Perbandingan Dua Ujian Diagnostik Untuk Pengesanan Antibodi Meneutralkan Serum Kepada Virus Cirit-birit Epidemik Porcine

Abstrak:

Kekebalan laktogenik adalah penting untuk perlindungan anak babi terhadap banyak patogen termasuk virus cirit-birit wabak babi. Mengedarkan tahap antibodi peneutral dalam sera tabur boleh membantu menentukan sama ada tindak balas imun yang boleh dikesan boleh memberi perlindungan kepada anak babi. Antibodi peneutralan boleh dikesan melalui pelbagai ujian diagnostik. Kajian ini menilai ciri diagnostik dua ujian antibodi peneutralan untuk antibodi peneutral virus cirit-birit epidemik babi dalam serum gilt tercabar. Empat kumpulan rawatan, kawalan, tidak divaksinasi, divaksinasi sebelum cabaran, dan divaksin selepas cabaran, terdiri daripada 20 gilt. Sampel serum dikumpul dari setiap sepuhan sebelum dan selepas cabaran dengan virus cirit-birit wabak babi. Sampel dinilai untuk kehadiran antibodi peneutralan melalui ujian peneutralan fokus pendarfluor dan ujian peneutralan tinggi. Kepekaan dan kekhususan diagnostik untuk peneutralan fokus pendarfluor dan ujian peneutralan pemprosesan tinggi untuk kajian ini telah dioptimumkan pada potongan pencairan masing-masing 80 dan 80% pengurangan pendarfluor dan menunjukkan persetujuan sederhana berdasarkan statistik kappa. Peneutralan pendarfluor fokus dan ujian peneutralan daya pemprosesan tinggi boleh digunakan untuk memantau status peneutralan antibodi dalam haiwan atau populasi haiwan. Ujian pemprosesan tinggi mempunyai kelebihan berbanding ujian pendarfluor fokus kerana ia mempunyai kekhususan yang lebih tinggi pada pemotongan yang ditunjukkan dan sifat keputusan membolehkan lebih banyak diskriminasi antara keputusan individu.

faedah tambahan cistanche-meningkatkan imuniti

Kata kunci: PEDV; meneutralkan antibodi; ujian diagnostik

1. Pengenalan

Virus cirit-birit epidemik babi (PEDV) ialah Alphacoronavirus yang telah menjadi endemik di Amerika berikutan kemunculannya di Amerika Syarikat pada tahun 2013 [1–3]. Langkah-langkah biosekuriti difokuskan pada menjaga patogen seperti PEDV daripada ternakan babi untuk mengurangkan kesan penyakit [4]. Ujian serologi ialah alat yang berguna untuk menentukan sama ada babi telah terdedah kepada dan dijangkiti oleh patogen sebelum ini. Pendedahan boleh berlaku secara semula jadi (cth, pengambilan bahan sarat virus) atau secara sengaja (cth, bercampur dengan haiwan pembenih menumpahkan, inokulasi mulut-hidung, atau lavage gastrik). Untuk tujuan kajian ini, pendedahan dicapai melalui cabaran yang disengajakan dengan homogenat tisu positif PEDV daripada wabak klinikal PEDV yang disahkan. Lagu et al. [5] menunjukkan titer antibodi yang meneutralkan serum tidak berbeza antara induk yang diberi vaksin PEDV DR13 yang dilemahkan sel Vero oral atau intramuskular. Kajian ini juga menunjukkan bahawa induk yang divaksin secara oral mempunyai kematian anak babi yang lebih rendah berbanding dengan vaksinasi intramuskular. Selain itu, de Arriba et al. [6] menunjukkan korelasi antara sel perembesan antibodi (ASC) IgA dan IgG dalam darah dan tisu limfoid yang berkaitan dengan usus. Plasenta epiteliokorial yang tersebar menghalang sel-sel imun dan antibodi daripada dipindahkan ke anak babi dalam rahim menjadikan babi agammaglobulinemik semasa lahir [7]. Imuniti ibu dipindahkan daripada anak babi kepada anak babi melalui rembesan susu dan memainkan peranan penting dalam perlindungan daripada patogen enterik seperti PEDV, TGEV, dan rotavirus. Oleh itu, anak babi bergantung pada kolostrum dan antibodi susu untuk perlindungan daripada patogen ini. Imunoglobulin serum adalah penyumbang besar kepada kolostrum manakala imunoglobulin dalam susu dihasilkan dalam kelenjar susu [8]. Oleh itu, ujian antibodi meneutralkan boleh membantu untuk menentukan sama ada tindak balas imun yang boleh dikesan dalam sera benih pra-bersalin boleh memberi perlindungan kepada anak babi. Mekanisme peneutralan antibodi termasuk pengagregatan, perencatan kemasukan virus sel sasaran, dan perencatan replikasi virus dalam sel sasaran [9]. Ujian diagnostik telah dibangunkan untuk mengesan antibodi peneutralan untuk PEDV termasuk peneutralan virus (VN), peneutralan fokus pendarfluor (FFN), dan ujian peneutralan tinggi throughput (HTNT) [2,10-13]. Seperti yang diterangkan oleh Sarmento et al. [2], ujian FFN adalah penambahbaikan ke atas ujian VN kerana ujian adalah lebih sensitif kerana ujian adalah berdasarkan pengesanan antigen virus yang dinyatakan pada permukaan sel Vero yang dijangkiti manakala ujian VN adalah berdasarkan kesan sitopatik yang disebabkan. oleh virus. Selain itu, keputusan FFN boleh diperolehi dengan lebih pantas daripada keputusan VN kerana kesan sitopati mengambil masa lebih lama untuk diperhatikan berbanding lampiran virus dengan FFN. Ujian HTNT adalah penambahbaikan lanjut ke atas ujian FFN kerana ujian HTNT bergantung pada sitometri imej digital dan bukannya tafsiran juruteknik untuk mendapatkan keputusan. Oleh itu, membenarkan keseluruhan plat dibaca dalam masa kurang daripada 3 minit, menghasilkan ukuran kuantitatif dalam keamatan pendarfluor, dan kemungkinan untuk menyimpan imej untuk semakan. Oleh itu, HTNT nampaknya sesuai untuk digunakan dalam ternakan babi komersial. Kajian ini membandingkan ciri diagnostik (kepekaan dan kekhususan) dan nilai ramalan positif dan negatif, dua ujian antibodi meneutralkan untuk ujian PEDV, FFN, dan HTNT. Ini berdasarkan kerja Sarmento et al. [2] dengan menguji haiwan naif, dijangkiti dan divaksinasi untuk membantu mengesahkan ujian untuk digunakan dalam makmal diagnostik berkemampuan tinggi. Berdasarkan keputusan Sarmento et al. [2], hipotesis nol kami ialah tiada perbezaan dalam ciri diagnostik kedua-dua ujian untuk mengesan antibodi PEDV yang meneutralkan dalam serum gilt yang dicabar PEDV.

faedah tambahan cistanche-meningkatkan imuniti

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Sumber dan Pemilihan Babi

Seperti yang diterangkan sebelum ini oleh Brown et al. [14], kajian ini menggunakan 4 kumpulan rawatan yang dirujuk sebagai Kawalan, NV (tidak divaksinasi), Pra (divaksin sebelum cabaran), dan Pos (divaksin berikut cabaran). Setiap kumpulan pada mulanya terdiri daripada 20 komersil, kacukan, gilt. Sebanyak 60 gilt telah dipilih dengan mudah daripada ladang babi komersial di tengah Iowa yang tidak mempunyai sejarah PEDV. 20 gilt dalam kumpulan Kawalan telah digunakan semula untuk kumpulan NV. Kumpulan NV hanya terdiri daripada 18 ekor babi kerana dua gilt telah dikeluarkan daripada kajian kerana komplikasi yang tidak berkaitan dengan cabaran PEDV.

Sebagai bukti lanjut status negatif PEDV, 12 mL darah telah dikumpul melalui jugular venipuncture menggunakan 16-tolok, jarum 1.5-inci dan picagari 12 mL. Serum dituai daripada sampel darah melalui sentrifugasi pada 1.500 × g selama 8 min (min), berpecah kepada 1 mL aliquot, dan disimpan pada -80 ◦C. Sampel serum telah diuji dengan wv-ELISA di Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory (ISU-VDL, Ames, IA, USA) [15].

2.2. Penugasan Haiwan kepada Kumpulan Rawatan

Enam puluh sepuh itu dibahagikan sama rata kepada 3 kumpulan, setiap satu terdiri daripada 20 ekor betina kacukan komersial. Untuk membentuk empat kumpulan rawatan, 20 gilt digunakan secara berurutan untuk dua kumpulan rawatan, CONTROL dan NV. Penggunaan semula 20 gilt dibenarkan untuk pembangunan dan kawalan sekumpulan gilt positif PEDV yang telah terdedah kepada PEDV dan mengurangkan jumlah bilangan haiwan yang digunakan dalam kajian. Baki 40 gilt terdiri daripada kumpulan PRE dan POST, dengan 20 gilt dalam setiap kumpulan. Garis masa peristiwa mengikut kumpulan rawatan diterangkan dalam Brown et al. [14]. Secara ringkas, sampel darah individu dikumpulkan sekali seminggu dalam setiap kumpulan rawatan berikutan cabaran. Penghuraian lanjut dibincangkan dalam Bahagian 2.4 dan 2.5. Kumpulan rawatan "PRE" gilts telah divaksin sebelum tiba di kemudahan luar tapak. Kumpulan rawatan "POST" gilts tidak diberi vaksin sehingga selepas cabaran.

2.3. Perumahan dan Penjagaan Babi

Setibanya di kemudahan penyelidikan, gilts telah ditempatkan oleh kumpulan rawatan: semua 20 gilts dalam kumpulan rawatan berada dalam satu pen dengan suapan ad libitum dan air. Semua pen berada di dalam bilik yang sama. Satu pen dibiarkan kosong di antara kumpulan NV PRE dan POST untuk meminimumkan pencemaran. Suapan, air, suhu bilik tinggi dan rendah, dan tinggi dan rendah kelembapan dipantau untuk memastikan konsistensi dengan piawaian pengeluaran. Pemerhatian kesihatan telah dijalankan dan direkodkan sekali sehari untuk menilai ambulasi, kelesuan, konsistensi najis, dan tanda-tanda klinikal penyakit yang lain. Tag telinga (Integra Hog, Allflex, Dallas, TX, USA) diletakkan di telinga kanan setiap gilt untuk pengenalan haiwan individu.

2.4. Cabaran Lisan

Selepas 4-tempoh penyesuaian hari, setiap sepuhan dalam CONTROL didedahkan secara lisan kepada PEDV menggunakan homogenat tisu yang dikumpulkan daripada wabak klinikal PEDV yang disahkan di ladang komersial. Homogenat telah disusun oleh Makmal Diagnostik Veterinar Universiti Iowa State dan didapati sebagai strain prototaip AS, genogroup G2b. Sepuluh mililiter homogenat dicampur dengan 590 mL garam fosfat buffered dan 30 mL campuran itu ditadbir secara ironi kepada setiap gilt. Inokulum telah disahkan positif PEDV oleh tindak balas rantai polimerase transkripase terbalik masa nyata dengan nilai CT 19.6 dan 14.23 × 107 salinan genomik per mL dan perkembangan cirit-birit dalam gilts berikutan cabaran. Sampel darah individu dikumpulkan setiap 7 hari selepas cabaran melalui jugular venipuncture seperti yang diterangkan di atas hingga hari ke-42 selepas cabaran. Serum telah dituai dan disimpan seperti yang diterangkan di atas dan sampel telah diserahkan kepada ISU VDL untuk pengesanan antibodi peneutralan oleh ujian peneutralan pendarfluor fokus dan ujian peneutralan virus throughput tinggi. Pada hari ke-60 selepas cabaran awal CONTROL, baki 40 gilt dibawa ke kemudahan penyelidikan dan 18 daripada gilt CONTROL menjadi NV. Dua gilt telah dikeluarkan dari CONTROL kerana keadaan yang tidak berkaitan dengan kajian. Berikutan 3-tempoh penyesuaian hari selepas ketibaan, 18 gilt telah dicabar semula (NV) dan 40 gilt (PRE dan POST) telah dicabar, sampel darah telah dikumpul, serum dituai dan sampel diserahkan untuk ujian seperti yang diterangkan di sini .

