Obacunone Melemahkan Fibrosis Hati Dengan Meningkatkan Kesan Anti-Oksidan GPx-4 Dan Perencatan EMT

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Abstrak:Obacunone, triterpenoid limonin yang diekstrak daripada tumbuhan Phellodendronchinense Schneid atau Dic-tamnus dasycarpusb Turcz, menimbulkan pelbagai kesan farmakologi seperti anti-radang, anti-neoplastik, anti-pengoksidaan dan anti-paru-fibrosis. Walau bagaimanapun, kesan anti-fibrotik oba-kon dan mekanisme asas terperinci dalam fibrosis hati masih tidak jelas. Fibrosis hati adalah penyakit melemahkan yang mengancam kesihatan manusia. Faktor pertumbuhan mengubah(TGF)- /P-Smad ialah laluan utama fibrosis yang ditampilkan dengan transformasi epitelium-mesenchymal(EMT) dan pemendapan kolagen, disertai oleh radikal bebas oksigen yang berlebihan. Nrf{12}} bertindak sebagai pengawal selia anti-oksidatif utama yang memacu ekspresi pelbagai gen berkaitan antioksidan. Glutathione peroxidase-4(GPx-4) ialah ahli keluarga glutathione peroxidase yang secara langsung menghalang pengoksidaan fosfolipid untuk mengurangkan tekanan oksidatif. Dalam kajian ini, kami bertujuan untuk meneroka peranan tulang belakang dalam model fibrosis hati tikus yang disebabkan oleh karbon tetraklorida (CCl4) dan dalam sel stellate hepatik (garisan sel LX2) yang dicabar dengan TGF- . Obacunone menunjukkan kesan amelioratif yang kuat pada fibrosis hati kedua-dua dalam LX2 yang diaktifkan dan dalam tisu hati tikus dengan pengurangan tahap -SMA, kolagen1, dan vimentin. Obacunone juga sangat menekan isyarat TGF- / P-Smad dan proses EMT. Sementara itu, obacunone memberikan kesan anti-pengoksidaan yang kuat dengan mengurangkan tahap spesies oksigen reaktif (ROS) dalam kedua-dua model. Kesan antioksidan tulang belakang telah dikaitkan dengan pengaktifan GPx-4 dan Nrf-2. Selain itu, kesan terapeutik tulang belakang pada sel LX2 telah dikeluarkan dengan ketara secara in vitro plus dengan GPx-4 antagonis RSL3, selari dengan tahap ROS yang dinaikkan semula.puritans vitamin cOleh itu, kami menunjukkan bahawa tulang belakang mampu melemahkan fibrosis hati melalui meningkatkan isyarat GPx-4 dan perencatan laluan TGF- /P-Smad dan proses EMT.

Kata kunci:tulang belakang; fibrosis hati; EMT; sel stellate hepatik; GPx-4;TGF- ;tegasan oksidatif

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

1. Pengenalan

Hepatitis kronik biasanya disebabkan oleh hepatitis virus, steatosis bukan alkohol, hepatitis alkohol dan hepatitis autoimun. Kecederaan hepatik yang berterusan mungkin berakhir dengan fibrosis hati, atau juga kanser hati, yang menjejaskan kesihatan manusia secara maut [1]. Fibrosis hati adalah sejenis tindak balas tidak sembuh luka di bawah faktor kecederaan berterusan yang dicirikan oleh pengumpulan berlebihan matriks ekstraselular (ECM) dan pembentukan parut [2]. Sel-sel stellate hepatik (HSCs) biasanya berada dalam keadaan rehat di bawah keadaan normal, ia menjadi aktif secara menyimpang di bawah kecederaan hati kronik dan dipaparkan dengan percambahan tinggi dan rembesan ECM [3], ditandakan sebagai myofibroblas [4]. Memahami mekanisme pengaktifan HSC sangat bernilai untuk pembangunan terapeutik baru untuk merawat fibrosis hepatik.

