Sel T CD4D Antigen-reaktif Nuklear Mengembang dalam Lupus Erythematosus Sistemik Aktif, Menghasilkan Sitokin Efektor, Dan Menceroboh Buah Pinggang
Mar 16, 2022
Kenalan: ali.ma@wecistanche.com
Dimas Abdirama et al
Cistanche DHT untuk penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel
Lupus sistemikeritematosusadalah sistemik dan kronikautoimunpenyakitdicirikan oleh kehilangan toleransi terhadap antigen nuklear dengan autoreaktifCD4DSel T terlibat dalam patogenesis penyakit. Walau bagaimanapun, sangat sedikit yang diketahui tentang kekhususan reseptor mereka sejak pengesanan khusus autoantigen manusiaCD4DSel T telah sangat mencabar. Di sini kami membentangkan analisisCD4DSel T bertindak balas terhadap antigen nuklear menggunakan dua kaedah pelengkap: perpustakaan sel T dan pengayaan sel T reaktif antigen. Frekuensi khusus antigen nuklearCD4DSel T berkorelasi dengan keparahan penyakit. Sel T autoreaktif ini menghasilkan sitokin efektor seperti interferon-g, interleukin-17 dan interleukin-10. Berbanding dengan darah, sel-sel ini diperkaya dalam air kencing pesakit lupus nefritis aktif, mencadangkan penyusupan ke dalam keradangan.buah pinggang. Oleh itu, ciri-ciri yang tidak diiktiraf sebelum ini menyokong peranan sel T CD4D khusus antigen nuklear dalam lupus erythematosus sistemik.
Lupus sistemikeritematosus(SLE) ialah penyakit autoimun sistemik dan kronik yang dicirikan oleh kehilangan toleransi terhadap antigen nuklear akibat pelupusan sisa biologi yang rosak seperti bahan apoptosis yang mengandungi ribonukleoprotein dan nukleosom.1 Autoantibodi yang ditujukan terhadap antigen nuklear adalah ciri SLE dan biasanya berlaku sebelum kejadian yang nyata. penyakit.2Di samping itu, sel T CD4þ autoreaktif terlibat dalam patogenesis SLE dengan menggalakkan pengeluaran autoantibodi oleh sel B dan secara langsung menyebarkan kerosakan organ dalam organ sasaran yang meradang.3Walaupun pengesanan sel T antigen-reaktif nuklear telah dilaporkan sebelum ini, bukti kewujudan mereka kekal melingkar sehingga kini dan pada masa ini tidak jelas bagaimana ia berinteraksi dalam patogenesis.4–9Memahami cara sel-sel ini mengambil bahagian dalam autoimun akan menjadi penting untuk reka bentuk rawatan yang berkesan.
Pengesanan sel T spesifik autoantigen dihalang oleh frekuensinya yang sangat rendah dalam peredaran darah.10 Kajian terdahulu tentang repertoir sel T CD4þ naif manusia telah menggunakan teknologi berasaskan tetramer untuk memberikan maklumat yang tepat tentang tindak balas sel T terhadap epitop antigen tertentu secara berkesan. ; bagaimanapun, kaedah ini memerlukan pengetahuan awal tentang jenis antigen leukosit manusia penderma.11–13Teknik alternatif untuk mengesan dan menghitung populasi sel T yang jarang berlaku secara serentak dengan kereaktifan terhadap antigen berbeza tanpa pengetahuan awal tentang jenis antigen leukosit manusia telah dibangunkan dengan menggunakan perpustakaan sel T poliklonal yang diperkuatkan.14dan melalui pengayaan CD154-mengekspresikan sel T selepas rangsangan dengan antigen yang dipanggil ARTE (pengayaan sel T antigen-reaktif).15
Sel T CD4þ terutamanya menggunakan fungsinya melalui rembesan sitokin apabila pengaktifan antigenik16dan dengan menyebarkan keradangan tisu seperti dalam lupus nefritis (LN) yang mewakili salah satu komplikasi SLE yang paling serius.17,18
Analisis repertoir sel T yang terdapat dalam biopsi buah pinggang daripada pesakit dengan LN mendedahkan oligoklonalitibuah pinggang-menyusup sel T CD4þ, menunjukkan pengumpulan sel T khusus antigen dalam keradanganbuah pinggang.19Kajian terdahulu kami mendedahkan sel T kencing pada pesakit dengan LN aktif sebagai biomarker tepat yang menyerupai fenotip sel intrarenal.20,21Walaupun sel-sel ini diperkaya untuk reseptor kemokin CXC 3 dan reseptor kemokin CC 5 yang mengekspresikan sel T yang menunjukkan populasi sel T helper 1 (Th1) dan mengandungi sel T CD154þ yang menunjukkan pertemuan antigen baru-baru ini,22,23kekhususan antigen mereka terhadap antigen nuklear masih tidak jelas Dalam kajian ini, kami membentangkan analisis sel T CD4þ yang reaktif kepada antigen nuklear dalam sejumlah 17 individu yang sihat,12 subjek dengan SLE tidak aktif, dan 20 subjek dengan SLE aktif dengan menggunakan perpustakaan sel T dan teknik ARTE untuk menganalisis frekuensi sel T CD4þ autoreaktif dalam darah periferi dan air kencing pesakit dengan LN serta pengeluaran sitokin.