2.5. Vaksinasi Gilts

Empat puluh gilt telah kekal di ladang asal dan dibawa ke kemudahan penyelidikan 8.5 minggu selepas ketibaan CONTROL. Dua puluh gilt telah divaksin 5 dan 2 minggu sebelum cabaran, seperti yang disyorkan oleh syarikat yang menghasilkan vaksin itu, dengan vaksin PEDV terbunuh yang tersedia secara komersial, genogroup G2b, (Vaksin Cirit-birit Epidemik Porcine, Zoetis, Inc., Florham Park, NJ , Amerika Syarikat) yang terdiri daripada kumpulan PRE. Baki dua puluh telah divaksin dengan vaksin yang sama, 1 dan 3 minggu berikutan cabaran PEDV yang terdiri daripada kumpulan POST. Lapan belas daripada dua puluh gilt CONTROL asal kekal dalam kajian dan terdiri daripada kumpulan NV dan tidak menerima vaksinasi untuk PEDV

sistem imun yang meningkatkan tumbuhan cistanche

2.6. Ujian Antibodi Meneutralkan

2.6.1. Prosedur Peneutralan Fokus Pendarfluor (FFN).

FFN telah dilakukan oleh Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory, prosedur operasi standard 9.5324 [16]. Secara ringkas, sel Vero 76 telah disediakan dengan membilas dan mengeram dengan asid Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) selama 5 minit pada suhu 37 ◦C. Pencairan 1:20 sel dan medium penyebaran sel telah dibuat dan 200 µL ditambahkan pada setiap telaga 96-plat perigi dan diinkubasi selama 48 jam. Pinggan dibuang dan dibilas dengan medium inokulasi virus. Sampel serum dinyahaktifkan haba dalam mandi air pada suhu 56 ◦C selama 30 minit dan kemudian dicairkan dalam 2-pencairan bersiri kali ganda bermula pada 1:10 dalam pinggan. Virus stok dicairkan kepada 100–200 unit pembentuk fokus setiap 100 µL dan 100 µL ditambahkan pada setiap telaga dan diinkubasi selama 60 minit pada suhu 37 ◦C dengan 5% karbon dioksida (CO2). Plat ujian dibuang, dibilas dan 150 µL campuran serum/virus ditambah ke dalam telaga yang sepadan dan diinkubasi selama 60 minit pada suhu 37 ◦C. Campuran serum/virus dibuang dan telaga dicuci dengan medium inokulasi virus. 150 µL medium inokulasi virus telah ditambah kepada setiap telaga dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ◦C dan 5% CO2. Media dikeluarkan dari pinggan dan sel telah diperbaiki dengan menambahkan 80% aseton, yang telah disejukkan dalam mandi ais, selama 15 minit. Aseton dibuang dan plat dikeringkan di udara. Pencairan 1:100 FITC konjugasi PEDV NP antibodi monoklonal yang dicairkan dalam PBS (pH 7.2) telah disediakan dan 50 µL telah ditambah ke semua telaga dan diinkubasi pada 37 ◦C selama 60 minit. Plat itu dibasuh dengan PBS dan kemudian dibaca menggunakan mikroskop pendarfluor (Olympus BX51, objektif 10X, penapis FITC). Telaga positif tidak menunjukkan plak pendarfluor dan negatif menunjukkan plak hijau. Titer antibodi yang meneutralkan dinyatakan sebagai pencairan serum tertinggi dengan pengurangan 90% replikasi virus berbanding kawalan virus. Sampel dengan titer Lebih daripada atau sama dengan 20 diklasifikasikan sebagai positif untuk antibodi peneutral PEDV. Titer yang lebih tinggi menunjukkan kepekatan antibodi peneutral yang lebih tinggi dalam sampel. Contoh sampel sera positif dan negatif terdapat dalam bahan tambahan.

2.6.2. Prosedur Ujian Peneutralan Pendarfluor Daya Tinggi (HTNT).

HTNT telah dilakukan oleh Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory, prosedur operasi standard 9.5324 Versi 2 [17]. Sampel serum dinyahaktifkan haba dalam mandi air pada suhu 56 ◦C selama 30 minit. Stok virus telah dicairkan bersiri 10-kali ganda dalam medium inokulasi virus (DMEM dengan 2 µg/mL Trypsin-TPCK), dipindahkan ke sel Vero 81 (ATTC® CCL-81™) dan diinkubasi pada 37 ◦C dengan 5% CO2 selama 5 hari. Pencairan terakhir di mana kesan sitopatik diperhatikan digunakan untuk menentukan dos berjangkit kultur tisu median (TCID50) menggunakan kaedah Spearman dan Karber [18]. Seratus mikroliter larutan sel (Medium penyebaran sel, Trypsin-EDTA, dan sel Vero 81), telah dicairkan dengan 100 µL medium penyebaran sel (DMEM dengan 10% FBS dan 1% penisilin-streptomisin) untuk membuat pencairan 1:1 . Hemositometer digunakan untuk mengira dan mengira pencairan untuk membuat 5 × 104 sel/telaga dan ditambahkan pada setiap telaga daripada plat telaga hitam 96-telaga jernih (Coring 96 well CellBind microplate, Sigma) dan diinkubasi selama 48 jam pada 37 ◦C dengan 5% CO2 untuk membuat konfluen sel (100% konfluen). Setiap plat mempunyai kawalan positif, kawalan negatif, dan telaga kawalan virus. Kemudian, lima mikroliter kawalan dan sampel yang tidak diaktifkan haba diletakkan dalam telaga pendua untuk membuat pencairan 1:40 dengan 1:20 pertama dengan menambahkan 95 µL medium inokulasi virus, kemudian 100 µL virus PEDV 1:10 yang dicairkan (3.16 × 105). TCID50/mL). Campuran serum/virus telah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ◦C dengan 5% CO2. Semua telaga sel plat ujian dicuci 3 kali dengan 150 µL medium pencuci sel (DMEM dengan 1% penisilin-streptomycin), dan 150 µL campuran serum/virus dan kawalan virus dipindahkan ke plat ujian dan diinkubasi selama 90 minit pada 37 ◦C. Campuran serum/virus telah dibuang dan pinggan dibasuh sekali dengan medium pencuci sel, seperti yang diterangkan di atas, diikuti sekali dengan medium inokulasi virus. Medium inokulasi virus (150 µL) telah ditambah pada setiap telaga dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ◦C dengan 5% CO2. Medium inokulasi virus dibuang dan plat dicuci dengan PBS pH 7.4. Sel-sel telah ditetapkan dengan menambah 4 ◦C, 80% aseton pada setiap telaga dan diinkubasi pada suhu bilik selama 15 minit. Aseton kemudiannya dikeluarkan dan plat dikeringkan di udara selama 30 minit. Setiap telaga dibilas dengan PBS pH 7.4. 50 µL antibodi monoklonal PEDV NP terkonjugasi FITC (klon SD6-29, Medgene Labs) yang dicairkan 1:100 dalam PBS pH 7.4 telah ditambah pada setiap telaga dan diinkubasi selama 60 minit pada suhu 37 ◦C. Plat dibasuh empat kali dengan PBS pH 7.4, meninggalkan basuhan terakhir di dalam pinggan selama 5 minit kemudian dibuang dan digantikan dengan 100 µL PBS pH 7.4. Plat kemudiannya dibaca dengan SpectraMax i3× menggunakan SoftMax Pro 6.5 (Peranti Molekul, San Jose, CA, Amerika Syarikat) menggunakan masa pendedahan 30 ms dan pelarasan fokus 20 um untuk 541 panjang gelombang. Sampel dengan Jumlah Pengurangan Pendarfluor (%FR) Lebih daripada atau sama dengan 85% diklasifikasikan sebagai positif untuk meneutralkan antibodi [2]. Jumlah pengurangan pendarfluor dikira sebagai 100 − ([Sampel purata Jumlah Intensiti Pendarfluor/Purata Kawalan Negatif Jumlah Intensiti Pendarfluor]) × 100). Jumlah pengurangan pendarfluor yang lebih tinggi menunjukkan kepekatan antibodi peneutral yang lebih tinggi dalam sampel. Contoh sampel sera positif dan negatif terdapat dalam bahan tambahan.

2.7. Ciri-ciri Diagnostik: Sensitiviti dan Kekhususan dan Nilai Ramalan Positif dan Negatif

Kepekaan dan kekhususan diagnostik dikira untuk HTNT menggunakan potongan %FR 70, 75, 80, 85, dan 90 dan FFN menggunakan potongan pencairan sampel 20, 40, 80, dan 160 untuk menentukan cutoff yang dioptimumkan. Dioptimumkan ditakrifkan sebagai potongan di mana kekhususan diagnostik dimaksimumkan dengan kehilangan kekhususan diagnostik yang minimum. Subset daripada tujuh puluh enam sampel PEDV-negatif yang diketahui telah dipilih daripada dua titik persampelan pertama untuk kumpulan CONTROL dan POST. 36 sampel positif PEDV yang diketahui telah dipilih daripada dua titik persampelan terakhir untuk kumpulan NV. Potongan lebih daripada 85 digunakan untuk menentukan sampel positif, selaras dengan prosedur operasi standard ISU VDL untuk ujian [17]. Kepekaan diagnostik dianggarkan dengan membahagikan bilangan sampel positif yang diketahui yang diuji positif dengan jumlah sampel positif yang diketahui. Kekhususan diagnostik dianggarkan dengan membahagikan bilangan sampel negatif yang diketahui yang diuji negatif dengan bilangan sampel negatif yang diketahui. Potongan yang mengoptimumkan kekhususan dan sensitiviti diagnostik telah dipilih untuk perbandingan ujian. Untuk tujuan kajian ini, kekhususan diagnostik (DSp) dan kepekaan (DSe) telah dimaksimumkan, di mana nilai mutlak perbezaan antara nilai sensitiviti dan kekhususan adalah paling kecil. Nilai ramalan positif (PPV) dianggarkan dengan membahagikan bilangan sampel positif diketahui yang diuji positif (TP) dengan jumlah sampel positif ujian (TP campur positif palsu [FP]). Nilai ramalan negatif (NPV) dianggarkan dengan membahagikan bilangan sampel negatif (TN) yang diketahui yang diuji negatif dengan jumlah sampel negatif ujian (TN campur negatif palsu [FN]).

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.8. Analisis statistik

Tiada keputusan yang tidak pasti atau data yang hilang dalam kajian ini. Semua data dianalisis menggunakan SAS Versi 9.4 (SAS Instit. Cary NC). 609 pemerhatian daripada 6{{10}} babi milik salah satu daripada 4 kumpulan telah digunakan. Dua kemungkinan nilai cutoff (40 dan 80) untuk ujian FFN telah dipertimbangkan dan dibandingkan dengan cutoff 85 untuk HTNT. Bagi setiap satu, model kesan campuran linear sesuai untuk menerangkan kesan kumpulan pada persetujuan ujian FFN dan HTNT, dengan kesan rawak khusus babi. Semua analisis perbandingan berpasangan kumpulan telah dilakukan. Selanjutnya, untuk dua daripada tiga nilai cutoff yang digunakan untuk ujian FFN, pekali Kappa Cohen dikira untuk menentukan persetujuan keseluruhan ujian FFN dan HTNT. Pekali Kappa ditafsirkan seperti berikut: kurang daripada 0.0, perjanjian "buruk"; antara 0.0 dan 0.20, perjanjian "sedikit"; antara 0.21 dan {{30}}.40, perjanjian "adil"; antara 0.41 dan 0.60, perjanjian "sederhana"; antara 0.61 dan 0.80, perjanjian "substantial"; dan antara 0.81 dan 1.0, perjanjian "hampir sempurna" [19]. Kepentingan ditetapkan pada p Kurang daripada atau sama dengan 0.05. Petak kotak dan kumis telah dibangunkan menggunakan perisian R.

3. Keputusan

Jadual 1 menunjukkan sensitiviti dan kekhususan diagnostik untuk ujian FFN dan HTNT pada potongan yang dipilih. Kepekaan dan kekhususan diagnostik untuk kedua-dua ujian untuk kajian ini telah dioptimumkan pada potongan pencairan masing-masing 80 dan 80% FR.

Jadual 1. Kepekaan diagnostik (DSe), Kekhususan diagnostik (DSp), Nilai Ramalan Positif (PPV) dan Nilai Ramalan Negatif (NPV) untuk ujian HTNT dan FFN menggunakan pelbagai potongan yang disenaraikan dalam baris kedua jadual. Contohnya, untuk ujian HTNT pada potongan 70, DSe=0.97 (97%), DSP=0.91 (91%), PPV=0.83 ( 83%) dan NPV=0.95 (95%). U=tidak ditentukan.

Rajah 1 memaparkan plot kotak dan kumis keputusan HTNT mengikut hari selepas cabaran oleh kumpulan rawatan kajian. Sampel daripada kumpulan CONTROL dan POST (n=76) dikelaskan sebagai negatif pada hari −4, 0 dan 7 seperti yang dijangkakan disebabkan oleh status babi sebelumnya. Kumpulan NV membangunkan tindak balas anamnesis berikutan cabaran itu. Penurunan kebolehubahan berlaku di kalangan keputusan HTNT seperti yang ditunjukkan oleh penurunan dalam julat nilai dalam kedua-dua kumpulan yang divaksin (PRE dan POST) berikutan cabaran dengan PEDV. Variasi menurun ini boleh diperhatikan dalam Rajah 1 apabila misai dan bahagian luar bagi POST dan PRE-plot menjadi lebih pendek 14 hari selepas cabaran. Rajah 2 memaparkan plot kotak dan misai hasil FFN yang diubah suai log semula jadi mengikut hari selepas cabaran mengikut kumpulan rawatan, yang mempunyai keputusan yang sama seperti ujian HTNT. Kedua-dua keputusan HTNT (Rajah 1) dan FFN (Rajah 2) menunjukkan tindak balas terhadap cabaran dan vaksinasi seperti yang dilihat dengan peningkatan %FR dan titer daripada kedua-dua ujian. Walaupun sama dalam magnitud, variasi setiap keputusan ujian dikurangkan berikutan cabaran homolog (NV). Pengurangan variasi juga berlaku selepas vaksinasi (PRE dan POST). Variasi nilai antibodi meneutralkan ini mengikut minggu selepas pendedahan berkurangan berikutan vaksinasi dan cabaran homolog dengan PEDV (Rajah 1 dan 2). Terdapat kecenderungan yang sama dalam penurunan variasi antibodi peneutralan yang dilihat dalam kedua-dua keputusan ujian kumpulan rawatan yang dicabar vaksin dan homolog. Cabaran homolog PEDV dan vaksinasi kedua menghasilkan tindak balas anamnestik yang menjana tahap antibodi peneutral yang lebih tinggi dengan variasi yang berkurangan antara babi berbanding dengan nilai pra-cabaran dan selepas vaksinasi seperti yang diukur oleh kedua-dua ujian (Rajah 1). Berdasarkan analisis kepekaan dan kekhususan diagnostik, potongan 80 (titer) dan 85 (%FR) telah dipilih untuk menganalisis perjanjian ujian untuk ujian FFN dan HTNT masing-masing. Ujian kappa menunjukkan persetujuan "sederhana" sebanyak 0.5257 dengan selang keyakinan 95% sebanyak 0.461, 0.5904 daripada ujian untuk potongan 80 (titer) dan 85 (%FR) untuk Ujian FFN dan HTNT.

Rajah 1. Plot kotak dan kumis bagi keluk tindak balas antibodi HTNT mengikut hari selepas cabaran bagi setiap kumpulan rawatan. Bar tengah mewakili nilai median keputusan mengikut minggu. Engsel (atas dan bawah kotak) mewakili kuartil pertama (Q1) dan ketiga (Q3). Kawasan berlorek mewakili julat antara kuartil (IQR). Misai ditentukan seperti berikut: Misai atas=Q3 + 1.5∗IQR; Misai bawah=Q1 + 1.5∗IQR. Jika tiada titik data berada pada nilai yang dikira, titik data seterusnya yang paling hampir dengan Q1 atau Q3 ialah had whisker. Bulatan terbuka (◦) menunjukkan outliers. Potongan 85 dilambangkan dengan garis putus-putus pada 85 pada paksi-y.

Rajah 2. Plot kotak dan kumis bagi keluk tindak balas antibodi FFN mengikut hari selepas cabaran bagi setiap kumpulan rawatan. Bar tengah mewakili nilai median keputusan mengikut minggu. Engsel (atas dan bawah kotak) mewakili kuartil pertama (Q1) dan ketiga (Q3). Kawasan berlorek mewakili julat antara kuartil (IQR). Misai ditentukan seperti berikut: Misai atas=Q3 + 1.5∗IQR; Misai bawah=Q1 + 1.5∗IQR. Jika tiada titik data berada pada nilai yang dikira, titik data seterusnya yang paling hampir dengan Q1 atau Q3 ialah had whisker. Bulatan terbuka (◦) menunjukkan outliers. Potongan 40 dilambangkan dengan garis putus-putus di ln(40) pada paksi-y.

4. Perbincangan

Kami membuat hipotesis bahawa variasi yang dikurangkan dan tindak balas anamnestik dikaitkan dengan imuniti kumpulan homogen dan perlindungan daripada penyakit, walaupun tanda-tanda klinikal masih diperhatikan dalam kumpulan PRE seperti yang diterangkan sebelum ini [14]. Kesan klinikal dan keterukan penyakit dalam haiwan ini tidak dinilai untuk tujuan kajian ini. Penyakit ini menunjukkan secara berbeza antara orang dewasa dan neonat dengan tanda-tanda klinikal yang lebih teruk dan kematian pada neonat berbanding haiwan dewasa [1,20]. Walaupun mengedarkan tahap antibodi yang meneutralkan sahaja tidak memberikan perlindungan [21], ia boleh digunakan untuk menilai tindak balas antibodi berikutan pendedahan yang disengajakan atau pentadbiran vaksinasi dalam kumpulan. Walaupun ketiadaan viremia adalah ciri PEDV, viremia telah dilaporkan pada anak babi sehingga umur 4 minggu [22,23]. Oleh itu, antibodi peneutral yang beredar boleh mempengaruhi perjalanan klinikal penyakit [21]. Walau bagaimanapun, imuniti laktogenik, khususnya IgA dalam rembesan susu akan menjadi ukuran perlindungan yang lebih tepat untuk anak babi [21]. Ujian yang diterangkan dalam kajian ini boleh digunakan untuk memantau antibodi peneutralan serum berikutan pemberian vaksinasi dalam kumpulan sows atau gilts di samping mengumpul rembesan susu untuk menguji IgA laktogenik/sekretari. Adalah berfaedah jika data yang dijana daripada ujian ini boleh meramalkan kuantiti dan kestabilan imuniti laktogenik yang dihasilkan selepas vaksinasi. Walau bagaimanapun, itu tidak dianalisis dalam kajian ini. Tindak balas antibodi IgG serum selepas vaksinasi telah terbukti meramalkan tindak balas IgG kolostral, tetapi tidak ada korelasi antara antibodi peneutral serum dan rembesan susu [15]. Walaupun tiada korelasi antara antibodi peneutralan serum dan rembesan susu, haiwan yang divaksin ditunjukkan mempunyai antibodi peneutral yang lebih tinggi dalam rembesan susu berbanding haiwan kawalan [15]. Oleh itu, seperti yang disokong oleh, Bjustrom-Kraft, et al. [15], jika antibodi peneutral serum adalah tinggi, maka IgG dan IgA dalam rembesan susu juga boleh ditingkatkan. Oleh itu, mengumpul sampel serum sebelum pergerakan betina ke rumah farrowing akan meminimumkan tekanan dan kesakitan yang disebabkan semasa pengumpulan darah dan rembesan susu yang mungkin memberi kesan negatif kepada anak benih dan sampah [24]. Adalah penting bagi pengguna untuk memahami cara nilai potong boleh mempengaruhi sensitiviti diagnostik dan kekhususan ujian. Meningkatkan nilai potong akan mengurangkan bilangan keputusan positif palsu dan meningkatkan bilangan keputusan negatif palsu. Sebaliknya, mengurangkan nilai potong akan meningkatkan bilangan keputusan positif palsu dan mengurangkan bilangan keputusan negatif palsu. Pengetahuan ini membolehkan pengguna memilih nilai cut-off yang akan digunakan untuk situasi khusus mereka. Untuk kajian ini, berdasarkan hasil kajian ini dan keputusan terdahulu yang diterbitkan oleh Sarmento et al. [2], kami memilih 80 %FR untuk HTNT dan pencairan 80 FFN. Pada pemotongan ini, kekhususan diagnostik lebih tinggi untuk HTNT (97%) berbanding FFN (76%) dan memberikan nilai ramalan positif yang lebih tinggi daripada HTNT berbanding FFN. Ia juga mesti difahami bahawa nilai ramalan bergantung pada kelaziman penyakit [25,26]. Dalam kajian ini, berdasarkan sampel terkelas prevalens adalah 32.1% (36 sampel positif dan 76 sampel negatif). Apabila kelaziman meningkat, PPV juga akan meningkat kerana haiwan yang diuji (sampel) lebih berkemungkinan positif; apabila kelaziman berkurangan, NPV akan berkurangan. Rajah 3A dan B menggambarkan ini untuk ujian HTNT dan FFN pada pelbagai potongan yang dinilai dalam kajian ini mengikut kaedah yang diterangkan oleh Erb [25]. Oleh itu, apabila mempertimbangkan keputusan diagnostik, seseorang harus mempertimbangkan sensitiviti diagnostik dan kekhususan ujian dan memahami kelaziman dalam kumpulan jika menggunakan nilai ramalan.

Rajah 3. (A). Nilai Ramalan positif untuk ujian HTNT (garis hitam) dan FFN (garisan kelabu) pada pelbagai potongan. Potongan 90 tidak diwakili untuk HTNT. (B). Nilai ramalan negatif atau ujian HTNT (garis hitam) dan FFN (garisan kelabu) pada pelbagai potongan. Potongan 20 tidak diwakili untuk ujian FFN.

HTNT mempunyai sensitiviti dan kekhususan diagnostik yang unggul berbanding dengan FFN. Apabila menganalisis keputusan antibodi, ini sesuai untuk meminimumkan bilangan keputusan positif palsu dan negatif palsu. Sebagai contoh, apabila menggunakan potongan 80 untuk FFN, kami memerhatikan sensitiviti 97% dan kekhususan 76%. Ini bermakna terdapat sedikit keputusan negatif palsu tetapi akan terdapat sejumlah besar positif palsu. Jika keputusan dikategorikan secara palsu sebagai positif, maka ini mungkin membawa kepada salah tafsir bahawa kumpulan mempunyai antibodi kepada PEDV sedangkan sebenarnya mereka tidak. Oleh kerana HTNT mempunyai diagnostik dan kekhususan yang lebih tinggi merentasi pelbagai cutoff, ia adalah ujian yang lebih baik untuk pengesanan antibodi PEDV. Keputusan daripada Sarmento et al. [2] menunjukkan kekhususan diagnostik yang lebih tinggi untuk FFN dan sensitiviti dan kekhususan yang setanding untuk HTNT. Ujian diagnostik ini menunjukkan persetujuan sederhana mengikut statistik kappa (κ). Satu kelemahan κ ialah satu ujian mesti dianggap sebagai piawaian emas. Apabila membandingkan dua ujian tidak sempurna, ini boleh memesongkan tafsiran κ. Untuk kajian ini, kami menilai prestasi diagnostik ujian bersama-sama dengan κ untuk menentukan bahawa ujian itu bersetuju tetapi mungkin mempunyai utiliti yang berbeza. Kelebihan tambahan HTNT berbanding ujian FFN ialah keputusan HTNT dikira daripada data berterusan berbanding dengan nilai kategori (titrasi) daripada FFN. Sifat berterusan data HTNT membolehkan lebih besar diskriminasi keputusan sampel untuk menggambarkan status antibodi meneutralkan induk. Seperti yang dilaporkan oleh Sarmento et al. [2], HTNT mempunyai masa baca yang lebih pendek daripada plat telaga 96 kepada kurang daripada 4 minit membolehkan pemulihan yang lebih cepat pada keputusan. Antibodi sistemik yang beredar boleh menyumbang kepada perlindungan anak babi terhadap jangkitan PEDV [21]. Walau bagaimanapun, tiada literatur tentang kuantiti antibodi peneutral yang beredar dalam anak babi yang akan memberikan perlindungan PEDV kepada anak babi. Tahap antibodi yang beredar yang tinggi membawa kepada kepekatan yang lebih tinggi dalam kolostrum dan mampu meningkatkan perlindungan. Penilaian lanjut diperlukan untuk menentukan perkaitan antara, semasa kehamilan untuk mengumpul sampel, dan perlindungan antibodi kolostral terhadap jangkitan PEDV. Imuniti laktogenik dan mukosa adalah sangat penting untuk kemandirian babi yang terdedah kepada PEDV. Antibodi terkumpul dalam susu melalui paksi usus-MG-sIGA dan disalurkan kepada anak babi untuk memberikan perlindungan. Langel et al. [27] mendapati bahawa sepuhan yang terdedah semasa trimester kedua mempunyai tahap IgA, IgG yang beredar, dan antibodi peneutral yang jauh lebih tinggi berbanding sepuhan trimester pertama dan ketiga. Selain itu, Langel et al. [27] mendapati bahawa anak babi sepuhan yang terdedah kepada PEDV pada trimester kedua mempunyai kadar kelangsungan hidup 100% berbanding kurang daripada 87.2% pada trimester lain yang menunjukkan bahawa serum IgA, IgG, dan antibodi peneutral yang tinggi dikaitkan dengan kemandirian anak babi dalam menghadapi PEDV. Walaupun antibodi serum tidak memberikan perlindungan untuk PEDV, hasil daripada kajian kami mencadangkan tahap antibodi yang meneutralkan serum dikaitkan dengan perlindungan terhadap jangkitan PEDV. Seperti yang dilaporkan sebelum ini oleh Brown et al. [14], PEDV ditumpahkan dalam najis berikutan cabaran homolog dan vaksinasi sepuhan. Kajian ini menggunakan sampel daripada haiwan yang sama seperti Brown et al. [14]. selanjutnya menunjukkan bahawa peningkatan antibodi peneutral serum berikutan pendedahan cabaran atau vaksinasi tidak mempengaruhi corak penumpahan virus kerana tahap antibodi meningkat berikutan cabaran dan vaksinasi. Kajian lanjut adalah wajar untuk mengesahkan sama ada jumlah virus yang ditumpahkan dalam najis dikaitkan dengan kuantiti antibodi peneutral yang terdapat dalam serum [21].

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

5. Kesimpulan

Hipotesis nol kajian ini ialah tiada perbezaan dalam ciri diagnostik dua ujian antibodi peneutral PEDV, FFN dan HTNT. Keputusan menunjukkan bahawa ujian ini sederhana bersetuju berdasarkan statistik kappa manakala terdapat variasi dalam ciri diagnostik dan nilai ramalannya berdasarkan potongan untuk ujian. Ujian ini boleh digunakan untuk mengukur tindak balas vaksinasi sekawan. Kegagalan untuk menolak hipotesis nol menunjukkan bahawa HTNT adalah ujian pilihan untuk pengesanan antibodi peneutral PEDV dalam serum. Berikutan vaksinasi dalam kedua-dua kumpulan PRE dan POST, kajian ini mendapati majoriti keputusan sebagai positif. Dalam kumpulan PRE, penurunan variasi antara keputusan juga mengikuti cabaran. Keputusan ini mencadangkan pengamal babi boleh mengukur antibodi peneutralan serum untuk menentukan sama ada vaksin PEDV ditadbir dengan betul dalam kumpulan itu.

Rujukan

1. Saif, L.; Wang, Q.; Vlasova, A.; Jung, K.; Xiao, S. Coronaviruses. Dalam Penyakit Babi, ed. ke-11; Zimmerman, JJ, Ed.; Wiley Blackwell: Hoboken, NJ, Amerika Syarikat, 2019.

2. Sarmento, LV; Poonsuk, K.; Tian, ​​L.; Mora-Diaz, JC; Utama, RG; Baum, DH; Zimmerman, JJ; Gimenez-Lirola, LG Pengesanan antibodi peneutral virus cirit-birit epidemik babi menggunakan sitometri pengimejan throughput tinggi. J. Doktor haiwan. Diagnos. Menyiasat. 2020, 32, 324–328. [CrossRef]

3. Stevenson, GW; Hoang, H.; Schwartz, KJ; Burrough, ER; Matahari, D.; Madson, D.; Cooper, VL; Pilatzki, A.; Gauger, P.; Schmitt, BJ; et al. Kemunculan virus cirit-birit epidemik Porcine di Amerika Syarikat: Tanda-tanda klinikal, lesi, dan urutan genomik virus. J. Doktor haiwan. Diagnos. Menyiasat. 2013, 25, 649–654. [CrossRef]

4. Kim, Y.; Yang, M.; Goyal, SM; Cheeran, MC; Torremorell, M. Penilaian langkah-langkah biosekuriti untuk mencegah penularan tidak langsung virus cirit-birit wabak babi. BMC Vet. Res. 2017, 13, 89. [CrossRef]

5. Lagu, DS; Oh, JS; Kang, BK; Yang, JS; Bulan, HJ; Yoo, HS; Jang, YS; Park, BK Keberkesanan lisan sel Vero yang dilemahkan virus cirit-birit wabak babi strain DR13. Res. Doktor haiwan. Sci. 2007, 82, 134–140. [CrossRef] [PubMed]

6. de Arriba, ML; Carvajal, A.; Pozo, J.; Rubio, P. Tindak balas dan perlindungan antibodi khusus isotype mukosa dan sistemik dalam babi konvensional yang terdedah kepada virus cirit-birit wabak babi yang ganas atau dilemahkan. Doktor haiwan. Immunol. Imunopathol. 2002, 85, 85–97. [CrossRef] [PubMed]

7. Furukawa, S.; Kuroda, Y.; Sugiyama, A. Perbandingan struktur histologi plasenta dalam haiwan eksperimen. J. Toksik. Pathol. 2014, 27, 11–18. [CrossRef] [PubMed]

8. Bourne, FJ; Curtis, J. Pemindahan imunoglobin IgG, IgA, dan IgM daripada serum kepada kolostrum dan susu dalam induk. Imunologi 1973, 24, 157–162. [PubMed]

9. Parren, PW; Burton, DR Aktiviti antiviral antibodi in vitro dan in vivo. Adv. Immunol. 2001, 77, 195–262. [CrossRef]

10. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Gimenez-Lirola, L.; Rotolo, M.; Wang, C.; Matahari, Y.; Lasley, P.; Zhang, J.; Baum, D.; Gauger, P.; et al. Pengesanan virus cirit-birit epidemik babi (PEDV) dan tindak balas antibodi dalam babi yang tumbuh secara komersial. BMC Vet. Res. 2016, 12, 99. [CrossRef]

11. Oh, JS; Lagu, DS; Yang, JS; Lagu, JY; Bulan, HJ; Kim, TY; Park, BK Perbandingan ujian imunosorben berkaitan enzim dengan ujian peneutralan serum untuk serodiagnosis jangkitan virus cirit-birit wabak babi. J. Doktor haiwan. Sci. 2005, 6, 349–352. [CrossRef]

12. Okda, F.; Liu, X.; Singrey, A.; Clement, T.; Nelson, J.; Christopher-Hennings, J.; Nelson, EA; Lawson, S. Pembangunan ELISA tidak langsung, menyekat ELISA, immunoassay mikrosfera pendarfluor dan ujian peneutralan fokus pendarfluor untuk penilaian serologi pendedahan kepada strain Amerika Utara Porcine Epidemic Diarrhea Virus. BMC Vet. Res. 2015, 11, 180. [CrossRef] [PubMed]

13. Chen, Q.; Li, G.; Stasko, J.; Thomas, JT; Stensland, WR; Pilatzki, AE; Pengukur, PC; Schwartz, KJ; Madson, D.; Yoon, KJ; et al. Pengasingan dan pencirian virus cirit-birit wabak babi yang dikaitkan dengan wabak penyakit 2013 di kalangan babi di Amerika Syarikat. J. Clin. mikrobiol. 2014, 52, 234–243. [CrossRef]

14. Brown, J.; Rademacher, C.; Baker, S. Keberkesanan vaksin virus cirit-birit epidemik babi komersial dalam mengurangkan tempoh penumpahan virus dalam sepuhan. JSHAP 2019, 27, 256–264.

15. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Giménez-Lirola, L. Serum dan tindak balas antibodi rembesan susu dalam wabak babi cirit-birit-gilt imun berikutan vaksinasi cirit-birit wabak babi. JSHAP 2018, 26, 34–40.

16. Universiti Negeri Iowa. Prosedur untuk Ujian Virus Cirit-birit Epidemik Porcine (PEDV) Fluorescent Focus Neutralization (FFN). Serologi 2017, 1–7.

17. Universiti Negeri Iowa. Prosedur untuk Ujian Peneutralan Virus Epidemik Porcine Epidemic (PEDV) Virus Peneutralan Tinggi (HTNT). Serologi 2017, 1–16.

18. Hierholzer, JC; Killington, RA; Kangro, HO; Mahy, Manual Kaedah Virologi BWJ; Akhbar Akademik: London, UK, 1996; hlm. 21.

19. Thrusfield, M. Epidemiologi Veterinar, ed. ke-2; Blackwell Science LTD: Hoboken, NJ, Amerika Syarikat, 1995; hlm. 479.

20. Lee, C. Virus cirit-birit epidemik Porcine: Virus babi epizootik yang muncul dan muncul semula. Virol. J. 2015, 12, 193. [CrossRef]

21. Poonsuk, K.; Gimenez-Lirola, LG; Zhang, J.; Arruda, P.; Chen, Q.; Correa da Silva Carrion, L.; Magtoto, R.; Pineyro, P.; Sarmento, L.; Wang, C.; et al. Adakah Antibodi Beredar Memainkan Peranan dalam Perlindungan Anak Babi terhadap Virus Cirit-birit Wabak Porcine? PLoS ONE 2016, 11, e0153041. [CrossRef]

22. Niederwerder, MC; Nietfeld, JC; Bai, J.; Peddireddi, L.; Breazeale, B.; Anderson, J.; Kerrigan, MA; An, B.; Oberst, RD; Crawford, K.; et al. Penyetempatan tisu, penumpahan, pengangkutan virus, tindak balas antibodi dan penghantaran aerosol virus cirit-birit epidemik Porcine berikutan inokulasi 4-khinzir pengumpan berumur seminggu. J. Doktor haiwan. Diagnos. melabur. 2016, 28, 671–678. [CrossRef]

23. Madson, DM; Arruda, PH; Magstadt, DR; Burrough, ER; Hoang, H.; Matahari, D.; Bower, LP; Bhandari, M.; Pengukur, PC; Stevenson, GW; et al. Pencirian Virus Cirit-birit Epidemik Porcine Mengasingkan Jangkitan AS/Iowa/18984/2013 dalam 1-Anak Babi Kehilangan Kolostrum Berusia Sehari. Doktor haiwan. Pathol. 2016, 53, 44–52. [CrossRef]

24. Mainau, E.; Manteca, X. Sakit dan ketidakselesaan yang disebabkan oleh bersalin pada lembu dan induk. Appl. Anim. perangai. Sci. 2011, 135, 241–251. [CrossRef]

25. Erb, HN Kebarangkalian sebelumnya (tekaan terbaik praujian) mempengaruhi nilai ramalan ujian diagnostik. Doktor haiwan. Clin. Pathol. 2011, 40, 154–158. [CrossRef] [PubMed]

26. Tenny, S.; Hoffman, MR Prevalence. Dalam StatPearls; StatPearls Publishing: Treasure Island, FL, USA, 2022. 27. Langel, SN; Paim, FC; Alhamo, MA; Buckley, A.; Van Geelen, A.; Lager, KM; Vlasova, AN; Saif, LJ Peringkat Kehamilan di Jangkitan Virus Cirit-birit Wabak Porcine Babi Hamil Kesan Kekebalan Ibu dan Perlindungan Imun Laktogenik Anak Babi Penyusuan Neonatal. Depan. Immunol. 2019, 10, 727. [CrossRef] [PubMed]