Faktor pertumbuhan mengubah(TGF-) menggalakkan tindak balas keradangan dengan merangsang ekspresi Interleukin-1 (IL-1) dan Interleukin-6(IL-6) dalam monosit [5]. Selain itu, ia mendorong metastasis kanser melalui transformasi epitelium-mesenchymal(EMT) dan pelarian imun tumor [6-8]. EMT merujuk kepada proses fisiologi yang dinamik di mana sel epitelium kehilangan kekutubannya dan berubah menjadi sel mesenkim seperti fibroblas dan myofibroblas, sekali gus membawa kepada perkembangan fibrosis [9]. Kejadian EMT selalu dikaitkan dengan penurunan regulasi E-cadherin dan peningkatan regulasi penanda sel mesenchymal, seperti N-cadherin dan siput[10]. TGF- -Pengaktifan Smad ialah salah satu laluan intraselular utama dalam EMT serta pembentukan myofibroblast [11].

Tekanan oksidatif dianggap sebagai salah satu punca utama fibrosis dengan pengeluaran berlebihan spesies oksigen reaktif (ROS)[12]. Tahap ROS yang tinggi menyebabkan kerosakan struktur kepada biomolekul, seperti protein, lipid, dan DNA, akhirnya membawa kepada kecederaan sel dan promosi fibrosis [13]. Di bawah tegasan oksidatif, dimer Nrf-2-Keep-1 diasingkan, faktor pernafasan nuklear-2(Nrf-2) diangkut ke dalam nukleus, dan mendorong ekspresi pelbagai enzim antioksidan dengan mengikat dengan unsur tindak balas antioksidan (ARE) mengurangkan tahap ROS[14]. Glutathione peroxidase-4 (GPx-4) ​​bertindak sebagai protein antioksidan dengan aktiviti glutation peroxidase, yang bertanggungjawab terutamanya untuk perencatan pengoksidaan fosfolipid dan pengeluaran ROS dalam proses ferroptosis [15].sistancheKajian tikus telah menunjukkan bahawa fibrosis bertambah teruk selepas kehilangan sama ada Nrf-2 atau GPx-4 [16,17].

Cistanche boleh anti-penuaan

Pada masa ini, terdapat beberapa ubat yang tersedia untuk rawatan fibrosis hati, termasuk yang mempunyai sifat anti-keradangan [18], antioksidan [19], dan agonis reseptor diaktifkan proliferator peroksisom (PPAR) [20]. Dalam kajian baru-baru ini, Prof. Yu mendapati bahawa pesakit dengan sirosis hati mempunyai tahap pengoksidaan lipid yang lebih tinggi berbanding dengan kawalan sihat dalam spesimen klinikal [21]. Beberapa ubat antioksidan seperti resveratrol[19] dan asid ursolik |13]telah menunjukkan kesan yang baik pada fibrosis. Bukti ini secara kumulatif menunjukkan bahawa anti-pengoksidaan adalah strategi yang menjanjikan untuk merawat anti-fibrosis.

Pirfenidone (PFD) ialah ubat piridin untuk fibrosis pulmonari idiopatik (IPF), sementara ia juga menunjukkan kesan terapeutik yang baik pada fibrosis hati dalam pelbagai kajian [22,23]. Oleh itu, PFD dipilih sebagai ubat kawalan positif dalam kajian ini. Obacunone(Oba) ialah sebatian limonoid semulajadi yang diekstrak daripada tumbuhan rutaceous seperti Phellodendri dan Dictamnus-dasycarpus [24], yang mempunyai pelbagai sifat biologi seperti anti-radang |25, antioksida [26], dan anti-tumor [27]. Laporan terkini telah mendedahkan bahawa Oba ialah agonis Nrf-2 yang kuat, yang berkesan mengurangkan fibrosis paru-paru dengan induksi CCL4 dan kerosakan oksidatif pada sel MDA-MB-231 yang disebabkan oleh H, O2. Lebih penting lagi, Oba tidak toksik kepada tikus [28]. Walau bagaimanapun, tiada laporan tentang kesan Oba dalam fibrosis hati dilaporkan, terutamanya pada GPx{16}} pengantara pengoksidaan anti-fosfolipid, TGF- -isyarat Smad dan proses EMT. Di sini, kami berhasrat untuk meneroka kesan Oba pada fibrosis hati dan menentukan mekanisme molekul yang mendasari.

2. Keputusan

2.1. Oba Menghalang Pengaktifan- -Lx-2 TGF

Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >20 uM Oba. Menariknya, dengan peningkatan kepekatan Oba, kesan perencatan a-SMA tidak meningkat dengan ketara （Rajah 1B）.apa itu cistancheOleh itu, kami memilih kepekatan 20 μM untuk eksperimen berikut, dengan PFDserving sebagai kawalan positif. Oba berkesan menghalang paras protein -SMA, kolagen-1, vimentin, dan faktor pertumbuhan tisu penghubung (CTGF) (Rajah 1C), dalam aHSC[3,4]. Selain itu, Oba mengurangkan tahap ekspresi mRNA -SMA, kolagen-1 dan vimentin (Rajah 1D). Keputusan imunofluoresensi selanjutnya mengesahkan bahawa isyarat pewarnaan positif -SMA jelas dikurangkan oleh Oba (berbanding dengan kumpulan TGF-, kerana kiraan sel merah berkurangan selepas rawatan dengan Oba) dalam Lx-2(Rajah 1E). Keputusan ini menunjukkan bahawa Oba memberikan kesan perencatan yang baik pada pengaktifan Lx{13}}.

2.2.Oba Menghalang Isyarat TGF- /Smad, Proses EMT dan Kesan Anti-Radang

Untuk menentukan mekanisme molekul yang mendasari kesan anti-fibrosis di atas, tahap ekspresi protein TGF-Receptor, P-Smad, dan -SMA telah diperhatikan, yang telah dihalang dengan ketara oleh Oba dalam aHSCs (Rajah 2A). Selain itu, protein tahap ekspresi N-cadherin dan siput telah dikurangkan, manakala tahap ekspresi protein E-cadherin dinaikkan (Rajah 2B), menunjukkan bahawa laluan EMT telah disekat juga [3]. Di samping itu, kami mendapati bahawa Oba mendorong tahap IL -6 yang berkurangan (Rajah 2C).Cistanche anti penuaanUntuk menilai lebih lanjut kesan Oba pada keradangan, kami mula-mula merangsang sel HepG-2 (sejenis saluran sel karsinoma hepatoselular manusia) dengan 20 nmol CCl4, diikuti dengan rawatan dengan 20 uM Oba. Keputusan ini menunjukkan bahawa Oba boleh mengurangkan tahap ekspresi mRNA dan protein IL-6 dalam CCl4-merangsang HepG-2(Rajah 2D). Secara keseluruhannya, oba memaparkan pelbagai kesan anti-fibrosis dengan menghalang isyarat TGF- /Smad, dan proses EMT, serta anti-radang.

2.3. Kesan Anti-Fibrosis Oba Bergantung pada Kapasiti Antioksidan yang Dipertingkatkan dengan Mengaktifkan GPXx-4

In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{{0}}.75 μM, daya maju sel Lx-2 telah berkurangan dengan ketara; oleh itu, 0.75-μM RLS telah dipilih untuk campur tangan dalam ekspresi GPx-4.Hasil Western blot menunjukkan bahawa apabila RSL3 ditambah dalam aHSC, ekspresi protein GPx-4 dikurangkan dan penanda profibrotik termasuk -SMA dan vimentin semuanya terbalik dengan ketara, menunjukkan kepentingan GPx-4 dalam mengantarkan kesan anti-fibrosis Oba(Rajah 3D). Sementara itu, Oba jelas mengurangkan tahap ROS aHSC oleh pengesan pendarfluor ROS, dan kesan ini nampaknya disekat oleh RSL3 (Rajah). Data ini menunjukkan bahawa tahap ROS fosfolipid yang lebih rendah yang dimediasi oleh GPx-4 ialah anti-fibrosis utama isyarat Oba.

