Parasit, Jangkitan, Dan Inokulasi dalam Sel Minimal Sintetik
Oct 27, 2023
ABSTRAK: Sel minimum sintetik menyediakan model yang boleh dikawal dan kejuruteraan untuk proses biologi. Walaupun lebih mudah daripada mana-mana sel semula jadi hidup, sel sintetik menawarkan casis untuk menyiasat asas kimia proses biologi utama. Di sini, kami menunjukkan sistem sel sintetik dengan sel perumah, berinteraksi dengan parasit dan mengalami jangkitan dengan keparahan yang berbeza-beza. Kami menunjukkan cara perumah boleh direkayasa untuk menentang jangkitan, kami menyiasat kos metabolik untuk membawa rintangan, dan kami menunjukkan inokulasi yang mengimunkan perumah terhadap patogen. Kerja kami mengembangkan kotak alat kejuruteraan sel sintetik dengan menunjukkan interaksi hos-patogen dan mekanisme untuk memperoleh imuniti. Ini membawa sistem sel sintetik selangkah lebih dekat untuk menyediakan model komprehensif kehidupan semula jadi yang kompleks.
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
PENGENALAN
Dalam beberapa dekad yang lalu, bidang biologi sintetik telah meletup, membolehkan pembinaan sel sintetik yang menyerupai dan memodelkan aspek kehidupan biologi semula jadi. Memodelkan laluan dan tingkah laku selular dalam sel sintetik menawarkan banyak kelebihan berbanding sel hidup seperti persekitaran tindak balas yang lebih mudah dan jelas, kawalan sepenuhnya ke atas solekan proteomik dan kimia sel, keupayaan untuk membahagikan laluan dan proses biologi yang mengganggu, serta mengekalkan sistem biologi penting yang tidak terdapat dalam sistem tindak balas in vitro.1,2 Aset unik teknologi sel sintetik ini telah membenarkan simulasi keadaan dan laluan biologi dalam bioreaktor in vitro (sel sintetik) seperti hidupan dan membawa pemahaman yang lebih baik kepada banyak bidang kajian, termasuk kesesakan molekul, 3 dinamik lipid-protein, 4 metabolisme minimum, 5 dan banyak lagi aspek kritikal kehidupan biologi.2 Sel-sel sintetik seperti hidupan ini dengan aset uniknya dengan pantas menjadi model yang lebih baik dan memberikan lebih banyak cahaya kepada kerja dalaman yang misteri bagi kehidupan selular.6,7 Penemuan ini tidak terhad kepada proses sel tunggal; interaksi kejuruteraan antara populasi liposom telah membuktikan teknologi yang berkuasa juga. Sebagai contoh, reka bentuk sistem selular sintetik yang meniru hubungan pemangsa-mangsa telah dibangunkan menggunakan cahaya sebagai isyarat antara populasi sel sintetik ini.8 Satu lagi kerja kompleks telah dibangunkan yang membolehkan perambatan isyarat ke seluruh matriks titisan sel sintetik, membenarkan pendarfluor merebak dalam cara spatial di kalangan populasi.9 Selain interaksi sel-sintetik sel sintetik, terdapat kemajuan terkini dalam antara muka sel hidup sel sintetik juga. Sebagai contoh, telah ditunjukkan bahawa sel sintetik yang direka bentuk untuk bersambung dengan sel stem neural mampu mendorong pembezaan saraf serta bertindak sebagai casis umum yang mampu berinteraksi dengan jenis sel lain.10 Terdapat banyak kemajuan dalam pembangunan. pembiakan isyarat dan sel sintetik bertindak sebagai antara muka, yang kebanyakannya diterokai dalam ulasan berikut.11−13 Ringkasnya, terdapat keseluruhan bidang penyelidikan yang berkaitan dengan meniru interaksi populasi selular dalam sistem model sel sintetik. Walaupun begitu, belum ada kajian yang menggunakan sel sintetik untuk memodelkan jangkitan, parasitisme, atau inokulasi. Sama seperti sel sintetik yang biasa digunakan untuk memodelkan proses biologi yang kompleks dengan cara yang mudah dan terkawal, potensi wujud untuk dapat memodelkan interaksi antara organisme yang kompleks ini. Kepentingan ini dapat dilihat dalam kajian terobosan yang berjaya menghasilkan zarah fag aktif dalam platform ekspresi protein bebas sel.14 Kami berhasrat untuk membawa konsep ini ke peringkat makro dengan mereka bentuk populasi sel sintetik yang boleh menjangkiti satu sama lain secara aktif dan merampas genom sel perumah, sama seperti yang dilakukan oleh virus dan parasit hidup. Mampu mengaplikasi dan merekayasa sel sintetik untuk memodelkan tingkah laku penyakit ini akan menyediakan alat yang berharga kepada komuniti saintifik.
Dalam kerja ini, kami mempamerkan sistem kami untuk pemodelan penyakit sel sintetik. Kami merekayasa sel hos yang boleh mengalami jangkitan daripada populasi kedua sel sintetik parasit dan menyiasat persaingan sumber, rampasan genom dan penggunaan semula metabolik yang berlaku semasa jangkitan sedemikian. Kami juga memodelkan kaedah yang membolehkan penyelamatan perumah selepas jangkitan serta cara inokulasi yang akan membolehkan perumah menahan jangkitan sel sintetik yang menyebabkan penyakit. Ringkasnya, kami membentangkan casis model penyakit dan jangkitan baru untuk sel sintetik. Dengan teknologi ini, sel sintetik boleh mula digunakan sebagai model asas untuk penyakit, jangkitan dan inokulasi (Rajah 1).
Rajah 1. Parasit, jangkitan, dan sistem inokulasi dalam sel minimum sintetik. (a) "Hos" ialah sel sintetik yang mengekspresikan protein pendarfluor hijau (GFP). Pada permukaan membran luar, hos membawa tag ssDNA. Satu-satunya protein yang diterjemahkan kepada perumah yang sihat ialah protein perumah sendiri daripada plasmid yang dicipta oleh perumah. (b) "Parasit" ialah liposom yang dipenuhi dengan DNA plasmid yang mengekod gen untuk protein pendarfluor mCherry, dan permukaan liposom parasit dihiasi dengan tag ssDNA (pelengkap kepada tag pada permukaan perumah). "Jangkitan" bermula dengan gabungan liposom perumah dan parasit, yang dimediasi oleh tag DNA pelengkap pada permukaannya. Selepas jangkitan, tuan rumah menyatakan kedua-dua gen tuan rumah asal (GFP) dan gen parasit (mCherry). (c) "Jangkitan" bermula dengan liposom "patogen" yang membawa gen untuk enzim sekatan MunI bercantum dengan liposom perumah. Gen patogen MunI diekspresikan oleh perumah dan enzim sekatan MunI mencerna DNA perumah. Ini mengakibatkan genom perumah asli dicerna, menukar sebahagian besar ekspresi protein perumah daripada GFP kepada protein yang dikodkan oleh patogen, MunI. (d) "Jangkitan maut" ialah gabungan liposom perumah (dengan genom GFP) dengan liposom patogen yang mengandungi pengekodan gen aHL, protein membran. Selepas jangkitan, hos mengekspresikan aHL, yang mencipta liang membran, menyebabkan kebocoran nutrien tuan rumah dan secara berkesan menutup metabolisme tuan rumah. (e) "Imunisasi" ialah pengeraman perumah dengan ssDNA yang mengandungi urutan yang serasi dengan tag gabungan pada permukaan liposom perumah. DNA imunisasi mencipta dupleks dengan tag DNA perumah, menghalang hibridisasi oligo DNA lain kepada tag ini. Ini menghalang percantuman mana-mana liposom patogen kepada perumah. Ini ialah angka bukti konsep, dan graf adalah untuk tujuan ilustrasi, mewakili jumlah relatif protein yang dinyatakan daripada perumah dan pelbagai patogen. Data sebenar untuk setiap sistem disediakan dalam angka seterusnya.
KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN
Dalam kerja ini, kami menggunakan perkataan: hos, parasit, jangkitan, maut, vaksin, dan inokulasi semuanya dalam konteks sistem sel sintetik yang tidak hidup. Dengan jangkitan "maut", kami maksudkan penurunan ketara dalam terjemahan dalam populasi sel sintetik. Semua eksperimen dalam kerja ini dilakukan pada sel sintetik yang tidak hidup, tidak mereplikasi sendiri dan tidak berkembang. Ini adalah sistem model untuk sifat dan proses biologi semula jadi.
faedah tambahan cistanche-meningkatkan imuniti
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity
【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Jangkitan Sel Sintetik dengan Sel Sintetik Parasit Merampas Sumber Hos.
Untuk menguji konsep sistem sel sintetik yang meniru jangkitan, kami bermula dengan membina sistem model untuk parasit. Kami menggunakan konsep parasit paling mudah yang mungkin untuk membentuk semula dalam sistem biokimia tidak hidup ini: parasit yang merampas beberapa sumber hos. Dalam kes ini, metabolisme tuan rumah diwakili oleh ekspresi protein GFP, dan parasit diwakili oleh ekspresi protein mCherry. Untuk sistem ini, kami menggunakan fenomena hasil ekspresi protein linear yang ditunjukkan sebelum ini bergantung pada kepekatan templat DNA dalam TxTl.15,16 Pertama, kami berusaha untuk mencari jumlah kepekatan plasmid optimum di mana nisbah GFP dan DNA mCherry sepadan dengan nisbah pendarfluor yang diperhatikan daripada protein ini. Kami sewenang-wenangnya menetapkan gen GFP sebagai "tuan rumah" dan gen mCherry sebagai "parasit". Nama-nama ini menandakan tiada yang istimewa dalam eksperimen khusus ini tetapi akan menunjukkan perumah dan parasit dalam eksperimen sel sintetik berikutnya. Di sini, kami menggunakan nama ini untuk menjadikannya lebih mudah untuk mengaitkan eksperimen konsep bukti ini dengan eksperimen jangkitan sel sintetik berikutnya menggunakan plasmid yang sama. Kami mencampurkan plasmid GFP dan mCherry, dengan kedua-dua gen di bawah kawalan promoter T7 pada nisbah plasmid yang berbeza-beza dan jumlah kepekatan plasmid dalam sampel 1, 5, 10, atau 15 nM (Rajah 2b). Hasilnya mengikuti hubungan hampir linear yang dijangkakan antara kepekatan plasmid dan keamatan pendarfluor yang direkodkan, dengan padanan terbaik antara nisbah kepekatan pendarfluor dan plasmid diperhatikan pada jumlah 10 nM plasmid. Hubungan yang diperhatikan menunjukkan bahawa plasmid, dengan saiz protein yang serupa dan komposisi asid amino (Rajah S1), bersaing untuk kumpulan sumber TxTl yang sama untuk ekspresinya. Menukar kepekatan relatif kedua-dua plasmid menghasilkan perubahan dalam kecekapan ungkapan secara kasar berkadar dengan nisbah plasmid. Ini menunjukkan bahawa ia akan menjadi model yang baik untuk meniru jangkitan parasit: genom parasit (plasmid mCherry) akan bersaing dengan genom perumah (plasmid GFP). Seterusnya, kami memutuskan untuk menguji kes di mana salah satu plasmid berada di bawah kawalan penganjur yang lebih kuat, dengan itu meniru senario peruntukan sumber yang berat sebelah. Untuk mengekalkan aspek persaingan sumber eksperimen jangkitan "parasit" masa hadapan, kami menyimpan kedua-dua gen di bawah penganjur polimerase RNA yang sama (polimerase RNA T7, RNAP T7) tetapi mengubah kekuatannya. Kami menggunakan promoter T7 RNAP T7Max yang kuat, yang menunjukkan hasil transkripsi yang lebih tinggi dengan ketara, menghasilkan hasil terjemahan yang lebih tinggi, dalam TxTl.17 Kami menguji persediaan tindak balas yang sama dengan yang diterangkan sebelum ini: dua plasmid pada nisbah berbeza, diuji pada jumlah akhir yang berbeza-beza kepekatan plasmid. Salah satu plasmid berada di bawah kawalan promoter T7Max yang kuat, manakala satu lagi berada di bawah promoter T7 kanonik. Dalam kedua-dua kes ujian, ekspresi plasmid T7Max cukup kuat sehingga pendarfluor protein daripada gen di bawah T7Max tidak meningkat dengan ketara dengan peningkatan jumlah kepekatan plasmid (Rajah 2c, 2d). Nampaknya tidak penting jika T7Max memandu GFP atau mCherry, kedua-dua protein bertindak balas kepada promoter yang lebih kuat dengan peningkatan relatif yang sama. Ini menyediakan model yang menjanjikan untuk jangkitan dengan parasit "lebih kuat" (parasit yang membawa gen di bawah T7Max ke dalam perumah di bawah T7) dan membalikkan, perumah yang lebih kuat menentang parasit yang lebih lemah (perumah dengan genom di bawah T7Max dan parasit yang membawa gen T7). Digalakkan oleh eksperimen bukti prinsip ini, kami beralih kepada eksperimen sel sintetik.
"Jangkitan," dalam semua kes, adalah gabungan sel sintetik perumah dan parasit. Percantuman difasilitasi oleh tag DNA pada permukaan liposom, menggunakan sistem cantuman DNA yang diterangkan sebelum ini.18 Secara ringkas, sel sintetik telah dicipta dengan Escherichia coli TxTl di dalam membran POPC dan kolesterol, dan risalah luar telah dihiasi. dengan DNA untai tunggal yang berlabuh pada membran oleh pengubahsuaian kolesterol. Jika sepasang liposom dengan tag pelengkap bertemu, tag DNA berhibrid, membawa membran bersama-sama dan memulakan gabungan membran, yang diikuti dengan pencampuran lumen. Dalam eksperimen kami, sel sintetik hos ialah liposom yang mengandungi TxTl dengan T7 RNAP sebagai tambahan kepada genom GFP yang dikodkan plasmid. Memantau pendarfluor GFP berfungsi sebagai proksi untuk "kesihatan" metabolisme hos. Parasit yang masuk mengandungi genom dalam bentuk pengekodan plasmid mCherry, sistem terjemahan lengkap, tetapi tiada polimerase RNA T7. Ini memastikan bahawa sebarang perubahan yang diperhatikan dalam metabolisme perumah terhasil daripada gen yang dibawa masuk oleh parasit dan bukan daripada gabungan parasit dan liposom perumah, mencairkan sitoplasma perumah. Eksperimen jangkitan parasit telah dijalankan dengan membran perumah yang dilabelkan dengan Marina Blue DHPE, pewarna lipid membran biru. Ini membolehkan kami menormalkan pendarfluor gen perumah dan parasit yang diperhatikan kepada pendarfluor biru, menormalkan keputusan kepada jumlah keseluruhan pendarfluor membran perumah yang terdapat dalam sampel. Ini menyumbang kepada pencairan jumlah isipadu sampel selepas penambahan liposom parasit. Membran parasit tidak dilabelkan secara pendarfluor. Semua eksperimen disertai dengan sampel kawalan, di mana hanya satu populasi yang hadir sebagai tuan rumah, tetapi dengan plasmid mCherry, untuk menunjukkan tahap ekspresi mCherry maksimum teori yang mungkin jika ia adalah satu-satunya gen dalam populasi. Dalam set eksperimen pertama, kami mencampurkan hos dan parasit dengan gen kedua-duanya di bawah kawalan promoter T7 biasajadi kedua-dua gen perumah dan parasit adalah sama-sama "kuat." Kami mencampurkan perumah dengan parasit supaya parasit berada pada 25, 50, atau 75% daripada jumlah populasi liposom. Dalam semua kes, pendarfluor GFP hos berkurangan dengan kehadiran parasit, dengan peningkatan yang sepadan dengan pendarfluor mCherry parasit (Rajah 2e). Sampel dengan hanya parasit dan tiada perumah tidak menghasilkan pendarfluor mana-mana warna, seperti yang dijangkakan. Dalam semua kes, gabungan liposom pengantara DNA tidak 100% cekap;18,19 Oleh itu, penurunan relatif dalam pendarfluor perumah dan peningkatan pendarfluor parasit tidaklah sebesar nilai teori yang dijangkakan berdasarkan nisbah perumah kepada parasit. Dengan kata lain, jangkitan itu tidak 100% berkesan. Kualiti sistem gabungan yang disebabkan DNA ini, dalam kes ini, merupakan ciri yang bermanfaat bagi sistem tersebut. Seperti dalam kes jangkitan semula jadi, jangkitan pengantara gabungan sel sintetik tidak menjejaskan semua perumah dan tidak semua parasit menemui