Pemprofilan Imun Membujur Mendedahkan Epitope Dominan Mengantara Kekebalan Humoral Jangka Panjang dalam COVID-19–Individu yang sembuh

Latar belakang: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ialah coronavirus yang sangat patogenik dan berjangkit yang menyebabkan wabak global dengan 5.2 juta kematian setakat ini. Soalan mengenai ciri serologi imuniti jangka panjang, terutamanya epitop dominan yang mengantara tindak balas antibodi tahan lama selepas jangkitan SARS-CoV-2, masih belum dijelaskan.

Objektif: Kami menyasarkan untuk membedah kinetik dan jangka hayat tindak balas imun dalam pesakit penyakit koronavirus 2019 (COVID-19), serta epitop yang bertanggungjawab untuk imuniti humoral jangka panjang yang berterusan terhadap SARS-CoV-2.

Kaedah: Kami menilai dinamik imun SARS-CoV-2 sehingga 180 hingga 220 hari selepas serangan penyakit dalam 31 individu yang kebanyakannya mengalami gejala sederhana COVID-19, kemudian melakukan pemprofilan seluruh proteom bagi epitop dominan yang bertanggungjawab untuk tindak balas imun humoral yang berterusan.

Keputusan: Analisis membujur mendedahkan antibodi spesifik protein SARS-CoV-2 yang berterusan dan antibodi peneutral dalam pesakit COVID-19, bersama-sama dengan pengaktifan pengeluaran sitokin pada peringkat awal selepas jangkitan SARS-CoV-2. Epitop yang sangat reaktif yang mampu mengantarkan tindak balas antibodi jangka panjang ditunjukkan terletak pada protein spike dan ORF1ab. Epitop utama protein lonjakan SARS-CoV-2 telah dipetakan ke domain terminal N subunit S1 dan subunit S2, dengan pelbagai peringkat homologi jujukan antara coronavirus manusia endemik dan identiti jujukan tinggi antara SARS- awal. CoV-2 (Wuhan-Hu- 1) dan varian edaran semasa.

faedah suplemen cistanche-bagaimana untuk menguatkan sistem imun

Kesimpulan: Jangkitan SARS-CoV-2 mendorong imuniti humoral yang berterusan dalam individu yang sembuh COVID–19 dengan menyasarkan epitop dominan yang terletak di spike dan protein ORF1ab yang mengantara tindak balas imun jangka panjang. Penemuan kami menyediakan laluan untuk membantu reka bentuk vaksin dan pembangunan diagnostik yang rasional. (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)

Kata kunci:

SARS-CoV-2, COVID-19, tindak balas imun jangka panjang, imuniti humoral, mikroarray peptida seluruh proteom, epitope dominan

Sindrom pernafasan akut yang teruk coronavirus 2 (SARS-CoV- 2), patogen penyebab penyakit coronavirus 2019 (COVID-19) yang sedang berlangsung, tergolong dalam genus Betacoronavirus, yang merangkumi 2 manusia lain yang sangat patogenik. coronavirus: coronavirus sindrom pernafasan akut teruk (SARS) dan sindrom pernafasan Timur Tengah (MERS).1 Sejak bermulanya kes pertama yang direkodkan pada akhir Disember 2019, jangkitan SARS-CoV-2 telah mengakibatkan lebih 263 juta kes yang disahkan dan 5.2 juta kematian di seluruh dunia setakat November 2021, menjejaskan 220 negara dan wilayah di 5 benua.2 Selepas jangkitan, persembahan klinikal berkisar secara meluas, termasuk jangkitan tanpa gejala, simptom ringan atau sederhana, malah radang paru-paru teruk yang mengancam nyawa.3 Walaupun terdapat ketersediaan pelbagai jenis pendekatan vaksin, banyak negara masih bergelut untuk membendung gelombang jangkitan baharu, dengan varian virus muncul yang kelihatan menunjukkan peningkatan kebolehtransmisian dan ketahanan terhadap tindak balas imun antivirus. Tindak balas imun humoral yang berkesan yang dimediasi oleh antibodi meneutralkan harus mempunyai imuniti adaptif yang kuat dan sangat diperlukan untuk menyekat jangkitan dan menghapuskan patogen virus. Selepas jangkitan SARS-CoV-2, kadar tinggi (melebihi 90%) seroconversion teguh dalam kalangan individu yang dijangkiti diperhatikan pada 7 hingga 14 hari selepas penyakit bermula.4-6 Pengeluaran IgA, IgG, antigen khusus, dan IgM yang mengiktiraf spike protein (S) dan protein nukleokapsid (N) SARS-CoV-2 dapat dikesan semasa fasa akut penyakit dan peringkat awal pemulihan.4,5,7 Magnitud antibodi peneutral kelihatan seperti dikaitkan dengan umur, jangkitan simptom, dan keterukan penyakit. Pesakit dan individu yang lebih tua yang menunjukkan simptom COVID{30}} yang teruk cenderung untuk membina tahap antibodi peneutral yang lebih tinggi.4,8-10 Beberapa kajian mengenai jangka hayat tindak balas antibodi telah mendedahkan bahawa walaupun kehilangan kereaktifan serum/plasma kepada virus antigen dan penurunan titer antibodi yang meneutralkan dari semasa ke semasa dalam beberapa kes COVID-19 yang bergejala, tahap keseluruhan imuniti humoral jangka panjang yang berterusan diperhatikan sehingga 8 hingga 12 bulan selepas jangkitan pada COVID-19–individu yang sembuh .10-13 Tambahan pula, bilangan sel B memori khusus antigen SARS-CoV-2 kekal stabil selama sekurang-kurangnya 6 hingga 12 bulan,12,13 bersama-sama dengan pemilihan berterusan dan pengumpulan klon sel B yang mengekspresikan meneutralkan antibodi,12,14 menunjukkan pengekalan imuniti humoral yang berterusan selepas jangkitan SARSCoV{49}}.

faedah tambahan cistanche-meningkatkan imuniti

Antibodi yang meneutralkan memainkan peranan asas dalam pertahanan perumah terhadap jangkitan virus. Panel antibodi monoklonal SARS-CoV yang sangat kuat-2 telah dikenal pasti,15-17 terutamanya menyasarkan epitop yang terletak pada domain pengikat reseptor protein S yang berhimpun menjadi trimer pada permukaan virion dan memudahkan kemasukan virus dan gabungan pada penglibatan reseptor enzim penukar angiotensin 2.18 Kawasan lain protein S, termasuk domain terminal N (NTD) subunit S1 dan subunit S2, juga mengandungi epitop imunogenik yang mampu mendorong antibodi peneutralan.16 ,19,20 Selain peneutralan, antibodi SARS-CoV-2 mungkin memberikan perlindungan in vivo melalui fungsi efektor pengantara Fc, seperti fagositosis bergantung kepada antibodi yang dicetuskan oleh sel pembunuh semulajadi dan sitotoksisiti bergantung kepada antibodi oleh monosit atau makrofaj. 21,22 Selain daripada memerangi jangkitan virus, antibodi yang dihasilkan oleh jangkitan semula jadi atau vaksinasi boleh memudahkan patogenesis virus, sama ada dengan meningkatkan pengaktifan keradangan atau meningkatkan kebolehjangkitan virus melalui pembentukan kompleks imun antigen/antibodi atau oleh fungsi yang bergantung kepada Fc,23-25 walaupun jangkitan virus yang dipertingkatkan tidak diperhatikan dalam konteks SARS-CoV-2 in vivo. Peranan tindak balas antibodi yang berbeza ini memerlukan pencirian sistematik bagi epitop SARSCoV-2, serta sifat antibodi tahan lama yang menyasarkan epitop peneutralan atau tidak peneutralan. Walaupun kemajuan terkini mengenai kinetik dan tempoh tindak balas antibodi selepas jangkitan SARS-CoV-2, analisis membujur berkenaan epitop menonjol yang mengekalkan tindak balas imun humoral jangka panjang masih terhad. Kajian terdahulu telah memprofilkan epitop tindak balas antibodi dalam individu yang dijangkiti COVID–19 terutamanya menggunakan ujian berasaskan ELISA, 26,27 pendekatan berasaskan paparan faj atau bakteria,28-31 dan teknologi berasaskan mikroarray.30,{{ 38}} Beberapa epitop imunodominan bagi protein SARS-CoV-2 S telah dikenal pasti; kawasan yang paling kerap dikesan dipetakan berhampiran atau merentangi peptida gabungan (FP) subunit S2, heptad kedua berulang dalam subunit S2 dan pada domain terminal C subunit S1.26,28-30, 32,33 Selain itu, saringan serologi turut mendedahkan epitop yang terdapat pada protein lain merentas protein-2 SARS-CoV, termasuk protein N, protein membran (M) dan ORF1ab, ORF3a dan ORF7a.28-30, 34,35 Walaupun kajian terdahulu telah memberikan cerapan penting tentang epitop antigenik, kajian ini sebahagian besarnya tertumpu pada pemprofilan epitop pesakit COVID-19 dalam fasa pemulihan awal. Epitop yang tepat mengantarkan tindak balas antibodi spesifik SARS-CoV-2 yang tahan lama serta dinamik pengecaman epitop masih belum dijelaskan. Di sini, untuk mendapatkan pemahaman yang lebih mendalam tentang kinetik dan jangka hayat tindak balas imun humoral dalam pesakit-19 COVID, terutamanya epitop yang bertanggungjawab untuk imuniti jangka panjang yang berterusan terhadap SARS-CoV-2, kami menjalankan analisis membujur komprehensif pemprofilan imun dalam 31 pesakit-19 COVID sehingga 180 hingga 220 hari selepas permulaan simptom. Berdasarkan penilaian antibodi pengikat antigen dan peneutralan serta paras sitokin serum, kami seterusnya mengenal pasti panel epitop yang terletak pada protein ORF1ab, S dan N SARSCoV-2 yang mengantara tindak balas imun humoral berterusan menggunakan peptida microarray merangkumi proteom lengkap SARS-CoV-2. Keputusan kami menjelaskan ciri-ciri imuniti jangka panjang untuk mengatasi jangkitan virus dan akan membantu memaklumkan reka bentuk vaksin yang rasional dan pembangunan alat diagnostik serologi yang lebih baik.

KAEDAH

Peserta kajian dan pengumpulan sampel

Untuk menilai secara membujur kinetik tindak balas imun terarah SARS-CoV-2, 101 sampel serum telah dikumpulkan daripada 31 individu yang dijangkiti SARS-CoV-2 yang dimasukkan ke Hospital Ketiga Nantong yang Bergabung dengan Universiti Nantong (Nantong , China) antara Januari dan Mac 2020. Semua pesakit telah didiagnosis dengan jangkitan SARS-CoV-2 yang disahkan melalui ujian PCR kuantitatif transkripsi terbalik; keterukan penyakit ditakrifkan sebagai COVID yang ringan hingga sederhana (tidak teruk) atau teruk-19 mengikut versi 7 Protokol Diagnosis dan Rawatan untuk Novel Coronavirus Pneumonia yang dikeluarkan oleh Suruhanjaya Kesihatan Kebangsaan Republik Rakyat China.36 Pesakit diikuti naik secara membujur selama 4 hingga 8 bulan selepas pulih daripada jangkitan akut. Sampel darah dikumpulkan secara membujur dari 4 hingga 219 hari selepas timbulnya gejala untuk 20 pesakit di kalangan 31 peserta kajian (median 4.5 sampel setiap individu, antara 2 hingga 8), manakala pensampelan titik masa tunggal dilakukan untuk setiap satu 11 individu lain yang berada dalam fasa penyakit sembuh lewat (hari 122 hingga 214 selepas permulaan penyakit). Sehubungan itu, sera (n 5 20) daripada penderma sihat padanan umur dan jantina turut dimasukkan sebagai kumpulan kawalan. Tiada peserta kajian mempunyai jangkitan sebelumnya yang didokumenkan dengan SARS atau MERS.

Kajian itu telah diluluskan oleh jawatankuasa etika Hospital Ketiga Nantong yang bergabung dengan Universiti Nantong (kelulusan EL2020006). Persetujuan bertulis secara bertulis diperolehi daripada setiap peserta kajian. Serum diasingkan daripada darah periferi dalam tiub gel serum melalui sentrifugasi, dibentuk menjadi aliquot, dan disimpan pada suhu 2808C sebelum digunakan.

Talian sel

Sel HEK293T dan Huh7 telah dibiakkan dalam medium Eagle yang diubah suai Dulbecco (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass) ditambah dengan 10% serum lembu janin yang tidak diaktifkan haba (Gibco), 100 U/mL penisilin (Gibco), dan 100 mg/ mL streptomycin (Gibco) pada 378C dengan 5% CO2.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Pengesanan antibodi IgG oleh ELISA

Tahap antibodi IgG yang mengikat antigen dalam sampel serum manusia ditentukan oleh ELISA. Plat ELISA sembilan puluh enam telaga (Corning, Corning, NY) telah disalut dengan protein nukleokapsid SARS-CoV-2 (Sino Biological, Beijing, China, no katalog 40588-V08B , 50 ng setiap telaga) atau protein spike (Sino Biological, 40589-V08B1, 100 ng setiap telaga), protein spike SARS-CoV (Sino Biological, 40634-V08B, 100 ng setiap telaga), atau protein spike MERS-CoV (Sino Biological, 40069-V08B, 50 ng setiap telaga) semalaman pada suhu 48C. Selepas menyekat dengan susu tanpa lemak 5% dalam garam penimbal fosfat (PBS) yang mengandungi 0.05% Tween 20 (PBS-T) selama 2 jam pada suhu 378C, 3-lipat sampel serum tidak aktif haba yang dicairkan secara bersiri pada pencairan permulaan 1 :200 telah ditambah ke dalam plat pra-bersalut selama 2 jam pada 378C. Perigi dicuci 3 kali antara setiap langkah dengan PBS-T. Tindak balas divisualisasikan melalui pengeraman dengan antibodi IgG anti-manusia terkonjugasi lobak pedas peroksidase (Abcam, Cambridge, United Kingdom, 1:100,000 pencairan) selama 1 jam pada 378C, diikuti dengan menambah substrat tetramethylbenzidine (Life Technologies, Carlsbad , Calif). Tindak balas yang berkembang telah dihentikan dengan 2 mol H2SO4, dan penyerapan diukur pada 450 nm dengan panjang gelombang pembetulan ditetapkan pada 630 nm (OD450 2 OD630). Untuk mengira titer titik akhir antibodi pengikat, data telah dilinearkan dengan memplot log10 pencairan serum berbanding nilai ketumpatan optik (OD) yang diperbetulkan (OD450 2 OD630) dalam bahagian linear lengkung (y 5 kx 1 b , r2 > 0.99), dan pencairan serum di mana nilai OD terlaras (OD450 2 OD630) 5 0 dikira untuk memberikan titer titik akhir. Antibodi IgG khusus antigen dalam tikus yang diimunisasi peptida dinilai oleh ELISA berasaskan peptida. Secara ringkas, 96-plat ELISA telaga (Thermo Fisher Scientific) disalut dengan 1 mg setiap telaga 4 peptida campuran (peptida 318, 356, 510, dan 530) dalam penampan karbonat (pH 9.6) semalaman pada suhu 48C. Selepas menyekat dengan PBS-T yang mengandungi 5% susu tanpa lemak, telaga diinkubasi dengan sampel serum yang dicairkan pada 1:40 selama 1 jam pada 378C. Selepas itu, plat dibasuh dan diinkubasi dengan antibodi IgG anti-tikus (Abcam) yang terkonjugasi lobak pedas peroksidase. Tindak balas telah divisualisasikan dengan substrat tetramethylbenzidine (Life Technologies), dan penyerapan pada 450 nm diukur selepas menghentikan tindak balas dengan 2 mol H2SO4.

Pengeluaran dan titrasi Pseudovirus

Pengekodan gen yang dioptimumkan kodon SARS-CoV-2 (NC_045512) atau SARS-CoV (AY291315.1) spike protein dengan pemadaman C-terminal 19 aa atau MERS-CoV (JX{{10 }}) protein spike yang dipotong dengan terminal C 16 aa masing-masing diklonkan ke dalam vektor pcDNA3.1(1). Sel HEK 293T yang dikultur dalam hidangan kultur tisu 100 mm telah ditransfeksi bersama dengan 1mg protein spike pengekodan plasmid dan 15 mg tulang belakang pengekspresi luciferase yang kekurangan env (pNL4-3.luc.RE) menggunakan polyethyleneimine (Polysciences). , Warrington, Pa). Supernatan kultur sel yang mengandungi Pseudovirus dikumpulkan pada 48 jam selepas pemindahan, ditapis, dan disimpan pada suhu 2808C dalam aliquot. Untuk penentuan titer virus (dos berjangkit kultur tisu 50%), pencairan bersiri pseudovirus telah ditambahkan pada 1 3 104 sel Huh7 yang dipraseedi dalam 96-plat perigi. Selepas 12 jam jangkitan, medium yang mengandungi virus digantikan dengan medium pertumbuhan segar, dan sel dibiakkan selama 48 jam tambahan. Aktiviti Luciferase lisis sel diukur dengan Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, Wisc) menggunakan pembaca plat mikro (Instrumen BioTek, Winooski, Vt), dan telaga yang menghasilkan unit pendaran relatif lebih tinggi daripada 10 kali nilai latar belakang purata telah dipertimbangkan positif.

Pseudoviujian peneutralan rus

Sampel serum yang tidak diaktifkan haba daripada pesakit COVID-19 atau penderma yang sihat telah 2-kali ganda dicairkan secara bersiri dan diinkubasi dengan 200 pseudovirus pada 50% dos berjangkit kultur tisu selama 1 jam pada suhu 378C. Campuran itu kemudiannya digunakan untuk menjangkiti sel Huh7 yang diprabiji dalam 96-plat perigi dalam bentuk pendua. Telaga telah diisi semula dengan medium pertumbuhan segar pada 12 jam selepas jangkitan, dan aktiviti luciferase sel ditentukan 48 jam kemudian. Titer peneutralan 50% (NT50) terhadap SARS-CoV-2 dan pseudovirus SARS-CoV telah dikira dengan regresi tak linear menggunakan perisian GraphPad Prism 8.0 (Perisian GraphPad, La Jolla, Calif); dan NT50 pseudovirus MERS-CoV ditakrifkan sebagai pencairan tertinggi serum yang menghasilkan pengurangan 50% unit pendaran cahaya berbanding kawalan virus tanpa menggunakan sampel serum.

Pengesanan sitokin berasaskan mikroarray protein

Pengukuran kuantitatif berbilang sitokin (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10 , IL-13, MCP-1, IFN-g dan TNF-a) dalam sampel serum telah dilakukan menggunakan tatasusunan ELISA multipleks (RayBiotech, Peachtree Corners, Ga) mengikut protokol pengeluar. Secara ringkas, slaid kaca yang disalut dengan antibodi khusus sitokin telah disekat dengan pelarut sampel pada suhu bilik selama 30 minit, diikuti dengan penambahan 60 mL 2-kali ganda sampel serum cair atau pencairan piawai sitokin. Selepas pengeraman semalaman pada suhu 48C, slaid dibasuh 5 kali dan diwarnai dengan 80 mL koktel antibodi pengesanan biotinilasi dan kemudian streptavidin konjugasi pewarna setara Cy3 pada suhu bilik selama 1 jam. Keamatan pendarfluor dikesan oleh pengimbas microarray InnoScan 300 (Innopsys, Chicago, Ill) pada 532 nm, dan data dianalisis oleh perisian Q-Analyzer (RayBiotech).

Sintesis peptida dan konjugasi dengan albumin serum lembu

Sebanyak 515 peptida (15 aa panjang, bertindih sebanyak 11 aa) yang meliputi proteom SARS-CoV-2 telah disintesis oleh GL Biochem (Shanghai, China) berdasarkan urutan asid amino SARS-CoV -2 ketegangan Wuhan-Hu-1. Peptida dikonjugasikan dengan albumin serum lembu (BSA) menggunakan penghubung silang Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) mengikut arahan pengilang. Secara ringkas, Sulfo-SMCC telah ditambahkan pada 30-kali ganda lebihan molar kepada BSA, diikuti dengan dialisis kepada PBS. Selepas itu, peptida yang mengandungi sistein ditambah dalam nisbah 1:1 (berat/berat) diinkubasi selama 2 jam, dan selanjutnya didialisis dengan PBS untuk menghapuskan peptida bebas.

Pembuatan microarray peptida

Untuk menyediakan susunan mikro peptida, peptida SARS-CoV-2, serta kawalan negatif (BSA) dan kawalan positif (antibodi IgG anti-manusia dan IgM anti-manusia; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) , telah dialihkan pada slaid substrat PATH (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) dalam tiga kali ganda menggunakan pencetak Super Marathon (Arrayjet, Edinburgh, Scotland, United Kingdom). Kemudian microarrays peptida telah dipelihara pada 2808C untuk kegunaan selanjutnya.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Pemetaan epitope berasaskan microarray

Analisis serum berasaskan mikroarray dilakukan sebagai Li et al, 37 dengan pengubahsuaian kecil. Untuk mencipta ruang individu bagi subarray yang sama, 14-gasket getah ruang telah dipasang pada setiap slaid mikroarray peptida. Susunan slaid telah dipanaskan ke suhu bilik sebelum digunakan, kemudian disekat dengan 3% BSA dalam PBS-T selama 3 jam. Sampel serum daripada pesakit COVID-19 atau sera terkumpul daripada 20 penderma sihat (kumpulan kawalan) telah dicairkan pada 1:200 dalam PBS-T untuk kebanyakan sampel dan kemudian diinkubasi dengan setiap subbarray selama 2 jam pada 48C. Susunan telah dicuci dengan PBS-T dan diinkubasi dengan Cy3-konjugasi kambing anti-manusia IgG dan Alexa Fluor 647– keldai konjugat anti-manusia IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa) pada 1:1000 pencairan setiap satu selama 1 jam pada suhu bilik. Selepas pengeraman, tatasusunan dibasuh dengan PBS-T dan kemudian dikeringkan sepenuhnya dengan sentrifugasi pada suhu bilik. Selepas itu, tatasusunan telah diimbas menggunakan pengimbas mikroarray LuxScan 10K-A (CapitalBio, Beijing, China), dan data intensiti pendarfluor FL diperoleh dan dianalisis oleh perisian GenePix Pro 6.0 (Peranti Molekul, Sunnyvale, Calif).

RAJAH 1. Dinamik membujur tindak balas antibodi dalam pesakit-19 COVID. Skema reka bentuk kajian. Sebanyak 31 individu yang dijangkiti SARS–CoV–2 dan 20 penderma yang sihat telah didaftarkan dalam kajian itu. Pengumpulan sampel serum dilakukan secara membujur pada titik masa berbilang untuk 20 pesakit dalam kalangan 31 individu yang dijangkiti SARS-CoV-2, manakala pensampelan pada satu titik masa dijalankan untuk 11 pesakit yang lain. Bilangan peserta dan sampel serum yang digunakan dalam pelbagai ujian disenaraikan. B dan C, Sebanyak 101 sampel serum daripada 31 pesakit COVID-19 telah diuji oleh ELISA untuk SARS-CoV-2 protein N (B) dan protein S (C) mengikat antibodi IgG pada titik masa berbeza selepas timbulnya gejala (hari 1-30, n 5 37; hari 31-61, n 5 18; hari 100-150, n 5 21; hari {{21 }}, n 5 25). Sampel serum daripada 20 penderma yang sihat dimasukkan sebagai kumpulan kawalan. D, NT50 terhadap pseudovirus-2 SARS-CoV dari semasa ke semasa dikira dengan regresi tak linear. E, Taburan aktiviti peneutralan serum dalam pesakit COVID-19 pada titik masa yang dinyatakan selepas permulaan penyakit dibentangkan. Sampel dengan titer NT50 di bawah 20 ditakrifkan sebagai tiada peneutralan

Analisis data microarray peptida

Data IgG dan IgM dianalisis masing-masing. Keamatan isyarat setiap tempat ditakrifkan sebagai latar depan tolak latar belakang dan purata titik tiga untuk setiap peptida. Nilai potongan untuk tindak balas peptida positif sampel COVID-19 telah ditetapkan sebagai dua kali ganda keamatan isyarat kawalan penderma yang sihat. Peptida dengan kadar positif melebihi 80% dalam kalangan sampel yang diuji pada semua 3 titik masa pensampelan (hari 10-60, 100-150 dan 180-220 selepas serangan penyakit) ditakrifkan sebagai peptida dan peptida yang dominan dan berterusan dengan kekerapan tindak balas positif melebihi 60% pada semua 3-titik masa dianggap sebagai subdominan dan berterusan. Purata keamatan isyarat setiap peptida dalam 3 kumpulan titik masa pensampelan dikira; peptida yang menunjukkan keamatan isyarat tinggi (melebihi min 1 SD bagi keamatan isyarat semua sampel yang diuji) juga dipilih. Pemprosesan dan analisis data telah dilakukan oleh perisian R v3.6.3 (https://www.r-project.org/), dan perubahan intensiti isyarat yang ketara di kalangan kumpulan titik masa pensampelan yang berbeza telah dinilai berdasarkan Limma. Perbezaan dengan P <.05 dianggap signifikan secara statistik.

Imunisasi tikus

Tikus BALB/c betina berumur 6 hingga 8 minggu telah dibeli dari Beijing Vitalstar Biotechnology (Beijing, China). Semua tikus ditempatkan di kemudahan bebas patogen tertentu, dan kajian haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Perubatan Tianjin (Tianjin, China). Untuk imunisasi, kumpulan tikus (n 5 5) disuntik secara intramuskular dengan 25 mg setiap dos setiap peptida (peptida 318, 356, 510, dan 530 masing-masing) dicampur dengan 50 mg tawas (InvivoGen, San Diego, Calif) dan 10 mg CpG adjuvant, dan dirangsang dua kali dengan 50 mg setiap dos peptida dengan kehadiran adjuvant pada 2-selang minggu. Vaksinasi dengan adjuvant sahaja berfungsi sebagai kawalan negatif. Sera dikumpul daripada tikus yang diimunisasi pada hari ke 10 atau hari ke 14 selepas imunisasi kedua dan ketiga.

Analisis statistik dan struktur

Semua graf telah diplot oleh GraphPad Prism. Perbandingan statistik antara kumpulan dalam Rajah 1, 2, dan 4 dilakukan dengan 1-cara ANOVA dengan perbandingan berbilang Tukey. Korelasi yang ditunjukkan dalam Rajah 1 Rajah E9 dan Rajah E10 dalam Repositori Dalam Talian yang terdapat di www.jacionline.org ditentukan oleh analisis korelasi Pearson. Perbezaan dengan P <.05 dianggap signifikan secara statistik. Struktur SARS-CoV-2 spike protein (Protein Data Bank [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX dan PDB ID: 6ZGI) dan domain dimerisasi SARS-CoV{{ 13}} protein nukleokapsid (ID PDB: 6YUN) telah digunakan untuk membedah butiran struktur epitop yang dikenal pasti yang terletak pada protein pancang dan domain dimerisasi protein nukleokapsid. Penjajaran jujukan dan analisis homologi antara pelbagai coronavirus manusia telah dilakukan oleh algoritma Clustal W dalam perisian MEGA v10.1.6.

KEPUTUSAN

Jangkitan SARS-CoV-2 mendorong pengikatan dan peneutralan antibodi spesifik antigen yang berterusan

Untuk menilai secara membujur tindak balas antibodi selepas jangkitan SARS-CoV-2, 101 sampel serum telah dikumpulkan daripada 31 individu dengan jangkitan SARS-CoV-2 PCR yang disahkan (Rajah 1, A). Peserta kajian termasuk 26 pesakit dengan COVID sederhana-19, 1 dengan persembahan tanpa gejala, 2 dengan penyakit ringan dan 2 dengan simptom yang teruk (lihat Jadual E1 dalam Repositori Dalam Talian yang tersedia di www.jacionline.org). Pesakit yang mendaftar dalam kajian ini berumur antara 17 hingga 66 tahun (umur median, 45 tahun), dengan pengagihan lebih kurang sama rata subjek lelaki (51.6%) dan perempuan (48.4%). Gejala yang paling biasa di kalangan peserta kajian termasuk demam (83.9%), batuk (67.7%), myalgia (22.6%), dan menggigil (22.6%), dengan tempoh median penyakit selama 15 hari. Sebanyak 90 sampel serum daripada 20 pesakit COVID-19 telah dikumpul semasa dimasukkan ke hospital dan keluar dari hospital selepas pemulihan pada beberapa titik masa sehingga 219 hari selepas permulaan simptom (Rajah 1, A dan lihat Jadual E2 dalam Repositori Dalam Talian). Persampelan daripada 11 peserta lain telah dilakukan pada satu titik masa semasa pemulihan lewat (hari 122 hingga 214 selepas permulaan simptom). Selain itu, sampel daripada 20 penderma yang sihat dengan taburan umur dan jantina yang sepadan dimasukkan sebagai kumpulan kawalan (Jadual E1). Antibodi IgG khusus antigen dalam sampel serum dikira oleh ELISA yang disaluti dengan protein N atau protein S SARS-CoV{43}}. Berbanding dengan penderma yang sihat, kedua-dua antibodi IgG anti-N dan anti-S telah dibangunkan dalam pesakit-19 COVID dalam masa 30 hari selepas permulaan simptom, dengan titer titik akhir purata geometri 4.10 (log10 anti-N IgG) dan 4.20 (log10 anti-S IgG) (Rajah 1, B dan C; dan lihat Jadual E3 dalam Repositori Dalam Talian di www. jacionline.org; Rajah E1, A dan B; dan Rajah E2), dalam persetujuan dengan pemerhatian sebelumnya bahawa seroconversion berlaku pada 1 hingga 2 minggu selepas jangkitan SARS-CoV-2.5,38 Selepas itu, titer antibodi pengikat antigen menurun kepada tahap yang berbeza-beza dari semasa ke semasa. Penurunan tahap antibodi IgG anti-N secara pantas dan mendadak telah diperhatikan dalam pesakit COVID-19, manakala tahap titer IgG anti-S yang lebih tinggi dikekalkan sehingga 180 hingga 220 hari selepas serangan penyakit berbanding penderma yang sihat (Rajah 1, B , dan C). Analisis korelasi mendedahkan korelasi yang ketara antara titer IgG anti-N log10 dan titer IgG anti-S (r 5 0.50 dan P <.001; Rajah 1, F). Selain mengukur antibodi pengikat, dinamik antibodi peneutral berfungsi dalam individu dengan COVID-19 ditentukan selanjutnya menggunakan pseudotaip SARS-CoV-2. Lebih 95% sampel serum pesakit (35/37) yang dikumpul antara 4 dan 30 hari selepas permulaan simptom mempunyai aktiviti peneutralan yang teguh terhadap SARS-CoV-2, dan sebahagian besar sampel menunjukkan sederhana (NT50 80-320 ) kepada aktiviti meneutralkan kuat (NT50 > 320) (Rajah 1, D dan E). Daripada perhatian, 2 sampel tanpa atau titer peneutralan rendah (NT50 pada pencairan serum minimum 1:20) telah dikumpulkan pada tempoh awal selepas jangkitan virus (pada hari ke-4 dan hari ke-11 selepas permulaan simptom) sebelum menimbulkan antibodi peneutral yang kuat (Rajah). 1, D, dan Rajah E1, C). Walaupun paras SARS-CoV{103}} meneutralkan antibodi{103}} semakin berkurangan dalam pesakit COVID{104}} dari masa ke masa, kebanyakan sampel serum pesakit (24/25) diperolehi dalam tempoh 180 hingga 220 hari selepas timbulnya gejala positif berterusan untuk peneutralan terhadap SARS- CoV-2, dengan penurunan 2.8-kali ganda dalam titer NT50 min geometri (Rajah 1, D dan E; Jadual E3; Rajah E3). Seperti yang dijangkakan, berbanding dengan antibodi IgG anti-N, korelasi yang lebih kuat antara titer IgG yang mengikat SARS-CoV-2 S dan titer antibodi yang meneutralkan telah dikenal pasti (r 5 0.61 dan P < .001; Rajah 1 , G dan H), selaras dengan penemuan bahawa protein SARS-CoV-2 S ialah sasaran utama peneutralan antibodi. Protein S SARS-CoV-2 berkongsi persamaan jujukan tinggi dengan SARS-CoV yang sangat ganas (identiti jujukan 76%) dan menunjukkan homologi jujukan rendah kepada MERS-CoV (identiti jujukan 34%). Kereaktifan silang serologi dalam kalangan coronavirus telah dilaporkan; 8,10,28,29 bagaimanapun, data mengenai penilaian susulan membujur kereaktifan silang antibodi terhadap SARS-CoV-2 terhadap coronavirus lain kekal terhad. Kami menentukan antibodi pengikatan silang dan peneutralan silang dalam sera longitudinal daripada individu yang dijangkiti SARS-CoV{144}}. Keputusan menunjukkan bahawa lebih daripada 80% sampel serum pesakit terikat kepada protein S SARS-CoV dan/atau MERS-CoV dalam tempoh 1 bulan selepas permulaan simptom, dengan 27% sampel menunjukkan kereaktifan silang berganda (Rajah 1, I). Kereaktifan terhadap protein SARS-CoV S mempunyai perkadaran yang lebih besar (73%) daripada MERS-CoV (35%) dalam kalangan sampel yang diuji dalam tempoh awal (1-30 hari selepas serangan penyakit) (Rajah 1, I). Antibodi pengikatan silang berganda dan pengikatan silang SARS-CoV menunjukkan penurunan beransur-ansur dari masa ke masa, dengan hanya 8% pengikatan silang berganda dan 20% sampel pengikatan silang tunggal SARS-CoV pada 180 hingga 220 hari selepas permulaan penyakit (Rajah 1). , I; dalam Repositori Dalam Talian yang terdapat di www. jacionline.org, lihat Rajah E4, A; Rajah E5, A; dan Rajah E6 dalam Repositori Dalam Talian artikel ini di www.jacionline.org). Menariknya, kepositifan antibodi reaktif protein MERS-CoV S kekal secara relatifnya dari masa ke masa (Rajah 1, I). Berbeza daripada kapasiti ikatan silang yang tinggi, hanya sebilangan kecil sampel serum pesakit yang meneutralkan silang pseudovirus SARS-CoV dan/atau MERS-CoV (Rajah 1, I; Rajah E4, B; Rajah E5, B; dan lihat Rajah E7 dalam Repositori Dalam Talian). Kira-kira 27% sampel yang dikumpul pada 1 hingga 30 hari selepas permulaan simptom menunjukkan aktiviti peneutralan silang, dan jumlah ini menurun kepada 20% pada 180 hingga 220 hari, dengan perubahan yang lebih dramatik dalam aktiviti peneutralan silang SARS-CoV (Rajah 1, I). ). Perkadaran sampel SARSCoV yang dineutralkan silang yang lebih tinggi daripada MERS-CoV dalam tempoh 30 hari selepas serangan penyakit. Perlu diingat bahawa walaupun perkadaran sampel yang sama menunjukkan peneutralan silang SARS-CoV dan MERS-CoV, nilai NT50 untuk MERS-CoV jauh lebih rendah daripada SARSCoV dalam kalangan sampel serum yang positif untuk peneutralan silang (Rajah E4, B; Rajah E5, B; Rajah E7).

sistem imun yang meningkatkan tumbuhan cistanche

Jangkitan SARS-CoV-2 mengakibatkan pengaktifan pengeluaran sitokin

Untuk mencirikan secara menyeluruh perubahan imunologi selepas jangkitan SARS-CoV-2, kami selanjutnya menilai perubahan dalam dinamik dalam tahap sitokin dalam serum pesakit COVID-19. Lima puluh lima sampel serum membujur yang dikumpul dalam tempoh 2 bulan pertama permulaan simptom telah digunakan untuk pengesanan pengeluaran sitokin oleh microarray berasaskan protein. Peningkatan paras serum berbilang sitokin diperhatikan semasa bulan pertama penyakit, termasuk IL-1a (proinflamatori), IL-6 (proin-radang), dan IL-10 (anti-radang ), yang telah dikaitkan dengan sindrom pelepasan sitokin dalam kes COVID-19 yang teruk,39,40 serta IFN-g (jenis TH1) dan IL-4 (jenis TH2) (Rajah 2, A, dan Rajah E8 dalam Repositori Dalam Talian boleh didapati di www. jacionline.org). Khususnya, tahap serum IL-6, IL-10 dan IFN-g meningkat dalam masa 15 hari selepas permulaan simptom pada pesakit dan menurun pada fasa kemudian, manakala pelepasan IL-1 a dan IL-4 telah ditunjukkan meningkat dengan ketara dalam tempoh 16 hingga 30 hari dari permulaan penyakit, dan dengan cepat menurun kepada normal selepas itu (Rajah 2, A). Analisis korelasi menunjukkan perkaitan linear yang lemah atau tiada antara tindak balas antibodi khusus antigen dan pengeluaran sitokin selepas jangkitan SARS-CoV-2, walaupun kepentingan statistik diperhatikan antara tahap IL-10 dan SARS-CoV{{ 34}} Antibodi pengikat protein N (r 5 0.321 dan P < .05), antara pengeluaran IL-1b dan antibodi pengikat protein S (r 5 20.335 dan P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.

Pemetaan epitop seluruh proteome mengenal pasti epitop dominan yang mengantara tindak balas imun humoral berterusan dalam pesakit-19 COVID

Untuk mencirikan ciri pembezaan imuniti humoral dengan lebih baik kepada SARS-CoV-2 dari semasa ke semasa, kami menggunakan pemetaan epitop seluruh proteom menggunakan mikroarray berasaskan peptida. Pustaka peptida yang meliputi proteom SARS-CoV-2 telah dijana dan digerakkan pada slaid, di mana setiap peptida mempunyai panjang 15 aa dengan pertindihan 11 aa. Sebanyak 51 sampel serum membujur daripada 19 pesakit dengan sama ada tanpa gejala (n 5 1) atau ringan (n 5 2) hingga sederhana (n 5 15) atau teruk (n 5 1 ) Jangkitan SARS-CoV-2 telah diuji (Jadual I). Untuk mencapai bilangan pensampelan yang agak seimbang, selang masa dan titik masa, sampel dikumpulkan secara berurutan pada 2 atau 3 titik masa daripada setiap peserta-19 COVID dalam julat 16 hingga 219 hari selepas permulaan simptom. Majoriti pesakit (18/19) menghasilkan antibodi peneutralan selepas jangkitan virus, kecuali individu tunggal dengan jangkitan tanpa gejala (Jadual I). Mengikut titik masa pensampelan yang berbeza, sampel dibahagikan kepada 3 kumpulan: hari 10-60 (n 5 18), hari 100-150 (n 5 18), dan hari {{28 }} (n 5 15). Penilaian membujur pro-fail epitope virus dalam pesakit COVID{31}} dilakukan untuk kedua-dua antibodi IgG dan IgM serum, dengan sera terkumpul daripada 20 penderma yang sihat digunakan sebagai kawalan negatif. Menggunakan mikroarray protein SARS-CoV-2, kinetik tindak balas antibodi pengikat peptida telah ditentukan dan dianalisis untuk (1) keamatan isyarat mengikat dan (2) peratusan sampel reaktif positif (kadar positif) untuk setiap peptida . Berdasarkan nilai cutoff untuk tindak balas pengikat peptida positif, yang ditetapkan sebagai dua kali ganda intensiti isyarat kawalan negatif, kami mengenal pasti sejumlah 460 peptida positif untuk IgG dan 479 peptida positif untuk IgM yang reaktif dengan sekurang-kurangnya 1 pesakit sampel serum. Nombor peptida positif dan taburan respons merentas bingkai bacaan terbuka (ORF) SARS-CoV yang berbeza-2 secara relatifnya stabil dalam kalangan kumpulan pensampelan yang berbeza, dengan trend penurunan sedikit dalam nombor peptida positif dari semasa ke semasa (Rajah 3, A). Kereaktifan yang paling banyak dikenal pasti dalam poliprotein replika ORF1ab, yang merupakan ORF terbesar, merangkumi lebih daripada dua pertiga daripada keseluruhan genom (Rajah 3, A). Menariknya, kami memerhati tahap korelasi sederhana hingga kuat antara tindak balas pengikat peptida positif dan paras sitokin serum lebih awal selepas jangkitan SARS-CoV-2 (hari 10-60 selepas serangan penyakit; lihat Rajah E10 dalam Repositori Dalam Talian di www. jacionline.org). Bilangan peptida pengikat positif untuk IgM ditunjukkan dikaitkan dengan paras serum IL-6 dan IL-10; begitu juga, keamatan isyarat purata bagi jumlah peptida reaktif dan peptida pengikat ORF1ab untuk IgM menunjukkan perkaitan positif dengan pengeluaran IL-6 dan IFN-g dalam sampel serum. Data ini mencadangkan bahawa perubahan dalam tahap sitokin selepas jangkitan SARS-CoV-2 mungkin mempengaruhi magnitud dan keluasan epitop yang dikenali oleh tindak balas humoral khusus antigen. Berdasarkan mengenal pasti epitop positif, kami seterusnya memilih epitop paling biasa yang kekal reaktif secara konsisten dalam lebih daripada 80% sampel-19 COVID antara setiap daripada 3 kumpulan pensampelan (disebut epitop dominan dan berterusan). Keputusan menunjukkan bahawa epitop yang sangat dominan ini yang mampu mengantara tindak balas imun humoral jangka panjang terletak pada poliprotein ORF1ab dan protein S SARS-CoV-2 dan protein S, dengan lebih banyak epitop yang diiktiraf oleh antibodi IgM (n 5 33) daripada Antibodi IgG (n 5 10) (Rajah 3, B, dan Jadual II; lihat Rajah E11 dan Rajah E12 dalam Repositori Dalam Talian di www.jacionline.org). Poliprotein ORF1ab mempunyai bilangan maksimum epitop dominan yang mengantara tindak balas jangka panjang, dan epitop diedarkan secara meluas pada kawasan protein bukan struktur (nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14, dan nbsp 16 (Jadual II). Terutama, kami mengenal pasti satu epitope imunodominan, 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), yang boleh dikenali oleh antibodi IgG dan IgM daripada 100% pesakit COVID-19, tanpa mengira titik masa pensampelan serum (Rajah). 3, B dan Jadual II; lihat Rajah E13 dan Rajah E14 dalam Repositori Dalam Talian). Peptida yang sangat reaktif ini terletak dalam kawasan helikase (nsp 13) poliprotein ORF1ab, yang penting untuk melepaskan templat RNA untai dua semasa replikasi-2 SARS-CoV.41 Antara peptida terpilih ORF1ab, 2 peptida imunodominan dengan purata keamatan isyarat tertinggi yang diiktiraf oleh antibodi IgG, nombor 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) dan nombor 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), kedua-duanya terletak pada nsp 13. Untuk tindak balas IgM, peptida 685 (ORF1ab, aa 249-263) pada nsp 2 dan peptida 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) pada nsp 13 mempersembahkan keamatan pengikatan yang paling teguh (Rajah 3, B). Memandangkan variasi dalam isyarat asas (sera terkumpul daripada penderma yang sihat) untuk peptida yang berbeza (Rajah 3, B), kami selanjutnya mengira perubahan lipatan intensiti isyarat mengenai setiap peptida utama, berbanding kumpulan kawalan yang sihat. Keputusan menunjukkan bahawa peptida 2073 (IgG mengikat) dan peptida 1985 (IgM mengikat) yang terletak di kawasan nsp 13 mengekalkan intensiti pengikatan peptida teratas (perubahan lipatan) di kalangan sera pesakit yang dikumpul sehingga 180 hingga 220 hari (Rajah E13 dan Rajah E14).

RAJAH 2. Kinetik pengeluaran sitokin dalam pesakit-19 COVID. A, Tahap pengeluaran sitokin dalam 55 sampel serum yang dikumpul daripada 16 pesakit COVID-19 semasa fasa akut dan peringkat awal pemulihan telah dikesan oleh ELISA berasaskan protein-microarray (hari 1-15, n 5 11; hari 16-30, n 5 26; hari 31-61, n 5 18; penderma sihat, n 5 20). Setiap titik mewakili sampel serum individu; garis putus-putus menandakan had pengesanan. Kepentingan statistik ditentukan oleh 1-cara ANOVA dengan perbandingan berbilang Tukey. *P <.05, **P <.01 dan ****P <.0001. B, Perubahan lipatan setiap tahap pengeluaran sitokin dalam pesakit COVID-19 ditunjukkan dalam (A) berbanding nilai min 20 sampel daripada penderma yang sihat. Setiap lajur menunjukkan sampel serum berbeza yang dikumpul daripada titik masa yang ditunjukkan selepas permulaan simptom; setiap baris mewakili 1 sitokin individu yang diuji.

JADUAL I. Ciri pesakit COVID-19 dan kohort sampel dalam pemetaan epitope

FIG 3. Pengiktirafan IgM dan IgG bagi epitop dominan yang menyumbang kepada tindak balas antibodi jangka panjang dalam individu yang dijangkiti SARS-CoV-2. Analisis membujur pengecaman serum epitop dalam 19 individu dengan COVID-19 menggunakan mikroarray peptida yang meliputi proteom SARS-CoV-2. Nilai cutoff untuk tindak balas positif pengikatan peptida dalam sampel pesakit (n 5 51) ​​ditetapkan sebagai dua kali ganda keamatan isyarat sera terkumpul daripada 20 penderma yang sihat. A, Kiraan peptida dan pengedaran peptida pengikat positif yang dapat dikesan dalam 1 atau lebih sampel yang dikumpul pada 10-60 hari (n 5 18), 100-150 hari (n 5 18), dan 180- 220 hari (n 5 15) selepas serangan penyakit. Nombor menunjukkan jumlah epitop IgG dan IgM yang dikenal pasti daripada setiap ORF. B, Keamatan isyarat bagi epitop IgG dan IgM yang dominan dan berterusan (paksi-x) yang reaktif secara mampan dalam lebih daripada 80% sampel dalam kesemua 3 titik masa pensampelan. Setiap titik menunjukkan sera terkumpul daripada penderma yang sihat (atas) atau sampel serum pesakit yang berbeza yang dikumpul daripada titik masa yang ditunjukkan selepas permulaan simptom. E, protein sampul surat.

TABLE II. Epitopes with >Kadar positif 80% pada semua 3 titik masa pensampelan

Epitop dominan dan berterusan protein SARS-CoV-2 S terletak di subunit NTD dan S2

Sebanyak 4 epitop dominan dan berterusan daripada protein SARSCoV-2 S telah dikenal pasti: peptida 318 (S, aa 45-59) dan peptida 356 (S, aa 197-211), yang terletak dalam kawasan NTD; peptida 510 (S, aa 813-827), yang meliputi tapak belahan S2 dan bahagian FP subunit S2, dan peptida 530 (S, aa 893-907), yang terletak di rantau penyambung antara FP dan kawasan ulangan heptad pertama subunit S2 (Rajah 3, B, dan Jadual II). Antara peptida utama protein S yang kami pilih, peptida 318, yang terletak di NTD protein S, mempunyai keamatan pengikatan yang paling teguh (perubahan kali ganda berbanding kawalan; Rajah E13 dan Rajah E14). Analisis struktur mendedahkan bahawa epitop ini terdedah sepenuhnya pada permukaan protein S monomerik; Walau bagaimanapun, beberapa sisa epitop untuk peptida 318, 356, dan 530 tersembunyi di bawah permukaan protein S trimerik (Rajah 4, A dan B), menunjukkan bahawa kedua-dua struktur monomer dan trimer S diiktiraf dengan cekap oleh sistem imun perumah di bawah keadaan tertentu. keadaan. Secara khusus, 2 segmen gelung peptida 318 (aa 45-46 dan aa 56-59) terdedah pada protein S trimerik, dengan untaian b pusat tertanam di dalam; dan kebanyakan sisa peptida 356 boleh diakses di permukaan, termasuk untaian b teras (aa 203-209) dan segmen gelung (aa 210-211). Peptide 510 mengandungi tapak belahan S2 dan heliks pusat FP, kedua-duanya dibentangkan sepenuhnya pada permukaan protein S; sisa peptida 530 kebanyakannya samar, dengan hanya sebahagian kecil daripada gelung (aa 893-895) terdedah pada protein S trimerik (Rajah 4, C). Analisis homologi jujukan antara 7 coronavirus manusia biasa mendedahkan bahawa 2 epitop yang terletak di subunit S2 (peptida 510 dan 530) berkongsi identiti jujukan tinggi dengan coronavirus lain, mencadangkan reaktiviti silang serologi yang menyasarkan epitop ini di kalangan coronavirus manusia (Rajah 4, D). Urutan peptida 318 mempamerkan persamaan yang tinggi dengan SARSCoV, manakala tahap homologi jujukan yang rendah untuk peptida 356 ditunjukkan dalam kalangan coronavirus, mencadangkan SARS-CoV-2–tindak balas antibodi khusus yang menyasarkan rantau ini (Rajah 4, D). Memandangkan varian baharu SARS-CoV-2 baharu yang muncul dan beredar di seluruh dunia, kami selanjutnya melakukan penjajaran jujukan berkenaan dengan epitop utama protein S antara strain awal SARS-CoV-2 (Wuhan-Hu{{52} }) dan 5 varian kebimbangan (Alpha, Beta, Gamma, Delta dan Omicron), serta 2 varian minat (Lambda dan Mu), menurut klasifikasi virus varian Pertubuhan Kesihatan Sedunia (dikemas kini pada 30 November 2021 ). Keputusan menunjukkan bahawa jujukan epitop dominan dan berterusan ini hampir sama antara varian yang dianalisis, kecuali mutasi N211I tunggal yang dikenal pasti dalam varian Omicron baharu (Rajah 4, E). Data ini menunjukkan bahawa antibodi yang dijana oleh strain awal SARS-CoV-2 mungkin secara konsisten mengecam varian yang beredar semasa dan bahawa epitop dominan ini mungkin mampu mengantara tindak balas antibodi jangka panjang yang berterusan terhadap jangkitan SARS-CoV-2 varian. Untuk menentukan lebih lanjut ciri imunologi epitop yang dikenal pasti pada protein S, dan untuk menyiasat lebih lanjut nilai potensi epitop protein S ini sebagai calon vaksin peptida, kami melakukan kajian imunisasi tikus menggunakan peptida terpilih. Tikus BALB / c telah diinokulasi 3 kali dengan setiap peptida dengan kehadiran alum dan adjuvant CpG (Rajah 4, F). Antara 4 peptida yang dipilih, vaksinasi dengan peptida 356 menimbulkan antibodi khusus antigen selepas dos kedua dan ketiga (Rajah 4, G). Keputusan ujian peneutralan serum mendedahkan bahawa imunisasi dengan peptida linear tidak menghasilkan tahap antibodi peneutral yang ketara terhadap SARS-CoV-2 (Rajah 4, H), menunjukkan bahawa peptida linear ini berfungsi dengan lemah dalam mendorong tindak balas antibodi peneutral yang teguh.

N protein SARS-CoV-2 tidak mempunyai kebanyakan epitop reaktif yang mengantara tindak balas antibodi tahan lama selepas jangkitan virus

Beberapa kajian telah menjelaskan antigenik kuat protein SARS-CoV-2 N.4,11,12 Walau bagaimanapun, kami gagal mengenal pasti epitop dominan dan berterusan yang terletak pada protein N berdasarkan kriteria pemilihan semasa (melebihi 80% kadar positif pada semua 3 titik masa pensampelan). Untuk penilaian membujur profil epitope protein N dalam individu yang menghidap COVID-19, kami menjalankan pusingan kedua saringan epitop yang berdasarkan data yang diperoleh daripada mikroarray peptida untuk pemilihan epitop subdominan yang kekal kereaktifan positif secara konsisten dalam lebih daripada 60% sampel COVID-19 untuk setiap satu daripada 3 titik masa pensampelan (disebut epitop subdominan dan berterusan). Sebanyak 4 epitop subdominan dan berterusan bagi protein SARS-CoV-2 N telah dikenal pasti, antaranya peptida 2455 (N, aa 213-227) menunjukkan kereaktifan kepada kedua-dua antibodi IgG dan IgM dalam COVID{{16 }} pesakit, dengan tahap keamatan isyarat yang lebih tinggi (Rajah 5, A dan B, dan lihat Jadual E4 dalam Repositori Dalam Talian di www.jacionline.org). 2 peptida bertindih, peptida 2455 (N, aa 213-227) dan peptida 2456 (N, aa 217-231), terletak di rantau penghubung yang kaya dengan Ser/Arg antara domain pengikat RNA terminal-N dan domain dimerisasi terminal-C bagi protein N. Peptida 2482 (N, aa 321-335) dan peptida 2491 (N, aa 357-371) terletak sepenuhnya atau sebahagiannya dalam domain dimerisasi protein N (Jadual E4). Disebabkan kekurangan 3-struktur D berkaitan pengukuhan utuh protein N, kami hanya melakukan analisis struktur 2 epitop yang dikenal pasti pada struktur dimerik domain dimerisasi terminal-C. Sisa helai peptida 2482 membentuk 2 b yang disusun dalam cara antiselari dalam antara muka dimerisasi, manakala aa 357-364 daripada peptida 2491 membentuk struktur berasaskan heliks yang terletak di hujung bertentangan dimer (Rajah 5, C) . Penjajaran jujukan antara SARS-CoV awal-2 (tekanan Wuhan-Hu12) dan 7 varian yang muncul selanjutnya mendedahkan bahawa jujukan epitop subdominan dan berterusan dalam protein N ini hampir sama antara varian yang beredar semasa, dengan penggantian G215C tunggal peptida 2455 yang berlaku dalam varian Delta dan mutasi G214C tunggal peptida 2455 yang dikenal pasti dalam varian Lambda, menunjukkan bahawa antibodi yang menyasarkan peptida ini berkemungkinan mengenali antigen daripada varian SARS-CoV-2 yang muncul (Rajah 5, D ).

FIG 4. Epitop dominan SARS-CoV-2 spike protein dari segi pengantaraan tindak balas imun humoral yang tahan lama. A dan B, Lokasi epitop dominan dan berterusan pada 3-D struktur protein monomerik (A) dan trimerik (B) S (PDB ID: 6VXX). Epitop diserlahkan dalam warna hijau (peptida 356, aa 197-211), merah (peptida 318, aa 45-59), biru (peptida 510, aa 813-827), dan ungu (peptida 530, aa 893-907), masing-masing. Tiga monomer S dalam konformasi tertutup digambarkan dalam warna kelabu, merah jambu dan sian, masing-masing. C, Analisis struktur terperinci bagi epitop dominan dalam protein SARS-CoV-2 S pada keadaan tertutup trimer S (ID PDB: 6VXX). D, Penjajaran jujukan epitop yang dikenal pasti antara coronavirus manusia biasa. Sisa epitope yang terpelihara antara SARS-CoV-2 dan coronavirus manusia lain dilorekkan dengan warna kelabu. E, Analisis pemuliharaan Epitope bagi SARS-CoV awal-2 (tekanan Wuhan-Hu-1) dan 7 varian baru muncul. Titik hitam mewakili sisa yang sama antara strain Wuhan-Hu-1 dan yang ditunjukkan.

RAJAH 5. Epitop subdominan yang terletak pada protein nukleokapsid SARS-CoV-2 mampu mengantara tindak balas antibodi yang berterusan. Frekuensi pengecaman A, IgG, dan IgM bagi peptida subdominan (tahan lama reaktif dalam lebih daripada 60% sampel) di kalangan sampel serum pesakit yang dikumpul pada beberapa titik masa selepas permulaan penyakit. B, Kinetik keamatan isyarat bagi epitop subdominan yang dikenal pasti dari semasa ke semasa. Setiap titik mewakili sampel serum pesakit berbeza yang diperoleh daripada pesakit COVID-19 pada titik masa yang dinyatakan selepas permulaan simptom. Garis mendatar bertitik menunjukkan nilai potong bagi tindak balas positif bagi setiap peptida. C, Analisis struktur terperinci epitop pada domain dimerisasi terminal-C protein N (ID PDB: 6YUN). Epitop dilabelkan dengan warna biru (peptida 2482, aa 321-335) ​​dan coklat (peptida 2491, aa 357-364). 2 struktur monomerik digambarkan dalam warna kelabu dan cyan, masing-masing. D, Analisis penjajaran jujukan bagi epitop N-protein yang dikenal pasti antara SARS-CoV awal-2 (tekanan Wuhan-Hu-1) dan 7 varian yang muncul. Titik hitam menandakan jujukan yang sama antara strain Wuhan-Hu-1 dan varian yang ditunjukkan. Perubahan dalam urutan asid amino diserlahkan dengan warna merah.

RAJAH 6. Epitop pelapik dengan keamatan pengikatan yang tinggi dan frekuensi reaktif yang berkurangan dari semasa ke semasa, diiktiraf oleh individu yang dijangkiti SARS-CoV-2. A dan B, Analisis membujur dan pengedaran peptida yang dikenal pasti mempamerkan keamatan isyarat mengikat yang tinggi (melebihi min 1 SD keamatan isyarat semua sampel yang diuji) tetapi menurunkan kadar positif dari semasa ke semasa. Kekerapan pengecaman (A) dan keamatan isyarat (B) epitop telah diplot dengan 3 titik masa pensampelan selepas permulaan simptom. Setiap titik dalam (B) bermaksud sampel serum pesakit individu yang dikumpul pada titik masa yang dinyatakan selepas permulaan simptom; garis mendatar bertitik menunjukkan nilai kepositifan bagi setiap peptida. Analisis kepentingan statistik dilakukan berdasarkan perisian Limma of R v3.6.3. *P <.05 dan **P <.01. C, Perbandingan lokasi dan jujukan 2 epitop bersebelahan, peptida 510 (dominan dan berterusan) dan peptida 511 (intensiti isyarat tinggi dan kepositifan menurun dari semasa ke semasa), pada struktur protein SARS-CoV-2 S (PDB ID: 6ZGI) . Kawasan bertindih antara 2 epitop diserlahkan dalam warna hijau; urutan unik dilabelkan dengan warna merah dan biru.

Analisis serologi membujur mengenal pasti epitop dengan keamatan isyarat yang tinggi tetapi mengurangkan kereaktifan dari semasa ke semasa

Sebagai tambahan kepada epitop yang sangat reaktif terpilih yang bertanggungjawab untuk tindak balas imun humoral yang berterusan yang disebutkan di atas, kami selanjutnya mengenal pasti dan mencirikan panel 9 peptida positif yang menunjukkan keamatan pengikatan yang teguh (melebihi purata 1 SD intensiti isyarat semua sampel yang diuji) dengan trend penurunan kereaktifan (kadar positif berubah melebihi 20%) dalam kalangan sampel serum daripada pesakit COVID-19 dari semasa ke semasa, selaras dengan trend umum penurunan tindak balas imun humoral. Epitop ini diletakkan dalam 3 antigen dominan: protein ORF1ab, S, dan N (Rajah 6, A; dan lihat Jadual E5 dalam Repositori Dalam Talian di www.jacionline.org). Selain itu, pengurangan ketara dalam keamatan isyarat 4 peptida daripada ORF1ab (peptida 784-IgG, 1617-IgM dan 1986-IgM) dan protein N (peptida 2457-IgG) telah diperhatikan. antara sampel dari tempoh awal titik masa pensampelan (hari 10-60 selepas permulaan penyakit) dan fasa kemudian titik masa pensampelan (hari 100-150 atau hari 180-220 selepas permulaan gejala) (Rajah 6 , B). Terutama, walaupun sebahagian besarnya bertindih antara satu sama lain, 2 peptida peptida protein S 510 (dominan dan berterusan; Rajah 3, B) dan peptida 511 (intensiti isyarat tinggi dan penurunan kadar positif dari semasa ke semasa; Rajah 6, A) mempamerkan corak yang berbeza kereaktifan di kalangan sampel serum pesakit dari semasa ke semasa. Analisis jujukan dan lokasi menunjukkan bahawa peptida 510 mengandungi tapak belahan S2 dan asid amino tambahan 813-SKRS-816, manakala peptida 511 berada dalam FP sepenuhnya dengan 828-LADA{{29 }} sisa yang terdedah sepenuhnya pada permukaan protein S trimerik (Rajah 6, C). Keputusan ini mendedahkan ciri baharu epitop yang akhirnya boleh menyumbang kepada imuniti humoral yang tahan lebih lama dan lebih kuat terhadap SARS-CoV-2.

PERBINCANGAN

Pencirian sistematik bagi tindak balas imun jangka panjang terhadap jangkitan SARS-CoV-2 adalah penting untuk pembangunan diagnostik yang lebih baik, campur tangan terapeutik yang berkesan dan vaksin. Dalam kajian semasa, kami melakukan analisis longitudinal komprehensif pesakit COVID-19 sepanjang 180 hingga 220 hari susulan, menunjukkan tindak balas imun humoral yang berterusan dan mengaktifkan pengeluaran sitokin selepas jangkitan virus.

Secara ketara, dengan mengambil kesempatan daripada microarray berasaskan peptida yang merangkumi proteom SARS-CoV-2, kami seterusnya mendedahkan kinetik pengecaman epitope dan mengenal pasti panel epitop dominan yang mampu menjadi pengantara imuniti humoral jangka panjang. Penemuan yang kami laporkan di sini mengenai jangka hayat tindak balas imun humoral selepas jangkitan SARS-CoV-2 mengesahkan beberapa data yang diterbitkan sebelum ini5,10,12,13,42 tetapi memanjangkannya dengan melakukan pemprofilan serologi yang mendalam dan saringan epitope menggunakan sampel serum membujur daripada individu dengan COVID{11}} melalui pendekatan microarray seluruh proteome. Dalam kajian ini, kami mengenal pasti 4 epitop dominan (peptida 318, 356, 510 dan 530) dalam protein-2 S SARS-CoV yang mampu bertindak balas secara berterusan dengan lebih 80% pesakit-19 COVID sampel diuji, sehingga 180 hingga 220 hari selepas timbulnya gejala. Peptida 510 (S, aa 813-827), yang terdiri daripada tapak belahan S2 dan FP subunit S2, telah dikenal pasti dalam kajian terdahulu kumpulan lain.26,28,32-34 Analisis fungsional menunjukkan antibodi menyasarkan rantau ini mungkin menunjukkan potensi peneutralan terhad terhadap SARS-CoV-226,33 walaupun sangat terdedah pada permukaan protein S (Rajah 4, AC). Dalam kes peptida 530 (S, aa 893-907), yang diletakkan di antara FP dan kawasan ulangan heptad pertama subunit S2, sisa biasanya tertimbus di dalam struktur trimerik protein S, yang menjadikannya sukar diakses melalui antibodi peneutral yang teguh terhadap SARS-CoV-2 (Rajah 4, AC). Selain itu, 2 S1-peptida terarah NTD yang boleh mengantara tindak balas antibodi jangka panjang SARS-CoV-2 turut dipilih. Analisis mengenai jujukan peptida dan lokasi menunjukkan bahawa sisa-sisa 2 peptida ini—peptida 318 (S, aa 45-59) dan peptida 356 (S, aa 197-211)—berdekatan dengan epitop yang dilaporkan yang diiktiraf. oleh antibodi yang meningkatkan jangkitan23,25 tetapi selain daripada tapak utama antibodi peneutral yang sangat kuat yang menyasarkan NTD subunit S1, 16,19,43 mencadangkan kemungkinan pengecaman epitope oleh antibodi tidak meneutralkan ke arah 2 peptida yang dikenal pasti ini. Sebagai tambahan kepada butiran yang dinyatakan di atas, imunisasi tikus dengan peptida terpilih selanjutnya menunjukkan keberkesanan rendah peptida linear domain bukan reseptor yang mengikat ini dalam mendorong tindak balas antibodi peneutralan yang teguh (Rajah 4, G). Secara kolektif, data ini mencadangkan bahawa epitop linear dominan yang mengantara tindak balas imun humoral jangka panjang pada jangkitan SARS-CoV-2 mungkin mendorong antibodi tanpa atau potensi peneutralan terhad. Pemahaman yang lebih lengkap tentang landskap epitope antibodi SARS-CoV-2, terutamanya epitop yang diarahkan protein S, memberikan cerapan baharu tentang pemotongan fungsi antibodi, yang memudahkan lagi reka bentuk vaksin yang inovatif dan rasional. Antibodi yang meneutralkan memberikan perlindungan untuk menghapuskan jangkitan virus, manakala antibodi yang tidak meneutralkan mungkin memainkan peranan yang bermanfaat, neutral atau malah berbahaya semasa pembersihan virus. Antibodi tidak meneutralkan memberikan perlindungan tambahan dalam vivo melalui pelbagai fungsi efektor pengantara Fc dalam konteks fagositosis bergantung kepada antibodi dan sitotoksisiti bergantung kepada antibodi. Sebaliknya, beberapa kajian telah mencadangkan kemungkinan peranan patogenik antibodi tidak meneutralkan dalam jangkitan coronavirus. Kajian terdahulu yang menggunakan pelbagai jenis calon vaksin untuk SARS-CoV dan MERS-CoV mendapati imunopatologi dipertingkatkan dalam haiwan kecil dan primata bukan manusia yang divaksin selepas cabaran virus.24,44-50 Baru-baru ini, kajian terhadap 2 kumpulan melaporkan bahawa tidak meneutralkan antibodi yang menyasarkan NTD bagi protein SARS-CoV-2 S mampu meningkatkan jangkitan virus secara in vitro melalui mekanisme bebas reseptor Fcg,23,25 walaupun antibodi penambah jangkitan yang diberikan secara pasif dalam model haiwan telah terbukti melindungi daripada SARS Jangkitan -CoV-2 dalam vivo. Memandangkan peranan antibodi yang kontroversi semasa jangkitan coronavirus, siasatan lanjut diperlukan untuk mengesahkan potensi peranan antibodi dalam mengiktiraf epitop dominan dan berterusan ini dalam memerangi jangkitan virus dalam vivo. Peringkat seterusnya reka bentuk vaksin rasional untuk SARS-CoV-2 boleh difikirkan dengan menimbulkan antibodi peneutral yang sangat kuat dan antibodi bukan peneutral pelindung, bersama-sama dengan pengurangan pembentangan epitop yang meningkatkan jangkitan atau epitop imunodominan yang tidak mempunyai kesan berfaedah. Walaupun beberapa kajian terdahulu hanya tertumpu pada protein S SARS-CoV-2 yang bertujuan untuk menggambarkan fungsi antibodi berkenaan peneutralan, kami melakukan pemetaan epitop seluruh proteom yang komprehensif dan mengenal pasti panel epitop dalam poliprotein ORF1ab yang telah diiktiraf secara konsisten oleh sebahagian besar sampel serum pesakit dari semasa ke semasa. Walaupun peptida terarah ORF1ab yang diedarkan pada berbilang protein bukan struktur ini mungkin tidak menimbulkan antibodi berfungsi yang menyasarkan virus SARS-CoV-2, ia boleh digunakan sebagai alat diagnostik untuk membantu membezakan jangkitan semula jadi daripada vaksinasi. Dengan peningkatan bilangan penerima vaksin di seluruh dunia, ujian serologi semasa berdasarkan protein S dan protein N menghadapi cabaran sebagai pendekatan yang berkesan untuk membantu ujian molekul untuk pengesanan jangkitan SARS-CoV-2, dan juga untuk penentuan status imun selepas jangkitan virus. Dengan mengambil kesempatan daripada peptida yang paling biasa dan reaktif secara berterusan dalam ORF1ab dalam kalangan individu yang dijangkiti COVID{101}}, diagnosis serologi jangkitan semula jadi akan dijalankan tanpa mengambil kira status vaksinasi yang melibatkan protein S berasaskan domain pengikat reseptor– pendekatan vaksin berasaskan virus dan tidak aktif. Kajian masa depan diperlukan untuk menilai kereaktifan, sensitiviti dan kekhususan peptida ORF1ab yang dikenal pasti dalam kohort yang lebih besar yang terdiri daripada individu yang dijangkiti SARSCoV-2 dan penerima vaksin. Selain itu, penilaian lanjut mengenai kecekapan pengesanan melalui strategi gabungan berbilang peptida akan diperlukan untuk mengatasi sensitiviti peptida yang lebih rendah berbanding dengan protein penuh dan kemungkinan kereaktifan silang antara coronavirus manusia biasa. Had utama kajian kami ialah bilangan sampel yang agak sedikit yang diperoleh daripada saiz kohort pesakit yang kecil dan majoriti peserta mengalami penyakit COVID{106}} yang tidak teruk. Ini mungkin mengehadkan beberapa kesimpulan kami berkenaan dengan kekerapan tindak balas positif dan magnitud tindak balas imun, yang mungkin berbeza-beza mengikut keterukan penyakit. Namun begitu, data yang dibentangkan dalam kajian ini memberikan cerapan berharga tentang kinetik tindak balas imun dari semasa ke semasa selepas jangkitan SARS-CoV{108}} dan ciri epitop dominan yang mampu menjadi pengantara imuniti humoral yang berterusan dalam individu yang menghidap COVID{109}}. Bersama-sama, penemuan ini menawarkan pemahaman yang lebih mendalam tentang jangka hayat imuniti semula jadi yang disebabkan oleh jangkitan virus dan mempunyai implikasi yang luas untuk strategi vaksinasi yang inovatif dan pendekatan diagnostik yang lebih baik.

RUJUKAN

1. Lu R, Zhao X, Li J, Niu P, Yang B, Wu H, et al. Pencirian genom dan epidemiologi novel coronavirus 2019: implikasi untuk asal usul virus dan pengikatan reseptor. Lancet 2020;395:565-74.

2. Pertubuhan Kesihatan Sedunia (WHO). Papan pemuka WHO coronavirus (COVID-19), 2021. Tersedia di: https://COVID19.who.int/. Diakses pada 30 November 2021.

3. Wu Z, McGoogan JM. Ciri-ciri dan pengajaran penting daripada wabak penyakit coronavirus 2019 (COVID-19) di China: ringkasan laporan 72314 kes daripada Pusat Kawalan dan Pencegahan Penyakit China. JAMA 2020;323:1239-42.

4. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D, et al. Kekebalan adaptif khusus antigen kepada SARS-CoV-2 dalam COVID-19 akut dan kaitan dengan umur dan keterukan penyakit. Sel 2020;183:996-1012.e19.

5. Wu J, Liang B, Chen C, Wang H, Fang Y, Shen S, et al. Jangkitan SARS-CoV-2 mendorong tindak balas imun humoral yang berterusan dalam pesakit pemulihan berikutan COVID yang bergejala-19. Nat Commun 2021;12:1813.

6. Long QX, Liu BZ, Deng HJ, Wu GC, Deng K, Chen YK, et al. Tindak balas antibodi terhadap SARS-CoV-2 dalam pesakit COVID-19. Nat Med 2020;26:845-8.

7. Sterlin D, Mathian A, Miyara M, Mohr A, Anna F, Claer L, et al. IgA mendominasi tindak balas antibodi peneutral awal kepada SARS-CoV-2. Sci Transl Med 2021;13: eabd2223.

8. Zhang J, Wu Q, Liu Z, Wang Q, Wu J, Hu Y, et al. Sel pembantu folikel T yang beredar khusus lonjakan dan tindak balas antibodi peneutral silang dalam COVID-19– individu yang sembuh. Nat Microbiol 2021;6:51-8.

9. Wang P, Liu L, Nair MS, Yin MT, Luo Y, Wang Q, et al. Tindak balas antibodi yang meneutralkan SARS-CoV-2 adalah lebih teguh pada pesakit dengan penyakit yang teruk. Emerg Microbes Infect 2020;9:2091-3.

10. Vanshylla K, Di Cristanziano V, Kleipass F, Dewald F, Schommers P, Gieselmann L, et al. Kinetik dan kaitan tindak balas antibodi peneutral kepada jangkitan SARSCoV-2 pada manusia. Mikrob Hos Sel 2021;29:917-29.e4.

11. Xiang T, Liang B, Fang Y, Lu S, Li S, Wang H, et al. Menurunkan tahap antibodi peneutralan terhadap SARS-CoV-2 dalam pesakit COVID-19 yang sembuh satu tahun selepas timbulnya gejala. Immunol Depan 2021;12:708523.

12. Wang Z, Muecksch F, Schaefer-Babajew D, Finkin S, Viant C, Gaebler C, et al. Keluasan peneutralan yang dipertingkat secara semula jadi terhadap SARS-CoV-2 satu tahun selepas jangkitan. Alam Semula Jadi 2021;595:426-31.

13. Dan JM, Mateus J, Kato Y, Hastie KM, Yu ED, Faliti CE, et al. Memori imunologi kepada SARS-CoV-2 dinilai sehingga 8 bulan selepas jangkitan. Sains 2021;371:eabf4063.

14. Sokal A, Chappert P, Barba-Spaeth G, Roeser A, Fourati S, Azzaoui I, et al. Kematangan dan kegigihan tindak balas sel B memori anti-SARS-CoV-2. Sel 2021; 184:1201-13.e14. 15. Ju B, Zhang Q, Ge J, Wang R, Sun J, Ge X, et al. Antibodi peneutral manusia yang ditimbulkan oleh jangkitan SARS-CoV-2. Alam Semula Jadi 2020;584:115-9.

16. Liu L, Wang P, Nair MS, Yu J, Rapp M, Wang Q, et al. Antibodi peneutral yang kuat terhadap berbilang epitop pada lonjakan SARS-CoV-2. Alam Semula Jadi 2020;584:450-6.

17. Zost SJ, Gilchuk P, Case JB, Binshtein E, Chen RE, Nkolola JP, et al. Berupaya meneutralkan dan melindungi antibodi manusia terhadap SARS-CoV-2. Alam Semula Jadi 2020; 584:443-9.

18. Xu C, Wang Y, Liu C, Zhang C, Han W, Hong X, et al. Dinamik konformasi bagi glikoprotein pancang trimerik SARS-CoV-2 dalam kompleks dengan reseptor ACE2 yang didedahkan oleh cryo-EM. Sci Adv 2021;7:eabe5575.

19. McCallum M, De Marco A, Lempp FA, Tortorici MA, Pinto D, Walls AC, et al. Pemetaan antigenik domain N-terminal mendedahkan tapak kerentanan untuk SARSCoV-2. Sel 2021;184:2332-47.e16.

20. Sauer MM, Tortorici MA, Park YJ, Walls AC, Homad L, Acton OJ, et al. Asas struktur untuk peneutralan coronavirus yang luas. Nat Struct Mol Biol 2021;28:478-86.

21. Tortorici MA, Beltramello M, Lempp FA, Pinto D, Dang HV, Rosen LE, et al. Antibodi manusia yang sangat kuat melindungi daripada cabaran SARS-CoV-2 melalui pelbagai mekanisme. Sains 2020;370:950-7.

22. Pinto D, Park YJ, Beltramello M, Walls AC, Tortorici MA, Bianchi S, et al. Peneutralan silang SARS-CoV-2 oleh antibodi SARS-CoV monoklonal manusia. Alam Semula Jadi 2020;583:290-5.

23. Liu Y, Soh WT, Kishikawa JI, Hirose M, Nakayama EE, Li S, et al. Tapak meningkatkan kejangkitan pada protein lonjakan SARS-CoV-2 yang disasarkan oleh antibodi. Sel 2021; 184:3452-66.e18.

24. Liu L, Wei Q, Lin Q, Fang J, Wang H, Kwok H, et al. IgG anti-spike menyebabkan kecederaan paru-paru akut yang teruk dengan memesongkan tindak balas makrofaj semasa jangkitan SARS-CoV akut. JCI Insight 2019;4:e123158.

25. Li D, Edwards RJ, Manne K, Martinez DR, Sch€afer A, Alam SM, et al. Fungsi in vitro dan in vivo bagi jangkitan SARS-CoV-2-meningkatkan dan meneutralkan antibodi. Sel 2021;184:4203-19.e32. 26. Poh CM, Carissimo G, Wang B, Amrun SN, Lee CY, Chee RS, et al. Dua epitop linear pada protein lonjakan SARS-CoV-2 menimbulkan antibodi peneutralan dalam-19 pesakit COVID. Nat Commun 2020;11:2806.

27. Zhang BZ, Hu YF, Chen LL, Yau T, Tong YG, Hu JC, et al. Perlombongan epitop pada protein lonjakan SARS-CoV-2 daripada pesakit-19 COVID. Sel Res 2020;30:702-4.

28. Stoddard CI, Galloway J, Chu HY, Shipley MM, Sung K, Itell HL, et al. Pemprofilan epitope mendedahkan tandatangan yang mengikat bagi tindak balas imun-2 SARS-CoV dalam jangkitan semula jadi dan kereaktifan silang dengan CoV manusia endemik. Rep Sel 2021;35: 109164.

29. Shrock E, Fujimura E, Kula T, Timms RT, Lee IH, Leng Y, et al. Pemprofilan epitop virus pesakit COVID-19 mendedahkan kereaktifan silang dan korelasi keterukan. Sains 2020;370:eabd4250.

30. Zamecnik CR, Rajan JV, Yamauchi KA, Mann SA, Loudermilk RP, Sowa GM, et al. ReScan, saluran paip diagnostik multipleks, menyuburkan sera manusia untuk mendapatkan antigen SARS-CoV-2- 2. Sel Rep Med 2020;1:100123.

31. Haynes WA, Kamath K, Bozekowski J, Baum-Jones E, Campbell M, Casanovas Massana A, et al. Pemetaan epitop resolusi tinggi dan pencirian antibodi SARS-CoV-2 dalam kohort besar subjek dengan COVID-19. Commun Biol 2021;4:1317.

32. Li Y, Lai DY, Lei Q, Xu ZW, Wang F, Hou H, et al. Penilaian sistematik terhadap tindak balas IgG terhadap SARS-CoV-2 melonjakkan peptida terhasil protein untuk memantau pesakit-19 COVID. Sel Mol Immunol 2021;18:621-31.

33. Li Y, Ma ML, Lei Q, Wang F, Hong W, Lai DY, et al. Landskap epitop linear protein lonjakan-2 SARS-CoV yang dibina daripada 1,051 pesakit-19 COVID. Rep Sel 2021;34:108915.

34. Wang H, Wu X, Zhang X, Hou X, Liang T, Wang D, et al. SARS-CoV-2 Proteome Microarray untuk Memetakan COVID-19 Interaksi Antibodi pada Resolusi Asid Amino. ACS Cent Sci 2020;6:2238-49.

35. Yi Z, Ling Y, Zhang X, Chen J, Hu K, Wang Y, et al. Pemetaan fungsional epitop linear sel B bagi SARS-CoV-2 dalam COVID-19 populasi pulih. Emerg Microbes Infect 2020;9:1988-96.

36. Suruhanjaya Kesihatan Kebangsaan & Pentadbiran Kebangsaan Perubatan Tradisional Cina. Protokol Diagnosis dan Rawatan untuk Pneumonia Novel Coronavirus (Versi Percubaan 7). Chin Med J (Bahasa Inggeris) 2020;133:1087-95; https://doi.org/10.1097/ CM9.0000000000000819.

37. Li Y, Li CQ, Guo SJ, Guo W, Jiang HW, Li HC, et al. Pemprofilan repertoir autoantibodi serum membujur mengenal pasti biomarker berkaitan pembedahan dalam adenokarsinoma paru-paru. EBioPerubatan 2020;53:102674.

38. Zhao J, Yuan Q, Wang H, Liu W, Liao X, Su Y, et al. Tindak balas antibodi terhadap SARSCoV-2 pada pesakit dengan penyakit novel coronavirus 2019. Clin Infect Dis 2020;71: 2027-34.

39. Lucas C, Wong P, Klein J, Castro TBR, Silva J, Sundaram M, et al. Analisis membujur mendedahkan kesilapan imunologi dalam COVID yang teruk-19. Alam Semula Jadi 2020;584: 463-9.

40. Moore JB, Jun CH. Sindrom pelepasan sitokin dalam COVID yang teruk-19. Sains 2020;368:473-4.

41. Chen J, Malone B, Llewellyn E, Grasso M, Shelton PMM, Olinares PDB, et al. Asas Struktur untuk Gandingan Helikase-Polymerase dalam Kompleks Transkripsi Replikasi-2 SARS-CoV. Sel 2020;182:1560-73.e13.

42. Wajnberg A, Amanat F, Firpo A, Altman DR, Bailey MJ, Mansour M, et al. Antibodi peneutral yang teguh kepada jangkitan SARS-CoV-2 berterusan selama berbulan-bulan. Sains 2020; 370:1227-30.

43. Chi X, Yan R, Zhang J, Zhang G, Zhang Y, Hao M, et al. Antibodi manusia yang meneutralkan terikat pada domain terminal N bagi protein pancang SARS-CoV-2. Sains 2020;369:650-5.

44. Tseng CT, Sbrana E, Iwata-Yoshikawa N, Newman PC, Garron T, Atmar RL, et al. Imunisasi dengan vaksin coronavirus SARS membawa kepada imunopatologi pulmonari yang menghadapi cabaran dengan virus SARS. PLoS One 2012;7:e35421.

45. Bolles M, Deming D, Long K, Agnihothram S, Whitmore A, Ferris M, et al. Vaksin coronavirus sindrom pernafasan akut teruk dua kali tidak aktif memberikan perlindungan yang tidak lengkap pada tikus dan mendorong peningkatan tindak balas pulmonari proinflamasi eosinofilik apabila dicabar. J Virol 2011;85:12201-15.

46. ​​Weingartl H, Czub M, Czub S, Neufeld J, Marszal P, Gren J, et al. Imunisasi dengan virus vaccinia yang diubah suai Vaksin rekombinan berasaskan Ankara terhadap sindrom pernafasan akut yang teruk dikaitkan dengan peningkatan hepatitis dalam ferret. J Virol 2004;78:12672-6.

47. Yasui F, Kai C, Kitabatake M, Inoue S, Yoneda M, Yokochi S, et al. Imunisasi sebelumnya dengan protein nukleokapsid berkaitan sindrom pernafasan akut teruk (SARS) berkaitan coronavirus (SARS-CoV) menyebabkan radang paru-paru teruk pada tikus yang dijangkiti SARS-CoV. J Immunol 2008;181:6337-48.

48. Deming D, Sheahan T, Heise M, Yount B, Davis N, Sims A, et al. Keberkesanan vaksin dalam tikus tua dicabar dengan wabak pembawa SARS-CoV rekombinan dan varian lonjakan zoonosis. PLoS Med 2006;3:e525.

49. Wang Q, Zhang L, Kuwahara K, Li L, Liu Z, Li T, et al. Epitop coronavirus SARS imunodominan pada manusia menimbulkan kesan meningkatkan dan meneutralkan jangkitan pada primata bukan manusia. ACS Infect Dis 2016;2: 361-76.

50. Agrawal AS, Tao X, Algaissi A, Garron T, Narayanan K, Peng BH, et al. Imunisasi dengan vaksin coronavirus sindrom pernafasan Timur Tengah yang tidak aktif membawa kepada imunopatologi paru-paru yang menghadapi cabaran dengan virus hidup. Hum Vaccin Immunother 2016;12:2351-6.