KEPUTUSAN
Sel T CD4D antigen-reaktif nuklear dikembangkan SLE tidak aktif seperti yang ditentukan menggunakan perpustakaan sel T dan ARTE
Memandangkan sensitiviti teori yang tinggi untuk mengesan sel T khusus antigen yang jarang ditemui, perpustakaan sel CD4þ T yang diperkuat telah dihasilkan dan disoal siasat untuk kereaktifan terhadap antigen nuklear. Perpustakaan sel T yang diperluaskan daripada 12 pesakit dengan SLE dan 6 kawalan sihat telah dirangsang dengan antigen nuklear kanonik SmD1, RNP70, histon, Ro dan La dengan kehadiran sel pembentang antigen diikuti dengan pengukuran sel percambahan sebagai tindak balas kepada rangsangan antigen (Tambahan Rajah S1A). Oleh kerana letupan sel T yang diperkuatkan bertindak balas secara berbeza kepada antigen, skor z khusus penderma digunakan sebagai ambang percambahan dan tahap indeks rangsangan (tindak balas sel yang dirangsang berbanding dengan sel yang tidak dirangsang) kepada superantigen Staphylococcus enterotoxin B (SEB). ) berkhidmat sebagai kriteria kemasukan (Rajah Tambahan S1B–D). Sebagai tambahan kepada antigen nuklear, kami memasukkan transthyretin sebagai autoantigen kawalan yang tidak relevan (n ¼ 8 pesakit dengan SLE; n ¼ 5 kawalan sihat) (Rajah 1a). Pengesanan sel khusus antigen telah disahkan dengan mencabar satu siri mikrokultur skor positif dengan antigen masing-masing dan menganalisis ungkapan penanda pengaktifan sel T spesifik antigen CD154 dan interferon (IFN) -g dengan menggunakan sesama cytometry24 (Rajah Tambahan). S1E). Menggunakan taburan Poisson,14 frekuensi sel T khusus antigen telah dikira. Terutamanya, frekuensi median beberapa sel T CD4þ antigen-reaktif nuklear telah meningkat pada pesakit dengan SLE aktif jika dibandingkan dengan subjek yang sihat (SmD1: P ¼ 1; RNP70: P ¼ 0.{{ 35}}4; histon: P ¼ 0.35; Ro: P ¼ 0.02; La: P ¼ 0.04 ) dan pesakit dengan SLE tidak aktif (SmD1: P ¼ 0.79; RNP70: P ¼ 0.04; histon: P ¼ 0.23; Ro: P ¼ 0.04; La: P ¼ 0.006) (Rajah 1b). Jumlah bilangan sel CD4þ T autoreaktif yang berkaitan dengan SLE berbeza-beza di kalangan individu dalam julat 0 hingga 185.5 sel setiap 1 juta sel, dengan frekuensi tertinggi pada pesakit dengan SLE aktif (Rajah 1c). Sel T CD4-reaktif antigen nuklear dapat dikesan dalam semua pesakit dengan SLE aktif. Sel-sel ini juga dapat dikesan dalam 5 daripada 6 pesakit dengan SLE yang tidak aktif, manakala hanya 3 daripada 6 kawalan sihat menunjukkan sel T autoreaktif yang beredar. Menariknya, pesakit dengan SLE aktif juga menunjukkan pelbagai tindak balas sel T autoreaktif yang lebih luas, dengan setiap pesakit mempunyai sel T reaktif terhadap sekurang-kurangnya 3 antigen nuklear. Sebagai perbandingan, portfolio sasaran kurang berubah pada pesakit dengan SLE yang tidak aktif dan kawalan sihat. Secara keseluruhan, sel T antigen-reaktif nuklear yang beredar tidak eksklusif untuk SLE, namun SLE tidak aktif, bilangannya lebih besar dan struktur sasarannya lebih berubah-ubah.
Oleh kerana sel T autoreaktif memainkan peranan dalam menyebarkan tindak balas autoimun, kami membandingkan bilangan sel T autoreaktif dengan keterukan penyakit, yang dinilai oleh skor indeks aktiviti penyakit SLE (SLEDAI). Hanya frekuensi sel T CD4þ yang reaktif kepada RNP70, Ro, dan La berkorelasi positif dengan SLEDAI (RNP70: P ¼ 0.04, r ¼ { {11}}.4865; Ro: P ¼ 0.005, r ¼ 0.6299; La: P ¼ 0.01, r ¼ 0.5651) (Rajah 1d). Sebaliknya, kekerapan sel T reaktif kepada transthyretin didapati pada tahap yang agak serupa di semua 3 kumpulan (Rajah 1e), dengan itu menolak kemungkinan bias eksperimen disebabkan oleh hiperreaktiviti sel T bukan antigen spesifik umum SLE yang tidak aktif.
Perpustakaan sel T menawarkan satu siri kelebihan termasuk kepekaan yang tinggi untuk mengesan sel yang sangat jarang berlaku dalam bilangan sel input yang rendah. Walau bagaimanapun, teknik ini bergantung pada pengembangan sel, yang boleh mengubah komposisi sel dan hanya memberikan kemungkinan terhad untuk mencirikan sel reaktif secara fenotip. Oleh itu, kami mengesahkan pemerhatian kami dengan kaedah ARTE. Protokol ARTE memerlukan jumlah sel input yang lebih besar, yang amat mencabar pada pesakit SLE yang sering mengalami limfopenia dan anemia. Disebabkan oleh pengehadan ini dan juga untuk meningkatkan bacaan jangkaan sel reaktif, kami mengumpulkan kesemua 5 antigen nuklear kanonik dan menggunakan kumpulan ini untuk merangsang sel mononuklear darah periferi (PBMC) sebelum pengayaan CD154-sel ekspresi (n ¼ 15). pesakit SLE; n ¼ 6 kawalan sihat). Menggunakan gabungan penanda permukaan CD154 dan CD69, sel T yang reaktif terhadap antigen nuklear yang berkaitan dengan SLE boleh dikenal pasti dalam populasi latar belakang (Rajah 1f). Walaupun ekspresi latar belakang CD154 dan CD69 banyak diperhatikan dalam semua individu, pesakit dengan SLE aktif telah meningkatkan frekuensi sel T CD154þCD69þ dengan ketara apabila dirangsang dengan antigen nuklear berbanding dengan rangsangan latar belakang (P ¼ 0.0{ {18}}8), manakala individu yang sihat dan pesakit dengan SLE yang tidak aktif mempunyai frekuensi yang sama antara sel yang dirangsang antigen dan yang tidak dirangsang (individu yang sihat: P ¼ 0.44; pesakit dengan SLE yang tidak aktif: P ¼ {{23} }.56) (Rajah 1g). Tambahan pula, dengan menolak frekuensi latar belakang, frekuensi sel T antigen-reaktif nuklear adalah lebih tinggi pada pesakit dengan penyakit aktif berbanding individu yang sihat dan pesakit dengan penyakit tidak aktif (P ¼ 0.02 dan P ¼ 0.11, masing-masing) (Rajah 1h). Kekerapan sel T antigen-reaktif nuklear latar belakang yang dikurangkan dengan itu berkorelasi positif dengan aktiviti penyakit (P ¼ 0.004, r ¼ 0.5978), mencadangkan potensi peranan mereka dalam patogenesis SLE (Rajah 1i). Lebih-lebih lagi, sel T CD4 yang reaktif kepada antigen penarikan semula Candida albicans MP65 menunjukkan frekuensi yang sama di seluruh penderma (Rajah 1j), tidak termasuk kemungkinan kecenderungan umum terhadap frekuensi yang lebih tinggi bagi sel T antigen-reaktif pada pesakit dengan SLE aktif.
Secara kolektif, data kami yang dijana menggunakan perpustakaan sel T dan kaedah ARTE menunjukkan pengembangan sel T CD4þ autoantigen khusus pada pesakit dengan SLE aktif. Kedua-dua teknik adalah setanding seperti yang ditunjukkan oleh nilai indeks rangsangan median yang serupa antara tindak balas sel T yang dirangsang antigen dan tidak dirangsang (indeks rangsangan median—perpustakaan sel T: 1.857; ARTE: 1.614; P ¼ 0.33), walaupun teknik ARTE mendedahkan frekuensi sel T CD4þ antigen-reaktif nuklear yang lebih tinggi daripada teknik perpustakaan sel T (Rajah 1k).
Sel T antigen-reaktif nuklear dalam individu yang sihat adalah sel T CD4D autoreaktif bona fife
Kedua-dua perpustakaan sel T dan teknik ARTE menunjukkan pengesanan sel T autoreaktif dalam individu yang sihat, yang mewakili kemungkinan asal untuk pembangunan autoimun manusia.25Walau bagaimanapun, bilangan mereka tidak jauh berbeza daripada frekuensi latar belakang, menjadikannya tidak pasti sama ada subjek yang sihat sememangnya perlu mengedarkan sel T CD4-reaktif antigen nuklear. Untuk membongkar kekhususan antigen sel T autoreaktif dalam subjek yang sihat, kami menghasilkan klon sel T tunggal daripada prekursor sel T CD154þCD69þ CD4þ yang diasingkan daripada individu yang sihat selepas rangsangan PBMC dengan antigen nuklear individu dan antigen kawalan yang diperoleh daripada Aspergillus fumigatus lysate. Sebilangan besar klon sel T autoantigen yang berkaitan dengan SLE bertindak balas terhadap antigen yang sepadan selepas rangsangan semula antigen seperti yang diserlahkan oleh ekspresi bersama IFN-g dengan CD154 (bilangan klon khusus-Aspergillus fumigatus: 5 daripada 5; SmD1: 4 daripada 8; RNP70: 3 daripada 11; histon: 5 daripada 5; Ro: 4 daripada 9; La: 5 daripada 7) (Rajah Tambahan S2A dan B). Selain itu, tindak balas antigen (secara perwakilan ditunjukkan untuk SmD1) adalah bergantung kepada dos, menekankan bahawa sel T antigen-reaktif nuklear dalam individu yang sihat adalah sel T CD4 þ autoreaktif bona fife (Supplementary Figure S2C). Oleh itu, kami mengesahkan kewujudan sel T antigen-reaktif nuklear dalam subjek yang sihat dalam isyarat latar belakang kaedah pengesanan yang digunakan.
Pengeluaran sitokin sel T CD4D antigen-reaktif nuklear
Kami seterusnya mengkaji pengeluaran sitokin sel T CD4-reaktif antigen nuklear. Sel pengekspresi CD154-diwarnakan secara intraselular untuk sitokin efektor seperti IFN-g, interleukin (IL)-17, IL-4 dan IL-10 selepas rangsangan dengan kumpulan Antigen nuklear yang berkaitan dengan SLE (Rajah 2a). Kekerapan IFN-g–, IL-17–, dan IL{{10}}–menghasilkan sel T CD154þCD4þ meningkat dengan ketara pada pesakit dengan SLE aktif (semua sitokin: P ¼ {{16} }.004), manakala kekerapan IL-4–menghasilkan sel T autoreaktif kekal tidak dapat dibezakan daripada kekerapan latar belakang (P ¼ 0.125) (Rajah 2b ). Selain itu, bilangan mutlak sel T autoreaktif IFN-g– dan IL{{20}}–menghasilkan lebih tinggi pada pesakit dengan SLE aktif berbanding individu yang sihat dan pesakit dengan SLE tidak aktif (Rajah 2b). Dengan menolak frekuensi latar belakang, pesakit dengan SLE aktif mempunyai frekuensi IFN-g– dan IL-10–menghasilkan sel T autoreaktif yang jauh lebih tinggi berbanding individu yang sihat (IFN-g: P ¼ {{40 }}.003; IL-10: P ¼ 0.004) serta IFN-g– , IL-17–, dan IL-10–menghasilkan sel T autoreaktif berbanding pesakit SLE yang tidak aktif (IFN-g: P ¼ 0.002; IL{{ 36}}: P ¼ 0.002; IL-10: P ¼ 0.005) (Rajah 2c). Selain itu, kekerapan IFN-g– dan IL-10– tetapi bukan IL-17– dan IL-4–menghasilkan antigen nuklear– sel T reaktif berkorelasi dengan aktiviti penyakit. Walau bagaimanapun, hanya kekerapan sel penghasil IL-4 yang menunjukkan kurang korelasi dengan aktiviti penyakit (IFN-g: P <0.0001, r="" ¼="" 0.7574;="" il-17:="" p="" ¼="" 0.005,="" r="" ¼="" 0.5889;="" il="" -4:="" p="" ¼="" 0.14,="" r="" ¼="" 0.3717;="" il-="" 10:="" p="" ¼="" 0.0004,="" r="" ¼="" 0.6977)="" (rajah="" 2d).="" dinilai="" oleh="" kekerapan="" pengeluar="" ifn-g,="" sel="" t="" cd4þ="" antigen-reaktif="" kebanyakannya="" daripada="" keturunan="" th1.="" sebaliknya,="" il-17,="" serta="" pengeluar="" il-10,="" dikesan="" hanya="" pada="" frekuensi="" yang="" lebih="" rendah.26="" berbanding="" dengan="" tahap="" autoantibodi,="" frekuensi="" sel="" t="" cd4þ="" yang="" menghasilkan="" sitokin="" tidak="" berkorelasi="" dengan="" kepekatan="" dna="" anti-double-stranded="" dan="" dengan="" titer="" serum="" antibodi="" antinuklear="" (rajah="" tambahan="" s3a="" dan="" b).="" tiada="" korelasi="" lain="" antara="" sel="" cd4þ="" t="" antigen-reaktif="" nuklear="" dan="" autoantibodi="" diperhatikan="" kecuali="" sel="" cd4="" t="" la-reaktif="" terhadap="" autoantibodi="" la="" (rajah="" tambahan="">
Detection of nuclear antigen–reactive CD4D T cells in the urine of patients with active SLE and LN The population of nuclear antigen–reactive Th1 cells is suspected to invade the renal tissue, where they might encounter their almost omnipresent cognate antigen.27 By investigating the T-cell receptor (TCR)-b repertoire of CD4þ T cells isolated from peripheral blood compared with those isolated from the urine of 5 patients with SLE and active LN, we observed oligoclonal skewed TCR repertoires of urine-derived cells (Figure 3a). The cumulative frequency of the 20 most abundant T-cell clones was significantly higher in urine corresponding to a lower diversity index (Supplementary Figure S4A). To test whether these cells also demonstrate reactivity to a set of SLE-associated nuclear antigens, we generated libraries consisting of urinary CD4þ T cells isolated from 3 patients with SLE and active LN (Supplementary Figure S4B). Urinary CD4þ T cells were metabolically and functionally active cells indicated by the ability to proliferate upon stimulation with SEB but with signs of exhaustion shown by a reduced proliferation capacity after polyclonal activation (Supplementary Figure S4C and D). Because of these circumstances, only microcultures with a SEB stimulation index of >4 telah dimasukkan untuk penghitungan sel CD4þ T kencing khusus untuk antigen nuklear individu. Selari dengan sel T CD4 þ kencing, kekerapan sel T CD4 þ antigen-reaktif nuklear dalam darah periferi telah ditentukan, membolehkan perbandingan terus bagi frekuensi masing-masing dalam individu yang sama (Rajah 3b). Kami mendapati bahawa LN tidak aktif, frekuensi sel T CD4þ antigen-reaktif nuklear kencing adalah lebih tinggi daripada darah periferi. Untuk mengesahkan pemerhatian ini, kami melabelkan sel kencing yang diasingkan daripada 4 penderma LN aktif dengan ester carboxyfluorescein succinimidyl dan mencampurkan sel berlabel dengan PBMC yang dipadankan dengan penderma untuk membolehkan perbandingan langsung sel antigen-reaktif dalam 1 ujian menggunakan teknik ARTE. Kekerapan sel T CD154þCD69þ dalam sampel yang dirangsang dan tidak dirangsang bagi sel darah kencing dan periferi yang dipadankan dengan penderma telah digunakan untuk menilai sama ada sel T antigen-reaktif nuklear diperkaya dalam air kencing sebagai proksi untukbuah pinggangdengan mengira indeks rangsangan (Rajah 3c). Walaupun perpustakaan sel T urin dan kaedah ARTE berbeza dalam indeks rangsangan median mereka kepada antigen nuklear (indeks rangsangan—pustaka sel T urinari: 17; ARTE: 2.79; P ¼ 0.4) (Rajah 3d) , analisis autoreaktiviti dalam sel T CD4þ periferal dan kencing daripada kedua-dua kaedah (jumlah n ¼ 7) menunjukkan peningkatan indeks rangsangan khusus antigen nuklear dalam air kencing (P ¼ 0.0156) (Rajah 3e). Pemerhatian ini menunjukkan bahawa sel T CD4þ antigen-reaktif nuklear menyerang dan terkumpul dalam sel yang meradang.buah pinggang. Oleh itu, keradangan tisu tempatan dalam SLE mungkin merupakan fenomena khusus antigen dan secara langsung dimodulasi oleh sel T autoreaktif yang menyusup.
PERBINCANGAN
Pemecahan toleransi terhadap antigen nuklear adalah ciri SLE, dan selain sel B, sel T autoreaktif dianggap memainkan peranan penting dalam patogenesisnya. Walau bagaimanapun, sebagai pengesanan (auto) antigen khusus, sel T CD4þ masih menimbulkan cabaran besar dalam penyelidikan autoimun, sehingga kini, sedikit yang sebenarnya diketahui tentang sel T CD4þ antigen-reaktif nuklear dalam SLE.
Baru-baru ini, kaedah baru untuk pengesanan dan penghitungan sel T CD4þ antigen khusus telah dibangunkan. Pendekatan perpustakaan sel T mengeksploitasi pengembangan poliklonal sel T sebelum ini untuk membolehkan pengesanan klon sel T khusus antigen yang jarang ditemui.14 Strategi ini menawarkan sensitiviti yang tinggi dan membolehkan bekerja dengan jumlah sel yang terhad. Menggunakan teknik ini, kami dapat menunjukkan sel T reaktif terhadap 5 antigen nuklear kanonik pada pesakit dengan SLE aktif. Kelemahan pengesanan berasaskan perpustakaan adalah, selain intensif buruh, pertumbuhan atau kehilangan klon tertentu semasa fasa pengembangan tidak boleh dikecualikan dan pilihan terhad untuk analisis fenotip sel.
Sesama sitometri standard dihadkan oleh bilangan peristiwa yang boleh dikesan, yang biasanya mengehadkan analisis sampel kepada populasi dengan frekuensi melebihi {{0}}.01 peratus . Pemerhatian kami menggunakan perpustakaan sel T mendedahkan bahawa kekerapan mengedarkan sel CD4þ T autoreaktif untuk autoantigen tertentu pada pesakit dengan suar penyakit ialah sel w20 dalam sejuta sel, mewakili kekerapan 0.002 peratus; oleh itu, pengesanan sel CD4þ T spesifik autoantigen menggunakan sitometri sesama yang tidak dimanipulasi adalah hampir mustahil. Bacher et al. memperkenalkan pra-pengayaan sel T CD4þ yang reaktif kepada antigen tertentu sebelum pemerolehan pada sesama sitometri, dikenali sebagai kaedah ARTE.15 Menyesuaikan pendekatan ini untuk pengesanan sel CD4þ T spesifik antigen nuklear, kami dapat mengesahkan penemuan kami dan menunjukkan pengembangan sel T CD4þ antigen nuklear-reaktif dalam SLE aktif. Terutamanya, kekerapan sel T reaktif dengan transthyretin dan C. Albicans adalah acuh tak acuh antara kawalan sihat dan pesakit SLE dengan aktiviti penyakit yang berbeza-beza. Oleh itu, pengembangan sel T autoreaktif yang diperhatikan mungkin bukan hasil daripada hiperreaktiviti umum SLE tidak aktif tetapi pengembangan sel T khusus antigen.
Laporan terdahulu telah pun menunjukkan kewujudan sel T autoreaktif dalam SLE, terutamanya menggunakan percambahan, pengeluaran sitokin, atau pengawalseliaan penanda pengaktifan, walaupun tanpa dapat mengukur populasi yang jelas bagi sel-sel ini.4–6,8 Bukti terbaik mengenai kekerapan sel T khusus antigen nuklear wujud untuk kereaktifan terhadap ribonukleoprotein kecil U1, sasaran autoantigen ciri dalam penyakit tisu penghubung campuran dan hanya terdapat dalam sebahagian kecil pesakit dengan SLE. U1 kecil nuklear ribonukleoprotein– sel T CD4þ reaktif ditentukan menggunakan pencairan mengehadkan dan Enzyme-Linked Immuno Spot Assay (ELISPOT) dan dilaporkan berlaku pada kekerapan (40 hingga 250) - 106 sel T dan (20 hingga 60 ) 106 PBMC, masing-masing, 7,9 yang mempunyai magnitud yang sama dengan kekerapan sel autoreaktif dalam kajian kami. Dalam kerja kami, kami menyiasat kereaktifan terhadap beberapa ciri antigen nuklear berkaitan SLE. Menariknya, walaupun semua pesakit dengan LN aktif menunjukkan peningkatan frekuensi sel T CD4 antigen-reaktif anti-nuklear, pesakit berbeza dalam portfolio sasaran mereka, dan kereaktifan disasarkan terhadap set antigen yang lebih luas berbanding pesakit dengan SLE yang tidak aktif. Kepentingan biologi ini tidak diketahui pada masa ini. Kereaktifan sel T CD4 yang berbeza mungkin dikaitkan dengan manifestasi klinikal tertentu kereaktifan berbeza yang mungkin berlebihan untuk patogenesis penyakit.
Sama seperti penyakit autoimun yang lain, kami juga dapat menunjukkan kewujudan sel T CD4 autoreaktif dalam individu yang sihat, 28,29 walaupun pada frekuensi yang jauh lebih rendah berbanding pesakit dengan SLE aktif. Sel-sel ini tidak dapat dikesan dengan membandingkan bilangan sel yang diaktifkan dengan atau tanpa rangsangan antigen, walaupun dengan teknik yang sangat sensitif seperti perpustakaan sel T atau kaedah ARTE. Walau bagaimanapun, dengan pengklonan sel tunggal, kami dapat menunjukkan bahawa isyarat "latar belakang" sememangnya mengandungi sel T CD4þ autoantigen khusus. Peristiwa khusus manakah yang membawa kepada pemecahan toleransi dan peningkatan frekuensi sel T autoreaktif kekal spekulatif; Walau bagaimanapun, data kami menunjukkan bahawa pengembangan klon autoreaktif memainkan peranan dalam patogenesis SLE.
Sel T CD4þ antigen-reaktif nuklear yang beredar terutamanya menghasilkan IFN-g dan, pada tahap yang lebih rendah, IL-17 dan IL-10. Profil sitokin ini bersama-sama dengan korelasi yang lemah/tiada dengan pengeluaran autoantibodi menunjukkan bahawa peranan sel T CD4þ antigen-reaktif nuklear mungkin bukan pembekal eksklusif bantuan sel B. IFN-g telah terbukti sangat diperlukan dalam patogenesis LN.30,31 sel Th1 telah ditunjukkan untuk direkrut ke dalam tisu buah pinggang yang meradang dalam SLE,20,32 menjadikan sel T antigen-reaktif nuklear calon utama untuk menyerangbuah pinggang, di mana mereka akan menemui autoantigen serumpun mereka di mana-mana. Sel T kencing telah diterangkan sebelum ini untuk mencerminkan aktiviti penyakit dan mencerminkan fenotip sel intrarenal dalam LN20,33; Oleh itu, kami menggunakan sel T kencing sebagai proksi untuk sel T buah pinggang. Sel T urinari mendedahkan kebolehubahan TCR yang terhad, yang selaras dengan pemerhatian dalambuah pinggangbiopsi,19,34 menunjukkan pengayaan klon sel T tertentu dalam tisu buah pinggang yang meradang. Di antara sel T kencing, kami dapat mengesan sel T antigen-reaktif nuklear, dan kekerapannya diperkaya berbanding sel T peredaran. Akibatnya, nampaknya sel antigen-reaktif nuklear secara langsung mengambil bahagian dalam penyebaran kerosakan organ tempatan.
Secara ringkasnya, kami di sini menunjukkan bahawa sel T CD4þ antigen-reaktif nuklear dikembangkan SLE tidak aktif; ia adalah fenotipik terutamanya sel Th1 T yang menghasilkan IFN-g dan menyerang organ sasaran yang meradang seperti buah pinggang.
KAEDAH
Kaedah terperinci diberikan dalam Bahan Tambahan.
