Myricetin Ameliorates Ox LDL Induced HUVECs Apoptosis Dan Keradangan Melalui LncRNA GAS5 Mengawal Selia Ungkapan MiR 29a 3p

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Aterosklerosis (AS)adalah penyebab utama morbiditi dan kematian di kalangan penyakit kardiovaskular, yang pada mulanya dicetuskan oleh disfungsi endothelial dan dicirikan oleh kemasukan komponen lipoprotein aterogenik. Ia adalah faktor potensi utama kebanyakan penyakit maut, seperti infarksi miokardium, angina yang tidak stabil, kematian jantung secara tiba-tiba, dan strok. Walaupun etiologi terlibat, teori tindak balas kerosakan bahawa kecederaan sel endothelial vaskular (EC) adalah mekanisme permulaan AS masih diterima pakai secara meluas3,4.Oksidatiflipoprotein ketumpatan rendah (ox-LDL) telah terbukti terlibat dalam pembentukan aterosklerosis, dan kecederaan endothelial vaskular yang disebabkan adalah salah satu patogenesis awal aterosklerosis. Setakat ini, mengawal perkembangan AS tetap menjadi cabaran utama kerana mekanisme molekul AS tidak difahami sepenuhnya. Oleh itu, mengurangkan kecederaan EC yang disebabkan oleh lembu-LDL dan menjelaskan mekanismenya mungkin merupakan strategi yang berpotensi untuk pencegahan dan rawatan AS. Myricetin (Myr) adalah flavonoid semulajadi biasa yang terdapat dalam banyak buah-buahan, sayur-sayuran, dan herba. Myr memainkan peranan yang besar dalam merawat dan mencegah beberapa penyakit, termasuk osteoporosis diabetes, karsinoma hepatoselular8, hati alkohol³，dan kanser kulitl9，kerana keupayaan besi-chelating yang kuat，antioksidan, dan aktiviti scavenging radikal bebas. Baru-baru ini,kardioprotektifperanan Myr telah menarik perhatian daripada komuniti penyelidikan. Myr menunjukkan kesan perlindungan pada lipopolysaccharide (LPS) yang disebabkanmiokardium keradangankecederaan, jantunghypertrophy, dan iskemia/reperfusi(I/R) yang disebabkan oleh kecederaan miokardium3. Walau bagaimanapun, kesan Myr pada metabolisme lipid dan aterosklerosis tidak difahami sepenuhnya.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Bahan dan kaedah

Budaya sel, model kecederaan yang disebabkan oleh lembu-LDL, dan percambahan.

Sel Endothelial Vein Vein Human Umbilical (HUVECs) dari Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) dikulturkan dalam DMEM ditambah dengan 10% FBS di bawahnormoxickeadaan pada 37 °C. HUVEC dirawat dengan kepekatan yang berbeza（50，100，200 μg/ml）daripada ox-LDL（Teknologi Union-Bio，China）dan dikumpulkan pada 24h untuk pengukuran lebih lanjut. Menurut arahan pengeluar, kadar percambahan sel diukur dengan ujian CCK8 (Solarbio, China).

Cistanche boleh meningkatkan imuniti

Analisis sitometri aliran apoptosis dengan PI dan lampiran V pewarnaan berganda.

Apoptosis sel dinilai oleh cytometry aliran menggunakan PI dan annexin V double-staining apoptosis assay kit (Solarbio, China)mengikut arahan pengeluar.

Pengukuran spesies oksigen reaktif (ROS). ROS intraselular ditentukan guna Kit Siang ROS（Beyotime，China）. Secara ringkas，sel-sel telah diinkubasi dengan 10 μM DCHF-DA selama 20 minit, dan kemudian keamatan pendarfluor dinilai di bawah pembaca mikroplate.

RNA immunoprecipitation(RIP) assay.

RIP dilakukan menggunakan Magna RIP Kit (Millipore, Amerika Syarikat)mengikut protokol pengeluar18. Secara ringkas, sel HUVEC dikumpulkan dan digabungkan dalam penimbal lysis RIP yang lengkap. Ekstrak protein sel keseluruhan kemudiannya diinkubasi dengan penimbal RIP yang mengandungi manik magnet yang dikonjugasi dengan antibodi anti-AGO2 manusia atau kawalan negatif tetikus normal IgG. RNA yang diambil kemudiannya dikesan oleh qRT-PCR.

RNA Fluorescent in Situ Hybridization (FISH) assay. Probe khusus untuk urutan GAS5 dan miR-29a-3p direka dan disintesis oleh RiboBio.A FISH Kit (RiboBio) digunakan untuk mengesan isyarat siasatan mengikut arahan pengeluar. Nuklei telah dinoda dengan DAPI.

Laporan wartawan Dual-luciferase. Ujian wartawan dual-luciferase digunakan untuk mengesan interaksi antara gas5 dan miR-29a-3p promoter rantau.

Urutan jenis liar dan mutasi tapak mengikat (WT-GAS5 dan MUT-GAS5)telah direka dan disintesis. HUVECcells telah ditransfekasi dalam kombinasi dengan WT(Mut)GAS5 vektor dan miR-NC atau miR-29a-3p menggunakan Lipofectamine 2000 Transfection Reagen (Invitrogen). Selepas 48h transfection, sistem ujian wartawan Dual-Luciferase (Promega) digunakan untuk menjalankan ujian luciferase.

Penentuan VCAM-1, IL-6, dan MCP-1.

Tahap supernatant monocyte chemo-attractant protein-1(MCP-1),interleukin-6 (IL-6), dan molekul lekatan sel vaskular 1(VCAM-1)ditentukan oleh kit ELISA. Il-6 ELISA Kit (ab178013), kit ELISA MCP-1 (ab179886),dan kit VCAM-1 ELISA (ab223591)digunakan mengikut arahan pengeluar.

PCR Yang Diukur Masa Nyata(gRT-PCR).

Jumlah RNA diasingkan menggunakan reagen Trizol (Takara Bio Inc., Jepun）mengikut protokol pengeluar. cDNA dijana daripada jumlah RNA（2 μg）dengan Kit Transkripsi Terbalik cDNA (Biosistem Gunaan, Amerika Syarikat), dan PCR masa nyata berasaskan SYBR telah dilakukan untuk mengesan jumlah transkrip mRNA pada sistem PCR Masa Nyata Gunaan (ABI)7300 yang pantas. Urutan primer disenaraikan di bawah.

Ujian blot Barat.

Ungkapan protein Bax, Bcl-2, caspase3, CD31, SM22a, p-p65, p65, p-IkBa, IkBa dan TLR4, diukur oleh blotting Barat. Sampel protein yang diasingkan dari sel HUVEC (25 ug))) telah diselesaikan menggunakan SDS-PAGE dan kemudian berpindah ke membran polyvinylidene fluoride (PVDF) membran (Millipore, Amerika Syarikat)dengan disiasat dengan GAPDH UCLA UCLA,1:5000, Isyarat Sel), Bax(#2772S,1:1000, Isyarat Sel), Bcl-2 (#15071S,1:1000, Isyarat Sel),caspase3(#9662S,1:1000, Isyarat Sel), CD31 (ab9498,1:1000, Abcam), SM22a (ab14106,1:1000,Abcam),Abcam),p-p65 (10745-1-AP 1:1000, Abcam), SM22a (ab14106,1:1000,Abcam),p-p65 (10745-1-AP 1:1000, Proteintech), p65 (66535-1-Ig,1:1000,Protein-tech),p-IkBa(10268-1-AP,1:1000, Proteintech),IkBa(66418-1-Ig,1:1000, Proteintech) dan TLR4(66350-1-Ig, 1:1000, Proteintech) antibodi diikuti oleh antibodi sekunder yang sesuai. Semua blots Barat diulang sekurang-kurangnya tiga kali. Akhirnya, ungkapan protein divisualisasikan dengan chemiluminescence (ECL)sys-tem yang dipertingkatkan.

Immunofluorescence assay.

Sel-sel yang ditanam pada slaid telah diperbaiki, distabilkan, disekat, dan imuntained semalaman dengan antibodi CD31(ab9498, 1:200, Abcam)dan SM22a (ab14106,1:200,Abcam). Selepas mencuci, antibodi IgG berlabel FITC kedua tertentu telah diinkubasi dengan sel secara berterusan. Akhirnya, imej-imej itu diperolehi di bawah mikroskop (Olympus, Jepun) dengan pembesaran yang sesuai.

Analisis statistik. Semua keputusan ditunjukkan sebagai ralat ±standard min (SEM). Keputusan yang signifikan secara statistik ditentukan menggunakan ANOVA sehala, diikuti oleh ujian Student-Newman-Keuls (S-N-K)q. Nilai p<0.05 was="" considered="" to="" be="">

Keputusan

Myricetin mengurangkan apoptosis yang disebabkan oleh lembu-LDL dan ROS dalam HUVECs.

Pertama sekali,100 inkubasi ug/ml ox-LDL untuk 24 h membawa kepada penurunan dos yang ketara dalam daya maju sel. Pretreatment dengan l uM Myr untuk 2 h tidak mempunyai pengaruh yang signifikan terhadap daya maju sel. Walau bagaimanapun，2.5 dan 5 μM Myr menyebabkan penurunan ketara dalam daya maju sel (Gamb. 1A dan B). Di samping itu, kami menyedari bahawa peningkatan ROS yang disebabkan oleh ox-LDL dalam HUVECs dikurangkan sebanyak Myr(Gamb. 1C). Kami juga mengkaji kesan Myr pada apoptosis. Selain itu, cytometry aliran dan hasil protein yang berkaitan dengan apoptosis apoptosis yang berkaitan dengan apoptosis HUVEC yang berkaitan dengan dos juga secara dramatik telah diterbalikkan sel-sel MYR-pretreated yang bergantung kepada dos (Rajah 1D dan E).

Myricetin menghalang tindak balas keradangan dan EndMT dalam sel HUVEC yang disebabkan oleh lembu-LDL. Pewarnaan Immunofluorescence menunjukkan bahawa inkubasi HUVEC dengan ox-LDL mengurangkan ungkapan penanda endothelial CD31, dan peningkatan ekspresi penanda mesenchymal SM22a, menunjukkan bahawa keadaan lembu-LDL mencetuskan EndMT. Tetapi kesan ini dikurangkan oleh MYR. Secara konsisten, blot barat menunjukkan bahawa Myr melemahkan tahap protein SM22a yang dikawal selia dalam HUVEC yang disebabkan oleh ox-LDL(Rajah, 2A dan B). Dengan kehadiran ox-LDL, tahap mRNA IL-6, MCP-1, VCAM-1 jelas dikawal selia dalam HUVECs, manakala rawatan Myr membalikkan perubahan menyimpang ini (Rajah.2C). Begitu juga, keputusan yang sama telah disahkan lagi oleh ELISA (Rajah 2D).

GAS5 over-expression mengurangkan kesan perlindungan myricetin terhadap huVEC yang dimediasi lembu-LDL.

Kami seterusnya mengesan ungkapan GAS5 dalam HUVECs dengan gRT-PCR. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3A, tahap GAS5 yang jauh lebih tinggi diperhatikan dalam kumpulan ox-LDL daripada dalam kawalan. Sebaliknya, tahap mRNA GAS5 dikurangkan dalam kumpulan yang dirawat Myr dengan cara yang bergantung kepada dos. Data ini menunjukkan bahawa GAS5 mungkin terlibat dalam kesan Myr pada sel endothelial. Untuk memahami mekanisme di mana GAS5 mungkin terlibat dalam kesan perlindungan Myr, kami menggunakan pcDNA-GAS5 untuk mengatasi ekspresi GAS5 dalam HUVECs. Ungkapan GAS5 telah dipertingkatkan oleh pcDNA-GAS5, yang pada mulanya dikurangkan oleh Myr dalam HUVECs yang disebabkan oleh lembu-LDL (Rajah 3B). Eksperimen selanjutnya mendedahkan bahawa daya maju sel HUVEC dengan overexpression GAS5 telah menurun dengan ketara, dan apoptosis telah meningkat dengan ketara di bawah rawatan Myr(Rajah 3C dan D). Selain itu, overexpression GAS5 dalam HUVEC yang dirawat oleh ox-LDL menunjukkan kandungan ROS yang lebih tinggi berbanding dengan kawalan yang sepadan (Gamb. 3E). Data ini menunjukkan bahawa mengawal ekspresi GAS5 mengurangkan kesan perlindungan Myr terhadap kecederaan HUVEC yang dimediasi oleh ox-LDL.

miR-29a-3p adalah sasaran GAS5 di HUVEC.

Sasaran GAS5 dikenal pasti melalui RegRNA 2.0 dan star-Base, hasil carian ditunjukkan dalam Rajah. 4A. Di antara miRNA ini, miR-29a-3p adalah penurunan yang paling ketara dalam kecederaan HUVEC yang dimediasi lembu-LDL (Gamb. 4B). Analisis bioinformatik dibawa untuk meramalkan kawasan mengikat antara GAS5 dan miR-29a-3p (Rajah.4C). Untuk mengesahkan ramalan bioinformatik ini, ujian gen wartawan dwi-luciferase menunjukkan bahawa GAS5-WIpresented aktiviti luciferase yang lebih rendah daripada kumpulan MUT yang sepadan, mengesahkan hubungan mengikat GAS5 dan miR-29a-3p (Rajah 4D). Sementara itu, tahap GAS5 yang diperkaya oleh Ago2 RIP adalah lebih tinggi dalam sel-sel yang ditransfekasi dengan miR-29a-3p daripada kumpulan miR-NC (Rajah.4E). Sementara itu, analisis IKAN dalam HUVECcells menunjukkan bahawa GAS5 telah disetempatkan bersama dengan miR-29a-3p terutamanya dalam nukleus (Rajah 4F). Penemuan ini mencadangkan bahawa GAS5 menyasarkan miR-29a-3p.

miR-29a-3p meniru menyelamatkan kesan GAS5 dalam HUVEC yang disebabkan oleh lembu-LDL yang dirawat dengan Myricetin.

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5A, ungkapan miR-29a-3p telah meningkat dengan ketara dalam kumpulan pemasi lembu-LDL+ Myr+pcDNA-GAS5+miR-29a-3p berbanding dengan kumpulan meniru ox-LDL+Myr+pcDNA-GAS5+mimic (Rajah 5A). Lebih-lebih lagi, GAS5 yang dikawal selia dengan ketara meningkatkan daya maju HUVEC yang disebabkan oleh lembu-LDL yang dirawat oleh Myr, manakala cotransfection pcDNA-GAS5andmiR-29a-3p meniru ke dalam HUVECs menghapuskan kesan ini (Rajah.5B). Selain itu, pengeluaran ROS dan apoptosis dalam ox-LDL menyebabkan HUVEC yang dirawat oleh Myr selepas terlalu banyak ekspresi GAS5, manakala miR-29a-3p meniru meneutralkan kesan ini (Rajah.5C dan D).

Sh-GAS5 atau miR-29a-3p meniru boleh mempercepatkan peranan perlindungan Myricetin dalam sel HUVECs yang disebabkan oleh lembu-LDL.

Untuk meneroka sama ada GAS5 dan miR-29a-3p terlibat dalam mekanisme pengawalseliaan Yang dimediasi Myr, HUVEC telah ditransfeksikan dengan NC, kawalan meniru sh-GAS5, meniru miR-29a-3p. Ungkapan GAS5 menurun dengan ketara dalam kumpulan sh-GAS5 berbanding dengan kumpulan NC (Rajah.6A). Selepas transfeksi, ox-LDL+ Myr meningkatkan daya maju berbanding dengan kumpulan ox-LDL, dan perencatan GAS5 atau miR-29a-3p yang dikawal selia meningkatkan daya maju HUVEC yang disebabkan oleh lembu-LDL yang dirawat oleh Myr(Rajah.6B). Selain itu, apoptosis sel terkawal Myr yang disebabkan oleh ox-LDL, yang kemudiannya diubah oleh sh-GAS5 dan miR-29a-3p meniru (Rajah.6C). Selain itu, tahap protein CD31 dan SM22a telah meningkat

Myricetin tidak mengaktifkan laluan isyarat TLR4/NF-KB dalam HUVEC yang dirawat ox-LDL dengan mengawal selia GAS5 atau mengawal selia miR-29a-3p. Laluan isyarat TLR4/NF-KB terlibat dalam proses AS. Untuk meneroka sama ada Myr menekan laluan isyarat TLR4/NF-B, TLR4, dan beberapa protein hiliran penting, contohnya, p-p65,p65, p-65, p-IkBa, IkBa, dan TLR4, telah dikenal pasti dalam sel HUVEC melalui analisis blot barat. Rajah6 menunjukkan bahawa Myr mengawal selia ungkapan p-p65, p-IkBa, dan TLR4 berbanding kumpulan ox-LDL, manakala tahap protein p-p65,p-IkBa. dan TLR4 dikurangkan dalam kumpulan meniru ox-LDL+ Myr+sh-GAS5 dan ox-LDL+ Myr+miR-29a-3p berbanding dengan kumpulan ox-LDL+ Myr(Gamb.7). Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan bahawa laluan GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB mungkin merupakan salah satu mekanisme asas di mana Myr mengurangkan keradangan sel HUVEC dan EndMT. Perbincangan

AS adalah keadaan keradangan yang berterusan yang dimulakan oleh pemendapan serta pengumpulan lipoprotein ketumpatan rendah di dinding arteri19. Walaupun terdapat kemajuan yang luar biasa dalam kajian asas dan saintifik, masih merupakan antara sebab utama kematian di dunia2. Dalam kajian ini, kami meneroka mekanisme molekul Myr pada kerosakan HUVEC yang disebabkan oleh lembu-LDL, mendedahkan peranan penting lncRNA GAS5 dalam peristiwa ini. Keputusan kami mencadangkan bahawa Myr mengawal daya maju sel HUVECs, ROS, apoptosis, keradangan, dan EndMT melalui laluan GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB, menjelaskan mekanisme baru Myr untuk melindungi daripada AS.

Ox-LDL telah ditunjukkan untuk mendorong generasi ROS yang dipertingkatkan, yang memainkan peranan penting dalam perkembangan AS. Bukti yang ketara menunjukkan bahawa peningkatan tekanan oksidatif memainkan peranan penting dalam patogenesis disfungsi endothelial vaskular bersama-sama dengan sel endothelial EndMT, keradangan, dan apoptosis. Kami menggunakan ox-LDL merangsang HUVEC untuk mensimulasikan kejadian aterosklerosis awal, dan tindak balas keradangan dan EndMT HUVECs meningkat, dan Myr dengan ketara menghalang tindak balas keradangan dan EndMT kepada HUVECs dirangsang dengan ox-LDL. Myr diketahui memberikan kesan sitoprotektif antioksidatif dalam pelbagai sel, termasuk garis sel HUVEC21. Kajian sebelumnya mendapati bahawa Myr mempamerkan kesan pro-proliferatif dan anti-apoptotik dalam kecederaan sel H9c2 yang disebabkan oleh LPS2. Dalam kajian penyelidikan ini, kami melihat hasil Myr pada versi sel aterosklerotik yang disebabkan oleh ox-LDL. Keputusan kami mencadangkan bahawa 5 μM Myr pretreatment boleh mengubah dengan ketara downregulation yang disebabkan oleh lembu-LDL daya maju sel dalam HUVECs. Keputusan kami menunjukkan bahawa ox-LDL, terapi boleh mengiklankan keradangan dan EndMT HUVEC melalui mengawal selia CD31, SM22a, dan sitokin keradangan (IL-6, MCP-1, VCAM-1), yang boleh diterbalikkan oleh pretreatment Myr. Beberapa elemen menubuhkan bahawa keradangan dan EndMT mengiringi aterosklerosis23. Kajian terdahulu mendapati perencatan ungkapan VCAM-1 dan ICAM-1 telah diiktiraf sebagai strategi penting terhadap aterosklerosis24. Lebih-lebih lagi, vaksin itu menekan EndMT endothelial yang disebabkan oleh lembu-LDL melalui penanda endothelial yang dikawal selia CD31 dan mengawal selia penanda mesenchymal SM22a25. Penemuan kami sangat bersetuju dengan penyelidikan ini.

Ungkapan GAS5 sangat dinyatakan dalam kedua-dua model manusia dan haiwan26,27.Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa GAS5 telah dikawal selia dan miR-29a-3p telah dikawal selia dalam kecederaan HUVEC yang disebabkan oleh lembu-LDL. Rawatan Myr boleh membalikkan kesan ini. Kajian sebelumnya menunjukkan bahawa Mvr menghalang ungkapan HMGB1, TLR4, dan MyD88 dalam neuron, dan ia memulihkan kerosakan neuron dan keradangan yang disebabkan oleh pengaktifan laluan isyarat NF-KB dan MAPK * 8.Dalam kajian ini, peraturan lncRNA GAS5 dan peraturan bawah miR-29a-3p menyebabkan penurunan apoptosis sel, keradangan, dan EndMT, serta pengurangan aktiviti laluan isyarat TLR4 / NF-KB. Menurut penemuan kami, Myr mengurangkan p-p65,p-IkBa, dan TLR4 dalam HUVEC dengan mengawal selia GAS5/miR-29a-3p mengurangkan tindak balas keradangan dan EndMT dalam HUVECinjury yang disebabkan oleh lembu-LDL. Akhirnya, kajian penyelidikan kami mendedahkan bahawa Myr mampu ameliorating apoptosis sel, keradangan sel, dan EndMT melalui laluan GAS5 /miR-29a-3p / TLR4 / NF-KB (Rajah 8), mencadangkan Myr sebagai agen terapeutik yang berpotensi untuk AS. Di samping itu, GAS5 dicadangkan untuk menjadi molekul sasaran yang menjanjikan yang melibatkan proses patofisiologi AS.

Rujukan

1. Kondapalli, L., Bottinor, W.&Lenneman, C. Dengan melepaskan brek dengan imunoterapi, adakah kita mempercepatkan aterosklerosis?.

Sirkulasi 142(24), 2312-2315(2020).

2. Libby, P.Ridker, P.M.& Hansson, G.K.Progress dan cabaran dalam menterjemahkan biologi aterosklerosis. Alam semulajadi 473(7347),

317-325 (2011).

3. Couto, N. F.et al. Perubahan OxLDL dalam dinamik membran sel endothelial membawa kepada perubahan dalam pemerdagangan vesicle dan peningkatan

kerentanan sel terhadap kecederaan. Biochim.Biophys.Acta Biomembranes 1862,183139 (2019).

4. Yamagata, K.Kesan perlindungan epigallocatechin gallate pada gangguan endothelial dalam aterosklerosis. J. Cardiovasc. Pharmacol.75,

292-298(2019).

5. Gao, S.& Liu, J.Persatuan antara peredaran lipoprotein ketumpatan rendah teroksida dan penyakit kardiovaskular aterosklerotik.

Dis. Transl. Med. 3(2),89-94 (2017).

6. Torisu,K. et al. Autophagy endothelial intact diperlukan untuk mengekalkan homeostasis lipid vaskular. Sel Penuaan15(1),187-191 (2016).

7. Pan,X. et al. Pengaktifan isyarat Nrf2/HO-1 dengan Myricetin untuk mengurangkan kemerosotan ECM dalam chondrocytes manusia dan ame-meliorating osteoarthritis murine. Int. Immunopharmacol. 75,105742 (2019).

8.Li,M.et al. Myricetin menekan penyebaran karsinoma hepatoselular melalui ungkapan yang mengawal selia YAP. Sel 8(4),

358(2019).

9. Guo, C.et al. Myricetin Ameliorates pengumpulan lipid yang disebabkan oleh etanol dalam sel hati dengan mengurangkan biosintesis asid lemak. Mol

Nutr. Makanan Res. 63(14), e1801393 (2019).