perumah. Seterusnya, kami menyiasat dua kes, di mana hos dan parasit tidak sepadan dengan kekuatan genom mereka. Dalam satu kes, genom tuan rumah berada di bawah kawalan promoter T7 manakala genom parasit berada di bawah promoter T7Max (Rajah 2f), dan dalam senario yang bertentangan, genom tuan rumah berada di bawah T7Max dan genom parasit berada di bawah promoter T7. (Rajah 2g). Dalam kes perumah yang lebih lemah yang diserang oleh parasit yang lebih kuat, peningkatan relatif dalam pendarfluor mCherry parasit dan penurunan yang sepadan dalam pendarfluor GFP perumah adalah lebih kuat daripada dalam kes sebelumnya bagi perumah dan parasit padanan sama rata. Seperti yang dijangkakan, apabila hos lebih kuat daripada parasit, sebaliknya adalah benar: tahap pendarfluor mCherry lebih rendah dan penurunan relatif dalam pendarfluor GFP adalah lebih rendah daripada dalam kes padanan sama rata. Ini terbaik digambarkan dengan membandingkan satu titik data di bawah keadaan jangkitan yang sama: pada nisbah parasit 75%. Populasi perumah dan parasit yang dipadankan secara sama rata menghasilkan pendarfluor parasit yang lebih besar sedikit daripada perumah. Apabila parasit lebih kuat, pendarfluor parasit jauh lebih tinggi daripada perumah. Dan apabila perumah lebih kuat, pendarfluor parasit lebih rendah sedikit daripada perumah. Titik data yang diserlahkan ini ditandakan dengan bintang kuning dalam Rajah 2e−g. Kami melakukan eksperimen kawalan hos yang dijangkiti dengan parasit "asimtomatik" parasit yang membawa plasmid dengan promoter T7 tetapi tiada urutan pengekodan protein (kami mengeluarkan kaset mCherry dari plasmid) (Rajah 2h). Pendarfluor GFP hos berkurangan secara minimum pada tahap parasit yang lebih tinggi, menunjukkan bahawa sejumlah kecil sumber hos ditumpukan untuk menyalin RNA bukan pengekodan pendek daripada plasmid parasit. Data ini juga mengesahkan bahawa beban metabolik utama jangkitan parasit pada perumah terletak pada penggunaan sumber translasi, bukan transkrip. Pemerhatian ini selaras dengan pemerhatian sebelumnya terhadap terjemahan sebagai sumber yang lebih berubah-ubah dan mengehadkan dalam sistem bebas sel.20 Secara keseluruhan, eksperimen ini menyediakan model untuk jangkitan parasit yang merampas sumber metabolik hos, dengan tingkah laku sel sintetik meniru. aspek hubungan perumah-parasit semulajadi.
Rajah 2. Jangkitan parasit merampas sumber perumah. (a) Liposom sel sintetik hos mengandungi sistem terjemahan bebas sel dan pengekodan plasmid GFP. Permukaan hos dihiasi dengan tag ssDNA. Liposom parasit mengandungi pengekodan plasmid mCherry, dengan sistem terjemahan tetapi tiada polimerase RNA (jadi parasit tidak dapat menyatakan mCherry). Permukaan parasit dihiasi dengan tag ssDNA yang melengkapi tag pada permukaan hos. Tag DNA memudahkan percantuman hos dan liposom parasit dan hos mengekspresikan kedua-dua GFP genomnya sendiri dan genom parasit yang mengandungi mCherry. (b−d) Bukti prinsip untuk genom hos (GFP) dan parasit (mCherry) bersaing untuk sumber sel sintetik yang sama. Eksperimen ini dilakukan dalam larutan TxTl, bukan dalam liposom. Dua plasmid, pengekodan GFP dan mCherry, dicampur pada nisbah yang ditunjukkan oleh ikon plasmid di sebelah kiri peta haba, dengan jumlah kepekatan DNA sampel ditunjukkan dalam baris di atas peta haba. Pendarfluor diukur dalam saluran hijau (GFP) dan merah (mCherry). Setiap plasmid telah diuji dalam dua varian dengan promoter yang mempunyai kekuatan yang berbeza: dengan T7 dan dengan promoter T7Max yang lebih kuat. Data individu untuk semua peta haba disediakan dalam Rajah S2−S4. Kursus masa individu yang mewakili untuk ekspresi protein hos T7 dan parasit disediakan dalam Rajah S5−S7 dan untuk parasit T7Max dalam Rajah S8−S10. (cth−g) Jangkitan perumah dengan parasit. Dalam setiap eksperimen, liposom perumah bercampur dengan liposom parasit. Percantuman parasit kepada hos menyampaikan DNA mCherry parasit, yang dinyatakan bersama DNA GFP hos. Nisbah berbeza perumah kepada parasit telah diuji, seperti yang ditunjukkan oleh ikon di bawah graf bar. Genom hos di bawah promoter T7 telah dijangkiti parasit dengan genomnya di bawah panel promoter T7 (e) dan dengan parasit dengan genomnya di bawah panel promoter T7Max (f), hos juga dibuat dengan genom T7Max dan dijangkiti. dengan parasit dengan panel genom T7 (g). Kursus masa individu wakil untuk ekspresi protein disediakan dalam Rajah S11. Eksperimen serupa pada jumlah kepekatan lipid yang lebih tinggi dan lebih rendah disediakan dalam Rajah S12. Surih penulenan pengecualian saiz yang menunjukkan postfusi kestabilan vesikel disediakan dalam Rajah S13. (h) Jangkitan dengan parasit yang tidak serasi: parasit membawa promoter T7 tetapi bukan pengekodan DNA. Bar ralat menunjukkan SEM, n=3. Nilai pendarfluor dalam panel (e−h) dinormalkan kepada pendarfluor biru pewarna membran untuk menormalkan keputusan kepada kepekatan sel perumah. Semua siri sampel yang dilabelkan "hos GFP dijangkiti" adalah eksperimen, di mana hos dan parasit mempunyai tag DNA pelengkap pada permukaan, membolehkan gabungan liposom, yang dipanggil jangkitan. "Hos GFP sihat" berlabel siri menunjukkan sampel, di mana hos dan parasit bercampur pada nisbah yang ditunjukkan, tetapi tidak mengandungi tag gabungan pelengkap, menjadikan jangkitan mustahil. Berlian dalam panel (e−h) menunjukkan satu keadaan jangkitan tertentu yang paling menggambarkan perbezaan dalam hos dan kekuatan ekspresi parasit dalam panel (e−g) dan faedah imuniti hos dalam panel (h). Perbandingan langsung nilai perumah dan parasit yang ditandakan oleh bintang diberikan dalam Rajah S14. Data untuk jangkitan dengan parasit tanpa sebarang plasmid ditunjukkan dalam Rajah S15.
Jangkitan Sel Sintetik Boleh Memusnahkan Genom Hos.
Parasit yang diterangkan di atas menyatakan mCherry pengekodan genom menggunakan sumber hos, tetapi hos mengekalkan beberapa metabolismenya dan terus menyatakan GFP walaupun dijangkiti. Seterusnya, kami memutuskan untuk menyiasat sistem di mana jangkitan mengakibatkan pengambilalihan lengkap metabolisme tuan rumah oleh parasit melalui pemusnahan genom tuan rumah (Rajah 3a). Untuk merekayasa senario sedemikian, kami menyiasat pencernaan enzim sekatan plasmid dalam TxTl. Dalam eksperimen bukti prinsip, enzim sekatan MunI dinyatakan dalam TxTl tanpa liposom. Plasmid MunI dicampur dengan plasmid GFP pada nisbah yang berbeza. Jika plasmid GFP tidak mengandungi tapak sekatan MunI, penurunan yang agak kecil dalam pendarfluor GFP yang diperhatikan boleh diambil kira oleh persaingan yang diterangkan sebelum ini antara kedua-dua plasmid untuk sumber TxTl. Jika plasmid GFP mempunyai tapak sekatan MunI, pendarfluor GFP berkurangan dengan ketara, dan penurunan berskala secara berkadar kepada peningkatan jumlah plasmid pengekodan MunI (Rajah 3b). Ekspresi MunI dipantau melalui Western Blot dan berskala secara berkadar dengan kepekatan plasmid (Rajah 3c).