2.4. Oba Melemahkan CCl4-Fibrosis Hati Tetikus

CCl4-fibrosis hati teraruh ialah salah satu model tetikus yang paling biasa digunakan untuk mengkaji fibrosis hati [3]. Pada peringkat histologi, Oba mengurangkan dengan ketara patologi hati, dibuktikan oleh pemendapan kolagen yang diperbaiki yang ditunjukkan dengan pewarnaan Masson dan pewarnaan anti-SMA. (Rajah 4A-D). Kemudian, paras serum alanine transaminase(ALT)/aspartate transaminase (AST) ditentukan untuk menguji tahap kerosakan hati, berbanding tikus CCL4, kumpulan Oba dos rendah dan kumpulan PFD secara ketara menurunkan paras ALT(p<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">

2.5. Oba Meningkatkan Ungkapan GPx-4, Mengurangkan Keradangan, Ungkapan Protein Berkaitan EMT dan Mengurangkan Tahap Pengoksidaan Lipid dalam CCl4-Fibrosis Hati Terinduksi

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5A, Oba menghalang ekspresi protein IL-6 dan kejadian EMT dalam hati fibrotik tikus dengan tahap siput dan N-cadherin yang berkurangan tetapi tahap E-cadherin yang lebih tinggi. Selain itu, ungkapan protein Nrf-2 dan GPx-4 jelas meningkat selepas rawatan dengan dos sederhana dan tinggi Oba (Rajah 5B).cistanche beefíciosKeputusan Pewarnaan Imunohistokimia (IHC) menunjukkan bahawa berbanding dengan kumpulan model, bilangan sel positif GPx-4 (coklat) dalam kumpulan Oba dos tinggi dan sederhana telah meningkat dengan ketara (Rajah 5C, E). Kami seterusnya menguji tahap tekanan oksidatif dalam hati tikus dan mendapati bahawa, berbanding dengan kawalan, intensiti pendarfluor ROS kumpulan model nampaknya lebih tinggi. Sebaliknya, tahap ROS telah menurun dengan ketara selepas rawatan dengan Oba (Rajah 5D, F).

3. Perbincangan

Fibrosis adalah penyakit intim di dunia. Walau apa pun etiologi, termasuk jangkitan virus, hepatitis alkohol atau bukan alkohol, dan tindak balas autoimun, semuanya berakhir dengan fibrosis akibat kecederaan hati kronik [1]. Pengaktifan HSC adalah peristiwa utama yang mendasari fibrosis hati. HSC diaktifkan dengan pengeluaran menyimpang dari pelbagai faktor fibrogenik dan pemendapan ECM [2,3]. TGF- -isyarat pengaktifan Smad kanonik, proses EMT serta IL-6-keradangan kronik yang berkaitan dilaporkan terlibat dalam proses di atas [3,4]. Untuk menilai kesan anti-fibrosis Oba pada fibrosis hati, pertama sekali kami menumpukan pada menentukan kesannya pada pengaktifan Lx-2 yang disebabkan oleh TGF- , dan kemudian mengesahkan kesan anti-fibrosis in-vivo dengan menggunakan CCl{12}}model tikus fibrosis hati teraruh pada akhirnya.

Oba ialah sebatian limonoid semulajadi [24] dan kesan biologinya terutamanya termasuk fungsi anti-radang [25], antioksidan [26], dan anti-tumor [27]. Baru-baru ini, didapati bahawa Oba ialah agonis Nrf-2 yang kuat dan berkesan serta memberikan kesan anti-pulmonari fibrosis pada tikus [28]. Walau bagaimanapun, bukti masih kurang dalam kesan fibrosis anti-hati dan mekanisme molekul yang berkaitan. Di sini, ekspresi berlebihan -SMA, kolagen 1 dan CTGF semuanya dihalang oleh Oba dalam model Lx-2 yang dirangsang dengan TGF- . Isyarat EMT yang dipertingkatkan juga ditindas dengan berkesan oleh Oba.

Telah disahkan bahawa tekanan oksidatif adalah penyumbang penting kepada fibrosis [12]. Spesies oksigen reaktif (ROS) adalah istilah umum untuk molekul atau ion teroksida dengan aktiviti biologi dan pengeluaran berlebihan pelbagai ROS dalam hepatosit boleh menyebabkan kematiannya dan menimbulkan fibrosis hati [13]. Sebaliknya, HSC yang berehat diaktifkan berikutan kecederaan sel hati dan ROS yang berlebihan menguatkan lebih banyak pengaktifan HSC dan berakhir dengan fibrosis hati [12]. Oleh itu, melembapkan tekanan oksidatif yang berlebihan menjadi rawatan yang berkesan untuk fibrosis.

Nrf-2 ialah pengawal selia kritikal bagi tekanan anti-oksidatif, Nrf terfosforilasi diaktifkan-2 dipindahkan ke dalam nukleus untuk memacu pengawalseliaan atas protein antioksidan hiliran, GST, HO1[15]. Banyak pengaktif kimia semula jadi Nrf2 dilaporkan mempunyai kesan anti-fibrosis, seperti tert-butylhydroquinone dan curcumin. Antara semua protein anti-oksida, glutathione peroxidase-4(GPx-4) ialah ahli keluarga glutathione peroxidase(GPx1-8) dan ia memudahkan keseimbangan redoks dengan mengurangkan glutation [ 30-32]. Dibuktikan bahawa ekspresi glutathione peroksidase{14}} yang lebih tinggi menghalang penyakit hati berlemak bukan alkohol dengan mengurangkan pengeluaran ROS [33]. GPx{17}} mengurangkan fosfolipid peroksida pada membran lipid untuk melindungi sel daripada kecederaan oksidatifJ15]. Kazuya Tsubouchi et al. mendapati bahawa ekspresi GPx-4 dikurangkan dalam tisu fibrosis paru-paru tikus yang disebabkan oleh bleomycin, dan fibrosis lebih teruk apabila gen GPx-4 tersingkir. Selain itu, peroksidasi lipid dan laluan TGF- /P-Smad dipertingkatkan dengan ketara dalam fibroblas paru-paru apabila gen GPx-4 habis [17]. Baru-baru ini, lebih banyak bukti menyokong bahawa ROS yang berasal dari fosfolipid terlibat dalam kematian sel khas, yang dipanggil ferroptosis. Perencat GPx-4, RSL3, digunakan sebagai inducer ferroptosis juga [21,34].

Dalam percubaan kami, kami mendapati bahawa Oba menggunakan kapasiti antioksidan dengan mengawal selia Nrf-2 dan GPx-4 dan Nox yang mengawal selia ke bawah-2. Terutama sekali, kesan anti-fibrosis Oba telah dilemahkan dengan ketara, apabila gen GPx-4 dihalang oleh RSL3, perencat GPx-4. Secara konsisten, tahap ROS yang dikurangkan oleh rawatan Oba juga telah dicerahkan. Pemerhatian in vitro ini sangat menyokong bahawa GPx-4-mediated ROS anti-phospholipid adalah kritikal untuk kesan perlindungan Oba.

Untuk mengesahkan keputusan rawatan anti-fibrosis Oba di atas dalam sel LX2, fibrosis hati tikus yang disebabkan oleh CCl4- telah diperiksa juga. CCl4 adalah sejenis racun hepatotropik, enzim mikrosomal P450 pengantara degradasi menghasilkan radikal bebas yang sangat reaktif untuk memusnahkan integriti membran sel, seterusnya, mencetuskan satu siri disfungsi dan kecederaan hati, akhirnya berkembang menjadi fibrosis hati [35]. Dalam eksperimen kami, Oba menunjukkan kesan kuratif yang baik pada fibrosis hati yang disebabkan oleh CCl. Ia mengurangkan kerosakan hati dengan tahap AST yang lebih rendah, kawasan berkas gentian kolagen menjadi lebih kecil dan ekspresi protein a-SMA, CTGF, Kolagen-1, siput, N-cadherin dan IL{{10 }} semuanya dikurangkan. Walaupun isyarat anti-oksidan, ungkapan protein Nrf-2 dan GPx-4 semuanya juga dinaikkan, tahap ROS yang lebih tinggi menurun. Keputusan ini mengesahkan lagi kesan anti-fibrosis in vitro oleh Oba dan isyarat yang berkaitan, terutamanya perencatan kesan EMT dan anti-oksida oleh Nrf-2 dan GPx-4.

