Beta-glucan Meningkatkan Tindak Balas Imun Terhadap Vaksin Penyakit Newcastle dan Ubah Ungkapan MRNA Limpa dalam Ayam

ABSTRAK

Kajian ini dilakukan untuk menyiasat kesan pemberian oral b-glucan (G70), produk yang diperoleh daripada dinding sel yis, terhadap titer perencatan hemagglutinasi (HI) spesifik virus Newcastle disease (NDV), percambahan limfosit, dan peranan subpopulasi limfosit T dalam ayam yang dirawat dengan vaksin NDV hidup. Di samping itu, pengaruh b-glucan pada ekspresi gen splenik telah disiasat oleh penjujukan transkrip. Keputusan menunjukkan bahawa suplemen b-glucan meningkatkan titer serum NDV HI meningkatkan indeks rangsangan NDV limfosit dalam darah periferi dan saluran usus, dan menggalakkan pembezaan limfosit T kepada sel T CD4+. Analisis penjujukan RNA (RNA-seq) menunjukkan bahawa G70 mengimbangi ekspresi mRNA yang berkaitan dengan reseptor berganding protein G dan polipeptida kelas I MHC, dan menurunkan ekspresi mRNA yang berkaitan dengan cathelicidin dan betadefensin. Kesan imunomodulator G70 mungkin berfungsi melalui laluan isyarat protein kinase yang diaktifkan mitogen. Ringkasnya, G70 boleh meningkatkan keberkesanan imunologi vaksin NDV hidup dalam ayam dan boleh digunakan sebagai calon adjuvant yang berpotensi dalam industri ayam.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Kata kunci: Vaksin penyakit Newcastle, beta-glucan, adjuvant, ayam tulang hitam, RNA-seq

PENGENALAN

Polisakarida dinding sel yis diikat secara langsung daripada dinding sel Saccharomyces cerevisiae dan digunakan secara meluas sebagai penggalak pertumbuhan, agen antimikrob, atau imunomodulator dalam ayam untuk meningkatkan pengeluaran dan kesihatan (Schiavone et al., 2017; Hasted et al., 2021). Sebelum ini, produk yang dipanggil PW220, yang mengandungi polisakarida dinding sel yis, telah ditunjukkan untuk meningkatkan tindak balas imun yang dicetuskan oleh virus penyakit Newcastle (NDV) dan untuk mengubah komuniti mikrob sekum ayam dengan pemberian oral (Bi et al., 2020). ). Polisakarida dinding sel yis terutamanya terdiri daripada b-glucan dan mannan-oligosakarida (Wang et al., 2018). Dalam kajian ini, b-glucan telah disiasat untuk kesannya terhadap tindak balas imun terhadap vaksin NDV dalam ayam. Limpa adalah organ penting untuk memulakan tindak balas imun. Kajian terbaru menunjukkan bahawa PW220, yang merupakan produk dinding sel yis, mengimbangi ekspresi mRNA TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 dan T-bet dalam limpa ayam ( Bi et al., 2022). Walau bagaimanapun, mekanisme khusus perlu dijelaskan. Penjujukan RNA (RNA-seq) ialah salah satu teknologi pemprosesan tinggi yang boleh digunakan untuk menguji ekspresi gen kuantitatif dan menyediakan analisis profil ekspresi yang berbeza pada tahap keseluruhan transkrip (Zhao et al., 2018). Dengan kelebihan sensitiviti tinggi dan kos rendah, RNA-seq telah digunakan secara meluas dalam kajian ternakan dan ayam itik (Teixeira et al., 2019; Yuan et al., 2020). Oleh itu, dalam kajian ini, kesan pemberian b-glucan pada titer perencatan hemagglutinasi khusus NDV, percambahan limfosit, dan subpopulasi T-limfosit dalam ayam yang divaksin secara lisan dengan vaksin NDV telah dinilai. Tambahan pula, analisis transkriptom digunakan untuk menilai kesan b-glucan pada ekspresi gen dan laluan transduksi isyarat asas dalam limpa ayam.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Haiwan

Ayam tulang hitam komersial berusia satu hari (jantan) telah diperoleh daripada Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd. (Anshun, China). Ayam-ayam itu dibahagikan kepada sangkar dawai yang membenarkan akses percuma kepada makanan dan air. Dalam 7 hari pertama, suhu bilik dikekalkan pada 33 darjah C hingga 35 darjah Cand kemudian secara beransur-ansur menurun sebanyak 1 darjah C untuk setiap 2 hari hingga 27 darjah C. Semua ayam telah diproses mengikut piawaian yang ditetapkan oleh Penjagaan Haiwan Universiti Barat Daya dan Jawatankuasa Penggunaan (Nombor Sijil Etika: IAC-2021-0057). Semua burung eksperimen telah dimatikan dengan CO2 pada akhir kajian.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Vaksin

Vaksin hidup NDV (Strain La Sota) telah disediakan oleh Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Qingdao, China).

Reagen 

Produk dinding sel yis (YP) G70 diperoleh daripada dinding sel yis (Saccharomyces cerevisiae), yang mengandungi b-glucan (Lebih daripada atau sama dengan 70%) (AngelG70, QB/T4572, Ragi Malaikat, Yichang, China). Kedua-dua antigen dan sera kawalan positif untuk mengukur titer HI khusus NDV telah dibeli daripada Pusat Pembangunan Diagnostik Regen Qingdao (Qingdao, China). CD anti-ayam3-APC (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) dan CD8- PE (L{{14 }}TH49T) dalam tikus ditawarkan oleh Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, China).

Reka bentuk eksperimen

Empat puluh lapan ekor ayam tulang hitam pada umur 5 hari telah dibahagikan secara rawak kepada 3 kumpulan (Jadual 1) dan diberi sama ada diet asas (Jadual 2) atau diet asas dengan 0.1% G7{{10} } (b-glucan, 0.7 g/kg) suplemen untuk tempoh penyelidikan ini. Kumpulan H (Vaksin G70 +) dan C (Vaksin) telah diimunisasi secara lisan dengan vaksin NDV pada 14 dan 28 hari, masing-masing. Kumpulan S (Sailne) dirawat dengan jumlah garam yang sama. Sampel darah dituai melalui venipuncture sayap pada usia 5, 7, 14, 21, 28, 35, dan 42 hari untuk menguji titer HI. Tujuh hari selepas vaksinasi penggalak, 8 ekor ayam dalam setiap lajur dipetik secara rawak dan dikorbankan secara asfiksia menggunakan CO2. Limfosit dipisahkan daripada kedua-dua darah periferal dan jejunum untuk melakukan percambahan limfosit dan analisis sitometri aliran. Dalam kes pensampelan jejunal, ligamen suspensori duodenal adalah titik permulaan jejunum dan bahagian sepanjang 5 cm dikumpulkan dari titik permulaan jejunum. Limpa dibekukan dengan cepat dalam nitrogen cecair dan kemudian disimpan pada -80 darjah untuk RT-qPCR dan pemprofilan jujukan.

Jadual 1. Reka bentuk eksperimen

Jadual 2. 1 Komposisi dan kandungan nutrien diet asas ayam pedaging eksperimen.

Pengajian HI

Ujian untuk titer HI khusus NDV dalam serum dilakukan mengikut penerangan sebelumnya (Ball et al., 2019). Secara ringkasnya, serum telah dicairkan dengan garam penimbal fosfat (PBS) dari 1:2 hingga 1:1,024 dalam plat mikrotiter telaga 96-V-bawah. Kemudian, 25 mL pencairan NDV ditambah setiap telaga dan diinkubasi pada 37 darjah selama 30 minit. Selepas itu, 25 mL ampaian eritrosit ayam jantan 1% ditambah ke dalam setiap perigi dan diinkubasi pada suhu 37 darjah selama 30 minit. Semua sampel telah diuji dua kali dan kedua-dua kawalan positif dan negatif dimasukkan pada setiap plat. Titer HI adalah berdasarkan pencairan terbesar yang mengakibatkan perencatan lengkap hemagglutinasi. Purata titer HI dan ralat piawai (SE) diukur bagi setiap kumpulan.

Pengasingan Limfosit Daripada Darah Periferi

Limfosit telah diasingkan dan dikumpulkan daripada limfosit darah periferi menggunakan Kit Medium Pemisahan Limfosit (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Tianjin, China). Kemudian, limfosit disimpan dalam penggantungan dengan medium RPMI 1640 (Solarbio, Beijing, China) termasuk 5% serum betis janin dan 25 mM HEPES (pH 7.0).

Pengasingan Limfosit Daripada Jejunum

Proses penugasan telah dijalankan mengikut penerangan sebelum ini, dan dengan sedikit pengubahsuaian (Yuan et al., 2020). Ringkasnya, gunakan penapis sel 70 mm untuk membelah usus kepada 4 mL PBS sejuk. Selepas itu, penggantungan sel sampel telah disentrifugasi pada 4,500 rpm selama 12 minit dengan penyingkiran supernatan. Kemudian, gantung semula sel usus ke medium penuh (Solarbio Co., Beijing, China) yang terdiri daripada 5% serum lembu janin (FBS) dalam RPMI 1640 (Sijiqing Co., Hangzhou, China). Pada akhirnya, kit pengasingan limfosit ayam (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) untuk memisahkan limfosit. tisu usus dipecahkan kepada 4 mL PBS sejuk menggunakan penapis sel 70 mm. Seterusnya, penggantungan sel sampel telah disentrifugasi pada 4,500 rpm selama 12 minit dan supernatan dibuang. Selepas itu, sel-sel usus digantung semula ke dalam RPMI 1640 (Solarbio Co.) yang mengandungi 5% FBS (Sijiqing Co.). Akhirnya, limfosit diasingkan menggunakan kit pengasingan limfosit ayam (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.).

Pembiakan Limfosit 

Sel telah disemai dalam 96-plat perigi (5£105 setiap perigi), dirangsang oleh antigen NDV yang tidak diaktifkan untuk 4 unit hemagglutinasi atau jumlah garam yang sama. Setiap sampel diuji dalam 3 ulangan. Sel-sel dan antigen telah diinkubasi selama 44 jam pada 37 darjah dalam 5% CO2 dan kemudian 50 mL metil thiazolyl tetrazolium (MTT) (2 mg/mL) telah ditambah pada setiap telaga dan diinkubasi selama 4 jam lagi. Sampel telah disentrifugasi pada 1,200 £ g selama 8 minit pada suhu dalaman. Selepas itu, supernatan dikeluarkan dengan berhati-hati dan 100 mL DMSO ditambah kepada setiap telaga. Plat digoncang selama 8 minit untuk melarutkan kristal sepenuhnya. Akhirnya, purata ketumpatan optik (OD) direkodkan pada 570 nm. Indeks rangsangan (SI) diperoleh dengan menggunakan persamaan: nilai OD telaga teransang/ nilai OD telaga tak teransang (Cui et al., 2020).

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Analisis Sitometri Aliran Subpopulasi T-Limfosit

Suspensi sel limfoid telah diasingkan dan dibasuh dua kali dengan PBS. Kepekatan sel telah diubah suai kepada 106 /mL dan kemudian disimpan di atas ais. Setiap sampel diwarnakan dengan 2 mL CD anti-ayam tikus3-APC, CD4- FITC dan CD anti-ayam tikus{8-PE di bawah keadaan kalis cahaya selama 30 minit, diikuti dengan 2 cucian dengan PBS. Sel-sel telah diuji melalui analisis sitometri aliran pada sitometer Aliran (BD Bioscience, San Jose, CA).

Analisis RT-qPCR

Jumlah RNA diperolehi daripada limpa menggunakan reagen TRIzol (Takara, Shiga, Jepun) mengikut garis panduan pengilang dan kemudian ditukar kepada cDNA menggunakan PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian, China) pada pengitar haba T100 (Bio-Rad, Hercules, CA). Beta-aktin ayam telah digunakan sebagai gen kawalan dalaman. RT-qPCR gen terpilih telah dijalankan pada Sistem PCR Masa Nyata Berbilang (AB, Carlsbad, CA) dengan SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Kaedah kuantitatif relatif (244CT) dilakukan untuk menilai variasi kuantitatif (Bi et al., 2022). Urutan primer disenaraikan dalam Jadual 3.

Pengekstrakan RNA

Setiap satu daripada 3 sampel limpa daripada Kumpulan H (G70 +Vaksin) dan Kumpulan C (Vaksin) telah digunakan untuk RNA-seq dengan reagen TRIzol (Takara). Selepas itu, RNA diuji untuk pencemaran dan degradasi dengan gel agarose 1% dan ketulenan RNA dianalisis menggunakan spektrofotometer NanoPhotometer (IMPLEN, Westlake Village, CA). Kepekatan RNA ditentukan menggunakan Kit Ujian RNA Qubit dalam Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, CA). Integriti RNA diukur menggunakan Kit Ujian RNA Nano 6000 sistem Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Keputusan menunjukkan bahawa RNA adalah lengkap dan tanpa pencemaran DNA.

Analisis Transkriptom

Penjujukan transkrip, pemasangan jujukan dan analisis data disediakan oleh Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Beijing, China). Prosedur utama untuk transkriptom disenaraikan seperti berikut: 1) Pemurnian mRNA daripada jumlah RNA dilakukan menggunakan manik magnet poli-T oligo-dipasang. Pemecahan telah dijalankan dengan kation divalen dalam NEB Next First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) pada suhu tinggi. 2) CDNA untaian pertama telah disintesis menggunakan primer heksamer rawak dan Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV) Reverse. Sintesis cDNA untaian kedua kemudiannya disintesis menggunakan DNA Polimerase I dan RNase H. 3) Baki overhang telah diubah menjadi hujung tumpul melalui aktiviti exonuclease/polimerase. Struktur gelung penyepit rambut NEB Next Adapter kemudiannya diikat untuk menyediakan penghibridan selepas adenilasi hujung 3' serpihan DNA. 4) Kira-kira 250 hingga 300 bp serpihan cDNA diperoleh dan pustaka telah disucikan menggunakan sistem AMPure XP Beckman Coulter (Beckman Coulter, Beverly, MA). Kemudian 3 mL NEBU SER Enzyme (Thermo Fisher, Hillsboro, OR) digunakan dengan cDNA berikat penyesuai yang dipilih saiz pada 37 darjah C selama 15 minit, dan diikuti dengan 5 minit pada 95 darjah . Penguatan PCR telah dijalankan dengan polimerase DNA Kesetiaan Tinggi Phusion. Pada akhirnya, produk PCR telah dimurnikan (sistem AMPure XP) dan kualiti perpustakaan dianggarkan menggunakan sistem Agilent Bioanalyzer 2100. Pengelompokan sampel berkod indeks telah dilakukan pada TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, CA). Kemudian, penjujukan telah dilakukan pada platform Illumina Novaseq dan bacaan akhir berpasangan 150 bp telah dihasilkan. Genom rujukan dan fail anotasi model gen telah dimuat turun daripada tapak web genom (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ dan ftp://ftp. ensembl.org/ pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). Indeks genom rujukan telah ditubuhkan menggunakan HISAT2 (v2.0.5) dan bacaan bersih berpasangan diselaraskan dengan genom rujukan. Bilangan bacaan yang dipetakan pada setiap gen dan Fragmen Per Kilobase per Million (FPKM) untuk setiap gen berdasarkan panjang gen dan bilangan bacaan yang dipetakan pada gen telah dikira menggunakan Kiraan Ciri v1.5.{{38} }p3. Ungkapan pembezaan antara kumpulan H (Vaksin G70 +) dan kumpulan C (Vaksin) diperoleh menggunakan pakej DESeq2 R (1.16.1). Gen dengan P < 0.05 dan |log2 (perubahan kali ganda)| > 1 ditakrifkan sebagai gen ekspresi pembezaan (DEGs).

Jadual 3. Urutan primer untuk RT-qPCR.

Pengesahan PCR Kuantitatif Masa Nyata 

Dua DEG terkawal atas dan 4 DEG terkawal ke bawah dalam perbandingan kumpulan H (Vaksin G70 +) lwn Kumpulan C ( Vaksin) telah dipilih untuk mengesahkan keputusan penjujukan transkrip oleh RT-qPCR. RNA telah ditukar kepada cDNA menggunakan PrimeScript RT Master Mix (Takara) pada kitar haba T100 (Bio-Rad). Urutan primer disenaraikan dalam Jadual 3. Ayam b-aktin digunakan sebagai gen kawalan dalaman. RT-qPCR gen terpilih telah dijalankan pada Sistem PCR berbilang masa nyata (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) dengan SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Kaedah kuantitatif relatif (244CT) digunakan untuk menilai variasi dalam kuantifikasi. Semua sampel dilakukan dalam tiga kali ganda untuk dianalisis.

Analisis statistik

ANOVA sehala dengan ujian post hoc Duncan digunakan untuk berbilang perbandingan antara kumpulan menggunakan perisian SPSS (versi 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Data dinyatakan sebagai min § SE. Nilai P < 0.05 dianggap sebagai signifikan secara statistik.

KEPUTUSAN Kesan b-Glucan pada Titer Antibodi Serum

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1, titer HI khusus NDV menurun dalam semua kumpulan sebelum vaksinasi dan meningkat dalam kumpulan H (G70+Vaksin) dan C (Vaksin) selepas imunisasi. Menariknya, titer HI yang lebih tinggi diperhatikan dalam kumpulan H (G70+Vaksin) pada 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{ 14}}5), 35 (P > 0.05), dan 42 (P > 0.05) d umur berbanding kumpulan C (Vaksin).

Kesan b-Glucan pada Pembiakan Limfosit

Kesan G70 pada percambahan limfosit darah periferi digambarkan dalam Rajah 2A. SI dalam limfosit darah dipertingkatkan pada burung yang ditambah dengan G70 (G70 + Vaksin) pada 7 hari (P <0.05) imunisasi penggalak, jika dibandingkan dengan kumpulan Vaksin. Tambahan pula, SI dalam limfosit jejunal meningkat dengan ketara pada 7 hari (P <0.05) imunisasi pasca penggalak jika dibandingkan dengan kumpulan Vaksin (Rajah 2B).

Kesan b-Glucan pada Nisbah CD4 + / CD8 + Sel T dalam Darah Periferi 

Rajah 3A dan 3B menunjukkan gating limfosit dan CD3 + sel dan Rajah 3C hingga 3E menunjukkan nisbah CD4 + /CD8 + sel T dalam G70, vaksin, dan kumpulan salin, masing-masing. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3F, tiada perbezaan yang ketara antara kumpulan Vaksin dan kumpulan Saline berikutan imunisasi penggalak (P > 0.05), manakala perkadaran CD4 + /CD{{12} } Sel T jelas lebih tinggi dalam kumpulan G70 (G70 +} Vaksin) berbanding kumpulan Vaksin (P <0.05).

Rajah 1. Kesan pemberian oral b-glucan pada titer antibodi serum kepada vaksin NDV. Data dinyatakan sebagai min § SE.

Ekspresi Gen Berkaitan

Seperti yang digambarkan dalam Rajah 4, ekspresi mRNA TGF-b (P < 0 meningkat dengan ketara.05), IL-6 (P < 0.{{13} }5), dan TLR5 (P < 0.05) telah dikesan dalam limpa ayam yang dirawat dengan Vaksin G70 (G70 +), berbanding dengan kumpulan Vaksin. Tiada perbezaan ketara ditemui dalam ekspresi mRNA IFN-g (P > 0.05), TLR4 (P > 0.05), dan TLR3 (P > 0.05) dalam limpa antara G70 (G70 + Vaksin) dan Vaksin kumpulan.

Analisis Data Penjujukan RNA 

Penjujukan RNA daripada 8 perpustakaan limpa menghasilkan 24.1 G data mentah seperti yang dibentangkan dalam Jadual S1 bahan tambahan. CN bermaksud Vaksin kumpulan, dan HN bermaksud Vaksin kumpulan G70 +. Perpustakaan C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3, dan H4 masing-masing terdiri daripada 45,591,492, 47,424,782, 46,193,492, 54,403,376, 47,118,476, 45,84,476, 25,84,499 38 bacaan asal. Following aptamer, ambiguous sequences and low-quality sequences were removed, leaving 44,050,198, 45,449,884, 44,261,112, 52,097,846, 45,542,404, 44,566,290, 44,113,172, and 44,026,960 clean reads. Lebih daripada 96% bacaan bersih adalah antara bacaan asal, dan 8 perpustakaan dipadankan menggunakan HISAT2 untuk penjujukan bacaan terhadap pangkalan data rujukan yang terdiri daripada genom Gallus. Selanjutnya, bacaan bersih telah dipetakan ke pangkalan data ini dalam lebih daripada 95% kes. Khusus kepada perpustakaan daripada C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3, dan H4 ialah 40,921,384 (92.9%), 41,302,100 (90.87%), 40,771,075 (92.11%), 46,92 (92.11%), 46,92 (4.7%) .2 %), 40,213,444 (90.23%), 40,922,895 (92.77%), dan 40,971,972 (93.06%) bacaan masing-masing diberikan secara unik kepada pangkalan data rujukan.

Gen yang Diungkapkan Secara Berbeza

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5A, sejumlah 198 gen yang dinyatakan secara berbeza, termasuk 47 gen yang dikawal selia dan 151 gen yang dikawal ke bawah telah dikenalpasti. DEG diterangkan secara terperinci dalam bahan tambahan Jadual S2. Rajah 5B menunjukkan bahawa DEG mempunyai kebolehulangan rawatan yang baik.

Analisis Pengkelasan Ontologi Gen dan Ensiklopedia Kyoto Gen dan Pengayaan Genom

Gen yang merupakan gen yang dinyatakan secara berbeza dikelaskan kepada 3 kategori fungsi utama berdasarkan sistem klasifikasi Gene Ontology (GO): proses biologi, komponen selular dan fungsi molekul. 10 istilah GO teratas dalam 3 kategori dibentangkan dalam Rajah 6. Terdapat dominasi gen yang terlibat dalam "tindak balas terhadap imun humoral," "tindak balas kemokin," "tindak balas kepada humoral antimikrob," "tindak balas pertahanan terhadap bakteria, " "tindak balas imun terhadap humor antimikrob yang dimediasi oleh peptida antimikrob," "tindak balas pertahanan terhadap bakteria Gram-negatif," dan "tindak balas pertahanan terhadap bakteria Gram-positif" dalam kategori proses biologi. Di samping itu, dalam kategori fungsi molekul, nisbah gen yang luar biasa berkaitan dengan "pengikatan reseptor kemokin CC motif (CCR) reseptor kemokin," "pengikatan reseptor kemokin," dan "pengikatan lipopolysaccharide." Tambahan pula, "kompleks rantai pernafasan mitokondria I," "kompleks dehidrogenase NADH," dan "rantai pernafasan" adalah istilah diperkaya yang paling dominan dalam kategori komponen sel. Analisis laluan Ensiklopedia Gen dan Genom Kyoto juga dilakukan pada gen yang dinyatakan secara berbeza. Hasilnya mencadangkan bahawa gen terutamanya dikumpulkan kepada 7 laluan termasuk "interaksi reseptor ligan Neuroaktif," "Simpang jurang," "laluan isyarat protein kinase (MAPK) diaktifkan mitogen," "pengangkut ABC," "Biosintesis asid amino," "Metabolisme dadah," dan "Eksport protein."

Rajah 2. Kesan pemberian oral b-glucan pada indeks perangsang limfosit (SI). (A) Limfosit darah periferi; (B) limfosit usus. Data dinyatakan sebagai min § SE.

Rajah 3. Kesan pemberian oral b-glucan pada nisbah sel CD4+/CD8+ darah periferi. (A) Pintu pada limfosit; (B) get pada CD3+ sel T; (C) frekuensi CD3+ CD4 + CD8 + sel T dalam kumpulan G70+Vaksin; (D) frekuensi CD3+ CD4 + CD8 + sel T dalam kumpulan Vaksin; (E) frekuensi CD{15}} CD{16}} CD{17}} sel T dalam kumpulan Saline; (F) bardiagram mewakili nisbah CD4+/CD8+. Data dinyatakan sebagai min § SE.

Rajah 4. Kesan pemberian oral b-glucan pada ekspresi mRNA dalam limpa ayam. Data dinyatakan sebagai min § SE.

Rajah 5. Ringkasan data RNA-Seq. (A) Senarai gen yang dinyatakan secara berbeza, (B) peta pengelompokan DEG.

Pengesahan Gen yang Dinyatakan Secara Berbeza oleh RT-qPCR

6 DEG yang dikawal atas atau bawah telah disahkan oleh PCR kuantitatif masa nyata. Hasilnya mencadangkan bahawa data RT-qPCR secara amnya selaras dengan data RNA-seq secara umum, menunjukkan hasil penjujukan yang boleh dipercayai (Rajah 7). Ekspresi mRNA bagi Gen Berkaitan Laluan MAPK Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 8, ekspresi mRNA FAS (P < 0 menurun dengan ketara.05) dan CACNA2 (P < 0.05) adalah dikesan dalam limpa ayam dalam kumpulan G70 (G70 + Vaksin) jika dibandingkan dengan kumpulan Vaksin. Selain itu, ekspresi mRNA DUSP5 dan DUSP4 yang meningkat secara berangka, dan ekspresi mRNA p38, JNK dan ERK yang menurun secara berangka telah dikesan dalam kumpulan G70 (G70 + Vaksin) jika dibandingkan dengan kumpulan Vaksin (P > 0.05) .

PERBINCANGAN

Vaksin ND hidup disuntik secara meluas di ladang ayam namun masih terdapat wabak sporadis penyakit Newcastle dalam kumpulan ayam yang diimunisasi (Zhang et al., 2022). Vaksin optimum ditakrifkan untuk merangsang imuniti selular dan mukosa serta imuniti humoral yang berkesan (Shan et al., 2019). Oleh itu, semakin banyak perhatian diberikan kepada adjuvant yang boleh memberikan tindak balas imun mukosa serta selular (Chen et al., 2014; Yu et al., 2015). Berbanding dengan laluan suntikan, pemberian oral adalah pendekatan yang lebih mudah yang mengurangkan kos dan menyebabkan kurang tekanan untuk ayam pedaging (Boyaka et al., 2003; Zhang et al., 2008). Keputusan kajian ini menunjukkan bahawa diet yang ditambah dengan b-glucan sangat meningkatkan tahap titer HI khusus NDV dalam serum ayam, yang konsisten dengan laporan sebelumnya (Horst et al., 2019). Antibodi khusus NDV adalah penting untuk pembangunan tindak balas imun humoral untuk melindungi ayam daripada jangkitan NDV (Martinez et al., 2018; Li et al., 2020). Limfosit B menghasilkan antibodi dan limfosit T berkembang sebagai tindak balas kepada mitogen (Bohacova et al., 2021). Dalam kajian ini, indeks rangsangan limfosit darah periferal ayam kepada NDV kumpulan G70 jelas lebih tinggi daripada kumpulan vaksin, menunjukkan bahawa lebih banyak limfosit T telah diaktifkan. Subpopulasi utama limfosit T ialah CD{14}} dan CD{15}} sel T (Cui et al., 2020). CD{17}} Sel T terutamanya menghasilkan sitokin dan menggalakkan kematangan sel B, manakala CD{18}} sel T dikaitkan dengan membunuh sel sasaran (Zhang et al., 2021b). Dalam penyelidikan ini, nisbah CD4 +/CD8 + sel T yang dikesan dalam kumpulan G70 jelas meningkat, menunjukkan bahawa G70 boleh mengaktifkan lebih banyak CD4 + sel T daripada darah periferi. Di samping itu, kami memerhatikan indeks rangsangan limfosit usus yang jauh lebih tinggi dalam kumpulan G70 berbanding kumpulan Vaksin, yang mengesahkan bahawa b-glucan juga boleh merangsang limfosit usus. Eksperimen kami sebelum ini mengesahkan bahawa ekstrak dinding sel yis PW220 dengan ketara meningkatkan sel sIgA dan IgA + khusus usus (Bi et al., 2020). Maksudnya, kedua-dua b-glucan G70 dan PW220 berkesan dalam menggalakkan imuniti mukosa usus.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Peningkatan imuniti haiwan dengan pentadbiran b-glucan telah dilaporkan sebelum ini. Guo et al. (2003) mengesahkan bahawa pemberian b-glucan meningkatkan indeks bursa dan antibodi khusus NDV dalam ayam. Levine et al. (2018) mencadangkan bahawa suplemen b-glucan dapat mengawal selia MHC Ⅱ usus dan meningkatkan bilangan sel CD45 + untuk mengurangkan kecederaan usus.