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Digalakkan oleh keputusan ini, kami menyediakan percubaan jangkitan dengan sel sintetik. Hos membawa plasmid GFP dan patogen membawa plasmid MunI. Kepekatan plasmid GFP dan MunI ditetapkan kepada 2 mM, jauh di bawah kepekatan tepu plasmid untuk TxTl.21 Kami berhasrat untuk kekal di bawah jumlah kepekatan plasmid di mana ekspresi perumah dan parasit akan cukup tinggi untuk bersaing secara langsung untuk sumber terhad ( seperti dalam kes parasit mudah yang diterangkan di atas), sebaliknya berhasrat untuk mengukur kesan enzim parasit secara aktif memusnahkan genom perumah. Seperti dalam eksperimen parasit yang diterangkan sebelum ini, perumah mengandungi TxTl dan T7 RNA polimerase bakteria, patogen hanya membawa ekstrak sel tanpa T7 RNA polimerase, dan kedua-dua perumah dan patogen dilabelkan dengan tag gabungan DNA pelengkap. Membran perumah telah dilabelkan dengan Marina Blue DHPE untuk menormalkan hasil pendarfluor kepada kepekatan liposom perumah. Perumah dan patogen bercampur pada nisbah yang berbeza-beza, dengan patogen ialah 25, 50, atau 75% daripada jumlah populasi. Pendarfluor hos yang "dijangkiti", di mana hos dan patogen mengandungi tag gabungan pelengkap, berkurangan dengan peningkatan jumlah patogen. Pendarfluor GFP daripada hos "sihat", di mana patogen tidak mengandungi tag gabungan pelengkap, tidak berkurangan dengan kehadiran sebarang jumlah patogen. Sampel dengan hanya patogen menyebabkan tiada pendarfluor yang boleh diukur (Rajah 3d). Ekspresi protein MunI patogenik dikira menggunakan analisis Western Blot, dengan data ditunjukkan untuk siri sampel hos yang dijangkiti (Rajah 3e). Seterusnya, kami menyiasat jangkitan dalam kes hos yang kebal kepada patogen: plasmid GFP tuan rumah tidak mempunyai tapak sekatan MunI (Rajah 3f). Pendarfluor hos selepas jangkitan berkurangan tetapi tidak begitu ketara seperti dalam kes awal hos dengan tapak MunI dalam genom. Protein patogen MunI dinyatakan pada tahap yang setanding dengan eksperimen jangkitan terdahulu (Rajah 3g), jadi beban metabolik pada perumah adalah serupa. Penurunan pendarfluor perumah yang dijangkiti dalam eksperimen ini disebabkan oleh beberapa sumber perumah yang dirampas oleh patogen yang mengekspresikan MunI, tetapi kerana jumlah kepekatan plasmid adalah jauh lebih rendah daripada eksperimen patogen mudah terdahulu, penurunan pendarfluor perumah adalah kurang ketara. Eksperimen ini juga mengesahkan bahawa penurunan pendarfluor hos dengan tapak MunI (Rajah 3d) disebabkan oleh kursus masa ekspresi protein yang disediakan dalam Rajah S22. (g) Ekspresi MunI telah dikesan melalui analisis blot barat melalui eksperimen untuk sampel yang ditunjukkan dalam siri "GFP dijangkiti" dalam panel (f). Bar ralat pada semua panel menunjukkan SEM, n=3. Nilai pendarfluor dalam panel (d, f) dinormalkan kepada pendarfluor biru pewarna membran yang digunakan untuk menormalkan keputusan kepada kepekatan sel perumah. Pendarfluor dalam panel (b) dinormalkan kepada 0 mM MunI plasmid untuk setiap siri sampel. Simbol berlian dalam panel (d, f) menyerlahkan satu keadaan tertentu yang paling menggambarkan perbezaan tindak balas terhadap jangkitan daripada hos yang terdedah kepada panel patogen (d) dan kebal kepada panel patogen (f). Semua siri sampel yang dilabelkan "GFP dijangkiti" adalah eksperimen, di mana hos dan patogen mempunyai tag DNA pelengkap pada permukaan, membolehkan gabungan liposom, yang dipanggil jangkitan. Siri berlabel "GFP sihat" menunjukkan sampel, di mana hos dan patogen bercampur pada nisbah yang ditunjukkan tetapi tidak mengandungi tag gabungan pelengkap, menjadikan jangkitan mustahil.
Rajah 3. Jangkitan memusnahkan genom perumah dan merampas sumber perumah. (a) Sel hos mengandungi pengekodan plasmid GFP, dengan dua tapak sekatan MunI; patogen mengandungi pengekodan plasmid enzim sekatan MunI. Selepas gabungan perumah dan patogen, perumah TxTl mengekspresikan enzim sekatan MunI, yang kemudiannya mencerna genom perumah. (b) Eksperimen bukti-prinsip untuk jangkitan: Plasmid GFP disediakan dengan dan tanpa tapak sekatan MunI. Plasmid GFP dicampur dengan plasmid MunI dan ekspresi GFP direkodkan. Eksperimen ini dilakukan dalam larutan TxTl tanpa liposom. Bukti-prinsip untuk eksperimen jangkitan, dengan enzim MunI ditambah secara luaran dan bukannya dinyatakan dalam TxTl, ditunjukkan dalam Rajah S16 dan S17. Kursus masa ekspresi protein perwakilan disediakan dalam Rajah S18. (c) Ekspresi MunI dipantau oleh analisis western blot; keamatan jalur MunI dikira dalam sampel yang sama seperti keputusan pendarfluor yang ditunjukkan dalam panel (b) untuk siri "MunI tapak tidak hadir". Blot barat yang mewakili enzim sekatan MunI disediakan dalam Rajah S19. (d) Pendarfluor GFP hos bercampur dengan liposom patogen pada nisbah yang ditunjukkan di bawah graf data. Plasmid GFP hos mempunyai dua tapak sekatan MunI. Kursus masa ekspresi protein perwakilan disediakan dalam Rajah S20. Data untuk eksperimen jangkitan dengan tag gabungan yang tidak serasi disediakan dalam Rajah S21. (e) Ekspresi MunI telah dikesan melalui analisis blot barat melalui eksperimen untuk sampel yang ditunjukkan dalam siri "GFP dijangkiti" dalam panel (d). (f) Pendarfluor GFP hos bercampur dengan liposom patogen pada nisbah yang ditunjukkan di bawah graf data. GFP hos tidak mempunyai tapak sekatan MunI, memberikannya imuniti kepada protein patogen. Kursus masa ekspresi protein perwakilan disediakan dalam Rajah S22. (g) Ekspresi MunI telah dikesan melalui analisis blot barat melalui eksperimen untuk sampel yang ditunjukkan dalam siri "GFP dijangkiti" dalam panel (f). Bar ralat pada semua panel menunjukkan SEM, n=3. Nilai pendarfluor dalam panel (d, f) dinormalkan kepada pendarfluor biru pewarna membran yang digunakan untuk menormalkan keputusan kepada kepekatan sel perumah. Pendarfluor dalam panel (b) dinormalkan kepada 0 mM MunI plasmid untuk setiap siri sampel. Simbol berlian dalam panel (d, f) menyerlahkan satu keadaan tertentu yang paling menggambarkan perbezaan tindak balas terhadap jangkitan daripada hos yang terdedah kepada panel patogen (d) dan kebal kepada panel patogen (f). Semua siri sampel yang dilabelkan "GFP dijangkiti" adalah eksperimen, di mana hos dan patogen mempunyai tag DNA pelengkap pada permukaan, membolehkan gabungan liposom, yang dipanggil jangkitan. Siri berlabel "GFP sihat" menunjukkan sampel, di mana hos dan patogen bercampur pada nisbah yang ditunjukkan tetapi tidak mengandungi tag gabungan pelengkap, menjadikan jangkitan mustahil.
Jangkitan Sel Sintetik Boleh "Mematikan", Menghabiskan Sumber Sel Hos, dan Jangkitan Sebegitu Boleh "Dirawat" untuk Fungsi Menyelamat.
Eksperimen parasit dan patogen di atas menunjukkan bahawa sel sintetik boleh digunakan sebagai model untuk jangkitan, di mana patogen merampas sumber hos. Seterusnya, kami memutuskan untuk menyiasat senario di mana jangkitan menyebabkan metabolisme hos berhenti berfungsi selepas ekspresi protein patogenik. Dalam kes ini, patogen adalah setanding dengan jangkitan dengan bakteria yang mengeluarkan toksin yang mematikan tolak aspek replikasi perumah atau parasit kerana sel sintetik ini tidak mereplikasi (Rajah 4a). Untuk merekayasa sistem ini, kami memilih hemolysin (aHL), toksin semula jadi dan protein membran yang digunakan secara meluas dalam kejuruteraan sel sintetik untuk mencipta liang membran tidak spesifik.22,23 Kami menghargai ironi pilihan ini kerana aHL secara semula jadi dinyatakan oleh Staphylococcus aureus sebagai toksin, dan protein kemudiannya diperuntukkan untuk merekayasa pengangkutan membran dan memanjangkan metabolisme sel sintetik.24 Di sini, kami kembali menggunakan aHL untuk peranan semula jadinya sebagai toksin berbahaya yang dihasilkan oleh jangkitan. Satu lagi contoh berkaitan kejuruteraan sel sintetik yang ketara dalam menggunakan ketoksikan aHL untuk menyebabkan kematian sel semula jadi datang daripada penggunaan sel sintetik sebagai teknologi terapi kanser.25 Sebagai bukti prinsip, kami menetapkan bahawa menyatakan kepekatan tinggi aHL dalam vesikel sel sintetik mengakibatkan kebocoran kandungan sel dan penurunan ketara dalam ekspresi GFP di dalam sel. Kesan ini boleh diterbalikkan jika bahagian luar liposom mengandungi semua molekul kecil yang diperlukan untuk TxTl (Rajah 4b). Dalam sistem model hos-patogen kami, hos mengandungi plasmid pengekodan GFP dan patogen mengandungi plasmid pengekodan aHL. Semua reka bentuk eksperimen jangkitan adalah serupa dengan senario parasit dan patogen yang diterangkan di atas, dengan patogen tidak membawa T7 RNAP dan kedua-dua hos dan patogen dihiasi dengan tag gabungan DNA. Menariknya, kami memerhatikan bahawa pada kepekatan patogen yang lebih rendah (patogen ialah 25 atau 50% daripada jumlah populasi), pendarfluor perumah berkurangan sedikit sahaja. Walau bagaimanapun, meningkatkan kepekatan patogen kepada 75% mengakibatkan penurunan ketara dalam pendarfluor GFP hos (Rajah 4c). Kami membuat spekulasi bahawa keputusan ini mungkin disebabkan oleh kebocoran nutrien yang agak perlahan daripada sel sintetik pada kepekatan aHL yang lebih rendah. Pendarfluor GFP diukur hanya selepas 12 jam pengeraman dan GFP adalah protein yang sangat stabil. Oleh itu, ada kemungkinan bahawa dalam kes kepekatan aHL yang lebih rendah (jumlah patogen yang lebih rendah), kebocoran nutrien yang disebabkan oleh aHL adalah cukup perlahan sehingga sel hos mengumpul sejumlah besar GFP sebelum kesan kebocoran yang disebabkan oleh aHL menjadi melumpuhkan kepada metabolisme. Untuk mengasingkan keputusan persaingan mudah untuk sumber antara hos dan genom parasit, kami melakukan eksperimen "jangkitan dengan penyelamatan" di mana penimbal luar mengandungi semua molekul kecil yang menyusun tenaga TxTl, asid amino dan campuran garam. Ini telah ditetapkan sama dengan keadaan "nutrien di luar" yang diuji dalam Rajah 4b. Pengurangan dalam pendarfluor perumah dalam eksperimen ini adalah serupa dengan sampel "jangkitan tanpa penyelamatan" sebelumnya dengan 25 dan 50% tahap patogen. Penurunan pendarfluor hos pada 75% daripada patogen adalah jauh lebih kecil daripada penurunan yang diperhatikan dalam sampel tanpa penyelamatan (Rajah 4d). Perbezaan besar dalam keputusan untuk eksperimen dengan 75% parasit, dengan titik data dalam panel Rajah 4 (c, d) diserlahkan dengan bintang, nampaknya menyokong hipotesis kami bahawa kepekatan aHL yang lebih tinggi menyebabkan kemudaratan pada awal tindak balas. Pada kepekatan patogen yang lebih rendah, kebocoran adalah cukup perlahan sehingga GFP hos terkumpul (seperti yang dilihat dengan dan tanpa nutrien penyelamat), jadi pendarfluor GFP yang diperhatikan berkurangan selepas jangkitan kebanyakannya disebabkan oleh persaingan untuk mendapatkan sumber. Pada kepekatan patogen yang lebih tinggi, pendarfluor GFP dalam sampel dengan nutrien luaran berkurangan kebanyakannya disebabkan oleh persaingan sumber. Eksperimen ini menunjukkan bahawa kita boleh merekayasa sel sintetik untuk memodelkan jangkitan, menghasilkan dua hasil yang berbeza: penalti metabolik jangkitan itu sendiri (penurunan GFP disebabkan persaingan sumber) dan jangkitan yang lebih "maut" akibat pemansuhan ekspresi protein hos. Digalakkan oleh pemerhatian ini, kami memutuskan untuk menyiasat sistem di mana sel sintetik boleh secara aktif menentang jangkitan patogen dan menyiasat penalti metabolik tindak balas sedemikian.
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
Sel Sintetik Boleh Mempertahankan Jangkitan Menggunakan Strategi yang Diilhamkan oleh Bakteria.
Diilhamkan oleh fungsi endonuklease sekatan yang terkenal untuk melindungi bakteria daripada DNA asing, kami berusaha untuk menggunakan strategi ini dalam sel sintetik. Kami mengembangkan sistem parasit yang dibentangkan dalam Rajah 2: sebagai tambahan kepada GFP, kami menambah plasmid yang mengandungi MunI kepada hos. Parasit itu mengandungi mCherry, seperti dalam eksperimen sebelumnya. Plasmid mCherry mengandungi tapak sekatan MunI (Rajah 5a). Pertama, kami melakukan eksperimen bukti prinsip untuk menilai beban metabolik mengekspresikan MunI pada hos. Dalam eksperimen TxTl yang tidak berkapsul ini, kami memantau ekspresi GFP dan ekspresi mCherry, masing-masing bercampur dengan peningkatan jumlah plasmid MunI atau EcorI. Semua gen berada di bawah kawalan promoter T7 yang sama. Gen GFP mempunyai EcorI tetapi bukan tapak sekatan MunI dan gen mCherry mempunyai MunI tetapi bukan tapak sekatan EcorI. Apabila plasmid enzim sekatan dicampur dengan plasmid protein pendarfluor tanpa tapak pengecaman untuk enzim sekatan itu, ekspresi protein pendarfluor menurun secara berkadar dengan peningkatan plasmid enzim sekatan, menunjukkan persaingan antara dua plasmid untuk sumber TxTl, seperti yang ditunjukkan sebelum ini untuk GFP dan mCherry dalam Rajah 2. Pasangan bukan pemotong ini ialah GFP dengan MunI (Rajah 5b) dan mCherry dengan EcorI (Rajah 5e). Apabila protein pendarfluor dipasangkan dengan enzim sekatan yang mampu memotong gen untuk protein pendarfluor itu, pendarfluor menurun dengan ketara kepada hampir tahap latar belakang pada kepekatan plasmid enzim sekatan yang lebih tinggi. Pasangan pemotongan ini ialah GFP dengan EcorI (Rajah 5c) dan mCherry dengan MunI (Rajah 5d). Ini menunjukkan penurunan dalam pendarfluor dengan ketara melebihi persaingan mudah untuk sumber dan serupa dengan senario jangkitan yang ditunjukkan dalam Rajah 3. Ekspresi MunI dengan kehadiran GFP mengurangkan ekspresi GFP. Jika kita menggunakan GFP sebagai proksi untuk metabolisme "garis dasar" hos, maka MunI boleh dilihat sebagai beban metabolik pada hos.
Rajah 4. Hos terdedah kepada jangkitan "maut", tetapi tuan rumah boleh diselamatkan. (a) Hos mengandungi plasmid GFP, dan patogen mengandungi pengekodan plasmid saluran membran hemolysin (aHL). Selepas jangkitan, hos mengekspresikan aHL, yang mewujudkan liang-liang dalam membran, menyebabkan kebocoran nutrien dan mengakibatkan penurunan dalam aktiviti metabolik hos. (b) Bukti prinsip untuk aHL yang mengekspresikan hos (tiada jangkitan, hos dicipta dengan kedua-dua 5nM GFP dan jumlah plasmid aHL yang ditunjukkan). Hos diinkubasi dalam penimbal dengan atau tanpa nutrien (semua komponen campuran tenaga, garam dan asid amino yang digunakan untuk menyediakan sistem terjemahan bebas sel hos). Kepekatan nutrien penyelamat optimum telah ditubuhkan secara eksperimen, data ditunjukkan dalam Rajah S23. (c) Jangkitan perumah dengan patogen, dengan jumlah patogen yang berbeza bagi setiap sel perumah. Kebocoran molekul kecil daripada sel "sihat" dan "dijangkiti" diukur secara langsung menggunakan pewarna molekul kecil, data ditunjukkan dalam Rajah S24 dan S25. (d) Eksperimen yang serupa dengan ini ditunjukkan dalam panel (c), tetapi penimbal luar mengandungi nutrien molekul kecil yang serupa dengan keadaan eksperimen "nutrien di luar" yang ditunjukkan dalam panel (b). Bar ralat pada semua panel menunjukkan SEM, n=3. Nilai pendarfluor dalam panel (b−d) dinormalkan kepada pendarfluor biru pewarna membran yang digunakan untuk menormalkan isyarat kepada kepekatan sel perumah. Simbol berlian dalam panel (c, d) menyerlahkan satu keadaan tertentu yang paling menggambarkan perbezaan tindak balas terhadap jangkitan daripada perumah tanpa panel nutrien luar (c) dan kebal terhadap patogen disebabkan oleh kehadiran panel nutrien luar (d). Untuk panel (c, d), siri "GFP dijangkiti" ialah perumah yang bergabung dengan patogen yang membawa protein aHL, dan "GFP sihat" ialah perumah yang bersatu dengan patogen yang tidak membawa plasmid.
Kami meneruskan ke eksperimen jangkitan, mencampurkan perumah (dengan plasmid GFP dan MunI) dengan parasit (dengan plasmid mCherry). Seperti sebelum ini, kami menyiasat senario dengan peningkatan jumlah parasit dalam populasi (Rajah 5f). Kawalan positif mCherry yang mengekspresikan hos sahaja (dengan EcorI dan bukannya MunI untuk mengimbangi beban metabolik) mencipta penanda aras untuk jumlah maksimum teori protein patogen yang boleh dinyatakan dalam hos (Rajah 5f). Apabila jumlah parasit meningkat, pendarfluor GFP hos berkurangan, tetapi penurunan dalam pendarfluor hos yang dijangkiti adalah jauh lebih kecil daripada penurunan ekspresi GFP yang diperhatikan dalam eksperimen terdahulu dengan parasit yang sama. GFP dan parasit mCherry pendarfluor bagi MunI yang mengekspresikan hos yang dijangkiti ini (titik data yang dilabelkan dengan bintang dalam Rajah 5f) boleh dibandingkan secara langsung dengan hos jangkitan serupa tanpa MunI (titik data yang dilabelkan dengan bintang dalam Rajah 2e). Dalam hos yang menyatakan MunI, hos GFP bermula dengan tahap yang sangat rendah semasa sihat (kerana beberapa sumber dialihkan kepada menyatakan MunI) tetapi selepas jangkitan, penurunan pendarfluor hos adalah kurang ketara, dan hos menghasilkan lebih sedikit protein mCherry parasit. daripada dalam kes tuan rumah tidak menyatakan MunI. Percubaan ini menunjukkan faedah tuan rumah membelanjakan beberapa sumber untuk pertahanan terhadap parasit. Sistem ini boleh dilihat sebagai model biokimia yang sangat mudah untuk organisma yang mengekspresikan protein untuk mempertahankan daripada jangkitan masa depan atau bahkan faktor persekitaran yang berbahaya. Hos pada asalnya kurang teguh (jika kita mengambil ekspresi GFP sebagai penanda aras untuk kesihatan hos), tetapi sekiranya berlaku jangkitan, sumber tambahan yang dibelanjakan oleh hos untuk menyatakan protein pertahanan berbaloi, memberikan perlindungan terhadap parasit yang menjangkiti. Oleh itu, dalam sel sintetik tak hidup yang ringkas ini, kami membentuk semula contoh perlumbaan senjata biologi asas.
Rajah 5. Sel perumah mempertahankan daripada jangkitan. (a) Sel hos mengandungi dua plasmid: satu pengekodan GFP (tanpa tapak sekatan MunI) dan pengekodan lain enzim sekatan MunI (gen "rintangan parasit"). Parasit mengandungi plasmid mCherry, dalam sistem yang serupa dengan eksperimen yang ditunjukkan dalam Rajah 2. Jangkitan ini dimediasi oleh pelakuran melalui tag DNA pada permukaan perumah dan parasit. Selepas jangkitan, plasmid mCherry yang diperkenalkan oleh parasit dicerna oleh enzim sekatan MunI hos. (b−e) Mengukur kos metabolik untuk menyatakan rintangan parasit. Eksperimen adalah dalam sistem TxTl pukal, tidak dibungkus dalam vesikel. Dalam setiap eksperimen, plasmid protein pendarfluor (GFP atau mCherry) dicampur dengan plasmid enzim sekatan (MunI atau EcorI) pada nisbah yang ditunjukkan pada paksi-x untuk jumlah kepekatan plasmid 10 mM. GFP mempunyai tapak sekatan EcorI tetapi bukan tapak MunI, dan mCherry mempunyai MunI tetapi bukan tapak sekatan EcorI. Garis arah aliran ialah panduan visual tetapi bukan padanan data. Bar ralat menunjukkan SEM, n=3. Kawalan eksperimen dengan enzim sekatan yang telah dimurnikan, bukannya menyatakannya daripada plasmid, disediakan dalam Rajah S26. Kestabilan liposom dengan peningkatan jumlah plasmid parasit juga diukur, data ditunjukkan dalam Rajah S27. (f) Jangkitan perumah dengan peningkatan jumlah parasit. "Hos GFP sihat" ialah ungkapan GFP daripada sel hos yang bersatu dengan parasit tanpa sebarang plasmid. "Hos GFP dijangkiti" ialah hos yang bergabung dengan parasit yang membawa mCherry. Pendarfluor merah ialah pendarfluor mCherry daripada parasit yang bersatu dengan perumah (hanya data daripada perumah yang dijangkiti tersedia. Sampel perumah yang sihat tidak membawa plasmid mCherry). Bar ralat pada semua panel menunjukkan SEM, n=3. Nilai pendarfluor dinormalkan kepada pendarfluor biru pewarna membran yang digunakan untuk menormalkan keputusan kepada kepekatan sel perumah. Simbol berlian menunjukkan ekspresi protein parasit di bawah keadaan jangkitan tertentu, secara langsung setanding dengan titik data yang diserlahkan dengan bintang dalam Rajah 2e percubaan di bawah keadaan yang sama, tetapi dengan hos yang tidak mempunyai gen rintangan MunI.
Rajah 6. Inokulasi menyediakan pertahanan terhadap jangkitan. (a) Hos mengandungi plasmid GFP. Patogen dalam eksperimen ini adalah salah satu daripada tiga skema jangkitan yang ditunjukkan dalam kertas ini: parasit (seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2), patogen dengan enzim sekatan MunI yang mencerna genom GFP hos (seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3), atau patogen. membawa saluran membran aHL menyebabkan kebocoran nutrien daripada perumah (seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4). Dalam setiap kes, hos dan patogen mengandungi tag gabungan DNA pelengkap. Sebelum memperkenalkan patogen, perumah "diinokulasi": diinkubasi dengan oligos ssDNA berlebihan pelengkap kepada tag DNA gabungan pada permukaan perumah (tag yang sama dengan ini pada patogen tolak bahagian kolesterol yang digunakan untuk menambat tag pada membran patogen). Inokulasi menyebabkan tag gabungan pada permukaan perumah menjadi dua terkandas, sekali gus menjadikan percantuman dengan patogen mustahil. (b) Prinsip pembuktian untuk skim inokulasi. Populasi liposom yang membawa GFP di bawah kawalan promoter RNA T7, tetapi tanpa polimerase RNA T7, digabungkan dengan liposom yang mengandungi polimerase RNA T7. Protein GFP boleh dinyatakan hanya jika kedua-dua populasi bergabung. Satu atau kedua-dua pasangan pembancuh telah "diinokulasi" melalui pengeraman dengan tag DNA yang serasi dengan tag gabungan pada permukaan liposom, menjadikan tag gabungan terkandas dua kali dan dengan itu tidak serasi dengan pelakuran. Kursus masa perwakilan untuk ekspresi protein ditunjukkan dalam Rajah S28. Kawalan eksperimen tanpa sebarang teg gabungan ada dalam Rajah S29 dan kawalan dengan teg gabungan yang tidak serasi disediakan dalam Rajah S30. Kepekatan oligo inokulasi telah ditubuhkan secara eksperimen, data ditunjukkan dalam Rajah S31. (c) Eksperimen jangkitan parasit. Perumah yang membawa GFP telah digabungkan dengan parasit yang membawa mCherry, seperti yang diterangkan dalam Rajah 2. Perumah dan parasit dicampur dengan nisbah yang berbeza-beza perumah kepada parasit; sel hos sama ada diinokulasi (dengan tag gabungan DNA bertali dua yang tidak serasi dengan gabungan) atau tidak diinokulasi (dengan itu terdedah kepada gabungan dengan parasit). Pendarfluor mCherry dilaporkan hanya untuk sampel dengan perumah yang tidak diinokulasi kerana tiada pendarfluor mCherry yang boleh diukur dalam sampel perumah yang disuntik. Inokulasi terbalik telah diuji dengan menyuntik parasit dan bukannya hos, data ditunjukkan dalam Rajah S32. (d) Eksperimen jangkitan dengan genom perumah yang mudah terdedah kepada patogen yang membawa enzim sekatan MunI, seperti yang diterangkan dalam Rajah 3. Siri data yang dijangkiti mewakili perumah tanpa inokulasi, dan siri data yang diinokulasi mewakili sampel dengan perumah yang diinkubasi dengan oligos inokulasi, oleh itu tidak terdedah kepada percantuman dengan patogen. (e) Eksperimen jangkitan dengan patogen yang membawa gen aHL, mengakibatkan saluran aHL membocorkan nutrien keluar daripada sel perumah selepas jangkitan, seperti yang diterangkan dalam Rajah 4. Siri data yang dijangkiti mewakili perumah tanpa inokulasi dan siri data yang diinokulasi mewakili sampel dengan perumah diinkubasi dengan oligos inokulasi, oleh itu tidak terdedah kepada percantuman dengan patogen. Bar ralat pada semua panel menunjukkan SEM, n=3. Nilai pendarfluor dalam panel (c−e) dinormalkan kepada pendarfluor biru pewarna membran yang digunakan untuk menormalkan keputusan kepada kepekatan sel perumah. Sesetengah data yang ditunjukkan dalam rajah ini ialah percubaan dengan persediaan yang serupa dengan eksperimen yang ditunjukkan dalam rajah terdahulu (seperti yang ditunjukkan dalam setiap kapsyen). Eksperimen ini diulang untuk angka ini menghasilkan data menggunakan kumpulan TxTl yang sama untuk membandingkan keputusan secara langsung, menghapuskan kebolehubahan kelompok-ke-kelompok persediaan TxTl.
Inokulasi Sel Sintetik Mencegah Jangkitan.
Dalam contoh yang diterangkan di atas, kami menunjukkan hos mempertahankan terhadap pengaruh genom patogen dengan menyatakan protein tambahan. Seterusnya, kami bertanya sama ada mungkin untuk memodelkan senario, di mana beberapa campur tangan menjadikan hos yang terdedah sebelum ini kebal terhadap jangkitan di tempat pertama. Kami memanggilnya model inokulasi. Walaupun menyedari ini jauh daripada analogi yang sempurna, aspek yang kami fokuskan ialah sel sintetik hos tidak membelanjakan sebarang sumber untuk menjana imuniti. Dalam model imunisasi kami, kami mereka bentuk rawatan yang menukar sel sintetik perumah yang terdedah kepada jangkitan kepada sel yang tidak boleh bergabung dengan patogen. Sistem gabungan sel sintetik yang digunakan sepanjang kertas ini bergantung pada tag DNA untai tunggal untuk mendorong pelakuran membran liposom. Untuk menyuntik terhadap gabungan dengan patogen, kami mengeram sel dengan oligonukleotida DNA yang melengkapi oligo gabungan pada permukaan sel (Rajah 6a). Pertama, kami perlu mengesahkan bahawa inokulasi dengan pengeraman dengan oligo pelengkap berfungsi untuk menghapuskan gabungan. Dalam eksperimen bukti prinsip, dua populasi liposom telah disediakan: satu populasi mempunyai TxTl dengan pengekodan plasmid GFP di bawah kawalan promoter T7 dan populasi lain mempunyai TxTl dan T7 RNA polimerase tetapi tiada plasmid. Selepas gabungan kedua-dua populasi ini, plasmid GFP bercampur dengan polimerase RNA T7 dan ekspresi GFP yang diinduksi. Jika kedua-dua populasi mempunyai tag gabungan tunggal dan pelengkap, gabungan berlaku dan pendarfluor GFP dikesan. Jika satu atau kedua-dua populasi diinkubasi dengan oligonukleotida pelengkap kepada tag gabungan, gabungan liposom tidak berlaku dan GFP tidak dinyatakan (Rajah 6b). Setelah menubuhkan sistem inokulasi, kami terus memperkenalkan inokulasi untuk melindungi sel sintetik perumah dalam tiga senario jangkitan yang diterangkan sebelum ini dalam kerja ini. Mula-mula, kami menggunakan senario parasit yang diterangkan dalam Rajah 2. Sel hos, yang mengandungi genom GFP, telah diinokulasi dengan oligo pelengkap kepada tag gabungan pada permukaan hos, dan hos bercampur dengan parasit mCherry. Kami mencampurkan perumah dengan parasit pada nisbah yang berbeza. Di bawah semua keadaan jangkitan, pendarfluor mCherry parasit tidak dapat dikesan jika perumah disuntik dan pendarfluor GFP perumah yang disuntik tidak berkurangan. Eksperimen kawalan dengan hos yang tidak diinokulasi menunjukkan penurunan dalam ekspresi GFP tuan rumah dan peningkatan dalam isyarat mCherry parasit, seperti yang dijangkakan (Rajah 6c). Seterusnya, kami menggunakan sistem inokulasi untuk kes hos yang dijangkiti patogen yang membawa enzim sekatan MunI pengekodan genom yang mampu mencerna genom GFP hos, seperti dalam eksperimen yang ditunjukkan dalam Rajah 3. Hos yang diinokulasi tidak menunjukkan penurunan. dalam pendarfluor GFP selepas bercampur dengan jumlah patogen yang semakin meningkat, manakala perumah yang tidak diinokulasi telah dijangkiti dan pendarfluor GFP perumah menurun secara berkadar dengan peningkatan jumlah patogen (Rajah 6d). Inokulasi juga berkesan terhadap patogen aHL. Perumah yang diinokulasi tidak menunjukkan penurunan dalam pendarfluor apabila bercampur dengan patogen, manakala pendarfluor GFP perumah yang tidak diinokulasi menurun dengan ketara dengan jangkitan (Rajah 6e). Dalam semua kes, prosedur inokulasi mudah ini, mengeram perumah dengan oligo DNA pelengkap kepada gabungan oligo pada permukaan perumah, adalah mencukupi untuk menghapuskan keupayaan sel sintetik patogen untuk menjangkiti sel perumah. Oleh itu, kami menunjukkan model intervensi fizikokimia mudah yang melindungi sel perumah daripada jangkitan.
