Kesan Neuroprotektif Dan Mekanisme Procyanidins In Vitro Dan In Vivo Bahagian 2

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

3. Perbincangan

Banyak kajian telah menunjukkan bahawa PC mempamerkan aktiviti penghapusan radikal dan antioksidan yang kuat ]25-27I, dan tekanan oksidatif yang disebabkan oleh pengeluaran ROS yang berlebihan dan/atau kerosakan sistem pertahanan antioksidan memainkan peranan penting dalam penyakit neurodegeneratif [ -6,28,29]. Walau bagaimanapun, kesan neuroprotektif dan mekanisme PC mengenai kerosakan oksidatif masih tidak jelas. Oleh itu, kajian ini mengkaji kesan dan mekanisme PC dalam perlindungan saraf.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Dalam kajian ini, kepekatan PC yang sesuai meningkatkan tahap enzim antioksidan, termasuk GSH-Px, CAT, dan SOD, tetapi menurunkan tahap ROS dan MDA dalam model kerosakan oksidatif berbanding dengan pengukuran menggunakan H, O, sahaja. Penemuan ini konsisten dengan kajian terdahulu yang mencadangkan bahawa suplemen PC yang rendah melalui diet boleh meningkatkan aktiviti GSH-Px, CAT, dan SOD dalam anak babi yang dipisahkan [30]. Kajian lain juga mencadangkan bahawa PC meningkatkan aktiviti CAT dan SOD dengan ketara dan menurunkan kandungan MDA, sekali gus meningkatkan kualiti sperma kambing [31].

Cistanche boleh meningkatkan imuniti

Laluan Nrf2/ARE ialah laluan antioksidan yang ketara [32-34]. Biasanya, Nrf2 berada dalam sitoplasma, di mana ia terikat kepada protein perencatan, Keap135,36]. Selepas rangsangan H2O2, Nrf2 berpisah daripada Keap1, memulakan sistem pertahanan antioksidan endogen, dan seterusnya translokasi ke dalam nukleus [34,37,38]. Ia kemudian berinteraksi dengan ARE untuk mengaktifkan satu siri gen pelindung sel dan antioksidan, termasuk GCLC, GCLM, NOO1 dan HO-139,40]. Sebagai tindak balas kepada tekanan oksidatif, sama seperti perubahan yang dilihat semasa rangsangan H-O2, Nrf2 berpisah daripada Keap1 dalam sitosol dan kemudiannya dipindahkan ke dalam nukleus, mengikat urutan ARE untuk mengaktifkan transkripsi gen krioprotektif [41,42]. Kami mendapati bahawa kepekatan PC yang sesuai memudahkan penyetempatan nuklear Nrf2 di bawah keadaan lesi H, O{23}}dalam sel PC12. Selain itu, kepekatan PC yang sesuai dengan ketara telah mengawal selia tahap ekspresi NOO1, HO-1, GCLM dan GCLC, yang kesemuanya boleh bertindak secara langsung untuk menghapuskan radikal bebas dan molekul oksidatif [43]. Oleh itu, keputusan ini menunjukkan bahawa kepekatan PC yang sesuai meningkatkan tahap laluan Nrf2/ARE. Seterusnya, pembungkaman gen Nfr2 melalui Nrf2 siRNA digunakan untuk menilai lebih lanjut peranan pengaktifan Nrf2/ARE dalam perlindungan saraf pengantara PC terhadap kerosakan oksidatif yang disebabkan oleh H, O{34}}. Nrf{35}}sel yang ditransfeksi siRNA menunjukkan penurunan ketara dalam ungkapan Nrf2. Pada masa yang sama, kami mendapati bahawa kalah mati Nrf2 menghapuskan perlindungan pengantara PC terhadap kerosakan H2O, dirawat dalam daya maju sel, dan kalah mati Nrf2 juga menghapuskan kesan antioksidan PC. Penemuan ini adalah selaras dengan kajian terdahulu yang mencadangkan bahawa meningkatkan pengaktifan laluan Nrf2 / ARE menyumbang kepada neuroprotection [44]. Oleh itu, keputusan sekarang menunjukkan bahawa laluan Nrf2 / ARE mungkin mewakili sasaran farmakologi PC untuk pencegahan neurodegeneration.

4. Bahan dan Kaedah 4.1. Bahan Kimia dan Reagen

H2O2 dibeli dari HUSHI (HUSHI, Shanghai, China). CCK-8, NAC telah dibeli daripada Beyotime (Beyotime, Shanghai, China). PC, 2',7/-dichlorofluorescein diacetate, MDA, GSH-Px, kit diagnostik SOD dan kit diagnostik CAT telah dibeli daripada Solarbio (Solarbio, Beijing, China).RNAi Plus, Kit reagen PrimeScript RT dengan Pemadam gDNA dan SYBR Premix Ex Tag II telah dibeli dari Takara (Takara, Shiga, Jepun). Nrf2-siRNA, control-siRNA, dan lipofectamine 2000 diperoleh daripada GenePharma (GenePharma, Shanghai, China). Antibodi primer berikut dan antibodi sekunder yang sepadan diperoleh daripada Proteintech (Proteintech, Wuhan, China): Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, lamin B dan GAPDH.

4.2. Kultur sel

Sel PC12 diperolehi daripada Koleksi Kebangsaan Kultur Sel Yang Disahkan. Sel-sel itu dikekalkan dalam medium DMEM ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin dan penisilin-streptomisin （100 U/mL; 100 ug/mL） dalam inkubator lembap pada 37 darjah dengan 5 peratus CO2.

4.3. Ujian Daya Tahan Sel

Sel PC12 telah disemai ke dalam 96-plat perigi pada ketumpatan 1×104 sel/telaga. Sel-sel telah terdedah kepada kepekatan PC atau NAC yang berbeza (20 μM) selama 24 jam, selepas itu ia diinkubasi dengan 200 μM H2O2, selama 24 jam. Seterusnya, 10 μLof CCK{11}}larutan ditambahkan pada setiap telaga dan diinkubasi selama 1 jam, selepas itu penyerapan diukur pada 450 nm.

4.4. Penyelenggaraan Ikan

Kelulusan etika untuk penggunaan haiwan telah diberikan oleh Jawatankuasa Pemuliharaan dan Penggunaan Haiwan Pusat Haiwan Eksperimen di Universiti Zhejiang(ZJU20200125). Ikan zebra dewasa (Danio rerio, strain AB) diperoleh daripada pusat haiwan makmal Universiti Zhejiang dan dikekalkan pada suhu 28±1C di bawah kitaran cahaya/gelap 14/10-j [21J. Ikan diberi makan Artemia nauplii dua kali sehari. Untuk menghasilkan embrio, ikan zebra dewasa diletakkan semalaman di dalam tangki pembiakan pada nisbah 1:1, jantan: betina. Pemijahan dicetuskan dalam masa 2 jam selepas lampu dihidupkan keesokan harinya. Embrio dinaikkan dalam air embrio pada 28 darjah [45].

4.5. Pengukuran ROS

Untuk mengukur pengeluaran ROS secara in vivo, larva ikan zebra(tekanan AB), 3 hari selepas persenyawaan （pdf） didedahkan kepada NAC（30 μM） atau pelbagai kepekatan PC jika tiada atau kehadiran 300 μM H, O, selama 4 hari. Selepas itu, pada 7 pdf, kumpulan rawatan yang berbeza dipindahkan ke 24-plat perigi (10 larva ikan zebra setiap kumpulan) dirawat dengan 20 uM larutan diasetat 2',7'-dichlorofluorescein, dan diinkubasi selama 60 minit dalam gelap pada 28.5 darjah C[46]. Seterusnya, larva dibasuh tiga kali dengan medium embrio untuk membuang lebihan 2'7'-dichlorofluorescein diacetate. Larva yang bernoda kemudiannya diperhatikan dan diimej di bawah mikroskop confocal pengimbasan laser Olympus. Keamatan pendarfluor setiap larva individu dikira melalui perisian Image].

Untuk mengukur pengeluaran ROS Secara in vitro, sel PC12 telah disemai ke dalam 6-plat perigi pada ketumpatan 2×10* sel/telaga. Sel-sel telah terdedah kepada kepekatan PC atau NAC (20 uM) yang berbeza selama 24 jam dan kemudian diinkubasi dengan 200 uM H O, selama 24 jam. Sel-sel telah diinkubasi dengan 10 μM larutan diasetat 2',7'-dichlorofluorescein dalam gelap selama 30 minit; selepas itu, larutan pewarna dikeluarkan, dan sel-sel itu dibasuh tiga kali dalam garam penimbal fosfat. Sel-sel itu kemudiannya diperhatikan dan diimej di bawah mikroskop confocal pengimbasan laser Olympus. Keamatan pendarfluor sel telah dikira melalui perisian Image].

4.6.Penilaian MDA, GSH-Px, SOD dan CAT

Larva zebrafish （AB strain） at3 pdf didedahkan kepada NAC （30 μM） atau pelbagai kepekatan PC tanpa kehadiran atau kehadiran 300 uM H2O, selama 4 hari. Ikan zebra 7 dpf telah dibius dengan tetrakain dan dihomogenkan selepas euthanasia di atas ais. MDA, GSH-Px, CAT dan SOD dianalisis secara serentak, mengikut arahan pengilang. Setiap eksperimen mengandungi 20 larva, dan setiap indeks yang diukur diulang dalam tiga kali ganda.

Sel PC12 telah disemai ke dalam 6-plat perigi pada ketumpatan 2× 10* sel/telaga. Sel-sel telah terdedah kepada kepekatan PC atau NAC (20 uM) yang berbeza selama 24 jam dan kemudian diinkubasi dengan 200 uM H2O, selama 24 jam. Sel PC12 seterusnya dikumpulkan dan diinkubasi dengan penimbal lisis. Aktiviti MDA, GSH-Px, SOD dan CAT diukur menggunakan kit ujian yang sepadan, mengikut protokol setiap pengeluar. Setiap indeks yang diukur diulang dalam tiga kali ganda.

4.7. Jumlah Pengekstrakan RNA, Transkripsi Songsang dan Tindak balas Rantaian Polimerase Masa Nyata Kuantitatif

Larva zebrafish （AB strain） pada 3 dpf telah terdedah kepada NAC（30 μM） atau pelbagai kepekatan PC jika tiada atau kehadiran 300 uM H, O, selama 4 hari. Selepas rawatan, RNA diekstrak menggunakan RNAiso, mengikut arahan pengilang. RNA telah ditranskripsi terbalik menggunakan PrimeScript RT Kit dengan pemadam gDNA, mengikut arahan pengilang (Takara, Shiga, Jepun). PCR masa nyata kuantitatif telah dilakukan dengan sistem PCR Masa Nyata Applied Biosystems Vi-7 menggunakan SYBR Premix Ex TaqII -actin digunakan sebagai gen rujukan dan ekspresi gen relatif dikira menggunakan 2-AACt kaedah. Urutan primer yang digunakan disenaraikan dalam Jadual 1.

4.8. Transfeksi siRNA Nrf2

Nrf2-siRNA telah digunakan untuk menumbangkan Nrf2. Sel PC12 telah disemai dalam 6-plat kultur telaga dan kemudian ditransfeksi dengan Nrf2-siRNA (80 nM) atau control-siRNA menggunakan Lipofectamine 2000, mengikut arahan pengilang.

4.9.Penyediaan Protein Seluruh Sel, Sitoplasma dan Nuklear

Untuk pengekstrakan protein sel keseluruhan, sel telah dikumpulkan dan diinkubasi dengan penimbal lisis RIPA yang mengandungi 1 peratus PMSF dan 1 peratus koktel perencat protease selama 30 minit di atas ais. Lisat sel telah disentrifugasi, dan supernatan dikumpulkan dan disimpan. Untuk penyediaan pecahan subselular, sampel sel telah diproses menggunakan kit pengekstrakan protein nuklear dan sitoplasma. Kandungan protein telah diuji menggunakan ujian BCA. 4.10.Western Blotting

Sampel protein aliquoted telah diselesaikan oleh SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran polyvinylidene-difluoride. Tompok kemudiannya diinkubasi dengan antibodi utama berikut: Nrf2, Keapl, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, atau GAPDH. Membran kemudiannya dibasuh dengan TBST selama 5 minit; ini diulang 5 kali. Selepas itu, blots diinkubasi dalam antibodi sekunder konjugasi peroksidase. Akhirnya, jalur protein divisualisasikan menggunakan reagen pengesanan pembongkaran Barat ECL-plus.

4.11.Ujian Tingkah Laku Lokomotor

Larva zebrafish （AB strain） pada 3 pdf telah terdedah kepada NAC（30 μM） atau pelbagai kepekatan PC jika tiada atau kehadiran 300 μM H O, selama 4 hari. Selepas itu, pada 7 pdf, larva yang dirawat ini disalut ke dalam 24-plat perigi (satu ikan bagi setiap perigi dan 12 larva bagi setiap kumpulan). Kami menggunakan Any-maze 4.73 untuk mengukur tingkah laku lokomotor larva ikan zebra, dan mengira jumlah jarak yang dilalui dalam 10 minit [47].

4.12.Analisis Statistik

Data ditunjukkan sebagai min ± sisihan piawai (SD) bagi sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas. Analisis sehala bagi varians(ANOVA) dan ujian julat berbilang Duncan digunakan untuk menentukan kepentingan statistik, dan perbezaan dianggap signifikan apabila p<0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" via="" spss,="" version="">

5. Kesimpulan

Kesimpulannya, penemuan sekarang menunjukkan bahawa PC memberikan kesan neuroprotektif melalui mengaktifkan laluan Nrf2/ARE dan enzim detoksifikasi hiliran dan enzim antioksidan. Secara keseluruhan, PC mungkin mempunyai kesan perlindungan terhadap gangguan neurodegeneratif.

Sumbangan Pengarang:Pengkonsepan, JCandJZ.(Jiajin Zhu); metodologi, JC; perisian, YC; pengesahan, YZ., JZ(Jiawen Zhao) dan HY; analisis formal, JC; penyiasatan, YC; sumber, JZ(iajin Zhu); penyusunan data, JC; penulisan—penyediaan draf asal, JC; menulis—menyemak dan menyunting, JZ.(iajin Zhu); visualisasi, JC; penyeliaan, DL; pentadbiran projek, JZ(Jiajin Zhu); pemerolehan pembiayaan, JZ(Jiajin Zhu). Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan:Penyelidikan ini tidak menerima pembiayaan luar.

Penyata Lembaga Semakan Institusi:Kajian itu dijalankan mengikut garis panduan Pengisytiharan Helsinki, dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Pemuliharaan dan Penggunaan Haiwan Pusat Haiwan Eksperimen di Universiti Zhejiang (ZJU20200125). Kenyataan Persetujuan Termaklum: Tidak berkenaan.

Penyata Ketersediaan Data:Data terkandung dalam artikel. Konflik Kepentingan: Pengarang mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Ketersediaan Sampel: Sampel sebatian tidak tersedia daripada pengarang.

Artikel ini diekstrak daripada Molecules 2021, 26, 2963. https://doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules