukkan bahawa kiraan PLT dalam tikus WT menurun pada 3dpi dan kemudian pulih secara beransur-ansur, tetapi mereka terus menurun dalam Nlrc3−/− tikus sehingga mencapai nilai terendah pada 9 dpi, jauh lebih rendah daripada WT pada 9 dpi (P<0.05) (figure="" 3a).="" the="" decrease="" of="" wbc="" counts="" was="" observed="" on="" 3="" dpi="" and="" then="" gradually="" recovered="" to="" normal="" levels="" in="" both="" mouse="" strains="" (figure="" 3b).="" to="" further="" dissect="" the="" subset="" changes="" in="" wbcs,="" we="" analyzed="" on="" 0,="" 3,="" 6="" dpi="" the="" number="" of="" monocytes,="" neutrophils,="" lymphocytes,="" and="" t="" cells="" by="" routine="" blood="" tests="" combined="" with="" fellow="" cytometry="" assay.="" the="" number="" of="">

meningkat dengan ketara dalam Nlrc3−/− tikus pada 6 dpi tetapi tidak dalam tikus WT (Rajah 3C). Neutrofil dalam kedua-dua jenis tikus menurun sedikit tetapi pulih ke tahap purata pada 6 dpi (Rajah 3D). Bilangan limfosit menurun dengan ketara pada 3 dpi, sementara mereka mula meningkat dalam tikus WT pada 6 dpi, bilangan limfosit kekal pada tahap rendah pada 6 dpi dalam tikus Nlrc3-/- (Rajah 3E). Nisbah CD3 tambah CD4 tambah sel T berbanding CD3 tambah CD8 tambah sel T dalam darah periferi ditentukan oleh sesama sitometri dan didapati meningkat pada 3 dpi dan kemudian dengan cepat diterbalikkan pada 6 dpi, selaras dengan perubahan yang sering diperhatikan pada pesakit HFRS (Rajah 3F), di mana CD4 tambah sel T menurun secara mendadak, dan CD8 tambah sel T kekal tidak berubah atau pampasan berkembang untuk menghasilkan nisbah terbalik CD4/CD8. Penemuan ini mencadangkan bahawa inokulasi intraperitoneal HTNV ke dalam tikus Nlrc3−/−, pada tahap tertentu, mendorong ciri klinikal utama pesakit yang dijangkiti HTNV, seperti trombositopenia dan nisbah sel CD4/CD8 T terbalik.

Perubahan Patologi dalam Buah Pinggang Nlrc3−/− Tikus yang Dijangkiti Menunjukkan Pendarahan Interstisial Renal yang Bertanda dan Pelebaran Tubul RenalSeterusnya, perubahan patologi tikus yang dijangkiti HTNV dinilai dengan pewarnaan H&E dan didapati wujud dalam buah pinggang semua tikus Nlrc3−/− yang dijangkiti yang dimanifestasikan sebagai Edema ofbuah pinggangsel epitelium tiub. Pada 6 dpi, lesi hemoragik diperhatikan dalambuah pinggangmedula (Rajah 4A).Tubul renaldilatasi diperhatikan seawal 3 dpi, keparahannya memuncak pada 9 dpi dan berterusan sehingga 12 dpi, dan ia lebih ketara dalam Nlrc3-/- tikus berbanding tikus WT (Rajah 4B, C). Penemuan ini menunjukkan

nefropati akut yang dicirikan olehtubul renaldilatasi danpendarahan interstisial buah pinggangtelah diinduksi dalam tikus Nlrc3−/− yang dijangkiti HTNV. Mengenai perubahan patologi lain dalam hati, limpa, paru-paru, kedua-dua kumpulan tikus ini menunjukkan hasil yang sama. Ini terutamanya termasuk hematopoiesis extra-medullary dalam limpa, penebalan dinding alveolar dalam paru-paru, dan degenerasi hati (Rajah Tambahan 3A-F). Berdasarkan perkara di atas, ciri-ciri patologi yang diperhatikan dalam buah pinggang Nlrc3 - / - tikus semasa fasa akut jangkitan HTNV hampir menyerupai perubahan klinikal-patologi dalam kes HFRS manusia.

Berdasarkan ini, kami selanjutnya mengkaji indeks darah dan air kencing yang berkaitan pada tikus untuk gangguan fungsi buah pinggang. Sera tikus dikumpulkan untuk penilaian alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase MB pecahan (CK-MB), urea, serta asid urik (UA). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4D, berbanding dengan tikus kawalan WT, tahap serum UA telah meningkat dengan ketara pada 3 dpi dalam Nlrc3-/- tikus, serum CK-MB telah meningkat dengan ketara pada 9 dpi dalam Nlrc3-/- tikus, tetapi tahap serum ALT, UREA, dan CREA tidak menunjukkan ketinggian (Jadual Tambahan 1).

buah pinggangpenglibatan dalam HFRS yang dijangkiti PUUV termasuk proteinuria sementara, hematuria mikroskopik tetapi jarang kelihatan, dan AKI oligurik, diikuti oleh poliuria dan pemulihan. Ciri khas proteinuria dalam penyakit ini adalah penurunan pesat selepas fasa akut penyakit (6). Dalam kohort besar pesakit dengan nefritis tubulointerstitial akut yang disebabkan oleh pelbagai etiologi, proteinuria ditemui hanya dalam satu perempat daripada pesakit, manakala hanya 2 peratus daripada semua pesakit, proteinuria julat nefrotik ditemui (28). Kami mengumpul air kencing pada 0, 3, 6 dpi dan mendapati tahap protein air kencing meningkat pada 3 dpi, fasa akut jangkitan. Kepekatan protein air kencing telah meningkat dengan ketara dan nilai purata adalah hampir kepada 0.3 g/L pada 3 dpi dalam tikus Nlrc3−/− dan tikus WT yang dijangkiti (Rajah 4E).

Untuk memeriksa sel-sel radang yang menyusup ke dalambuah pingganginterstisial selepas jangkitan HTNV, kami melakukan pewarnaan imunohistokimia (IHC) dengan CD3, F4/80, dan CD11b. Keputusan menunjukkan bahawa sekumpulan sel imun yang positif untuk CD3 telah menyusup ke dalambuah pingganginterstisial selepas jangkitan HTNV (Rajah 5A), dan sel myeloid positif untuk CD11b muncul dalam tubulointerstitial kortikal (Rajah 5B). Perkadaran sel T CD3 tambah yang menyusup dan sel mieloid CD11b serta sel mieloid adalah lebih tinggi secara ketara dalam Nlrc3-/- tikus yang dijangkiti berbanding tikus WT, tetapi makrofaj positif untuk F4/80 diedarkan ke seluruh korteks dan medula renal dan tidak menunjukkan ketara. perbezaan antara dua jenis tetikus ini (Rajah 5C).

Jangkitan HTNV Mengakibatkan Tindak Balas Sitokin Teguh dalam Nlrc3−/− Tikus

Pengeluaran berlebihan sitokin inflamasi biasanya dilaporkan dalam subjek dengan HFRS dan telah menimbulkan hipotesis bahawa disregulasi sitokin mungkin memainkan peranan penting dalam patogenesis penyakit. Vaheri et al. (8) mendapati bahawa berbilang sitokin dihasilkan oleh pelbagai sel, seperti makrofaj, monosit, dan limfosit, sebagai tindak balas kepada isyarat pro-radang seperti jangkitan virus. Wang et al. melaporkan bahawa kepekatan serum TNF-a, IL-6, IFN-g, IL-8, IP-10 dan RANTES (tetapi bukan IL-4) adalah lebih tinggi. dalam pesakit HFRS (29), berbanding dengan kawalan; dan bahawa kepekatan tertinggi biasanya ditemui semasa fasa demam, hipotensi dan oligurik, terutamanya dalam kes HFRS yang teruk dan kritikal. Tahap IL plasma tinggi-6 dikaitkan dengan tahap yang terukbuah pinggangkegagalan dan trombositopenia dalam HFRS yang disebabkan oleh PUUV dan boleh digunakan sebagai penanda keterukan penyakit.

Keputusan kami menunjukkan bahawa jangkitan HTNV membawa kepada pengeluaran sitokin yang tinggi, termasuk CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a dan IFN-g dalam Nlrc3−/− tikus, dan tahap sitokin ini memuncak pada 6 atau 9 dpi; sebagai perbandingan, tikus WT mempunyai tindak balas sitokin yang lebih lemah sepanjang proses jangkitan (Rajah 6).

Sebagai kesimpulan, kami mendapati dalam kajian ini bahawa selepas inokulasi intraperitoneal HTNV, Nlrc3-/- tikus mengalami penurunan berat badan,pendarahan buah pinggang, dan pelebaran tubul. Ciri-ciri ini menyerupai gejala klinikal HFRS dengan lebih dekat berbanding model haiwan lain yang diterbitkan sebelum ini. Selain itu, tikus Nlrc3−/− juga menunjukkan beban virus yang lebih tinggi dalam serum, limpa, dan buah pinggang berbanding tikus WT dan tikus Nlrc3−/− mengalami gangguan hematologi dan perubahan patologi yang ketara dalam pelbagai organ, sekali gus mewujudkan jangkitan HTNV Nlrc3−/ − tikus sebagai model baharu untuk mengkaji HFRS.

PERBINCANGAN

Model tetikus HFRS yang diterangkan di sini menunjukkan bahawa tikus Nlrc3−/− yang dijangkiti HTNV mewakili model haiwan kecil yang sesuai yang boleh digunakan untuk menilai vaksin dan terapeutik HFRS. Model tetikus Nlrc3−/− menyerupai kecederaan sistematik yang diperhatikan pada manusia, dicirikan oleh trombositopenia, limfositopenia, tahap serum AST (disfungsi hati) yang tinggi, LDH, pecahan MB creatine kinase dan UA(disfungsi buah pinggang). Tambahan pula, tikus Nlrc3−/− mengalami penurunan berat badan dan jelaspendarahan buah pinggang. Replikasi virus dan perubahan histopatologi dalam organ sasaran dikesan dalam paru-paru, limpa, hati, dan buah pinggang. Di samping itu, tahap beban RNA virus yang lebih tinggi didapati dalam darah, limpa, dan buah pinggang Nlrc3−/− tikus. Sebagai perbandingan, tikus WT mengalami perubahan histologi ringan walaupun mengesan RNA virus dalam darah, limpa, dan buah pinggang.

Our findings are generally in agreement with what would be expected for HTNV infection-induced HFRS and signify an improvement over previously published animal models. It has been reported that hemorrhagic fever (HF) virus infection in animal models can lead to a spectrum of diseases from asymptomatic to mild and severe and often transient viremia. A transient weight loss usually manifests mild illness, but severe disease showed more significant weight loss (>20 peratus ) (30). Sebagai contoh, hamster yang dijangkiti HTNV melalui laluan hidung membawa kepada jangkitan tanpa gejala yang berterusan, dicirikan oleh viremia sporadis tetapi tahap tinggi salinan genom virus dalam paru-paru, otak, dan buah pinggang. Ferret yang dijangkiti HTNV dos tinggi melalui suntikan otot menunjukkan penurunan berat badan secara beransur-ansur (5-12 peratus dari semasa ke semasa) tetapi masih utuhfungsi buah pinggang, ketiadaan viremia, dan kekurangan penghantaran virus ke organ. Dalam marmoset, suntikan intramuskular HTNV membawa kepada tahap seroconversion dan pengeluaran antibodi peneutral yang tinggi; secara konsisten, haiwan ini tidak mengalami kerosakan buah pinggang, viremia, atau penghantaran virus kepada organ (13).

Mengenai pemerhatian bahawa perubahan hematologi hanya diperhatikan pada satu titik masa dan perubahan sitokin tidak penting, kami fikir ia boleh dijelaskan oleh sifat jangkitan HTNV, yang serupa dengan banyak jangkitan virus lain yang menimpa pelbagai organ, dan oleh itu selalunya. sukar untuk mencari perubahan yang berterusan bagi satu parameter. Secara keseluruhannya, penemuan kami secara amnya selari dengan pengetahuan sedia ada di lapangan. Tambahan pula, penemuan tikus Nlrc3−/− yang lebih mudah terdedah kepada jangkitan HTNV dan menunjukkan banyak perubahan yang serupa dengan perubahan patologi HFRS adalah sumbangan baru kepada bidang ini. Secara umum diterima bahawa sel endothelial vaskular manusia adalah sasaran utama untuk hantavirus , yang membawa kepada darjah berubah-ubah dilatasi kapilari umum dan edema (31).

Antigen virus boleh ditemui di dalam endothelium kapilari pelbagai tisu (Kebolehtelapan sel endothelial terus Hantavirus dengan menyeka sel kepada faktor kebolehtelapan vaskular VEGF, manakala angiopoietin 1 dan sphingosine 1-fosfat menghalang kebolehtelapan terarah hantavirus). Analisis histologi menunjukkan bahawa buah pinggang Nlrc3−/− tikus diperhatikantubul renaldilatasi pada 9 dpi, Nlrc3−/− tikus dengan perubahan patologi yang lebih teruk daripada tikus WT dan telah berterusan pada 12 dpi. Dalam Nlrc3−/− tikus, edema sel epitelium tiub renal dan pendarahan interstisial buah pinggang yang luar biasa diperhatikan di buah pinggang. Selanjutnya, hematopoiesis extra-medullary yang menonjol dalam pulpa merah limpa diperhatikan pada 6, 9, dan 12 dpi, dan pembesaran pusat germinal dan peningkatan bilangan sel gergasi multinukleus pada 12 dpi. Hati juga menunjukkan degenerasi hepatosit yang teruk dan nekrosis bertaburan pada hari ke 3, 6, 9, dan 12 dpi. Keradangan paru-paru dan penebalan dinding alveolar diperhatikan pada 6 dpi. Dapatan ini menunjukkan bahawa jangkitan HTNV mempunyai kesan yang ketara dan jangka panjang pada hati dan buah pinggang dalam tikus Nlrc3-/- yang dijangkiti HTNV. Selain itu, Nlrc3-/- tikus menunjukkan menonjolpelebaran tubul renal, pendarahan interstisial, dan disfungsi buah pinggang selepas jangkitan HTNV. Tahap UA serum meningkat dengan ketara pada 3 dpi, petunjuk jelas tentang disfungsi buah pinggang. Kepekatan protein air kencing telah meningkat dengan ketara dan nilai purata hampir kepada 0.3 g/L pada 3 dpi dalam Nlrc3-/- tikus yang dijangkiti. Trend peningkatan UA yang sama tidak diperhatikan dalam tikus WT. Keputusan ini mencadangkan model kami menyusun semula lebih banyak ciri patologi jangkitan HTNV manusia.

Protein N (NP) dihasilkan dengan banyaknya dalam sel yang dijangkiti hantavirus dan boleh dikesan seawal 4 jam selepas jangkitan (32). Ciri-ciri ini menyumbang sebab utama mengapa titik akhir ELISA adalah untuk mengesan hantavirus N protein dan ujian imunofluoresensi untuk menilai bilangan zarah virus dan perkembangan jangkitan virus. Kaedah yang berbeza boleh menjejaskan keputusan yang diperoleh, dan kesimpulan dicapai. Protein virus dan viremia adalah dua parameter jangkitan virus yang berbeza, dan ia mungkin tidak selalu berubah secara serentak. Keputusan PCR masa nyata kuantitatif menunjukkan bahawa ketinggian sementara tahap NP berlaku pada 6 dpi dalam limpa, di mana virus itu mungkin telah mengalami replikasi sementara, diikuti dengan pelepasannya selepas itu. Seperti yang dijangkakan, pengumpulan protein virus diperhatikan selepas viremia puncak, yang muncul pada 3 dpi. Sesungguhnya, replikasi virus dalam limpa dan buah pinggang dikekalkan pada tahap sederhana pada 9 dan 12 dpi, disertai dengan sintesis protein N (limpa pada 9 dpi: tikus WT: 192 ± 128 salinan per mg; Nlrc3−/− tikus: 431 ± 229 salinan setiap mg; limpa pada 12 dpi: WT tikus: 160 ± 85 salinan setiap mg; Nlrc3−/− tikus: 226 ± 118 salinan setiap mg). Walau bagaimanapun, jumlah HTNV NP pada tahap protein mencapai maksimum pada hari 6 pi dan kekal tinggi sepanjang 9 dan 12 dpi. Perbezaan dalam kinetik salinan RNA virus dan jumlah protein mungkin mencerminkan pereputan pembezaan mereka dalam organ yang berbeza.

Peranan sitokin biasanya lebih kompleks dalam model penyakit. Dalam HFRS yang disebabkan oleh PUUV, terukkegagalan buah pinggangdan trombositopenia dikaitkan dengan paras IL-6 plasma yang tinggi (33). Analisis kami menunjukkan bahawa jangkitan HTNV membawa kepada pengeluaran sitokin yang tinggi, termasuk CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a dan IFN-g dalam Nlrc3−/− tikus, tetapi tidak sebanyak pada tikus WT. Perlu diingat bahawa pada 9 dpi, Nlrc3-/- tikus menunjukkan perubahan patologi yang luar biasa dalam limpa dan buah pinggang mereka, disertai dengan tindak balas sitokin yang teguh pada masa ini. Findings ini menunjukkan bahawa tahap sitokin yang tinggi mungkin berkaitan dengan patogenesis penyakit.

Ringkasnya, keputusan yang kami laporkan di sini menunjukkan bahawa selepas disuntik dengan HTNV melalui laluan intraperitoneal, tikus Nlrc3−/− mengalami penurunan berat badan, trombositopenia, rdisfungsi enal, dan pendarahan.Ini lebih menyerupai gejala klinikal HFRS berbanding model haiwan lain yang diterbitkan sebelum ini. Model ini boleh digunakan untuk menilai potensi vaksin dan terapeutik dan kajian mendalam tentang patogenesis HFRS dalam vivo.