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
KESIMPULAN
Dalam kertas ini, kami menunjukkan kaedah untuk menggunakan sel minimum sintetik untuk memodelkan jangkitan parasit dan patogen. Motivasi di sebalik kerja kami adalah dua kali ganda. Kami ingin merekayasa gelagat seperti hidupan yang kompleks ke dalam sel sintetik, memudahkan matlamat untuk membina sel sintetik yang lebih hampir menyerupai sel hidup semula jadi. Kami juga ingin memanfaatkan sistem sel sintetik yang mudah dan boleh dikawal untuk memodelkan sifat asas jangkitan, inokulasi dan proses rintangan. Walaupun sel sintetik tidak berkembang atau mereplikasi sendiri, sistem ini membenarkan untuk mengkaji dinamik jangkitan dalam model yang ringkas dan mudah untuk dianalisis. Kami berharap prinsip jangkitan yang diterangkan di sini akan membantu untuk mencipta model yang praktikal dan terpakai untuk patogen yang berbeza dan mitigasi jangkitan. Mempelajari sistem sel sintetik yang dipermudahkan ini menyerlahkan interaksi asas antara parasit dan patogen. Walaupun sel sintetik tidak (belum) hidup, dan mereka tidak mempunyai keupayaan untuk menjalani evolusi Darwin, sistem ini membolehkan kita memerhati interaksi patogen dan perumah tanpa keupayaan untuk membangunkan imuniti semula jadi atau mengubah virulensi patogen. Walaupun dinamik jangkitan perumah yang dibentangkan di sini menggunakan sel sintetik berasaskan bakteria, sistem ini tidak terhad kepada TxTl bakteria. Malah boleh dibayangkan menggunakan sistem yang dibentangkan di sini untuk memodelkan dinamik jangkitan dalam populasi yang menyerupai ekosistem semula jadi, mengambil kesempatan daripada kesederhanaan yang wujud pada sel sintetik untuk mengawal sepenuhnya dan mengkaji interaksi antara ahli populasi besar yang berbeza.
RUJUKAN
(1)Aplikasi. Mater. Hari ini 2016, 19, 516−532.
(2) Gaut, NJ; Adamala, KP Menyusun Semula Elemen Sel Asli dalam Sel Sintetik. Adv. biol. 2021, 5, No. 2000188.
(3) Tan, C.; Saurabh, S.; Bruchez, MP; Schwartz, R.; Leduc, P. Kesesakan Molekul Membentuk Ekspresi Gen dalam Sistem Nano Sel Sintetik. Nat. Nanoteknol. 2013, 8, 602−608.
(4) Glantz, ST; Berlew, EE; Chow, OLEH Antara Muka Membran Seperti Sel Sintetik untuk Menyiasat Interaksi Protein-Lipid Dinamik, ed. pertama; Elsevier Inc, 2019; Vol. 622.
(5) Zhao, J.; Zhang, Y.; Zhang, X.; Li, C.; Du, H.; Sønderskov, SM; Mu, W.; Dong, M.; Han, X. Meniru Metabolisme Selular dalam Sel Buatan: Pengangkutan Molekul Universal merentasi Membran melalui Gabungan Vesikel. dubur. Kimia. 2022, 94, 3811−3818.
(6) Damiano, L.; Stano, P. Mengenai "Kesamaan Kehidupan" Sel Sintetik. Depan. Bioeng. Bioteknol. 2020, 8, No. 953.
(7) Salehi-Reyhani, A.; Ces, O.; Elani, Y. Tiruan Sel Tiruan sebagai Model Ringkas untuk Kajian Biologi Sel. Exp. biol. Med. 2017, 242, 1309−1317.
(8) Chakraborty, T.; Wegner, SV Sel ke Sel Isyarat melalui Cahaya dalam Komuniti Sel Tiruan: Pemangsa Bercahaya Memikat Mangsa. ACS Nano 2021, 15, 9434−9444.
(9) Dupin, A.; Simmel, Isyarat dan Pembezaan FC dalam Litar Gen Vitro Berasaskan Emulsi Berbilang Petak. Nat. Kimia. 2019, 11, 32−39.
(10) Toparlak, OD; Zasso, J.; Bridi, S.; Serra, MD; Macchi, P.; Conti, L.; Baudet, M.-L.; Mansy, Sel Tiruan SS Memacu Pembezaan Neural. Sci. Adv. 2020, 6, No. eabb4920.
(11) Robinson, AO; Venero, OM; Adamala, KP Ke Arah Kehidupan Sintetik: Komunikasi Sel Sintetik Biomimetik. Curr. Pendapat. Kimia. biol. 2021, 64, 165−173.
(12) Smith, JM; Chowdhry, R.; Booth, MJ Mengawal Komunikasi Sel-Sel Sintetik. Depan. Mol. Biosci. 2022, 8, No. 1321.
(13) Elani, Y. Mengantaramukakan Sel Hidup dan Sintetik sebagai Sempadan Yang Muncul dalam Biologi Sintetik. Angew. Chem., Int. Ed. 2021, 60, 5602− 5611.
(14) Rustad, M.; Eastlund, A.; Jardine, P.; Noireaux, V. Sintesis TXTL Bebas-sel bagi Bakteriofaj T4 Berjangkit dalam Tindak Balas Tiub Uji Tunggal. Synth. biol. 2018, 3, No. ysy002.
(15) Marshall, R.; Noireaux, V. Pemodelan Kuantitatif Transkripsi dan Terjemahan bagi All-E. coli Sistem Tanpa Sel. Sci. Rep. 2019, 9, No. 11980.
(16) Garamella, J.; Marshall, R.; Rustad, M.; Noireaux, V. Kotak Alat All E. coli TX-TL 2.0: Platform untuk Biologi Sintetik Tanpa Sel. ACS Synth. biol. 2016, 5, 344−355.
(17) Deich, C.; Tunai, B.; Sato, W.; Sharon, J.; Aufdembrink, L.; Gaut, NJ; Heili, J.; Stokes, K.; Engelhart, AE; Adamala, Sistem Transkripsi KP T7Max. 2021, 1−28.
(18) Gaut, NJ; Gomez-Garcia, J.; Heili, JM; Tunai, B.; Han, Q.; Engelhart, AE; Adamala, KP Gabungan Boleh Aturcara dan Pembezaan Sel Minima Sintetik. ACS Synth. biol. 2022, 11, 855− 866.
(19) Stengel, G.; Zahn, R.; Höök, F. Gabungan Boleh Aturcara Terinduksi DNA bagi Vesikel Fosfolipid. J. Am. Kimia. Soc. 2007, 129, 9584− 9585.
(20) Chizzolini, F.; Forlin, M.; Yeh Martín, N.; Berlofa, G.; Cecchi, D.; Mansy, Terjemahan Tanpa Sel SS Lebih Berubah daripada Transkripsi. ACS Synth. biol. 2017, 6, 638−647.
(21) Shin, J.; Noireaux, V. An E. coli Kotak Alat Ekspresi Tanpa Sel: Aplikasi untuk Litar Gen Sintetik dan Sel Tiruan. ACS Synth. biol. 2012, 1, 29−41.
(22) Noireaux, V.; Libchaber, A. Bioreaktor Vesikel sebagai Langkah ke arah Perhimpunan Sel Tiruan. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 17669−17674.
(23) Adamala, KP; Martin-Alarcon, DA; Guthrie-Honea, KR; Boyden, Interaksi Litar Genetik Kejuruteraan ES dalam dan antara Sel Minima Sintetik. Nat. Kimia. 2017, 9, 431−439.
(24) Noireaux, V.; Bar-Ziv, R.; Godefroy, J.; Salman, H.; Libchaber, A. Menuju Sel Buatan Berdasarkan Ekspresi Gen dalam Vesikel. Fizik. biol. 2005, 2, P1−P8.
(25) Krinsky, N.; Kaduri, M.; Zinger, A.; Shainsky-Roitman, J.; Goldfeder, M.; Benhar, I.; Hershkovitz, D.; Schroeder, A. Sel Sintetik Mensintesis Protein Terapeutik di dalam Tumor. Adv. Mater Penjagaan Kesihatan. 2018, 7, No. 1701163.
(26) Kwon, YC; Jewett, MC Kaedah Penyediaan Berlaluan Tinggi Ekstrak Mentah untuk Sintesis Protein Bebas Sel Teguh. Sci. Rep. 2015, 5, No. 8663.
(27) Matahari, ZZ; Hayes, CA; Shin, J.; Caschera, F.; Murray, RM; Noireaux, V. Protokol untuk Melaksanakan Sistem Ekspresi Tanpa Sel TXTL Berasaskan Escherichia Coli untuk Biologi Sintetik. J. Vis. Exp. 2013, 79, 1−15.
(28) Fujii, S.; Matsuura, T.; Sunami, T.; Nishikawa, T.; Kazuta, Y.; Paparan Yomo, T. Liposom untuk Pemilihan In Vitro dan Evolusi Protein Membran. Nat. Protoc. 2014, 9, 1578−1591.
(29) Löffler, PMG; Ries, O.; Rabe, A.; Okholm, AH; Thomsen, RP; Kjems, J.; Vogel, S. Lata Gabungan Liposom yang Diprogramkan DNA. Angew. Chem., Int. Ed. 2017, 56, 13228−13231.