Tidak Semua Vaping Adalah Sama: Kesan Pulmonari Berbeza Daripada Vaping Cannabidiol Berbanding Nikotin
Sep 28, 2023
ABSTRAK
Rasional Vaping telah menjadi kaedah popular untuk menyedut pelbagai bahan psikoaktif. Semasa menilai kesan pernafasan vape telah tertumpu terutamanya pada produk yang mengandungi nikotin, cannabidiol (CBD)-vaping semakin popular. Pada masa ini masih tidak diketahui sama ada kesan kesihatan vape nikotin dan kanabinoid adalah serupa.
Objektif
Kajian ini membandingkan kesan pulmonari dari penyedutan akut CBD yang diwap berbanding nikotin.
Kaedah
Kajian penyedutan in vivo pada tikus dan eksperimen sitotoksisiti in vitro dengan sel manusia telah dilakukan untuk menilai kesan kerosakan paru-paru CBD atau aerosol nikotin yang dipancarkan daripada peranti vape.
faedah tambahan cistanche-meningkatkan imuniti
Pengukuran dan keputusan utama
Keradangan pulmonari pada tikus dijaringkan oleh histologi, sitometri aliran, dan mengukur tahap sitokin dan kemokin proinflamasi. Kerosakan paru-paru dinilai oleh histologi, pengukuran aktiviti myeloperoxidase, dan tahap neutrofil elastase dalam cecair lavage bronchoalveolar dan tisu paru-paru. Integriti epitelium / endothelial paru-paru dinilai dengan mengukur tahap protein BAL, kebocoran albumin, dan kebocoran FITC-dextran pulmonari. Tekanan oksidatif ditentukan dengan mengukur potensi antioksidan dalam BAL dan paru-paru. Kesan sitotoksik CBD dan aerosol nikotin pada neutrofil manusia dan sel epitelium saluran pernafasan kecil manusia dinilai menggunakan sistem antara muka cecair udara in vitro. Penyedutan aerosol CBD menyebabkan perubahan keradangan yang lebih besar, kerosakan paru-paru yang lebih teruk, dan tekanan oksidatif yang lebih tinggi berbanding dengan nikotin. Aerosol CBD juga menunjukkan ketoksikan yang lebih tinggi kepada sel manusia berbanding dengan nikotin.
Kesimpulan
Vape CBD mendorong tindak balas keradangan yang kuat dan membawa kepada lebih banyak perubahan patologi yang berkaitan dengan kecederaan paru-paru daripada vape nikotin.
PENGENALAN
1990-an sebagai cara alternatif penggunaan ganja. Pengewap ganja biasanya merupakan peranti besar yang memanaskan herba ganja kering sehingga pengewapan kanabinoid. Pada awal tahun 2000-an, pengewap mudah alih yang lebih kecil muncul sebagai 'e-rokok' dan telah menjadi kaedah pentadbiran nikotin yang popular.1 E-rokok memanaskan nikotin dalam larutan dan bukannya daripada daun tembakau kering. Baru-baru ini, pengewap dalam pasaran kanabis telah mengikuti peralihan yang sama, dengan lebih banyak penggunaan ekstrak ganja cecair.2–7 Aerosol yang dikeluarkan daripada produk vape mengandungi bukan sahaja bahan psikoaktif seperti nikotin dan kanabinoid (terutamanya tetrahydrocannabinol (THC) dan cannabidiol (CBD)) tetapi juga toksik pernafasan (cth, formaldehid, akrolein, benzaldehid).8–11 Banyak juzuk kimia yang terlibat dalam vape nikotin dan kanabinoid adalah serupa, dan yang lain sangat berbeza, memberi kepentingan untuk mempertimbangkan isu-isu ini dalam konteks memahami akibat pernafasan menguap kedua-dua bahan. Sebagai contoh, pelarut yang digunakan dalam produk vape yang mengandungi nikotin dan kanabinoid mungkin berbeza, disebabkan oleh sifat lipofilik kanabinoid.12 Vitamin E asetat dikenal pasti sebagai bahan tambahan dalam produk vape yang mengandungi THC dan memainkan peranan penting dalam wabak 2019. e-rokok dan kecederaan paru-paru yang berkaitan dengan vape (VALI).13 14 Sebilangan terhad kajian mengenai kesan pernafasan vape telah tertumpu terutamanya pada produk yang mengandungi nikotin. Kajian in vitro mencadangkan bahawa nikotin vape boleh mengaktifkan sel imun dan menjejaskan beberapa fungsi utamanya.15 Kajian haiwan menunjukkan bahawa pendedahan kepada nikotin daripada e-rokok memberi kesan buruk terhadap tindak balas imunologi.16 17 Kajian pemerhatian manusia telah menunjukkan bahawa nikotin vape menghalang aspek sistem imun semula jadi dalam sel epitelium hidung.18 19 Kajian epidemiologi telah melaporkan perkaitan antara vape nikotin dan keadaan pernafasan kronik (batuk kronik, bronkitis, asma).20–24 Sejak penyelidikan mengenai hasil kesihatan pernafasan dan imunologi dikaitkan dengan penggunaan kanabis secara eksklusif tertumpu pada ganja yang dihisap,25–31 pada masa ini tidak diketahui sama ada kesan kesihatan nikotin dan kanabinoid adalah serupa. Kajian ini bertujuan untuk membandingkan, dalam format bersebelahan, kesan penyedutan akut kanabinoid yang diwap berbanding nikotin.
Jadual 1 Perbandingan bahan kimia yang dikesan dalam produk vape (cecair tidak dipanaskan) yang digunakan dalam eksperimen pendedahan in vivo dan in vitro
BAHAN DAN KAEDAH
Kaedah yang digunakan diterangkan dengan lebih terperinci dalam fail tambahan dalam talian.
Produk vaping
Kami menggunakan dua produk vape komersial, satu mengandungi CBD dan satu lagi mengandungi nikotin (disingkatkan dalam angka sebagai CBD-vape dan Nic-vape). Pod yang mengandungi CBD ialah CalmVape daripada The Kind Group LLC dan pod yang mengandungi nikotin ialah Juul oleh Juul Labs. Kedua-dua produk telah dibeli dalam talian di AS pada 2 November020. Pod CalmVape dilabelkan sebagai mengandungi 50mg/mL CBD yang dilarutkan dalam campuran trigliserida rantai sederhana (MCT) dan mempunyai rasa semula jadi. Juul dilabelkan sebagai mengandungi 5.0% nikotin terlarut dalam campuran propilena glikol (PG) gliserin sayuran (VG) dan perisa Virginia Tobacco. Kami menguji cecair yang tidak dipanaskan dan dipanaskan serta pelepasan yang dihasilkan daripada kedua-dua produk menggunakan ujian kromatografi–spektrometri jisim yang disahkan sepenuhnya dan diterbitkan sebelum ini.32 Ramuan utama yang dikenal pasti dalam cecair daripada kedua-dua produk disenaraikan dalam Jadual 1. Senarai terperinci bahan kimia yang dikenal pasti dalam larutan yang dipanaskan, termasuk hasil empat sebatian karbonil yang berpotensi toksik (formaldehid, asetaldehid, aseton, dan akrolein) dalam aerosol yang dipancarkan disediakan dalam angka tambahan dalam talian E1–E4 dan jadual tambahan dalam talian E1 dan E2.
faedah suplemen cistanche-bagaimana untuk menguatkan sistem imun
tikus
Tikus jantan dan betina C57BL/6NCr berusia enam minggu telah diperoleh dari Makmal Charles River (Wilmington, Massachusetts, Amerika Syarikat) dan ditempatkan di bawah keadaan bebas patogen tertentu dengan kitaran terang/gelap selama 12/12 jam. Bilangan haiwan bagi setiap kumpulan pendedahan ialah n=10 (5 jantan dan 5 betina, kecuali Nic-vape yang mengandungi 5 jantan dan 4 betina; seekor tikus betina bersaiz sangat kecil dan perlu dimatikan sebelum kajian selesai. ). Semua eksperimen telah dilakukan mengikut garis panduan yang ditetapkan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi dan mematuhi semua peraturan negeri, persekutuan dan NIH.
Keadaan pendedahan haiwan
Aerosol daripada produk vape dihasilkan menggunakan penjana aerosol e-rokok yang diterangkan sebelum ini.14 33 Peranti Juul digunakan untuk mengaerosol kedua-dua produk. Haiwan telah didedahkan dalam kebuk aruhan 15 L yang diubah suai setiap hari kepada sejumlah 20 sedutan yang dihasilkan selama 1 jam (1 sedutan setiap 3 minit), 5 hari/minggu selama 2 minggu. Setiap sedutan mempunyai isipadu 55mL dan diaerosol dalam tempoh 3s. Aerosol daripada setiap produk vape dijana menggunakan protokol sedutan yang sama bertujuan untuk meniru tingkah laku vape nikotin berpengalaman.34 Disebabkan kekurangan penerbitan yang menerangkan tingkah laku vape dalam kalangan vaper CBD, kami mengikuti protokol sedutan yang sama untuk kedua-dua produk. Walaupun kami tidak mengukur CBD bawaan udara dan nikotin di dalam ruang pendedahan haiwan, kami telah menganggarkan berdasarkan jumlah cecair yang diwap setiap hari, CBD dan kepekatan nikotin dalam cecair, aerosol dan kadar aliran udara bahawa haiwan terdedah secara purata kepada 20.5 mg/ m3 CBD dan 22.8 mg/m3 nikotin. Haiwan kawalan terdedah kepada udara yang ditapis menggunakan protokol pendedahan yang sama.
Keadaan pendedahan in vitro
Sel-sel yang digunakan dalam eksperimen in vitro secara langsung terdedah kepada sedutan yang baru dihasilkan dalam sistem pendedahan tertutup di mana ruang antara muka cecair udara (ALI) disimpan di dalam inkubator 37 darjah. Untuk eksperimen ALI, kami menggunakan peranti vape sistem tertutup dan formulasi cecair isi semula yang sama seperti yang digunakan untuk eksperimen pendedahan in vivo yang diterangkan di atas. Butiran kaedah disediakan dalam fail tambahan dalam talian.
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity
【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Penilaian keradangan pulmonari
Keradangan pulmonari dijaringkan oleh sitometri aliran, histokimia dan dengan mengukur tahap sitokin dan kemokin (angka tambahan dalam talian E5), 14 35 36, dan butiran lengkap disediakan dalam fail tambahan dalam talian.
Penilaian kerosakan paru-paru
Integriti epitelium/endotel paru-paru dinilai dengan mengukur tahap protein oleh BCA, dan kebocoran albumin ruang bronchoalveolar sistemik oleh ELISA menggunakan sampel BAL dan bronchoalveolar kepada kebocoran sistemik dengan mengukur pendarfluor plasma 1 jam selepas intratrakeal intratrakeal probe pendarfluor. Tahap Neutrophil elastase (NE),37 38 diukur dalam BAL dan tisu paru-paru menggunakan kit NE ELISA daripada sistem R&D (Cat. #DY4517-05) mengikut protokol pengeluar. Aktiviti Myeloperoxidase (MPO) diukur dengan ujian kalorimetrik dalam BAL dan tisu paru-paru39 menggunakan kit ujian MPO daripada Abcam (Cat. #ab105136) menggunakan arahan pengilang. Pewarnaan Oil Red O digunakan untuk menggambarkan makrofaj alveolar yang sarat dengan lipid.14 Butiran ujian diberikan dalam fail tambahan dalam talian. Penilaian histologi dalam bahagian paru-paru telah digredkan oleh pakar patologi veterinar seperti yang diterangkan sebelum ini.40 41
Pengukuran tekanan oksidatif pada tikus BAL dan paru-paru
Tindak balas keradangan akut dengan cepat mengatasi sistem antioksidan untuk menggalakkan kecederaan paru-paru.42–44 Tekanan oksidatif ditentukan dengan mengukur potensi antioksidan dalam BAL dan lisat paru-paru seperti yang diterangkan dalam fail tambahan dalam talian.
Ujian sitotoksisiti in vitro
Sel epitelium saluran pernafasan kecil manusia (hSAECs) daripada LONZA dan neutrofil manusia yang telah dimurnikan secara langsung terdedah kepada CBD dan aerosol nikotin yang baru dihasilkan dalam budaya antara muka cecair udara. Protokol pendedahan dan butiran metodologi terdapat dalam bahan tambahan dalam talian. Sitotoksisiti diukur menggunakan pengecualian pewarna biru trypan, pengambilan pewarna merah neutral, dan ujian apoptosis Annexin V-FITC seperti yang diterangkan dalam fail tambahan dalam talian.
Pengukuran tahap NE dalam media kultur PMN
Tahap NE dalam media terkondisi kultur sel PMN terdedah aerosol selepas tempoh pemulihan dikira oleh kit ELISA daripada sistem R&D (Cat. #DY4517-05) mengikut arahan pengilang.
Ujian kebolehtelapan FITC-dextran
Kebolehtelapan paraselular, merentas satu lapisan tunggal SAEC manusia yang terdedah kepada aerosol daripada budaya ALI, telah dilakukan untuk menilai integriti halangan dan butiran diterangkan dalam fail tambahan dalam talian.
Analisis statistik
Perbezaan ketara secara statistik antara nilai kedudukan purata kumpulan pendedahan yang berbeza (CBD, nikotin dan kawalan udara) ditentukan dengan melakukan ujian bukan parametrik Kruskal-Wallis. Nilai P telah diperbetulkan untuk ujian berbilang menggunakan 'prosedur langkah linear dua peringkat kaedah kadar penemuan palsu (FDR) Benjamini, Krieger, dan Yekutieli', dan perbezaan antara kedua-dua kumpulan dianggap signifikan secara statistik pada p<0.05when FDR was set at Q<0.1. We also evaluated if there were differences between male versus female mice in the responses to inhalation of CBD and nicotine aerosols in comparison with air. All statistical analyses were carried out using GraphPad Prism V.9.3.1 software (GraphPad; La Jolla, California, USA).
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
KEPUTUSAN
Pendedahan kepada aerosol CBD menyebabkan pengumpulan sel imun semula jadi dan adaptif yang lebih besar dalam paru-paru berbanding dengan pendedahan nikotin
Jumlah penyusupan sel imun adalah jauh lebih tinggi dalam paru-paru tikus berikutan penyedutan aerosol CBD daripada nikotin atau udara yang ditapis (angka 1A). Tujuh daripada 10 subset sel imun yang dikaji mempunyai lebih banyak kesan berikutan pendedahan CBD berbanding dengan nikotin. Analisis imunofenotip mendedahkan penyusupan ketara secara statistik neutrofil CD11b+Ly6G+ dalam paru-paru tikus berikutan penyedutan CBDaerosol (14488 vs 3674 neutrofil dalam udara, p<0.05) as well as following nicotine aerosol exposure (15410 vs 3674 neutrophils in air, p<0.001) (figure 1B). Total numbers of CD11bCD- 11c+Siglec-F+ alveolar macrophages were significantly reduced following CBD-Vape or Nic-Vape inhalation as compared with air-exposed mice (15965 cells in CBD and 18834 cells in NicVape vs 43465 cells in air (p<0.05)) (figure 1C). Inhalation of both CBD and nicotine aerosols resulted in significantly lower numbers of pulmonary interstitial CD11bCD11c+CD206+ macrophages as compared with air-exposed control mice (11460 vs 47319 cells for CBD-Vape, p<0.0001) and 27727 vs 47319 cells for Nic-Vape, p<0.05). The reduction in the numbers of pulmonary interstitial macrophages was significantly greater following inhalation of CBD aerosols compared with nicotine (11460 cells in CBD-vape vs 27727 cells in Nic-Vape, p<0.05) (figure 1D). CD11bCD11c+arginase-1+ macrophages were significantly reduced following inhalation of both CBD-Vape and Nic-Vape compared with air-exposed control (13450 vs 44009 for CBD-Vape (p<0.001), and 24280 vs 44009 for Nic-Vape (p<0.05)) (figure 1E). However, the reduction in the numbers of CD11bD11c+arginase-1+ macrophages was significantly more following inhalation of CBD aerosols compared with Nic-Vape (13450 cells in CBD-vape vs 24280 cells in Nic-Vape (p<0.05). The number of CD19+ B cells was not statistically different (figure 1F). Following inhalation of CBD aerosols, the numbers of CD8+ and CD4+ T cells in the lungs were, respectively, 3.3-fold (p<0.001) and 5.6-fold (p<0.0001) higher than following nicotine inhalation (figure 1G, H). CD4+IL-17A+ T cells were not altered in the lungs following CBD-Vape or Nic-Vape exposures as compared with air control (figure 1I). CD4+RORγt + T cells, expressing the master transcription factor essential for the differentiation into proinflammatory Th17 cells, were significantly increased following inhalation of CBD aerosols as compared with both nicotine (11983 vs. 2015; p<0.001) and air exposure (11983 vs. 5887; p<0.05) (figure 1J). Furthermore, CBD aerosols resulted in markedly increased infiltration of CD4+Foxp3+ regulatory T cells into the lungs compared with nicotine (4401 cells in CBD-Vape vs 1688 cells in Nic-Vape; p<0.001) (figure 1K). There were no statistically significant differences observed between male and female mice concerning the infiltration of any of the innate and adaptive immune cells, regardless of the different exposure conditions (online supplemental figure E6A–K). Relatively more Oil Red O-positive lipid-laden macrophages were detected in BAL following CBD-aerosol inhalation compared with nicotine aerosol (0.66 vs 0.32; p<0.05) or air-exposure (0.66 vs 0.15; p<0.001) (figure 2A). Lung tissue sections of air-breathing mice contained rare (typically 1–2 positive cells in the entire lung lobe) lipid-containing, Oil Red O-positive intra-alveolar macrophages (online supplemental figure E7A). In contrast, lungs from CBD and nicotine-exposed animals regionally contained one or more Oil Red O-positive macrophages within multiple alveolar lumina that were often adjacent to one another (online supplemental figure E7B, C), with no obvious differences found in males versus females. Histological examination of H&E-stained lung tissue sections from filtered air-breathing control mice showed air-filled alveolar lumina bounded by thin alveolar walls (figure 2B). In contrast, peribronchiolar and/or intrabronchiolar, perivascular, alveolar infiltrates, and interstitial infiltrates of lymphocytes, macrophages, and granulocytes were the predominant findings in the CBD and nicotine-exposed mouse lungs (figure 2C–E). Small focal lesions and occasionally larger and more regionally extensive focal lesions were noted. Lesions were found primarily near terminal bronchioles and often subpleural. The frequency and severity of lesions were greater following CBD aerosol inhalation compared with nicotine. The male mice showed a greater frequency of most lesions as compared with female mice following inhalation of both CBD and nicotine.
Rajah 1 Kesan pendedahan akut kepada CBD atau aerosol nikotin pada penyusupan sel imun pulmonari. Jumlah bilangan leukosit (A), CD11b+ Ly6G+ neutrofil (B), CD11b-CD11c+ Siglec-F + makrofaj (C), CD11b- CD11c+ CD206+ makrofaj (D), CD11b- CD11c+ arginase+ makrofaj (E) dan bilangan CD19+ sel B (F), CD8+ sel T (G), CD4+ sel T (H), CD4+ IL17A+ (I) dan CD 4+ ROR t + sel T inflamasi (J) dan CD4+ FOXP3+ sel T (K) dalam paru-paru tikus yang terdedah kepada udara, nikotin atau aerosol CBD ditentukan oleh aliran sitometri menggunakan penanda khusus dan mengikut strategi gating seperti yang diterangkan sebelum ini dan ditunjukkan dalam rajah tambahan dalam talian 1. Data ditunjukkan sebagai plot kotak dengan misai pada min dan maks. Perbezaan antara kedua-dua kumpulan dianggap signifikan pada p<0.05, the statistical significance of the difference between the two groups is indicated with symbols *p<0.05; ***p<0.001; ****p<0.0001after performing non-parametric Kruskal-Wallis test with false discovery rate (FDR) correction for multiple comparisons by GraphPad Prism V.9 software (GraphPad; La Jolla, California, USA). In each exposure condition, n=10 mice (5 males+5 females) (n=9 (5 males+4 females) for Nic-Vape) were used. CBD, cannabidiol.
Aerosol CBD mempunyai kesan modulasi yang lebih kuat pada tahap sitokin daripada aerosol nikotin
Kami mendapati bahawa penyedutan aerosol CBD dengan ketara meningkatkan tahap sitokin IL-5, IL-6 dan G-CSF dalam BAL berbanding dengan pendedahan nikotin dan udara (p<0.01) and enhanced the levels of chemokine KC compared with air-control only (p<0.001) (figure 3A–D). Levels of IL-2 were significantly lower following CBD and Nic-vape aerosol exposures compared with air (p<0.05) (figure 3E). IL-10 and IFN-γ levels were significantly reduced only after CBD aerosol exposure compared with air (p<0.05) (figure 3F, G). IL-1α levels were not significantly different, though there was a trend for the values to be lower following exposure to CBD-Vape aerosols (figure 3H). There were no statistically significant differences observed between male and female mice in the levels of these cytokines or chemokines (online supplemental figure E8A–H and online supplemental table E3).
Pendedahan kepada aerosol CBD mengakibatkan lebih banyak kerosakan endothelial paru-paru daripada pendedahan kepada aerosol nikotin
Jumlah tahap protein dalam BAL dinaikkan berikutan penyedutan aerosol CBD jika dibandingkan dengan kawalan udara (435µg/mL vs 287µg/mL; p<0.01) (figure 4A, left panel). Additionally, serum albumin levels leaking into the BAL were markedly increased following CBD aerosol inhalation when compared with both nicotine aerosol (70303ng/mL vs 32741ng/mL in NicVape; p<0.01) and air inhalation (70303ng/mL vs 26042ng/ mL in air control; p<0.0001) (figure 4B, left panel). The systemic leak of FITC-dextran from the lungs into the plasma was markedly higher following CBD aerosol inhalation than Nic-vape aerosol (469.9ng/mL vs 227.6ng/mL in Nic-Vape; p<0.01) or air exposures (469.9ng/mL vs 157.5ng/mL in air control; p<0.0001) (figure 4C, left panel). Furthermore, the FITC-dextran leak following Nic-vape aerosol exposure was not significantly different when compared with air control (227.6ng/mL vs 157.5ng/mL). There were no statistically significant differences observed in the levels of these markers when comparing male with female mice following any of the exposures (figure 4A–C, right panels and online supplemental table E3). It is known that elastase activity in inflammatory diseases increases and correlates with the levels of elastase proteins and neutrophil infiltrates as the disease progresses.45 46 NE levels in the BAL were markedly augmented following inhalation of CBD aerosols (1.8-fold vs air; p<0.001) and Nic-Vape aerosols (1.42-fold vs air; p<0.01) (figure 5A, left panel). The levels of NE measured in lung tissue were significantly increased following CBD-Vape as compared with both Nic-Vape (1.3-fold; p<0.01) and air (1.41-fold; p<0.001) (figure 5B, left panel). There were no statistically significant differences observed in NE levels between male and female mice, measured either in the BAL or lung tissues (figure 5A, B, right panels and online supplemental table E3). We detected higher MPO activity in lung tissues following inhalation of CBD aerosols compared with nicotine aerosols (~2fold; p<0.05) and air (~8.44fold; p<0.0001) (figure 6A). BAL MPO activity following CBD and nicotine aerosol-inhalation was equivalent, but greater than air controls (p<0.01) (online supplemental figure E9A). There were no statistically significant differences observed in MPO activity between male and female mice, either in lung tissue or in the BAL (figure 6B; online supplemental figure E9B and online supplemental table E3).
Rajah 2 Perubahan keradangan dalam paru-paru berikutan pendedahan penyedutan kepada CBD dan aerosol nikotin. Pada akhir pendedahan, tikus telah dieutanasi, trakea dikannulasi untuk mengumpul BAL dalam 1% FBS dalam PBS, dan paru-paru dituai. (A) Sitospin sel BAL pada slaid kaca telah diwarnai dengan 0.5% larutan Minyak Merah O dan sel O-positif Minyak Merah telah dikira seperti yang diterangkan dalam kaedah. Keputusan digambarkan sebagai plot kotak dengan misai pada min dan maks. Perbezaan antara kedua-dua kumpulan dianggap ketara pada p<0.05 and indicated with the symbols *p<0.05; ***p<0.001 by performing non-parametric Kruskal-Wallis test with FDR correction for multiple comparisons using GraphPad Prism V.9 software (GraphPad; La Jolla, California, USA). In each experiment n=10 (5 males+5 females) for CBD-vape and air exposure and n=9 (5 males+4 females) for Nic-vape). (B–E) Left lung lobes from all mice were embedded, sectioned and H&E stained as described in the methods. (B) (Air): Image of the histologically unremarkable lung from air-breathing control mouse showing air-filled alveolar lumina bounded by thin alveolar walls (arrows). H&E, ×20. (C) Nic-vape: Peribronchiolar lymphocytic, macrophagic (arrowhead) granulocytic infiltrate (circle). H&E, ×20 magnification. B=bronchiolar lumen. (D, E) CBD-vape: Perivascular infiltrates composed of mononuclear (lymphocytes and macrophages) and granulocytic infiltrates (arrows). Intra-alveolar granulocytes (circles) and macrophages (arrowheads) were also present. H&E, ×20 magnification. BD, cannabidiol; B, bronchiolar lumen; FDR, false discovery rate; PBS, phosphate-buffered saline; V, vessel lumen.
Pendedahan kepada CBD dan aerosol nikotin mengurangkan potensi antioksidan pulmonari
Jumlah kapasiti antioksidan telah menurun dengan ketara dalam kedua-dua tisu paru-paru (m.s<0.01vs air) and BAL (p=0.001vs air) following inhalation of CBD aerosols (figure 7A; online supplemental figure E10A). However, following nicotine aerosol exposure it was significantly reduced only in the BAL (p<0.01vs air) compared with air (online supplemental figure E10A). We did not observe any statistically significant differences in the antioxidant potential between male and female mice for each exposure group, either in lung tissue or in the BAL (figure 7B; online supplemental figure E10B and online supplemental table E3).
Rajah 3 Modulasi lingkungan sitokin/kemokin radang dalam cecair BAL berikutan penyedutan CBD dan aerosol nikotin. Tahap pelbagai sitokin dan kemokin yang berkaitan dengan keradangan dalam BAL (A–H) tikus selepas 2 minggu pendedahan kepada udara, aerosol Nic-Vape atau aerosol CBD-Vape dikira menggunakan Kit PETA MULTIPLEX seperti yang diterangkan dalam bahan dan kaedah. Data ditunjukkan sebagai plot kotak dengan kumis pada min dan maks. Ujian Kruskal-Wallis bukan parametrik dengan pembetulan FDR untuk pelbagai perbandingan telah dilakukan untuk melihat sama ada wujud perbezaan yang signifikan secara statistik antara kedua-dua kumpulan menggunakan perisian GraphPad Prism V.9 (GraphPad; La Jolla, California, Amerika Syarikat). Perbezaan antara kedua-dua kumpulan dianggap signifikan pada p<0.05 and is indicated with symbols *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001. In each experiment n=10 for CBD-vape and air exposure (5 males+5 females) and n=9 (5 males+4 females) for Nic-Vape). CBD, cannabidiol.