Subjek dan sampel darah dan air kencing
Sampel darah diperoleh daripada 17 individu yang sihat, 12 pesakit dengan SLE tidak aktif (skor SLEDAI<10), and="" 20="" patients="" with="" active="" sle="" (sledai="" score="">10). Selain itu, sampel air kencing diperoleh daripada 12 pesakit SLE dan LN aktif. Semua subjek telah memberikan persetujuan termaklum mereka berdasarkan kelulusan etika yang diperoleh oleh lembaga semakan institusi dan pihak berkuasa etika diCharité – Universitätsmedizin Berlin (EA 1/342/12, EA 1/098/07, dan 1/036/16). PBMC dan sel-sel kencing disediakan menggunakan kecerunan ketumpatan Ficoll-Hypaque.
Antibodi dan sesama sitometri
Bergantung pada eksperimen, beberapa molekul permukaan telah diwarnakan pada sel yang dirangsang antigen dalam kombinasi berbeza antibodi monoklonal berikut: anti-CD3, -CD4, -CD8, -CD14,-CD20, -CD69, dan -CD154; untuk mendiskriminasi sel hidup dan sel mati, kit Aqua LIVE/DEAD (Life Technologies Ltd., Paisley, UK) telah digunakan. Untuk mengotorkan petak sel intrasel, sel-sel telah difiksasi dengan 2 peratus (v/v) paraformaldehid selama 15 minit pada suhu bilik dan telap dengan BD FACS Permeabilizing Solution 2 (BD Biosciences, San Jose, CA); antigen berikut telah diwarnakan secara intrasel dengan menggunakan protokol standard: CD154, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10 dan IL-17. Sampel telah diperoleh pada BD FACSCanto II dan BD LSRFortessa(BD Biosciences) fellow cytometers di Flow Cytometry Core Facility Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin dengan menggunakan perisian BDFACSDiva (BD Biosciences). Data sitometri aliran dianalisis menggunakan perisian FlowJo (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA).
Penyediaan kolam antigen dan antigen
Kami menggunakan antigen berikut untuk merangsang sel T CD4þ dalam ujian perpustakaan sel T: 0.5 mg/ml protein rekombinan SNRPD1 (SmD1) manusia (Biorbyt Ltd., Cambridge, UK), 5{{9 }} ng/ml protein rekombinan manusiaSNRP70 (RNP70) (Abcam Plc., Cambridge, UK), 0.5 mg/ml protein histon manusia semula jadi (Abcam Plc .), 0.5mg/ml protein rekombinan SS-A/Ro manusia (disediakan dengan baik olehEuroimmun AG, Lübeck, Jerman), 0.5 mg/ml protein SS-B/Larekombinan manusia (disediakan oleh Orgentec DiagnostikaGmbH, Mainz, Jerman) , 1 mg/ml SEB (Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Steinheim, Jerman), 1 mg/ml PepTivator Candidaalbicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Jerman), dan 0.5 mg/ml protein rekombinan transthyretin manusia (ATGen, Seongnam, Korea Selatan).
Perpustakaan sel T periferi dan kencing
The protocol to generate amplified peripheral and urinary T-cell libraries was adopted and adapted as previously described.14 Brieflfly, 200,000 peripheral CD4þ T cells or 500 to 2000 urinary CD4þ T cells were isolated using anti-human CD4 MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) according to manufacturer's instructions. The purity of CD4þ T-cell fraction was routinely checked using fellow cytometry on the basis of CD3þCD4þ expression, where the purity always reached >99 peratus dan 70 peratus hingga 75 peratus untuk sampel darah periferi dan air kencing. Secara selari, sel pembentangan antigen telah disediakan dengan mengumpul sel CD3 daripada PBMC selepas habis dengan CD3 MicroBeads anti-manusia (Miltenyi Biotec GmbH) dan cryopreserved. Selepas 1 hingga 2 minggu kultur, pecahan sel T CD4þ yang dikuatkan telah diagihkan ke dalam 96-plat perigi, bergantung pada bilangan antigen yang akan dianalisis. Sebelum rangsangan dengan antigen, sel-sel direhatkan selama sekurang-kurangnya 4 hari. Pada hari rangsangan, sel pembentang antigen telah dicairkan dan diedarkan ke dalam kultur sel T dalam nisbah sekurang-kurangnya 1 sel pembentang antigen kepada 100 sel T CD4þ. Perpustakaan sel T CD4 untuk kawalan negatif (sel tidak dirangsang) dan kawalan positif (sel dirangsang dengan SEB) sentiasa dimasukkan dalam eksperimen. Sel T CD4 telah dirangsang dengan antigen selama 4 hari, dan percambahan ditentukan menggunakan protokol [3 H]-thymidine standard.
Letupan sel T yang diperkuat bertindak balas secara berbeza kepada antigen yang dipaparkan oleh CPM kilauan yang sangat heterogen; oleh itu, normalisasi ambang percambahan yang ditentukan sebagai skor z khusus penderma adalah perlu. Skor z dikira sebagai 5 perbezaan persentil ke-75 dan ke-25 di atas median CPM mikrokultur yang tidak dirangsang. Sel-sel dalam mikrokultur yang dirangsang dengan SEB berfungsi sebagai kawalan positif. Nota, budaya mikro dengan indeks rangsangan SEB sebanyak<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="" cd4þ="" t="" cells="" was="" calculated="" using="" numbers="" of="" negative="" microcultures="" according="" to="" poisson="" distribution="" and="" expressed="" per="" 1="" million="" cells,="" as="" described="" previously.14="" the="" use="" of="" poisson="" distribution="" is="" based="" on="" the="" probability="" that="" at="" least="" 1="" cd4þ="" t="" cell="" is="" present="" in="" a="" single="" microculture="" of="" t-cell="" libraries="" when="" the="" radioactive="" signal="" was="" detected="" after="" antigen-specific="">
Kaedah ARTE periferal dan kencing
Kami mengikuti protokol yang menggunakan CD154 MicroBead Kit (Mil-tenyi Biotec GmbH).35 Secara ringkas, sel telah dirangsang selama 7 jam dengan antigen dan kemudian dilabelkan dengan CD154-antibody biotin anti-manusia dan mikrobead anti-biotin mengikut kepada arahan pengilang. Sel berlabel telah dimuatkan pada lajur MS yang ditentukur (Miltenyi Biotec GmbH) untuk memperkayakan CD154-sel ekspresi. Pelabelan sel dengan carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (Sigma Aldrich Chemie GmbH) telah dilakukan mengikut protokol standard.
Penjanaan klon sel tunggal
Klon sel tunggal dijana daripada sel antigen-reaktif, yang diperkaya oleh ekspresi CD154 mengikut protokol ARTE. CD154-sel ekspresi ditapis dengan penapis penyediaan 30-mm (Miltenyi Biotec GmbH) dan digantung semula dalam 1 ml 20 peratus (v/v) garam penimbal fosfat sejuk, 0.5 peratus albumin serum lembu dan asid etilenadiaminetetraacetic 2mM. Sel ialah sel tunggal yang diisih untuk fenotip CD154þCD69þ, dan sel yang diisih tunggal dikultur dalam telaga tunggal 96-plat perigi dengan kehadiran sel penyuap. Kultur sel dikekalkan selama 3 hingga 4 hari sehingga beberapa klon kelihatan. Sehari sebelum rangsangan semula, sel pembentang antigen telah dicairkan dan diedarkan ke dalam kultur sel T dalam nisbah sekurang-kurangnya 1 sel pembentang antigen kepada 100 sel T CD4þ. Sel telah dirangsang dengan 1 mg/ml antigen, dan klon yang tidak dirangsang berfungsi sebagai kawalan negatif.
Analisis repertoir TCR berasaskan penjujukan generasi seterusnya
DNA genomik telah diasingkan daripada sel T CD4þ periferal dan sel kencing menggunakan Kit Mikro DNA/RNA AllPrep (Qiagen, Venlo, Belanda). Lokus TCR-b yang digabungkan semula telah dikuatkan mengikut protokol seperti yang diterangkan sebelum ini.36 Bacaan diproses menggunakan IMSEQ,37 dan klonotip yang sama dikelompokkan dan dianalisis selanjutnya.
Perangkaan
Ujian statistik telah dilakukan dengan perisian GraphPad Prism (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Pelarasan Bonferroni untuk pelbagai perbandingan telah digunakan. Ujian Mann-Whitney U dan ujian bertanda Wil-Coxon digunakan dalam eksperimen dengan set data bebas dan bergantung, masing-masing. Selepas pelarasan Bonferroni untuk pelbagai perbandingan, pengiraan nilai P kritikal telah diperbetulkan kerana ia berdasarkan bilangan perbandingan yang dirancang. nilai P<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.01,="" **p="" <="" 0.005,="" and="" ***p="" <="" 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="" sledai="" values="" instead="" of="" ranked="" values="" to="" better="" provide="" an="" understanding="" of="" the="" correlation="" between="" the="" number="" of="" cells="" and="" disease="" activity.="" for="" correlation="" analysis,="" p="" values=""><0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.05,="" **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="" cd4þ="" t="" cells,="" the="" frequencies="" without="" background="" were="" defined="" as="" zero.="" a="" log(x="" þ="" 1)="" transformation="" was="" applied="" to="" the="" data="" set="" when="" it="" included="" zero="" values.="" supplemental="" patient="" data="" and="" statistical="" data="" are="" available="" in="" supplementary="" tables="" s1="" and="">
PENGHARGAAN
Kami mengucapkan terima kasih kepada Toralf Kaiser dan Jenny Kirsch (Flow Cytometry and CellSorting Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) atas bantuan dengan flflow cytometry dan sel sorting. Sokongan untuk kajian ini disediakan melalui geran daripada DeutscheForschungsgemeinschaft dalam Sonderforschungsbereich 650 toGR dan oleh geran daripada Deutsche Gesellschaft für Nephrologie dan Program Saintis Klinikal Charité – Universitätsmedizin Berlin dan Institut Kesihatan Berlin kepada PE.