Li et al. (2005) mendedahkan bahawa b-glucan diet boleh mengimbangi tahap ekspresi mRNA IL-8 dan TGF-b dalam saluran usus babi. Mekanisme kesan imunomodulator b-glucan tidak jelas. Kim et al. (2010) menunjukkan bahawa b-glucan menggalakkan kematangan sel dendritik dengan mengawal selia ekspresi CD40, CD80 dan CD86. Selain itu, Lee dan Kim (2014) dan Su et al. (2020) melaporkan bahawa reseptor pengecaman corak diaktifkan b-glucan seperti reseptor Dectin{14}}, reseptor seperti Tol dan CR3 (Baert et al., 2015). Limpa adalah organ kritikal untuk memulakan tindak balas imun dan memainkan peranan penting dalam imuniti semula jadi dan diperoleh (Bronte dan Pittet, 2013). Walau bagaimanapun, terdapat hanya sedikit penyelidikan berdasarkan analisis RNA-seq ekspresi mRNA dalam limpa pentadbiran post-oral polisakarida yis. Dalam kajian ini, analisis laluan Ensiklopedia Gen dan Genom Kyoto mencadangkan bahawa gen ini terutamanya dikumpulkan kepada 2 laluan, termasuk "interaksi reseptor ligan Neuroaktif" dan "laluan isyarat MAPK." Reseptor untuk pengecaman corak yang menyasarkan b-glucan telah diperkaya pada permukaan sel imun (Goodridge et al., 2009). Berikutan pengiktirafan b-glukan, kinase tyrosine dan faktor nuklear kappaB (NF-kappaB) telah dirangsang oleh reseptor ini, mengakibatkan induksi rembesan sitokin pro-radang dan pengaktifan tindak balas imun (Kankkunen et al., 2010; Masuda et al. ., 2012; Xu et al., 2016; Bode et al., 2019). MAPK, sebagai keluarga kinase protein serine-threonine, memainkan peranan penting dalam keradangan dan pengeluaran sitokin dalam ayam. Byun et al. (2016) menunjukkan bahawa b-glucan meningkatkan pengeluaran interferon-g dan interleukin{36}} dan mencetuskan tahap fosforilasi MAPK p38 yang jauh lebih tinggi dalam makrofaj peritoneal. Wang et al. (2014) melaporkan bahawa b-glucan melemahkan tindak balas keradangan dalam sel THP-1 dengan menghalang pengaktifan p38 MAPK. Dalam kajian ini, 13 DEG termasuk DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB dan EGFR telah dikenal pasti dalam laluan isyarat MAPK, yang mungkin mencadangkan tindak balas imun b-glucan. limpa melalui MAPK pada ayam. MAPK ialah kelas kinase Ser/Thr terpelihara dalam sel yang terlibat terutamanya dalam tindak balas selular seperti tindak balas imun, apoptosis dan percambahan. Keluarga MAPK termasuk sekurang-kurangnya 3 subfamili: c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 MAPK, dan kinase terkawal isyarat ekstraselular (ERK) (Hong et al., 2020; Zhang et al., 2021a). DUSP4 dan DUSP5 ialah fosfatase dwi-spesifik yang secara khusus menghalang aktiviti ahli keluarga MAPK seperti p38, JNK, dan ERK, memainkan peranan pengawalseliaan yang penting dalam mencegah tindak balas keradangan yang berlebihan dan menggalakkan regresi keradangan dalam badan (Imasato et al. ., 2002; Talreja et al., 2021). Di samping itu, RNA bukan pengekodan kecil bernama gga-miR-200a-3p telah dilaporkan untuk menyekat ekspresi faktor pro-radang dan dengan itu mengawal tindak balas autoimun hos dengan mengawal selia laluan MAPK secara negatif dan molekul isyarat hilirannya (Pham et al., 2017). Dalam kajian ini, analisis RT-qPCR menunjukkan bahawa ekspresi mRNA P38, JNK, dan ERK menurun dan ekspresi mRNA DUSP4 dan DUSP5 meningkat dalam ayam yang diberi makan b-glucan (G70). Keputusan ini menunjukkan bahawa kesan peningkatan imun b-glucan (G70) pada vaksin penyakit Newcastle mungkin berkaitan dengan peraturan maklum balas negatif faktor pro-radang yang dimediasi melalui MAPK. Di samping itu, FAS adalah bahan penting yang mengantara apoptosis dan penting untuk homeostasis imun (Krueger et al., 2003; Guegan dan Legembre, 2018). Sementara itu, CACNA2 ialah subunit saluran kalsium yang bergantung kepada voltan, yang mempunyai kesan promosi pada percambahan sel, penghijrahan dan pencerobohan (Sun et al., 2020). Dalam kajian ini, FAS dan CACNA2 telah menurun dengan ketara dalam ayam yang ditambah dengan b-glucan (G70), menunjukkan bahawa b-glucan (G70) memberikan kesan peningkatan imun terutamanya dengan menghalang apoptosis sel imun dan mengimbangi autoimun. Penemuan ini memberikan rujukan teori untuk penggunaan b-glucan (G70) sebagai penambah imun dalam tetapan klinikal. Walau bagaimanapun, mekanisme b-glucan meningkatkan tindak balas imun melalui kesan maklum balas negatif laluan MAPK memerlukan bukti lanjut. Adalah menarik untuk diperhatikan bahawa gen pengekodan cathelicidin yang terdiri daripada CATH3, CATH1, CATH2 dan gen pengekodan b-defensin termasuk AvBD6, AvBD7, AvBD1 dan AvBD4 dikawal dengan ketara ke bawah dalam perbandingan H (Kumpulan G70 + Vaksin) lwn. Kawalan (Vaksin Kumpulan). Peptida Pertahanan Hos (HDP) adalah molekul efektor yang memainkan peranan penting dalam sistem imun semula jadi (Cuperus et al., 2013). Peptida ini telah ditemui dalam pelbagai spesies haiwan daripada mamalia kepada burung. Terdapat 4 cathelicidin dalam anak ayam, terdiri daripada CATH1, CATH2, CATH3, dan CATHB1, yang berkesan membunuh pelbagai bakteria (Hamad et al., 2017). Avian beta-defensins (AvBDs), secara alternatif dinamakan gallinacean, adalah peptida kationik kecil dengan 3 ikatan sistein disulfida antara sisa sistein mereka dan memainkan peranan penting dalam sistem imun semula jadi (Yoshimura, 2015). Pengurangan dalam ekspresi cathelicidin dan beta-defensin mungkin dijelaskan oleh peraturan maklum balas, di mana populasi bakteria dan parabakteria dikurangkan oleh polisakarida dinding sel yis (Bi et al., 2020). Keputusan yang sama telah didedahkan dalam kajian lain. Shao et al. (2016) menunjukkan bahawa suplemen yis b-glucan dalam ayam pedaging menekan jangkitan Salmonella dan mengurangkan ekspresi HDP melalui analisis PCR masa nyata kuantitatif. Dalam kajian ini, produk G70 terutamanya terdiri daripada b-glucan meningkatkan tahap antibodi spesifik NDV dalam serum, meningkatkan indeks rangsangan NDV limfosit darah periferi dan limfosit usus, dan menggalakkan pembezaan limfosit T darah periferi kepada CD{{ 123}} Sel T. Di samping itu, analisis RNA-seq menunjukkan bahawa G70 mengawal selia ekspresi mRNA yang berkaitan dengan reseptor serotonin berganding protein G dan polipeptida kelas MHC I dan menurunkan kawalan ekspresi mRNA yang berkaitan dengan cathelicidin dan beta-defensin. Memandangkan kesan peningkatan G70 pada vaksin ND dalam ayam, kesan G70 pada vaksin ayam lain seperti vaksin selesema burung boleh dikaji lebih lanjut.

Rajah 6. Analisis laluan KEGG.

Rajah 7. Pengesahan RT-qPCR calon DEG terpilih. Data dinyatakan sebagai min § SE.

Rajah 8. Ekspresi mRNA relatif dalam limpa. Jumlah RNA diekstrak daripada limpa. B-aktin ayam dihidangkan sebagai gen kawalan dalaman. Data dinyatakan sebagai min § SE.

RUJUKAN

Baert, K., E. Sonck, BM Goddeeris, B. Devriendt, dan E. Cox. 2015. Perbezaan spesifik jenis sel dalam pengecaman b-glucan dan isyarat dalam sel imun semula jadi babi. Dev. Komp. Immunol. 48:192–203.

Ball, C., A. Forrester, A. Herrmann, S. Lemiere, dan K. Ganapathy. 2019. Imuniti perlindungan perbandingan yang disediakan oleh vaksin hidup virus penyakit Newcastle atau metapneumovirus burung apabila ditadbir bersama bersama-sama strain klasik dan varian virus bronkitis berjangkit pada anak ayam pedaging berumur sehari. Vaksin. 37:7566–7575.

Bi, S., J. Zhang, Y. Qu, B. Zhou, X. He, dan J. Ni. 2020. Produk dinding sel yis meningkatkan tindak balas IgA usus dan menukar spesies mikroflora cecum selepas vaksinasi oral pada ayam. Poult. Sci. 99:6576–6585.