Aerosol CBD adalah lebih toksik daripada aerosol nikotin kepada hSAEC dan mengganggu integriti penghalang epitelium mereka
Kami mendapati bahawa apabila SAEC manusia terdedah secara in vitro kepada aerosol CBD selama 1 jam, morfologi sel epitelium terganggu dengan ketara (angka 8A, B vs 8C). Kematian sel dalam hSAEC meningkat dengan ketara hanya selepas pendedahan aerosol CBD jika dibandingkan dengan udara (41% vs. 12.5% dalam kawalan udara; p<0.05) (figure 8D, E). Even though the cell death following CBD-Vape exposure was higher compared with exposure to nicotine aerosols, it, however, did not reach statistical significance (41% vs. 16% in Nic-Vape). Additionally, exposure to CBD aerosols diminished the epithelial barrier integrity of human SAECs compared with air by 2.1-fold (p<0.05) and while the exposure to nicotine aerosols also showed an increased trend, it was not significantly different compared with air-control (1.7-fold decrease in Nic-Vape vs air control) (figure 8F).
sistem imun yang meningkatkan tumbuhan cistanche
Aerosol CBD tetapi bukan aerosol nikotin menyebabkan kematian sel apoptosis dalam neutrofil manusia yang telah dimurnikan, tetapi kedua-duanya meningkatkan pembebasan NE
Pendedahan akut kepada aerosol CBD menyebabkan kematian sel yang ketara dalam neutrofil manusia yang telah disucikan (44.5% kematian sel berikutan CBDVape vs. 14% dalam kawalan udara; p<0.0001) and (44.5% vs 21%cell death in Nic-Vape; p<0.001) (figure 9A). CBD aerosol-induced neutrophil cell death was mainly due to increased apoptosis compared with air (29% vs. 10% in air control; p<0.0001) and compared with Nic-Vape (29% vs. 12% in Nic-Vape; p<0.001) (figure 9B). Furthermore, both CBD and nicotine aerosols lead to enhanced accumulation of NE levels in the neutrophil cell culture media as compared with air control (2-fold increase in CBD-Vape; p<0.001and 1.45-fold increase in Nic-Vape; p<0.05) (figure 9C). However, the levels were significantly higher following CBD versus nicotine exposure (CBD-Vape 1.4-fold higher than Nic-Vape; p<0.05) (figure 9C). Pictures of human neutrophils after ALI exposures and the 24-hour recovery period are provided in online supplemental figure E12. Importantly, an aliquot of purified neutrophils that were incubated in media (unexposed) for the duration of the experiment showed low cell death (~11%) that was equivalent to values noted in neutrophils exposed to air (~14%) in the ALI chambers (figure 9A), nor was apoptosis or increased NE levels induced (figure 9B, C).
Rajah 4 Penanda kerosakan paru-paru yang disebabkan selepas pendedahan penyedutan kepada CBD dan aerosol nikotin. Pada akhir pendedahan, tikus telah dieuthanasikan, BAL dituai dan tahap (A) jumlah protein dan (B) albumin dalam BAL dikira seperti yang diterangkan dalam bahagian Bahan dan Kaedah. (C) Tahap FITC-dextran yang bocor ke dalam plasma dikira. Panel kiri dalam setiap rajah mewakili data daripada lelaki dan perempuan digabungkan, manakala panel kanan mewakili data sebagai lelaki berbanding perempuan. Keputusan ditunjukkan sebagai plot kotak dengan misai pada min dan maks. Perbezaan antara kumpulan dianggap ketara pada p<0.05 and are indicated as symbols **p<0.01, ****p<0.0001, calculated after performing non-parametric Kruskal-Wallis test with FDR correction for multiple comparisons by employing GraphPad Prism V.9 software (GraphPad; La Jolla, California, USA). In each experiment n=10 (5 males+5 females) for air and CBD-vape exposures and n=9 (5 males+4 females) for the Nic-Vape group. CBD, cannabidiol.
Rajah 5 Tahap neutrofil elastase dalam paru-paru diukur selepas pendedahan kepada CBD dan aerosol nikotin. Pada penghujung 2-minggu pendedahan, tikus dimatikan, BAL dan paru-paru dituai, dan lisat tisu disediakan. ( A, B ) Tahap NE dalam BAL dan lisat tisu paru-paru dikira oleh ELISA. Panel kiri dalam setiap rajah menunjukkan data sebagai gabungan lelaki, manakala panel kanan mewakili data sebagai lelaki berbanding Wanita. Keputusan ditunjukkan sebagai plot kotak dengan misai pada min dan maks. Ujian Kruskal-Wallis bukan parametrik dengan pembetulan FDR untuk berbilang perbandingan digunakan untuk melihat sama ada wujud perbezaan ketara secara statistik antara kedua-dua kumpulan menggunakan perisian GraphPad Prism V.9 (GraphPad; La Jolla, California, Amerika Syarikat). Perbezaan antara kedua-dua kumpulan dianggap signifikan pada p<0.05 and is indicated with symbols **p<0.01, ***p<0.001. In each experiment n=10 (5 males+5 females) for air and CBD-vape exposures each and n=9 (5 males+4 females) for Nic-Vape. CBD, cannabidiol; NE, neutrophil elastase.
PERBINCANGAN
Penemuan kami mendedahkan bahawa kesan buruk pada sistem imun dan kerosakan paru-paru selepas pendedahan penyedutan kepada produk vape yang mengandungi cannabinoid adalah lebih teruk daripada selepas pendedahan kepada aerosol daripada peranti vaping yang mengandungi nikotin. Kami telah menemui kesan berbahaya CBD terwap yang memberi kesan kepada homeostasis imun pulmonari menggunakan model tetikus eksperimen vaping dan in vitro dengan sel manusia. Kajian kami mendedahkan bahawa vape CBD mendorong persekitaran mikro pulmonari proinflamasi, yang membawa kepada pengumpulan ketara sel imun radang yang mempamerkan peningkatan aktiviti faktor merosakkan tisu seperti MPO dan NE dan membawa kepada induksi kecederaan paru-paru melalui proses yang mungkin termasuk tekanan oksidatif. Walaupun beberapa kajian telah mengkaji kesan pernafasan nikotin vaping, untuk pengetahuan kami, ini adalah laporan pertama yang menunjukkan bahawa walaupun pendedahan jangka pendek kepada CBD yang mengewap mengubah persekitaran keradangan dalam paru-paru, yang membawa kepada kerosakan paru-paru. Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa kami menggunakan produk vape yang mengandungi CBD tanpa THC, untuk menghapuskan sebarang potensi pengaruh THC pada kesan paru-paru. Disebabkan sekatan undang-undang dalam mengakses produk vape yang mengandungi THC, kami tidak dapat menjalankan eksperimen yang juga akan membandingkan kesan vape THC. Satu kajian baru-baru ini melaporkan bahawa CBD dalam produk vape boleh dianggap sebagai prekursor THC, sekali gus menambahkan lagi masalah dengan mendorong kesan pengantaraan THC yang bebas CBD yang berkaitan dengan penggunaan umum produk vape ganja.47
Tambahan pula, sebarang kesan toksik pernafasan vape berpotensi diburukkan lagi dengan kehadiran juzuk lain produk vape, termasuk pelarut berbeza (MCT dalam produk CBD dan PG: VG dalam produk nikotin), perisa dan terpene berbeza yang terdapat dalam kedua-dua produk seperti yang didedahkan oleh analisis produk. Banyak produk sampingan degradasi yang berpotensi dikesan dalam kedua-dua larutan yang dipanaskan, menunjukkan bahawa kedua-dua produk terdedah kepada suhu tinggi. Walau bagaimanapun, tahap sebatian karbonil yang lebih tinggi telah dikesan dalam aerosol yang mengandungi CBD, menunjukkan bahawa produk vaping CBD yang digunakan dalam kajian kami mungkin lebih terdedah kepada degradasi haba berbanding dengan produk nikotin. Ini mungkin disebabkan oleh perbezaan dalam komposisi kimia dua larutan dan/atau perbezaan dalam keadaan pengewapan di dalam peranti vape. Banyak penanda keradangan dan kerosakan paru-paru yang diukur dalam kajian kami secara konsisten lebih tinggi selepas terdedah kepada produk vaping yang mengandungi CBD daripada peranti vaping yang mengandungi nikotin. Sebagai contoh, kami melaporkan bahawa penyedutan minyak vape CBD aerosol menyebabkan peningkatan yang lebih kuat dalam bilangan kedua-dua CD4+ dan CD8+ sel T serta bilangan neutrofil yang tinggi dalam paru-paru. Profil serupa bagi peningkatan neutrofil dan modulasi sel CD4+ dan CD8+ T telah dilihat pada paru-paru pesakit yang telah menggunakan minyak kanabis vape yang menyebabkan kecederaan paru-paru dan kegagalan pernafasan.3 Perhubungan yang ketat wujud antara sel T radang, faktor penggerak neutrofil, dan pengambilan neutrofil dalam gangguan radang paru-paru.48 Persekitaran keradangan yang meningkat dalam paru-paru selepas pendedahan kepada aerosol CBD boleh mengatur pengumpulan dan/atau pengaktifan neutrofil dalam ruang bronchoalveolar secara langsung, melalui pembebasan spesifik faktor penggerak neutrofil seperti IL-6, G-CSF dan KC (CXCL1) atau secara tidak langsung melalui pengaktifan makrofaj paru-paru pemastautin dan sel epitelium.49 50 Aerosol CBD juga mungkin merosakkan epitelium paru-paru dan memulakan satu proses pengambilan dan pengaktifan neutrofil melalui mekanisme termasuk kerosakan tisu tempatan.51 Sesungguhnya, kami menunjukkan bahawa aerosol CBD merosakkan integriti epitelium dan mendorong kematian sel dalam hSAEC, menunjukkan bahawa aerosol CBD secara langsung boleh menyebabkan kerosakan tisu paru-paru dan mengaktifkan DAMP untuk menengahi keradangan paru-paru . Penyusupan neutrofil dan pemusnahan tisu paru-paru akibat NE diketahui menjadi pengantara kerosakan paru-paru akibat asap rokok dan integriti penghalang epitelium terjejas.52–56 Neutrofil selepas memasuki paru-paru mempamerkan fenotip yang diaktifkan dan mengekalkan proses keradangan,57 jadi kami beralasan bahawa penambahan bilangan neutrofil yang terkumpul di dalam paru-paru tikus yang terdedah kepada aerosol CBD (14488 vs 3674 di udara) mungkin mempunyai akibat biologi disebabkan status pengaktifannya. Sel-sel granulositik ini adalah sumber dua faktor penting, myeloperoxidase dan NE yang terlibat dalam aktiviti mikrobisida dan pembentukan semula pulmonari. Tahap MPO yang dipertingkatkan, seperti yang diperhatikan dalam kajian kami, dianggap sebagai penanda tekanan inflamasi dan oksidatif yang ketara dalam beberapa penyakit termasuk kecederaan paru-paru.39 58 Protein MPO yang dikeluarkan daripada neutrofil diaktifkan bertindak sebagai modulator autokrin, mempamerkan seperti sitokin proinflamasi sifat untuk mendorong pengaktifan PMN, dengan cara yang bebas daripada aktiviti pemangkin MPO.59 Oleh itu, berdasarkan laporan ini dan penemuan kami sekarang, kami berpendapat bahawa penyedutan aerosol CBD kronik boleh mendorong persekitaran mikro proinflamasi yang kuat yang boleh memudaratkan paru-paru. homeostasis dan mungkin memburukkan lagi penyakit paru-paru yang sedia ada. Penyusupan neutrofil ke paru-paru selepas penyedutan aerosol CBD mungkin mungkin disebabkan oleh pengawalseliaan kemokin larut seperti KC, dan dengan itu boleh bertanggungjawab untuk meningkatkan tahap NE yang terdapat dalam BAL dan tisu paru-paru. Memandangkan pendedahan aerosol CBD mendorong pembebasan NE daripada neutrofil manusia secara in vitro, ini menyokong kesimpulan bahawa aerosol CBD mempunyai potensi untuk secara langsung mengaktifkan neutrofil dalam vivo dan menambah keradangan pulmonari pada pengguna. Apabila tahap NE dan aktiviti yang berkaitan meningkat semasa tindak balas keradangan yang dimediasi neutrofil, 46 kami hanya mengukur tahap NE sebagai indeks aktivitinya. Selain itu, kesan buruk daripada vape CBD mungkin boleh diburukkan lagi oleh sistem antioksidan yang terjejas seperti yang kami perhatikan, di mana faktor seperti MPO yang disebabkan oleh CBD-Vape boleh memainkan peranan penting.39 58 CD4+ROR t + T sel , yang menyatakan faktor transkripsi induk yang penting untuk pembezaan ke dalam sel Th17 proinflamasi, telah ditambah dan meramalkan persekitaran mikro proinflamasi yang disebabkan oleh aerosol CBD. Peningkatan induksi sel kawal selia CD4+FoxP3+ T (Tregs) mungkin merupakan satu mekanisme di mana vape CBD boleh menyebabkan penindasan imun. Treg menyekat pengaktifan, percambahan dan pengeluaran sitokin sel T CD4+ dan CD{38}} dan terlibat dalam menyekat sel dendritik melalui merendahkan molekul kostimulasi.60 Treg mengekspresikan rantai reseptor IL-2 , yang memudahkan penggunaan IL-2 dan dengan itu boleh menghalang sel T effector daripada ketersediaan IL-2, menyumbang kepada penindasan sel T effector.61 Oleh itu, menurunkan tahap IL-2 dalam BAL disebabkan oleh CBD Pembesaran Tregs yang disebabkan oleh aerosol boleh menjadi pengantara disfungsi sel T dan penindasan imuniti adaptif dalam paru-paru, meningkatkan kerentanan kepada jangkitan pernafasan, dan mendorong hasil yang buruk kepada vaksinasi profilaksis. Kami melihat pengurangan ketara dalam bilangan makrofaj interstisial paru-paru selepas pendedahan kepada CBD. Siglec-F+, biasanya dianggap sebagai penanda eosinofil, sangat dinyatakan dalam makrofaj alveolar murine, dan apabila digunakan dalam kombinasi dengan CD11c, memberikan pengenalan makrofaj alveolar yang paling tepat dalam paru-paru tikus. Pengurangan ketara dalam bilangan makrofaj alveolar CD11bCD11c+Siglec-F+ yang diperhatikan pada tikus yang terdedah kepada CBD disokong oleh kajian terdahulu.62 Kajian terdahulu melaporkan bahawa pendedahan EC pada tikus menyebabkan disfungsi makrofaj alveolar yang dikaitkan dengan pengambilan patogen yang lemah, dengan peningkatan serentak beban patogen pulmonari yang dikaitkan dengan masa pemulihan yang tertangguh dan peningkatan kematian selepas jangkitan.16 Penurunan ketara dalam bilangan arginase pulmonari anti-radang-1+ M2 makrofaj berikutan penyedutan aerosol CBD boleh menyumbang kepada homeostasis imun pulmonari yang tidak terkawal dan kerosakan. .63 Persekitaran mikro proinflamasi yang meningkat yang dikesan dalam paru-paru berikutan penyedutan CBD sebahagiannya boleh dikaitkan dengan pengurangan bilangan makrofaj pulmonari M2 anti-radang. Bilangan makrofaj yang berkurangan boleh memberi kesan ketara kepada tindak balas pulmonari terhadap jangkitan pernafasan, yang boleh ditambah dengan makrofag-fagositosis yang tidak berfungsi. Oleh itu, pendedahan kepada aerosol daripada rokok elektronik yang mengandungi nikotin menyebabkan pengurangan dalam fagositosis Haemophilus influenza (NTHI) yang tidak boleh ditaip oleh makrofaj, sebahagian besarnya disebabkan oleh kehadiran perasa e-rokok.64 Memandangkan perasa biasa juga digunakan untuk formulasi CBD, ia menimbulkan kemungkinan bahawa disfungsi makrofaj akibat aerosol CBD boleh dipergiatkan dengan penambahan pelbagai bahan kimia perisa.
Rajah 6 Peningkatan aktiviti myeloperoxidase (MPO) dalam paru-paru selepas terdedah kepada CBD dan aerosol nikotin. (A, B) Kami mengukur aktiviti MPO dalam lisat tisu paru-paru nikotin atau haiwan terdedah aerosol CBD menggunakan kit ujian MPO dari Abcam seperti yang diterangkan secara terperinci dalam bahagian bahan tambahan. Panel kiri menggambarkan data sebagai lelaki, manakala panel kanan mewakili data sebagai lelaki berbanding perempuan. Data ditunjukkan sebagai plot kotak dengan kumis pada min dan maks. Ujian Kruskal-Wallis bukan parametrik dengan pembetulan FDR untuk pelbagai perbandingan telah dilakukan untuk melihat sama ada wujud perbezaan yang signifikan secara statistik antara kedua-dua kumpulan menggunakan perisian GraphPad Prism V.9 (GraphPad; La Jolla, California, Amerika Syarikat). Perbezaan antara kedua-dua kumpulan dianggap signifikan pada p<0.05 and is indicated with the symbols *p<0.05, ****p<0.0001. In each experiment n=10 mice for air and CBD-vape exposures each (5 males+5 females) and n=9 for Nic-Vape group (5 males+4 females). CBD, cannabidiol; FDR, false discovery rate
Rajah 7 Perubahan dalam potensi antioksidan dalam paru-paru berikutan pendedahan kepada CBD dan aerosol nikotin. Pada penghujung pendedahan kepada aerosol nikotin atau CBD, tikus dimatikan dan lisat tisu paru-paru disediakan. (A, B) Jumlah tahap antioksidan dalam lisat tisu paru-paru dikira menggunakan kit ujian antioksidan Cayman (Cat # 709001) seperti yang diterangkan secara terperinci dalam bahagian bahan tambahan dalam talian. Panel kiri menggambarkan data sebagai lelaki dan perempuan digabungkan, manakala panel kanan mewakili data sebagai lelaki berbanding perempuan. Data ditunjukkan sebagai plot kotak dengan kumis pada min dan maks. Ujian Kruskal-Wallis bukan parametrik dengan pembetulan FDR untuk berbilang perbandingan digunakan untuk melihat sama ada wujud perbezaan ketara secara statistik antara kedua-dua kumpulan menggunakan perisian GraphPad Prism V.9 (GraphPad; La Jolla, California, Amerika Syarikat). Perbezaan antara kedua-dua kumpulan dianggap signifikan pada p<0.05 and is indicated by the symbol **p<0.01. In each experiment, n=10 mice for air and CBD-vape exposures each (5 males+5 females) and n=9 for the Nic-Vape group (5 males+4 females). CBD, cannabidiol; FDR, false discovery rate.