Ringkasnya, kami membuat kesimpulan bahawa Oba mengurangkan TGF- -pengaktifan HSC dan CCl4-mengakibatkan fibrosis hepatik melalui pelbagai mekanisme. Pertama, Oba menghalang pengeluaran TGF- /Smad, EMT dan IL{3}} klasik. Kedua, ia menunjukkan kapasiti antioksidan yang sangat baik dengan mempertingkatkan ungkapan Nrf-2 dan GPx-4. GPx-4pengantara ROS anti-fosfolipid terutamanya menyumbang kepada kesan anti-fibrosisnya. Oleh itu, Oba boleh bertindak sebagai calon pemangku raja untuk pencegahan dan rawatan fibrosis.

Oba menunjukkan beberapa kesan pengawetan pada fibrosis hati yang disebabkan oleh CCl4-dalam tikus C57. Oba boleh turun mengawal ekspresi biomarker protein fibrosis, seperti: -SMA, CTGF, dsb. Sementara itu, Oba mengurangkan ekspresi protein I-6, E-cadherin, dsb. Menariknya Mid-Oba menunjukkan tanda-tanda hasil yang lebih baik berbanding Oba rendah dan Oba tinggi dari segi ekspresi relatif protein ini, walaupun, ia tidak signifikan secara statistik. Walau bagaimanapun, ia menunjukkan bahawa dos optimum boleh menjadi faktor kritikal dalam proses ini, dan kami akan meneroka fenomena ini dalam percubaan seterusnya. Selain itu, kami mendapati bahawa ROS yang lebih rendah dan tahap fibrosis hati dengan ekspresi kawal selia naik Nrf-2 dan GPx-4. Jadi, kami percaya bahawa Oba boleh melegakan fibrosis hati dengan mengawal selia Nrf-2 dan GPx-4. Walau bagaimanapun, PFD mungkin mempunyai tindakan terapeutik yang lebih baik daripada Oba dalam vivo dan vitro. Walau bagaimanapun, Oba adalah lebih baik daripada PFD pada kesan anti-oksidan, ia adalah kondusif untuk meningkatkan kemungkinan mencari ubat baru untuk kesan anti-hati-fibrogenik dari sisi anti-oksidan, dan membuat sedikit sumbangan kepada kesihatan manusia.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Bahan Kimia dan Reagen

Oba (no.B20553, ketulenan Lebih besar daripada atau sama dengan 98 peratus ) dan RSL3 (no. S81241, ketulenan Lebih besar daripada atau sama dengan 98 peratus ) telah dibeli daripada YUANYE Bio-Technology Co., Ltd.(Shanghai, China) dan dibubarkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) (no.R21950; YUANYE) kepada kepekatan 72.64 mg/mL dan 6mmol, masing-masing. Selepas pensterilan penapis, larutan yang terhasil dikekalkan pada -20 darjah C. Penyelesaian itu ditambahkan pada medium kultur untuk mencapai kepekatan DMSO akhir<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">

4.2. Kultur Sel dan Reka Bentuk Eksperimen

Talian sel stellate hepatik manusia Lx-2 dan garisan sel kanser hati manusia Hepg-2 (semuanya diperoleh daripada Jabatan Farmasi, The Fourth Military Medical University, China) telah dibiakkan dalam Medium Helang Modified Dulbecco ( DMEM) ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin dan 1 peratus penisilin (Thermo Fisher Scientific) dan streptomycin (Thermo Fisher Scientific), dan kemudian dikekalkan pada suhu 37C dalam suasana lembap sebanyak 5 peratus CO2 dan 95 peratus udara. Untuk menilai kesan Oba pada daya maju sel Lx-2, Lx-2 telah dilapisi dengan 1×10* sel/telaga dalam 96-plat perigi dan diinkubasi selama 24 jam sebelum penambahan daripada Oba. Kemudian, Lx-2 telah dirawat dengan kepekatan Oba yang berbeza (10,20, 40,80, dan 160 wM dan dikultur selama 24,48, atau 72 jam. Daya maju sel telah diuji oleh CCK8. Untuk menilai kesan Oba pada pengaktifan Lx-2, Lx-2 telah diprakultur dengan medium bebas serum selama 12 jam, diikuti dengan rangsangan dengan TGF- (10ng/mL,24 jam) dan rawatan dengan Oba atau PFD. Untuk menilai kesan Oba pada keradangan, Hepg-2 telah dirangsang oleh CCl4(20 nm,8 h) dan dirawat dengan 20 μM Oba. Pada penghujung kultur, sel-sel telah dikumpulkan dan tertakluk kepada Western blotting dan analisis qPCR masa nyata.