Bi, S., J. Zhang, L. Zhang, K. Huang, J. Li, dan L. Cao. 2022. Dinding sel yis mengawal tindak balas imun pengantara sel terhadap vaksin virus penyakit Newcastle. Poult. Sci. 101:101712–101721.

Bode, K., F. Bujupi, C. Link, T. Hein, S. Zimmermann, D. Peiris, V. Jaquet, B. Lepenies, H. Weyd, dan PH Krammer. 2019. Dectin-1 yang mengikat aneksin pada sel apoptosis mendorong toleransi imun periferi melalui NADPH oksidase-2. sel. Rep. 29:4435–4446.

Bohacova, P., J. Kossl, M. Hajkova, B. Hermankova, V. Holan, dan E. Javorkova. 2021. Perbezaan antara sel B dan T yang dirangsang mitogen dalam pengikatan tidak spesifik antibodi R-phycoerythrin-conjugated. J. Immunol. Kaedah. 493:113013–113023.

Boyaka, PN, A. Tafaro, R. Fischer, K. Fujihashi, E. Jirillo, dan JR McGhee. 2003. Manipulasi terapeutik sistem imun: peningkatan imuniti mukosa semula jadi dan adaptif. Curr. Pharm. Reka bentuk. 9:1965–1972.

Bronte, V., dan MJ Pittet. 2013. Limpa dalam peraturan imuniti tempatan dan sistemik. Kekebalan. 39:806–818.

Byun, E., S. Park, B. Jang, N. Sung, dan E. Byun. 2016. B-glucan yang disinari gamma mendorong aktiviti imunomodulasi dan antikanser melalui laluan MAPK dan NF-kB. J. Sains. Makanan. Agr. 96:695–702.

Chen, X., X. Chen, S. Qiu, Y. Hu, C. Jiang, D. Wang, Q. Fan, C. Zhang, Y. Huang, Y. Yu, H. Yang, C. Liu, Z Gao, R. Hou dan X. Li. 2014. Kesan cecair oral epimedium polisakarida-propolis flavon pada imuniti mukosa dalam ayam. Int. J. Biol. Makromol. 64:6–10.

Cui, X., Y. Wang, R. Guan, M. Lu, L. Yuan, W. Xu, dan S. Hu. 2020. Tindak balas imun yang dipertingkatkan dengan analisis proteomik serum bagi vaksin penyakit kambing biri-biri hu kepada kaki dan mulut yang diemulsi dalam bahan pembantu minyak sayuran. Vaksin-vaksin. 8:180–197

Cuperus, T., M. Coorens, A. van Dijk, dan HP Haagsman. 2013. Peptida pertahanan hos burung. Dev. Komp. Immunol. 41:352–369.

Goodridge, HS, AJ Wolf, dan DM Underhill. 2009. Pengiktirafan beta-glukan oleh sistem imun semula jadi. Immunol. Wahyu 230:38–50.

Guegan, J., dan P. Legembre. 2018. Fungsi nonapoptotik Fas/ CD95 dalam tindak balas imun. FEBS J 285:809–827.

Guo, Y., RA Ali, dan MA Qureshi. 2003. Pengaruh beta-glukan terhadap tindak balas imun dalam anak ayam pedaging. Immunopharm. Immunol. 25:461–472.

Hamad, SK, S. Kim, SW El-Kadi, EA Wong, dan RA Dalloul. 2017. Ekspresi perbandingan peptida pertahanan tuan rumah dalam ayam belanda. Poult. Sci. 96:2083–2090.

Hasted, T., S. Sharif, P. Boerlin, dan MS Diarra. 2021. Potensi imunostimulasi buah-buahan dan ekstraknya dalam ayam. Depan. Immunol. 12:641696.

Hong, Y., J. Lee, TH Vu, S. Lee, HS Lillehoj dan YH Hong. 2020. Burung ayam b-defensin 8 memodulasi tindak balas imun melalui laluan isyarat protein kinase yang diaktifkan mitogen dalam barisan sel makrofaj ayam. Poult. Sci. 99:4174–4182.

Horst, G., R. Levine, R. Chick, dan C. Hofacre. 2019. Kesan beta- 1,3-glucan (AletaTM) pada tindak balas vaksinasi dalam ayam daging. Poult. Sci. 98:1643–1647.

Imasato, A., C. Desbois-Mouthon, J. Han, H. Kai, ACB Cato, S. Akira, dan J. Li. 2002. Perencatan p38 MAPK oleh glukokortikoid melalui induksi MAPK fosfatase-1 mempertingkatkan ekspresi tidak boleh taip pengaruh pengaruh Haemophilus reseptor seperti tol 2. J. Biol. Kimia. 277:47444–47450.

Kankkunen, P., L. Teiril€a, J. Ritahaka, H. Alenius, H. Wolff, dan S. Matikainen. 2010. (1,3)-beta-glukan mengaktifkan kedua-dua dectin-1 dan inflammasom NLRP3 dalam makrofaj manusia. J. Immunol. 184:6335–6342.

Kim, HS, JY Kim, HK Lee, MS Kim, SR Lee, JS Kang, HM Kim, K. Lee, JT Hong, Y. Kim dan S. Han. 2010. Pengaktifan sel dendritik oleh glucan diasingkan daripada umbilicaria esculenta. Imun. Netw. 10:188–197.

Krueger, A., SC Fas, S. Baumann, dan PH Krammer. 2003. Peranan CD95 dalam pengawalseliaan apoptosis sel T periferal. Immunol. Wahyu 193:58–69.