Rajah 8 Morfologi sel epitelium, sitotoksisiti, dan integriti penghalang epitelium sel epitelium saluran pernafasan kecil manusia (SAEC) berikutan pendedahan kepada CBD dan aerosol nikotin. SAEC manusia (0.5 juta sel/sisipan kultur dalam 6-format plat telaga) telah dibiakkan dalam media pertumbuhan lengkap semalaman dan keesokan harinya didedahkan terus pada antara muka cecair udara (ALI) kepada 110 sedutan udara, nikotin (50mg/mL nikotin) atau CBD (50mg/mL)-mengandungi aerosol seperti yang diterangkan dalam kaedah. Semua aerosol dihasilkan dalam jumlah sedutan 55mL seperti yang diterangkan dalam bahagian Kaedah. Pada akhir pendedahan, sel telah dikeluarkan dari ruang ALI dan diinkubasi dalam media pertumbuhan lengkap selama 24 jam pada 37 darjah. Selepas tempoh pemulihan tamat, sel pertama kali diimej (A–C) pada ×200 dalam mikroskop kontras fasa (Olympus IX73) dan kemudian ujian ketoksikan sel menggunakan kaedah (D) trypan blue (diukur sebagai peratus kematian sel) atau (E ) kaedah pengambilan merah neutral (digambarkan sebagai peratus kawalan udara) telah dilakukan. Untuk ujian kebolehtelapan FITC-dextran (F), 1 juta SAEC/sisipan kultur manusia telah dikultur semalaman dan keesokan harinya didedahkan terus di ALI kepada 110 sedutan udara, nikotin (50mg/mL nikotin) atau CBD (50mg/mL) yang mengandungi aerosol. Setelah selesai pendedahan, FITC-dextran pada kepekatan 10mg/mL telah ditambah ke dalam ruang apikal dan diinkubasi selama 2.5 jam. sampel telah dituai dari ruang basolateral dan pendarfluor diukur menggunakan panjang gelombang Exci485/Emi528 dalam pembaca plat hibrid H1 sinergi (BioTek). Kepekatan FITC-dextran dalam ruang basolateral dikira menggunakan lengkung piawai. Perbezaan antara kedua-dua kumpulan dianggap signifikan pada p<0.05 and is indicated with the symbol *p<0.05, calculated using non-parametric Kruskal-Wallis test with FDR correction for multiple comparisons by GraphPad prism V.9 software (GraphPad; La Jolla, California, USA). Results are depicted as box plots with whiskers at min and max from three independent experiments each performed in triplicate as described in online supplemental methods. CBD, cannabidiol; FDR, false discovery rate; SAECs, small airway epithelial cells.
Rajah 9 Kematian sel apoptosis dalam neutrofil manusia yang telah dimurnikan dan tahap neutrofil elastase (NE) yang dikeluarkan selepas terdedah kepada CBD dan aerosol nikotin. Neutrofil manusia yang disucikan daripada darah keseluruhan telah disemai pada 0.8 juta sel/sisipan kultur dalam 6-format plat perigi dan serta-merta terdedah kepada 110 sedutan Udara, nikotin (50mg/mL nikotin) atau CBD ( 50mg/mL)-mengandungi aerosol pada antara muka cecair udara dalam isipadu sedutan 55mL seperti yang diterangkan dalam bahagian Kaedah. Pada akhir pendedahan, sel telah dikeluarkan dari ruang ALI dan pulih dalam media pertumbuhan lengkap selama 24 jam. Seterusnya, kematian sel diukur menggunakan (A) ujian pengecualian pewarna biru trypan dan (B) apoptosis annexin V-FITC seperti yang dinyatakan secara terperinci dalam bahagian Kaedah. Sejurus selepas pengasingan, aliquot neutrofil yang telah disucikan disimpan dalam medium lengkap dalam inkubator CO2 sebagai 'kawalan tidak terdedah' negatif untuk keseluruhan tempoh ujian, untuk menganggarkan tahap kematian sel, induksi apoptosis, atau tahap NE dalam ketiadaan sebarang pendedahan. (C) Tahap NE dikira dalam media terkondisi yang dituai selepas tempoh pemulihan berakhir dengan melaksanakan NE ELISA seperti yang dibincangkan dalam bahagian Kaedah. Data digambarkan sebagai plot kotak dengan kumis pada min dan maks daripada eksperimen bebas yang masing-masing dilakukan dalam tiga kali ganda. Untuk ujian apoptosis: purata data daripada n{13}} penderma bagi setiap kumpulan. Untuk kaedah trypan blue: data purata daripada penderma n=6 kawalan tidak terdedah, penderma kawalan udara dan=7 Nic-Vape n=7 dan penderma n=8 CBD-Vape. Untuk data purata ujian NE daripada n=6 penderma bagi setiap kumpulan). Perbezaan antara kedua-dua kumpulan dianggap signifikan pada p<0.05 which is indicated by the symbols *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 calculated using non-parametric Kruskal-Wallis test with FDR correction for multiple comparisons by GraphPad Prism V.9 software (GraphPad; La Jolla, California, USA). ALI, air–liquid interface; CBD, cannabidiol; FDR, false discovery rate.
Jadual 2 Perbandingan pelbagai penanda hasil kajian selepas pendedahan kepada produk vaping yang mengandungi CBD (CBD-vape) dan produk vaping yang mengandungi nikotin (Nic-vape)
Kehadiran makrofaj intra-alveolar yang sarat dengan lipid yang diperhatikan dalam sel yang pulih daripada BAL tikus selepas penyedutan aerosol CBD dalam kajian kami menyokong dengan laporan terdahulu yang menunjukkan permulaan pneumonia lipoid eksogen pada pesakit yang menggunakan minyak kanabis dan mempunyai lipid -makrofaj paru-paru yang sarat.65 Memandangkan radang paru-paru lipoid eksogen dengan makrofaj paru-paru sarat lipid adalah ciri khas EVALI, maka ia menunjukkan bahawa penyedutan minyak vape CBD mungkin tidak bebas risiko dan boleh menyebabkan kecederaan paru-paru dalam vaper ganja. Kes-kes yang dibentangkan dalam laporan klinikal EVALI mencadangkan hubungan etiologi yang lebih kuat antara vape kanabis dan kegagalan pernafasan berbanding dengan vaping nikotin.65–68 Berbeza dengan kajian terdahulu kami terhadap tikus yang menyedut VEA (kemungkinan penyebab EVALI), dalam kajian ini, kami tidak memerhatikan kehadiran makrofaj berbuih.14 Walaupun risiko keseluruhan untuk komplikasi paru-paru yang berkaitan dengan vape mungkin lebih rendah berbanding dengan merokok, vape nampaknya menimbulkan risiko kesihatan pernafasan, terutamanya dalam vaper ganja jangka panjang. Ringkasnya, kajian kami dengan jelas membuktikan bahawa persekitaran proinflamasi dalam paru-paru yang disebabkan oleh penyedutan aerosol CBD adalah lebih besar daripada yang disebabkan oleh aerosol nikotin, dan ini dicerminkan oleh gangguan integriti penghalang paru-paru dan kerosakan paru-paru (diringkaskan dalam Jadual 2). Ini menunjukkan bahawa vape kanabis berpotensi membawa kepada hasil yang lebih teruk, termasuk peningkatan kerentanan terhadap jangkitan pernafasan, tindak balas yang lemah terhadap vaksinasi profilaksis dan gejala yang semakin teruk pada pesakit dengan penyakit radang paru-paru yang mendasari.16–19 35 36 69 70 Kami tidak memerhatikan sebarang perubahan ketara dalam tingkah laku haiwan semasa atau selepas pendedahan, mahupun perubahan berat berbanding dengan kawalan udara (angka tambahan dalam talian E11). Dalam kajian ini, pendedahan aerosol nikotin tidak mendorong paras pelbagai sitokin/kemokin dalam BAL pada tahap yang sama jika dibandingkan dengan kajian terdahulu.71 Sebab-sebab percanggahan ini mungkin kerana pengarang ini mengukur tahap transkrip pelbagai sitokin dalam paru-paru. homogenat berikutan pendedahan nikotin-aerosol, dan tahap transkrip kadangkala tidak diterjemahkan kepada perubahan apabila diukur pada tahap protein seperti yang dilakukan oleh kami. Tambahan pula, profil sitokin dan modulasi sistem imun bergantung kepada e-cecair tertentu, kaedah penjanaan/tempoh pendedahan aerosol, dan bahan kimia perasa yang ditambah. Walaupun ganja telah membuktikan manfaat kesihatan dalam pengurusan kesakitan, tidur, dan melegakan simptom loya/muntah yang disebabkan oleh kemoterapi pada pesakit kanser dan pada pesakit yang mengalami sawan, 72–76 terdapat kekurangan bukti kukuh tentang keselamatan ganja apabila dihantar daripada vaping produk. Dalam hal ini, kajian kami adalah novel dan mengenal pasti peranan penyedutan aerosol CBD dalam mendorong keradangan pulmonari dan kerosakan paru-paru.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Oleh kerana kajian kami menggunakan model pendedahan haiwan dan in vitro, beberapa batasan perlu dipertimbangkan apabila mengekstrapolasi hasil yang dibentangkan kepada pendedahan kehidupan sebenar pada manusia. Satu batasan kajian ini ialah tumpuannya hanya pada pendedahan jangka pendek. Hasil pendedahan kronik jangka panjang kepada CBD-aerosol, dan kesannya terhadap tindak balas terhadap jangkitan pernafasan dan/atau vaksinasi profilaksis adalah penting. Metodologi pendedahan haiwan kami adalah berdasarkan sistem pendedahan seluruh badan dan pendedahan hidung sahaja mungkin lebih sesuai untuk mensimulasikan pendedahan vaper berpengalaman. Walaupun menggunakan sistem pendedahan seluruh badan, kami mengesahkan bahawa pemendapan pada bulu haiwan (dan dinding sangkar) tidak menyumbang kepada pengambilan zarah oleh dandanan haiwan dan dengan itu mempengaruhi ketoksikan yang diperhatikan. Kami menggunakan bilangan tikus yang terhad bagi setiap kumpulan pendedahan; kemungkinan besar bilangan tikus yang lebih besar boleh mengukuhkan lagi kesimpulan kajian kami. Walaupun model ALI in vitro menyediakan pendekatan khusus pendedahan penyedutan untuk melaksanakan kajian biologi tentang kesan kesihatan yang berkaitan dengan penggunaan produk vaping, mengekstrapolasi data daripada kajian in vitro kepada risiko manusia kekal sebagai hipotesis. Kajian pemerhatian dan eksperimen masa depan dengan pengguna biasa CBD dan produk vape yang mengandungi nikotin diperlukan untuk mengesahkan penemuan kami. Akhirnya, dalam eksperimen kami, haiwan dan sel telah terdedah kepada aerosol daripada kedua-dua produk yang dihasilkan dengan cara yang sama. Walau bagaimanapun, pengguna produk vape berasaskan kanabis boleh menggunakan produk ini dengan cara yang sangat berbeza daripada vaper nikotin (cth, kurang kerap). Apabila data daripada kajian pemerhatian di kalangan vaper ganja muncul, potensi perbezaan dalam corak penggunaan produk yang diperhatikan dalam keadaan realistik harus diambil kira semasa mensimulasikan pendedahan haiwan dan in vitro dalam tetapan makmal. Kajian masa depan harus menyiasat kesan pernafasan produk vape yang mengandungi spektrum luas kanabinoid, termasuk THC.
RUJUKAN
1 Jabatan Kesihatan AS dan. Penggunaan e-rokok dalam kalangan belia dan dewasa muda: laporan pakar bedah am [PDF–8.47 MB]ikon PDF. Atlanta, GA: Jabatan Kesihatan dan Perkhidmatan Manusia AS, CDC, 2016.
2 Borodovsky JT, Crosier BS, Lee DC, et al. Merokok, menguap, makan: adakah pengesahan memberi kesan kepada cara orang menggunakan ganja? Dasar Dadah Int J 2016;36:141–7.
3 He T, Oks M, Esposito M, et al. " Tree-in-bloom ": kecederaan paru-paru akut yang teruk disebabkan oleh vape minyak ganja. Ann Am Thorac Soc 2017;14:468–70.
4 Knapp AA, Lee DC, Borodovsky JT, et al. Trend yang muncul dalam pentadbiran ganja di kalangan pengguna ganja remaja. J Kesihatan Remaja 2019;64:487–93.
5 Kriegel D. Vaping ganja vs merokok: adakah ada pemenang? 2021. Tersedia: https:// vaping360.com/learn/vaping-vs-smoking-weed/ [Diakses pada 15 Sep 2021].
6 Volkow ND, Baler RD, Compton WM, et al. Kesan buruk kesihatan penggunaan ganja. N Engl J Med 2014;370:2219–27.
7 Pahr K, Carter A. Panduan pemula untuk CBD. talian kesihatan. 2019. Tersedia: https://www. healthline.com/health/your-cbd-guide [Diakses pada 19 Ogos 2021].
8 Suleiman SA. Ketoksikan hidrokarbon petroleum secara in vitro: kesan n-alkana, benzena dan toluena pada makrofaj alveolar pulmonari dan enzim lisosom paru-paru. Arch Toxicol 1987;59:402–7.
9 Lachenmeier DW, Kuballa T, Reusch H, et al. Benzena dalam jus lobak merah bayi: pandangan lanjut tentang mekanisme pembentukan dan penilaian risiko termasuk data penggunaan dari kajian Donald. Food Chem Toxicol 2010;48:291–7.
10 Li YS, Li YF, Li QN, et al. Ketoksikan pulmonari akut pada tikus yang disebabkan oleh nanotube karbon berbilang dinding, benzena, dan gabungannya. Environ Toxicol 2010;25:409–17.
11 Anderson RP, Zechar K. Kecederaan paru-paru akibat terhidu minyak hash butana meniru radang paru-paru. Rep Kes Respir Med 2019;26:171–3.
12 Holt AK, Poklis JL, Peace MR. Analisis retrospektif juzuk kimia dalam cecair e-rokok terkawal dan tidak terkawal. Chem Depan 2021;9:752342.
13 Blount BC, Ahli Parlimen Karwowski, Shields PG, et al. Vitamin E asetat dalam cecair lavage bronchoalveolar yang dikaitkan dengan EVALI. N Engl J Med 2020;382:697–705.
14 Bhat TA, Kalathil SG, Bogner PN, et al. Model haiwan yang disedut vitamin E asetat dan kecederaan paru-paru seperti EVALI. N Engl J Med 2020;382:1175–7.
15 Merecz-Sadowska A, Sitarek P, Zielinska-Blizniewska H, et al. Ringkasan kajian in vitro dan in vivo yang menilai kesan pendedahan e-rokok terhadap organisma hidup dan alam sekitar. Int J Mol Sci 2020;21:652.
16 Sussan TE, Gajghate S, Thimmulappa RK, et al. Pendedahan kepada rokok elektronik menjejaskan pertahanan anti-bakteria dan anti-virus pulmonari dalam model tetikus. PLoS One 2015;10:e0116861.
17 Hwang JH, Lyes M, Sladewski K, et al. Penyedutan rokok elektronik mengubah imuniti semula jadi dan sitokin saluran pernafasan sambil meningkatkan virulensi bakteria yang menjajah. J Mol Med (Berl) 2016;94:667–79.
18 Martin EM, Clapp PW, Rebuli ME, et al. Penggunaan e-rokok mengakibatkan penindasan gen imun dan tindak balas keradangan dalam sel epitelium hidung yang serupa dengan asap rokok. Am J Physiol Sel Paru-paru Mol Physiol 2016;311:L135–44.
19 Rebuli ME, Glista-Baker E, Hoffman JR, et al. Penggunaan rokok elektronik mengubah tindak balas imun mukosa hidung kepada virus influenza yang dilemahkan secara langsung. Satu percubaan klinikal. Am J Respir Cell Mol Biol 2021;64:126–37.
20 Bloom JW, Kaltenborn WT, Paoletti P, et al. Kesan pernafasan rokok bukan tembakau. Br Med J (Clin Res Ed) 1987;295:1516–8.
21 Wasiat TA, Pagano I, Williams RJ, et al. Penggunaan e-rokok dan gangguan pernafasan dalam sampel dewasa. Pergantungan Alkohol Dadah 2019;194:363–70.
22 Xie W, Kathuria H, Galiatsatos P, et al. Persatuan penggunaan rokok elektronik dengan keadaan pernafasan kejadian dalam kalangan orang dewasa AS dari 2013 hingga 2018. JAMA Netw Open 2020;3:e2020816.
23 Bhatta DN, Glantz SA. Persatuan penggunaan e-rokok dengan penyakit pernafasan di kalangan orang dewasa: analisis membujur. Am J Prev Med 2020;58:182–90.
24 Li D, Sundar IK, McIntosh S, et al. Persatuan merokok dan penggunaan rokok elektronik dengan berdehit dan gejala pernafasan yang berkaitan pada orang dewasa: keputusan keratan rentas daripada penilaian populasi tembakau dan kajian (laluan) kesihatan, gelombang 2. Kawalan Tob 2020;29:140–7.
25 Tashkin DP, Coulson AH, Clark VA, et al. Gejala pernafasan dan fungsi paru-paru dalam kebiasaan perokok tegar ganja sahaja, perokok ganja dan tembakau, perokok tembakau sahaja dan bukan perokok. Am Rev Respir Dis 1987;135:209–16.
26 Tashkin DP. Menghisap ganja sebagai punca kecederaan paru-paru. Monaldi Arch Chest Dis 2005;63:93–100.
27 Tashkin DP. Kesan merokok ganja pada paru-paru. Ann Am Thorac Soc 2013;10:239–47.
28 Baldwin GC, Tashkin DP, Buckley DM, et al. Marijuana dan kokain menjejaskan fungsi makrofaj alveolar dan pengeluaran sitokin. Am J Respir Crit Care Med 1997;156:1606–13.
29 Taylor DR, Poulton R, Moffitt TE, et al. Kesan pernafasan pergantungan kanabis pada orang dewasa muda. Ketagihan 2000;95:1669–77.
30 Aldington S, Williams M, Nowitz M, et al. Kesan ganja pada struktur paru-paru, fungsi dan gejala. Thorax 2007;62:1058–63.
31 Moore BA, Augustson EM, Moser RP, et al. Kesan pernafasan penggunaan ganja dan tembakau dalam sampel AS. J Gen Intern Med 2005;20:33–7.
32 Goniewicz ML, Knysak J, Gawron M, et al. Tahap karsinogen dan toksik terpilih dalam wap daripada rokok elektronik. Kawalan Tob 2014;23:133–9.
33 Bhat TA, Kalathil SG, Leigh N, et al. Kesan akut penyedutan aerosol produk tembakau yang dipanaskan (IQOS) pada kerosakan tisu paru-paru dan perubahan keradangan dalam paru-paru. Nikotin Tob Res 2021;23:1160–7.
34 Kosmider L, Jackson A, Leigh N, et al. Tingkah laku semput sirkadian dan topografi di kalangan pengguna e-rokok. Tob Regul Sci 2018;4:41–9.
35 Bhat TA, Kalathil SG, Bogner PN, et al. Asap bekas menyebabkan keradangan dan menjejaskan imuniti terhadap jangkitan pernafasan. J Immunol 2018;200:2927–40.
36 Bhat TA, Kalathil SG, Bogner PN, et al. AT-rvd1 mengurangkan asap terpakai yang memburukkan lagi keradangan pulmonari dan memulihkan imuniti antibakteria yang ditindas asap terpakai. J Immunol 2021;206:1348–60.
37 Carden D, Xiao F, Moak C, et al. Neutrophil elastase menggalakkan kecederaan mikrovaskular paru-paru dan proteolisis kadherin endothelial. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology 1998;275:H385–92.
38 Kawabata K, Hagio T, Matsuoka S. Peranan elastase neutrofil dalam kecederaan paru-paru akut. Eur J Pharmacol 2002;451:1–10.
39 Khan AA, Alsahli MA, Rahmani AH. Myeloperoxidase sebagai biomarker penyakit aktif: perspektif biokimia dan patologi terkini. Med Sci (Basel) 2018;6:33.
40 Dietert K, Gutbier B, Wienhold SM, et al. Spektrum histopatologi spesifik patogen dan model dalam model tetikus radang paru-paru akut. PLoS One 2017;12:e0188251.
41 Butt YM, Smith ML, Tazelaar HD, et al. Patologi kecederaan paru-paru yang berkaitan dengan vaping. N Engl J Med 2019;381:1780–1.
42 Lee WL, Downey GP. Pengaktifan neutrofil dan kecederaan paru-paru akut. Curr Opin Crit Care 2001;7:1–7.
43 Ahli Parlimen Fink. Peranan spesies oksigen dan nitrogen reaktif dalam sindrom gangguan pernafasan akut. Curr Opin Crit Care 2002;8:6–11.
44 Abraham E. Neutrofil dan kecederaan paru-paru akut. Crit Care Med 2003;31:S195–9.
45 Pham CTN. Neutrophil serine protease memperhalusi tindak balas keradangan. Int J Biochem Cell Biol 2008;40:1317–33.
46 Arecco N, Clarke CJ, Jones FK, et al. Tahap dan aktiviti elastase meningkat dalam otot distrofik dan menjejaskan kelangsungan hidup, percambahan dan pembezaan sel myoblast. Sci Rep 2016;6:24708.
47 Czégény Z, Nagy G, Babinszki B, et al. CBD, adalah pendahulu THC dalam e-rokok. Sci Rep 2021;11:8951.
48 Lindén A, Laan M, Anderson GP. Neutrofil, interleukin-17A dan penyakit paru-paru. Eur Respir J 2005;25:159–72.
49 Ma K, Yang L, Shen R, et al. Sel Th17 mengawal pengeluaran CXCL1 dalam kanser payudara. Int Immunopharmacol 2018;56:320–9.
50 Becker S, Quay J, Koren HS, et al. Ekspresi MCP-1, GRO alfa, beta dan gamma yang konstitutif dan dirangsang dalam epitelium saluran pernafasan manusia dan makrofaj bronchoalveolar. Am J Physiol 1994;266:L278–86.
51 Potey PM, Rossi AG, Lucas CD, et al. Neutrofil dalam permulaan dan resolusi keradangan pulmonari akut: memahami fungsi biologi dan potensi terapeutik. J Pathol 2019;247:672–85.
52 Heijink IH, Brandenburg SM, Postma DS, et al. Asap rokok menjejaskan fungsi penghalang epitelium saluran pernafasan dan pemulihan hubungan sel-sel. Eur Respir J 2012;39:419–28.
53 Aghapour M, Raee P, Moghaddam SJ, et al. Disfungsi penghalang epitelium saluran udara dalam penyakit pulmonari obstruktif kronik: peranan pendedahan asap rokok. Am J Respir Cell Mol Biol 2018;58:157–69.
54 Shapiro SD, Goldstein NM, Houghton AM, et al. Neutrophil elastase menyumbang kepada emfisema yang disebabkan oleh asap rokok pada tikus. Am J Pathol 2003;163:2329–35.
55 Antunes MA, Rocco PRM. Emfisema pulmonari yang disebabkan oleh Elastase: pandangan daripada model eksperimen. An Acad Bras Cienc 2011;83:1385–96.
56 Ghosh A, Coakley RD, Ghio AJ, et al. Penggunaan e-rokok kronik meningkatkan neutrofil elastase dan tahap metalloprotease matriks dalam paru-paru. Am J Respir Crit Care Med 2019;200:1392–401.
57 Fortunati E, Kazemier KM, Grutters JC, et al. Neutrofil manusia bertukar kepada fenotip yang diaktifkan selepas masuk ke paru-paru tanpa mengira penyakit radang. Clin Exp Immunol 2009;155:559–66.
58 Faith M, Sukumaran A, Pulimood AB, et al. Sejauh manakah penunjuk keradangan adalah aktiviti myeloperoxidase? Clin Chim Acta 2008;396:23–5.
59 Lau D, Mollnau H, Eiserich JP, et al. Myeloperoxidase mengantara pengaktifan neutrofil dengan persatuan dengan CD11b/CD18 integrin. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102:431–6.
60 Schmidt A, Oberle N, Krammer PH. Mekanisme molekul penindasan sel T pengantara treg. Depan Immun 2012;3:51.
61 Thornton AM, Shevach EM. CD4+CD25+ sel T immunoregulatory menyekat pengaktifan sel T poliklonal secara in vitro dengan menghalang pengeluaran interleukin 2. J Exp Med 1998;188:287–96.
62 Kalininskiy A, Kittel J, Nacca NE, et al. Pendedahan e-rokok, jangkitan saluran pernafasan, dan imuniti semula jadi terjejas: ulasan naratif. Pediatr Med 2021;4:5.
63 Lucas R, Czikora I, Sridhar S, et al. Arginase 1: pengantara yang tidak dijangka bagi disfungsi penghalang kapilari pulmonari dalam model kecederaan paru-paru akut. Front Immunol 2013;4:228.
64 Ween MP, Whittall JJ, Hamon R, et al. Fagositosis dan keradangan: meneroka kesan komponen wap e-rokok pada makrofaj. Physiol Rep 2017;5:e13370.
65 Gay B, Medan Z, Patel S, et al. Kecederaan paru-paru akibat vape: kes pneumonia lipoid yang dikaitkan dengan e-rokok yang mengandungi kanabis. Rep Kes Pulmonol 2020;2020:7151834.
66 Abeles M, Popofsky S, Wen A, et al. Kecederaan paru-paru yang berkaitan dengan vape yang disebabkan oleh penyedutan minyak kanabis. Pediatr Pulmonol 2020;55:226–8.
67 Adapa S, Gayam V, Konala VM, et al. Ketoksikan pulmonari akut akibat vaping ganja: siri kes dan kajian literatur. J Investig Med Rep Kes Impak Tinggi 2020;8:2324709620947267.
68 Conuel EJ, Chieng HC, Fantauzzi J, et al. Kecederaan paru-paru yang berkaitan dengan vaping minyak cannabinoid dan rupa radiografinya. Am J Med 2020;133:865–7.
69 Lugade AA, Bogner PN, Thatcher TH, et al. Pendedahan asap rokok memburukkan lagi keradangan paru-paru dan menjejaskan imuniti terhadap jangkitan kuman. J Immunol 2014;192:5226–35.
70 Bhat TA, Kalathil SG, Miller A, et al. Pengantara pro-penyelesaian khusus mengatasi penindasan imun yang disebabkan oleh pendedahan kepada asap terpakai. J Immunol 2020;205:3205–17.
71 Garcia-Arcos I, Geraghty P, Baumlin N, et al. Pendedahan rokok elektronik kronik pada tikus mendorong ciri COPD dalam cara yang bergantung kepada nikotin. Thorax 2016;71:1119–29.
72 Booz GW. Cannabidiol ialah strategi terapeutik yang muncul untuk mengurangkan kesan keradangan pada tekanan oksidatif. Free Radic Biol Med 2011;51:1054–61.
73 Rosenberg EC, Tsien RW, Whalley BJ, et al. Cannabinoid dan epilepsi. Neurotherapeutics 2015;12:747-68.
74 Akademi Sains Kebangsaan, Kejuruteraan, Perubatan; Bahagian Kesihatan dan Perubatan. Kesan terapeutik ganja dan kanabinoid. Dalam: Kesan Kesihatan Ganja dan Cannabinoid: Keadaan Semasa Bukti dan Syor untuk Penyelidikan. Akhbar Akademi Kebangsaan, 2017.
75 Thiele EA, Marsh ED, JA Perancis, et al. Cannabidiol pada pesakit dengan sawan yang dikaitkan dengan sindrom Lennox-gestalt (GWPCARE4): percubaan fasa 3 terkawal rawak, dua buta, plasebo. Lancet 2018;391:1085–96.
76 Pentadbiran Makanan dan Dadah AS. FDA meluluskan ubat pertama yang terdiri daripada bahan aktif yang berasal daripada ganja untuk merawat bentuk epilepsi yang jarang berlaku dan teruk. 2018. Tersedia: https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm611046.htm [Diakses pada 15 Sep 2021].