4.3. Haiwan dan Reka Bentuk Eksperimen

Tikus C57 jantan seberat 20± 0.5 g (Pusat Haiwan Makmal Universiti Perubatan Tentera Keempat) ditempatkan dalam keadaan yang sesuai iaitu suhu 25 darjah ± 2 darjah dan 12-h kitaran terang/gelap dengan akses percuma kepada air dan makanan. Setiap eksperimen dalam kajian ini dilakukan mengikut protokol yang diluluskan oleh Jawatankuasa Universiti Perubatan Tentera Keempat mengenai Penjagaan Haiwan. Tikus c57 diagihkan secara rawak kepada 6 kumpulan (n=6 dalam setiap kumpulan) seperti berikut: i) kumpulan kawalan palsu, i) kumpulan model, ii) kumpulan Oba tinggi (CCl4 ditambah 6mg/kg Oba),io )kumpulan Oba sederhana(CCl4 tambah 3 mg/kg Oba）, ø）kumpulan Oba rendah （CCl4 tambah 1.5 mg/kg Oba）, dan vi） kumpulan PFD （CCl4＋ PFD）. Kumpulan model telah dirawat dengan CCl4 (30 peratus CCl4/minyak zaitun,5 mL/kg suntikan intraperitoneal) tiga kali seminggu selama 6-tempoh minggu untuk mendorong fibrosis hati. Kumpulan lain diberi makan dengan dos Oba atau PFD yang berbeza dan jumlah jangkitan intraperitoneal CCil4 yang sama untuk tempoh 6-minggu. Isipadu minyak zaitun yang sama dan bukannya CCl4 telah diberikan kepada C57 oleh ipas a sham control. Setiap percubaan dalam artikel ini dilakukan mengikut protokol yang diluluskan oleh Jawatankuasa Universiti Perubatan Tentera Keempat mengenai Haiwan Peduli.

4.4.Western Blotting

Hati C57 atau sel kultur telah dihomogenkan atau dilisekan dalam penimbal RIPA dengan menggunakan radas lap tisu atau pengikisan sel (Service, KZ-2). Kepekatan protein diukur menggunakan Kit Assay Protein BCA. Lisat telah disentrifugasi (4 darjah, 12,000 rpm, 5 min), dan supernatan telah dikumpulkan. Langkah-langkah operasi telah diikuti seperti yang dilaporkan sebelum ini [14]. Sampel telah diimbas di bawah sistem Pengimejan dan Analisis Chemiluminescent (Beijing Sage Creation Science Co, MiniChemi 610).

4.5. Analisis qPCR Masa Nyata

Hati C57 atau sel kultur telah dihomogenkan atau dilisekan dalam reagen Trizol dengan bantuan radas lapping tisu untuk mengekstrak jumlah RNA. Jumlah RNA telah ditranskripsikan terbalik ke dalam cDNA dengan menggunakan Kit Sintesis cDNA RevertAid First Strand. -aktin digunakan untuk rujukan dalaman. RT-qPCR telah dilakukan pada Sistem qPCR 7500 Masa Nyata (Applied Biosystems) dengan reagen SYBR Premix Ex Taq. Primer gen manusia yang digunakan disenaraikan dalam Jadual 1.

Artikel ini diekstrak daripada Molecules 2021, 26, 318. https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules