FOXO Mengawal Ekspresi Peptida Antimikrob dan Menggalakkan Fagositosis Hemosit dalam Kekebalan Antibakteria Udang
Aug 31, 2023
Abstrak
Invertebrata bergantung pada imuniti semula jadi, termasuk imuniti humoral dan selular, untuk menentang jangkitan patogen. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa faktor transkripsi kotak forkhead O (FOXO) mengambil bahagian dalam tindak balas imun mukosa mamalia dan peraturan imun humoral usus invertebrata. Walau bagaimanapun, sama ada FOXO terlibat dalam peraturan imuniti sistemik dan selular dalam invertebrata masih tidak diketahui. Dalam kajian ini, kami mengenal pasti FOXO daripada udang (Marsupenaeus japonicus) dan mendapati ia dinyatakan pada tahap yang agak basal dalam udang biasa, tetapi dikawal dengan ketara dalam udang yang dicabar oleh Vibrio anguillarum. FOXO memainkan peranan penting dalam mengekalkan homeostasis hemolymph dan mikrobiota usus dengan mempromosikan ekspresi Relish, faktor transkripsi laluan kekurangan imun (IMD) untuk ekspresi peptida antimikrobial (AMP) dalam udang. Kami juga mendapati bahawa jangkitan patogen mengaktifkan FOXO dan mendorong translokasi nuklearnya dengan mengurangkan aktiviti AKT serine / threonine kinase. Dalam nukleus, FOXO yang diaktifkan secara langsung mengawal ekspresi gen Amp dan Relish sasarannya terhadap jangkitan bakteria. Tambahan pula, FOXO dikenal pasti terlibat dalam imuniti selular dengan menggalakkan fagositosis hemosit melalui mengawal selia ekspresi reseptor penghapus reseptor fagositotik C (Src), dan dua GTPase kecil, Rab5 dan Rab7, yang berkaitan dengan pemerdagangan fagosom kepada lisosom. dalam sitoplasma. Secara keseluruhan, keputusan kami menunjukkan bahawa FOXO memberikan kesannya terhadap homeostasis hemolymph dan mikrobiota enterik dengan mengaktifkan laluan IMD dalam udang biasa, dan secara langsung atau tidak langsung mempromosikan ekspresi AMP dan meningkatkan fagositosis hemosit terhadap patogen dalam udang yang dijangkiti bakteria. Kajian ini mendedahkan fungsi FOXO yang berbeza dalam imuniti antibakteria mukosa (tempatan) dan sistemik invertebrata.
faedah suplemen cistanche-bagaimana untuk menguatkan sistem imun
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity
【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
pengenalan
Faktor transkripsi kotak forkhead O protein keluarga (FOXOs) terlibat dalam pelbagai proses biologi kritikal organisma, termasuk peraturan kitaran sel, pembaikan DNA yang rosak, imuniti anti-kanser, dan peraturan jangka hayat [1,2]. Mamalia mempunyai empat protein FOXO yang berbeza (FOXO1, FOXO3, FOXO4, dan FOXO6); walau bagaimanapun, invertebrata hanya mempunyai satu FOXO, yang juga dikenali sebagai Daf-16 dalam Caenorhabditis elegans [3]. Aktiviti transkrip FOXO dikawal oleh beberapa jenis pengubahsuaian pasca translasi, seperti fosforilasi, asetilasi, metilasi, dan ubiquitination [4]. Pengubahsuaian ini menjejaskan translokasi nuklear FOXO atau keluar dari nukleus, dan interaksinya dengan penindas bersama dan pengaktif bersama, yang boleh menggalakkan atau mengurangkan aktiviti FOXO dan mengantara fungsi biologinya yang berbeza [5,6]. Selepas pengaktifan, FOXO mengambil bahagian dalam banyak fungsi fisiologi dengan mengawal selia transkripsi pelbagai gen sasaran [7]. FOXO diaktifkan oleh pelbagai rangsangan ekstraselular, termasuk faktor pertumbuhan, sitokin, dan hormon [8]. Isyarat pertumbuhan, seperti insulin atau insulin-like growth factor 1 (IGF-1), berinteraksi dengan reseptor laluan insulin dan mengaktifkan isyarat phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), yang membawa kepada fosforilasi FOXO oleh serine/treonine kinase, protein kinase B (AKT) [9]. FOXO berfosforilasi berpindah dari nukleus ke sitosol, atau menghalang pemindahannya daripada sitosol ke nukleus, di mana ia menjadi ubiquitinated, membawa kepada degradasinya oleh proteasome [10]. Sebaliknya, jika tiada isyarat pertumbuhan luaran, laluan isyarat PI3K-AKT tidak aktif, dan FOXO yang tidak terfosforilasi dipindahkan ke dalam nukleus untuk mempromosikan transkripsi gen sasaran [11]. FOXO juga mengambil bahagian dalam tindak balas imun semula jadi anti-bakteria dan anti-virus invertebrata [12,13]. Pengaktifan kronik FOXO dalam usus penuaan Drosophila menindas ekspresi protein pengiktirafan peptidoglycan SC2 (pengatur negatif laluan kekurangan imun (IMD)) dan memecahkan homeostasis imun usus [14]. FOXO secara langsung mengawal gen peptida antimikrobial (AMP) dalam tisu epitelium Drosophila yang tidak dijangkiti sebagai tindak balas kepada tekanan kebuluran, yang bebas daripada laluan imuniti semula jadi yang responsif patogen [15]. Walau bagaimanapun, jangkitan patogen juga boleh mendorong enterosit FOXO untuk memasuki nukleus dari sitoplasma terus dalam usus Drosophila [12]. Peraturan AMP yang bergantung kepada FOXO juga berlaku dalam tisu epitelium mamalia, menunjukkan bahawa ini dipelihara secara evolusi dalam haiwan [16]. Beberapa kajian menunjukkan bahawa FOXOs diaktifkan oleh patogen atau rangsangan sitokin dalam tindak balas imun mukosa [17]. Translokasi mereka ke nukleus dan mengikat kepada promoter gen sasaran mereka dirangsang oleh laluan kinase protein diaktifkan mitogen (MAP) dan dihalang oleh laluan PI3K / AKT. Gen sasaran FOXO termasuk molekul isyarat pro-radang, molekul lekatan, dan reseptor kemokin [17]. Sama ada FOXO terlibat dalam tindak balas imun sistemik terhadap patogen masih tidak jelas. Menggalakkan ekspresi AMP terhadap patogen adalah mekanisme penting imuniti semula jadi humoral dalam invertebrata [18]. Dalam imuniti semula jadi Drosophila, laluan Tol dan IMD terlibat dalam pengawalan ekspresi AMP, dan AMP memainkan peranan penting dalam penghapusan patogen yang menyerang [19-21]. Sama seperti imuniti serangga, laluan Toll, IMD, dan Janus kinase (JAK)/transduser isyarat dan pengaktif transkripsi (STAT) terlibat dalam peraturan ekspresi AMP dalam krustasea [22,23]. Sama ada FOXO boleh mengawal selia ekspresi AMP yang bebas daripada laluan Tol, IMD dan JAK/STAT terhadap jangkitan patogen dalam krustasea memerlukan penjelasan. Selain imuniti humoral, invertebrata juga bergantung pada imuniti selular untuk melaksanakan fungsi imuniti semula jadi terhadap jangkitan patogen. Fagositosis oleh hemosit adalah salah satu mekanisme penting untuk imuniti selular terhadap jangkitan patogen [24]. Kajian terdahulu mendapati bahawa FOXO1-autophagy pengantara diperlukan untuk pembangunan sel pembunuh semulajadi (NK) [25]. Selain itu, FOXO terlibat dalam menggalakkan fagositosis bakteria oleh neutrofil [26]. Walaupun tiada sel imun khusus dalam krustasea, seperti sel NK atau neutrofil, hemosit udang boleh menggunakan imuniti semula jadi sistemik terhadap jangkitan bakteria patogen melalui fagositosis [27]. Walau bagaimanapun, sama ada FOXO mengambil bahagian dalam fagositosis patogen hemosit dalam udang tidak jelas. Akuakultur udang adalah salah satu industri yang paling pesat berkembang di dunia untuk menghasilkan protein haiwan dan telah memberikan sumbangan besar untuk memenuhi permintaan yang meningkat di seluruh dunia untuk protein haiwan. Pada masa ini, pengeluaran global udang adalah kira-kira 4.88 juta tan dengan nilai sekitar 39 bilion USD [28]. Walau bagaimanapun, memelihara sejumlah besar haiwan bersama-sama mengakibatkan tekanan haiwan yang besar, yang memudahkan patogen, termasuk bakteria dan virus, pendaraban dan penyakit klinikal, yang mengakibatkan kerugian ekonomi yang besar kepada industri [29]. Kajian tentang mekanisme imun udang boleh menyediakan strategi baru untuk pencegahan dan kawalan penyakit [30]. Dalam kajian ini, kami mengenal pasti FOXO dalam udang kuruma (Marsupenaeus japonicus). Selepas ekspresi Foxo knockdown, mengikuti cabaran Vibrio anguillarum, kami mendapati bahawa keupayaan pembersihan bakteria dan kadar kemandirian udang menurun dengan ketara. Kajian lanjut menunjukkan bahawa FOXO mempromosikan ekspresi AMP secara langsung atau tidak langsung, dan meningkatkan fagositosis bakteria dalam udang. Mekanisme kemungkinan kesan FOXO terhadap jangkitan patogen dalam udang telah dianalisis.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Keputusan
FOXO dinyatakan pada tahap basal dalam udang yang tidak dicabar dan dikawal semula dalam udang yang dicabar dengan V. anguillarum
Daripada penjujukan transkrip hemosit M. japonicus, kami memperoleh jujukan cDNA penuh Foxo (nombor penyertaan GenBank: MW080526). Perbandingan domain menunjukkan bahawa protein FOXO yang diramalkan mempunyai domain Forkhead (FH), yang serupa dengan Homosapiens FOXOs termasuk FOXO1, FOXO3, FOXO4, dan FOXO6, dan menanggung fosforilasi AKT yang serupa (S1A Fig). Hasil analisis filogenetik menunjukkan bahawa FOXO dibahagikan kepada dua kelompok termasuk FOXO vertebrata dan invertebrata, dan FOXO udang dikelompokkan dalam dahan invertebrata dalam pokok filogenetik (S1B Fig). Sama seperti FOXO manusia [31], udang FOXO mempunyai tapak pengubahsuaian fosforilasi terkawal ekstraselular kinase (ERK) dan tapak pengubahsuaian asetilasi CREB Binding Protein (CBP), tetapi tidak mempunyai tapak pengubahsuaian deasetilasi sir tuin 1 (SIRT1) dan terminal c-JUN N. tapak pengubahsuaian fosforilasi kinase (JNK) (S2 Rajah). Antibodi poliklonal yang mengenali udang FOXO telah disediakan menggunakan domain FH rekombinan FOXO yang dinyatakan dalam Escherichia coli (Rajah 1A). Analisis pengedaran tisu FOXO pada tahap mRNA dan protein mendedahkan bahawa ia telah dinyatakan dalam semua tisu yang diuji (Rajah 1B). Jangka masa ekspresi FOXO dalam hemosit dan usus udang yang dicabar oleh V. anguillarum dianalisis menggunakan qPCR dan western blotting. Keputusan menunjukkan bahawa FOXO telah dikawal selia dalam hemosit dan usus pada tahap mRNA (Rajah 1C dan 1D) dan pada tahap protein (Rajah 1E dan 1F). Keputusan ini mencadangkan bahawa FOXO terlibat dalam tindak balas terhadap jangkitan V. anguillarum dan mendorong kami untuk meneroka fungsi FOXO dalam imuniti udang.
FOXO mengambil bahagian dalam peraturan homeostasis hemolymph dan mikroflora usus dalam udang yang sihat
Untuk meneroka fungsi FOXO dalam hemolymph dan homeostasis mikroflora usus dalam udang, gangguan RNA dilakukan dan beban bakteria dianalisis. Keputusan menunjukkan bahawa ekspresi Foxo menurun dengan ketara dalam udang Foxo-RNAi (Rajah 2A dan 2B). Kesan luar sasaran Foxo RNAi juga dianalisis dengan mengesan ekspresi gen keluarga Fox lain (termasuk Foxk2 dan Foxn3). Keputusan menunjukkan bahawa kejatuhan Foxo tidak mengurangkan tahap ekspresi Foxk2 atau Foxn3 (S3A–S3C Fig). Dengan menggunakan western blotting dan ujian immunocytochemistry pendarfluor, kami selanjutnya memerhatikan taburan subselular FOXO dalam usus dan hemosit udang yang dicabar oleh bakteria selepas pembungkaman Foxo. Keputusan menunjukkan bahawa berbanding dengan kumpulan dsGfp, tahap FOXO dalam nukleus menurun dengan ketara dalam udang Foxo-RNAi, walaupun jika udang telah dijangkiti oleh V. anguillarum (S3D–S4E' Figs). Semua keputusan di atas mencadangkan bahawa ujian Foxo RNAi kami secara khusus boleh menyenyapkan Foxo dalam hemosit dan usus (termasuk dalam sitoplasma dan nukleus). Seterusnya, kami menganalisis beban bakteria dalam hemolimfa dan usus selepas menumbangkan Foxo dalam udang dalam keadaan biasa (tanpa cabaran bakteria). Keputusan menunjukkan bahawa bilangan bakteria dalam hemolymph dan usus meningkat dengan ketara selepas ekspresi Foxo berjaya ditumbangkan (Rajah 2C dan 2D). Kami selanjutnya menganalisis kadar survival udang Foxo-RNAi tanpa cabaran bakteria, dan keputusan menunjukkan bahawa kadar survival udang Foxo-knockdown menurun dengan ketara berbanding dengan kawalan (Rajah 2E). Untuk mengesahkan lagi keputusan ini, kami menganalisis kadar survival udang Foxo-RNAi yang dirawat dengan antibiotik dan keputusan menunjukkan bahawa berbanding dengan kumpulan dsGfp, kadar survival udang bebas kuman tidak berkurangan dengan ketara (Rajah 2F). Semua keputusan mencadangkan bahawa FOXO memainkan peranan dalam homeostasis mikrobiota in vivo (termasuk hemolymph dan mikrobiota enterik) dalam udang dalam keadaan normal.
faedah tambahan cistanche-meningkatkan imuniti
FOXO mengambil bahagian dalam pengawalan hemolymph dan homeostasis mikroflora usus dengan mempromosikan ekspresi Relish dan Amp dalam udang yang sihat
Kajian terdahulu menunjukkan bahawa udang yang sihat mengandungi bilangan bakteria yang rendah tetapi stabil dalam hemolimfa yang beredar, dan jumlah bakteria yang tinggi walaupun tetap dalam saluran gastrousus, dan pengesan imun, seperti peptida antimikrob (AMP) yang dikawal oleh faktor nuklear kappa B (NF). -κB) dan spesies oksigen reaktif (ROS) yang dikawal oleh laluan dwi oksidase (DUOX), memainkan peranan penting dalam homeostasis hemolymph dan mikrobiota usus [32-34]. Untuk meneroka mekanisme penglibatan FOXO dalam pengawalan hemolymph dan homeostasis mikroflora usus dalam keadaan normal, kami mula-mula mengesan pengedaran subselular FOXO dalam hemosit dan usus dalam keadaan normal. Keputusan menunjukkan isyarat lemah FOXO dalam nukleus hemosit udang dan sel usus dalam keadaan normal (Rajah 3A dan 3B), menunjukkan bahawa sedikit FOXO telah diaktifkan oleh mikrobiota in vivo dalam udang dalam keadaan normal. Ekspresi AMP dikawal oleh laluan IMD dalam usus Drosophila [35]. Oleh itu, kami mengandaikan bahawa faktor transkripsi Relish mungkin merupakan gen sasaran FOXO. Kami mengesan ekspresi mRNA Relish, faktor transkripsi laluan IMD, dalam hemosit dan usus udang selepas kejatuhan Foxo. Keputusan menunjukkan bahawa ekspresi Relish menurun dengan ketara dalam udang Foxo-knockdown (Rajah 3C dan 3D), dan keputusan yang sama diperoleh pada tahap protein (Rajah 3E dan 3E '). Hasilnya mencadangkan bahawa FOXO boleh mempromosikan ekspresi Relish dan mengaktifkan laluan IMD. Untuk mengesahkan bahawa FOXO mengambil bahagian dalam limfa hemo dan homeostasis saluran gastrousus melalui isyarat IMD, udang bebas kuman diperolehi (Rajah 3F) dan pengaktifan RELISH dan ekspresi AMP dikesan. Berbanding dengan kawalan, jumlah FOXO dan RELISH dalam nukleus sel usus dan hemosit menurun dengan ketara (Rajah 3G dan 3H). Sementara itu, ekspresi AMP, termasuk Crustins (CrusI-2 hingga 5) dan faktor Anti-lipopolysaccharide (Alf A1, B1, C1, D1 dan E1), mungkin dikawal oleh FOXO dan/atau RELISH telah disaring dalam kuman. -udang bebas, dan keputusan menunjukkan bahawa ekspresi CrusI-3, Alf-B1 dan Alf-C1 menurun dengan ketara dalam sit hemo dan usus udang (Rajah 3I dan 3J). Memandangkan ekspresi Alf-B1 dan Alf C1 dikawal oleh laluan IMD [36], keputusan ini mencadangkan bahawa FOXO mengambil bahagian dalam pengawalan homeostasis hemolymph dan saluran gastrousus di bawah keadaan normal melalui laluan IMD untuk mempromosikan ekspresi AMP.
Rajah 1. FOXO telah dikawal selia dalam udang yang dicabar oleh V. anguillarum. (A) Ekspresi rekombinan domain FH FOXO dalam E. coli dan western blotting untuk mengesan FOXO menggunakan antibodi poliklonal terhadap FOXO yang disediakan dalam arnab. Lorong 1, jumlah protein E. coli dengan Foxo-pGEX4T-1. Lorong 2, jumlah protein bakteria selepas induksi IPTG. Lorong 3, FOXO rekombinan yang telah dimurnikan. Lorong 4, FOXO dalam usus udang yang tidak dirawat dikesan menggunakan western blotting. M, Penanda jisim molekul protein. ( B ) Pengagihan tisu Foxo pada tahap mRNA (panel atas) dan protein (panel bawah) masing-masing dikesan oleh RT-PCR dan western blotting. ACTB ialah singkatan daripada -actin. (C, D) Corak ekspresi mRNA Foxo dalam hemosit (C) dan usus (D) dianalisis oleh qPCR menggunakan ungkapan min geometri bagi -actin dan Ef-1 sebagai gen kawalan endogen. (E, F) Corak ekspresi protein FOXO dalam hemosit (E) dan usus (F) telah dikesan oleh western blotting. Keputusan analisis statistik tiga ulangan ditunjukkan di panel bawah. Jalur pada western blot telah didigitalkan menggunakan perisian ImageJ dengan mengimbas jalur dari tiga ulangan bebas. Tahap ekspresi relatif FOXO/ -aktin dinyatakan sebagai min ± SD, dan nilai udang kawalan ditetapkan sebagai satu. Bar ralat dalam rajah menunjukkan SD (tiga ulangan).
FOXO diaktifkan dalam udang oleh cabaran V. anguillarum dan mengambil bahagian dalam pembersihan patogen hemolymph dan usus
Dilaporkan bahawa FOXO boleh diaktifkan oleh rangsangan bakteria atau sitokin dan dipindahkan ke nukleus untuk mengawal ekspresi gen sasaran tertentu dalam mamalia [17]. Untuk mengesan sama ada FOXO diaktifkan dalam udang yang dicabar oleh bakteria, taburan subselular FOXO dalam usus udang dianalisis menggunakan western blotting. Keputusan menunjukkan bahawa jumlah FOXO dalam sitoplasma sel usus menurun secara beransur-ansur dari 2 hingga 4 jam selepas cabaran anguillarum V. (Rajah 4A). Sebaliknya, jumlah FOXO dalam nukleus sel usus meningkat dengan ketara selepas jangkitan V. anguillarum (Rajah 4B). Untuk menganalisis peranan FOXO dalam imuniti sistemik, ujian imunositokimia pendarfluor digunakan untuk memerhati translokasi nuklear FOXO dalam hemosit udang 2 jam selepas V. rangsangan larum tahunan. Kami mendapati bahawa pemindahan FOXO yang disebabkan oleh cabaran bakteria ke dalam nukleus meningkat dengan ketara tetapi tidak ada perubahan yang jelas dalam udang yang dicabar PBS (Rajah 4C dan 4C '). Untuk meneroka sama ada FOXO yang ditranslokasi nuklear terlibat dalam pembersihan patogen, kami menganalisis beban bakteria dalam hemolimfa dan usus dalam udang Foxo-knockdown pada 6 jam selepas cabaran bakteria. Kami mendapati bahawa selepas penumpasan Foxo, beban bakteria dalam hemolymph dan usus meningkat dengan ketara berbanding dengan kumpulan kawalan (Rajah 4D). Selain itu, kadar kemandirian udang Foxo-knockdown yang dijangkiti V. anguillarum menurun dengan ketara berbanding dengan kawalan (Rajah 4E). Keputusan ini menunjukkan bahawa FOXO telah diaktifkan dalam sel enterik dan hemosit, dan mencadangkan bahawa FOXO mengambil bahagian dalam tindak balas imun tempatan dan sistemik terhadap jangkitan bakteria.
Rajah 2. FOXO mengambil bahagian dalam tindak balas imun antibakteria usus (tempatan) dan sistemik. (A, B) Kecekapan Foxo-RNAi dalam hemosit (A) dan usus (B) udang, seperti yang ditentukan menggunakan qPCR (A) dan western blotting (B). Analisis tarikh qPCR menggunakan ungkapan min geometri bagi -actin dan Ef-1 sebagai gen kawalan endogen. Bar ralat menunjukkan SD. (C) Pengesanan bakteria hemolymph udang Foxo-knockdown oleh kultur LB pepejal (tiga ulangan); Suntikan dsGfp digunakan sebagai kawalan. Nisbah pencairan ialah 1:10. (D). Bilangan bakteria dalam hemolymph dan usus dalam Foxo knockdown udang dan dsGfp-suntikan udang tanpa cabaran bakteria. (E). Kadar kemandirian udang Foxo-RNAi tanpa cabaran bakteria. Suntikan dsGfp digunakan sebagai kawalan. (F). Kadar kemandirian udang Foxo-RNAi yang dirawat dengan antibiotik. Suntikan dsGfp digunakan sebagai kawalan. Normal: udang jenis liar tidak dirawat dengan antibiotik.
Rajah 3. Sejumlah asas FOXO bertukar ke dalam nukleus hemosit dan sel usus menggalakkan ekspresi Relish dan seterusnya mengaktifkan laluan IMD untuk mengawal hemolimfa dan homeostasis mikrobiota usus dalam keadaan normal. (A) Imunositokimia digunakan untuk mengesan taburan subselular FOXO dalam hemosit udang biasa. Bar skala=20 μm. Cy: Sitoplasma; Nu: Nukleus. (B) Western blotting digunakan untuk mengesan taburan subselular FOXO dalam sel usus daripada udang biasa dan udang yang dijangkiti V. anguillarum. (C) Ekspresi Relish pada tahap mRNA telah dikesan dalam hemosit udang selepas Foxo ditumbangkan oleh qPCR menggunakan ungkapan min geometri -actin dan Ef-1 sebagai gen kawalan endogen. (D) Ekspresi Relish pada tahap mRNA dalam usus udang selepas ketukan Foxo dikesan oleh qPCR menggunakan ungkapan min geometri -actin dan Ef-1 sebagai gen kawalan endogen. (E) Tahap RELISH dikesan menggunakan western blotting dalam udang selepas ketukan Foxo. (E') Tiga replika panel E telah didigitalkan menggunakan perisian ImageJ. (F) Beban bakteria hemolymph dan usus dalam udang 24 jam selepas rawatan antibiotik. (G) FOXO dalam nukleus dikesan menggunakan western blotting dalam hemosit dan usus udang 24 jam selepas rawatan dengan antibiotik. (H) RELISH dalam nukleus dikesan menggunakan western blotting dalam hemosit dan usus udang pada 24 jam selepas rawatan dengan antibiotik. (I, J) Ekspresi Amps dalam hemosit (I) dan usus (J) udang bebas kuman ditentukan oleh qPCR menggunakan -actin dan Ef-1 sebagai gen rujukan dalaman. Udang biasa (suntikan H2O) digunakan sebagai kawalan.
Kajian terdahulu menunjukkan bahawa aktiviti transkrip FOXO dikawal oleh pengubahsuaian fosforilasi dan AKT serine / threonine kinase mengawal aktiviti faktor transkripsi Forkhead dengan memfosforilasi mereka dan menghalang translokasi yang tidak jelas [9,37]. Untuk menyiasat sama ada peningkatan FOXO dalam nukleus selepas jangkitan bakteria patogen dipengaruhi oleh AKT, kami mula-mula mengesan kandungan FOXO dalam sitoplasma dan nukleus dengan pembongkaran barat selepas ketukan Akt udang. Keputusan menunjukkan bahawa jumlah FOXO dalam nukleus hemosit dan sel usus meningkat dengan ketara selepas ketukan ekspresi Akt (Rajah 5A dan 5B) dalam udang 2 jam selepas jangkitan dengan V. anguillarum (Rajah 5C dan 5C'). Untuk mengesahkan keputusan eksperimen, kami juga menggunakan ujian imunositokimia untuk memerhatikan taburan subselular FOXO dalam hemosit udang selepas ketukan Akt. Keputusan menunjukkan bahawa FOXO telah meningkat dengan ketara dalam nukleus hemosit apabila Akt telah mengetuk 2 jam selepas jangkitan dengan V. anguillarum (Rajah 5D dan 5D'). Untuk meneroka sama ada jangkitan patogen menjejaskan aktiviti AKT, kami mengesan perubahan fosforilasi AKT selepas jangkitan patogen menggunakan antibodi p-AKT (Ser473) manusia (tapak fosforilasi AKT udang ialah Ser486) dan mendapati tahap AKT terfosforilasi menurun dengan ketara dalam hemosit dan usus udang selepas 30 minit jangkitan V. anguillarum (Rajah 5E dan 5F). Keputusan ini mencadangkan bahawa jangkitan patogen boleh mengurangkan tahap AKT terfosforilasi, yang menghalang aktiviti enzim dan mengurangkan keupayaan AKT untuk memfosforilasi FOXO. FOXO yang tidak berfosforilasi memasuki nukleus dan mendorong ekspresi gen sasarannya. angka menunjukkan SD.
ekstrak cistanche
Jangkitan patogen mengurangkan aktiviti AKT dan mendorong pemindahan nuklear FOXO
FOXO menggunakan pertahanan imun terhadap bakteria penceroboh dengan mengawal ekspresi peptida antimikrobial dalam udang yang dijangkiti bakteria
Untuk meneroka mekanisme yang FOXO mempengaruhi tindak balas terhadap jangkitan bakteria dalam udang, kami mula-mula mengenal pasti gen pengesan imun yang dikawal oleh FOXO. Selepas berjaya menumbangkan Foxo dalam hemosit dan usus udang dengan atau tanpa cabaran V. anguillarum, tahap ekspresi CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 dan Alf-E1 menurun dengan ketara dalam udang yang disenyapkan berbanding dengan kumpulan kawalan (Rajah 6A dan 6B). Untuk mengesahkan keputusan selanjutnya, kami turut mengesan ekspresi empat AMP selepas Akt ditumbangkan. Keputusan menunjukkan bahawa ekspresi empat AMP meningkat dengan ketara 6 jam selepas jangkitan V. anguil larum berbanding dengan dalam kumpulan kawalan (Rajah 6C dan 6D). Berbanding dengan AMP terkawal (termasuk Alf-B1, dan Alf-C1) dalam keadaan normal (Rajah 3I dan 3J), gen tambahan AMP (CrusI-3, Alf-E1) turut dikawal dalam udang yang dijangkiti V. anguillarum (Rajah 6A dan 6B). Kajian terdahulu kami menunjukkan bahawa RELISH mempromosikan ekspresi Alf-B1 dan Alf-C1 dalam udang [36]. Keputusan ini menunjukkan bahawa FOXO mungkin mengawal secara langsung ungkapan AMP, seperti CrusI-3 dan Alf-E1, bebas daripada laluan isyarat IMD. Untuk mengesahkan hipotesis, ujian ChIP dilakukan untuk mengesan sama ada FOXO boleh mengikat kepada promoter Alf-E1. Urutan promoter Alf-E1 diperolehi (S4 Fig) dan tapak pengikatan FOXO telah diramalkan (Rajah 6E). Keputusan ChIP menunjukkan bahawa FOXO boleh mengikat kepada promoter Alf-E1 (Rajah 6F). Keputusan ini mencadangkan bahawa FOXO juga mengambil bahagian dalam imuniti antibakteria dengan mengawal secara langsung ekspresi AMP dalam udang.
Rajah 4. FOXO ditranslokasikan ke dalam nukleus dalam udang yang dicabar oleh V. anguillarum. (A, B) Corak pengedaran FOXO dalam sitoplasma (A) dan nukleus (B) sel usus udang yang dicabar oleh bakteria, seperti yang dianalisis menggunakan western blotting (panel bawah A dan B). Jalur blotting barat telah didigitalkan menggunakan perisian ImageJ dengan mengimbas jalur dari tiga ulangan. Tahap ekspresi relatif FOXO/ -actin atau FOXO/Histone 3 dinyatakan sebagai min ± SD, dan nilai udang kawalan ditetapkan sebagai satu. (C) Translokasi nuklear FOXO dalam hemosit udang 2 jam selepas V. cabaran anguillarum telah dikesan menggunakan ujian immunocytochemical pendarfluor. Suntikan PBS digunakan sebagai kawalan. Bar skala=20 μm. (C') Analisis statistik panel C Kolokalisasi nukleus bernoda FOXO dan DAPI dalam hemosit telah dianalisis oleh perisian WCIF ImageJ. (D) Nombor bakteria dalam hemolymph dan usus udang Foxo-knockdown diikuti suntikan V. anguillarum; Suntikan dsGfp dalam udang selepas suntikan bakteria digunakan sebagai kawalan. (E) Kadar kemandirian udang Foxo-RNAi yang dijangkiti oleh V. anguillarum. Suntikan dsGfp digunakan sebagai kawalan.
FOXO menggalakkan fagositosis hemosit terhadap bakteria dengan mempromosikan ekspresi SRC
Kajian terdahulu telah melaporkan bahawa FOXO berinteraksi secara langsung dengan kawasan promoter CXCR2 dan CD11b untuk mengawal selia fagositosis neutrofil dalam mamalia [26]. Untuk menguji sama ada FOXO dikaitkan dengan fagositosis hemocyte dalam imuniti antibakteria udang, kami memeriksa kadar fagositik selepas gangguan dengan Foxo menggunakan kaedah yang berbeza. Selepas ketukan Foxo, kadar fagosit dan indeks fagositik kumpulan Foxo-knockdown adalah jauh lebih rendah daripada kumpulan kawalan (dsGfp) (Rajah 7A dan 7A'). Kami juga menggunakan sitometri aliran untuk mengukur kadar fagositik hemosit selepas pembungkaman Foxo. Keputusan menunjukkan bahawa kadar sitosis fag kumpulan Foxo-RNAi juga menurun dengan ketara berbanding dengan kumpulan dsGfp (Rajah 7B dan 7B '). Untuk mengesahkan lagi keputusan ini, kami juga mengkaji kadar fagositik selepas ketukan Akt. Keputusan menunjukkan bahawa berbanding dengan kumpulan kawalan, kadar fagosit dan indeks fagosit meningkat dengan ketara (Rajah 7C dan 7C '). Keputusan ini mencadangkan bahawa FOXO menggalakkan fagositosis hemosit dalam udang. Untuk meneroka bagaimana FOXO meningkatkan fagositosis hemosit dalam udang, kami mengesan ekspresi gen yang dilaporkan sebelum ini yang terlibat dalam fagositosis udang. Scavenger receptor kelas B (SRB) dan kelas C (SRC) dilaporkan terlibat dalam fagositosis hemosit [38,39]. Kami mendapati bahawa tahap ekspresi mRNA Src, bukannya Srb, menurun dengan ketara selepas membungkam Foxo dalam hemosit dan usus (Rajah 7D dan 7E), manakala ungkapan Src meningkat dengan ketara selepas ketukan Akt dalam udang (Rajah 7F). Keputusan yang sama diperoleh pada tahap protein (Rajah 7G dan 7G '). Keputusan ini mencadangkan bahawa FOXO menggalakkan fagositosis hemosit patogen dalam udang dengan mempromosikan ekspresi SRC.
FOXO menggalakkan ekspresi RAB5 dan RAB7 semasa fagositosis dalam udang
Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa GTPases kecil, RAB5 dan RAB7, adalah pengawal selia utama pengangkutan vesikel yang baru diendositosis ke endosom awal dan lewat [40]. RAB5 adalah pengawal selia utama peristiwa gabungan awal dan merupakan penanda endosom awal [41,42]. RAB7 diperlukan untuk gabungan fagosom-lisosom lewat dan merupakan penanda endosom lewat [43]. Untuk meneroka sama ada RAB5 dan RAB7 terlibat dalam pembersihan patogen dalam udang, kami mula-mula menganalisis corak ekspresi Rab5 dan Rab7 dan mendapati bahawa kedua-dua GTPase kecil telah dikawal selia dalam udang yang dicabar dengan bakteria (S5A-S5D Fig). Kami selanjutnya menganalisis kadar kemandirian udang Rab5-RNAi dan Rab7-RNAi selepas cabaran bakteria, dan keputusan menunjukkan bahawa kadar kemandirian udang rab5 dan Rab7 menurun dengan ketara berbanding kawalan ( S5E dan S5F Rajah). Keputusan ini mencadangkan bahawa RAB5 dan RAB7 memainkan fungsi penting dalam penentangan terhadap patogen bakteria. Untuk meneroka sama ada RAB5 dan RAB7 terlibat dalam fagositosis pengantara FOXO, kami memeriksa tahap ekspresi mRNA Rab5 dan Rab7 selepas gangguan dengan ekspresi Foxo dalam udang. Keputusan menunjukkan bahawa tahap ekspresi Rab5 dan Rab7 menurun dengan ketara dalam hemosit dan usus (Rajah 8A dan S6A). manakala ungkapan Rab5 dan Rab7 meningkat dengan ketara selepas ketukan Akt dalam udang (Rajah 8B). Untuk mengesahkan lagi keputusan di atas, paras protein RAB5 dan RAB7 dalam udang knockdown Foxo atau Akt turut dikesan. Berbanding dengan kumpulan suntikan dsGfp, tahap RAB5 dan RAB7 juga menurun dengan ketara dalam hemosit dan usus dalam udang Foxo-knockdown tetapi meningkat dengan ketara dalam udang Akt-knockdown pada 2 jam selepas rangsangan oleh V. anguillarum (Rajah 8C–8D'; S6B dan S6B'). Keputusan ini mencadangkan bahawa RAB5 dan RAB7 mengambil bahagian dalam sitosis fag pengantara FOXO hemosit dalam udang. Kami selanjutnya mengesan bahawa RAB5 dan RAB7 telah dilokalkan bersama dengan V. anguillarum dalam hemosit udang (Rajah 9). Diambil bersama, keputusan mencadangkan bahawa RAB5 dan RAB7 terlibat dalam fagositosis pengantara FOXO dalam udang.
Rajah 5. Jangkitan patogen mengurangkan aktiviti AKT, yang menggalakkan translokasi nuklear FOXO dalam hemosit dan sel enterik udang. (A, B) Kecekapan Akt-RNAi dalam hemosit dan usus udang, seperti yang ditentukan oleh qPCR menggunakan ungkapan min geometri bagi -actin dan Ef-1 sebagai gen kawalan endogen (A) dan western blotting (B). (C) Jumlah FOXO dalam sitoplasma dan nukleus usus daripada udang Akt-knockdown dianalisis dengan western blotting. dsGfp digunakan sebagai kawalan. (C') Analisis statistik panel (C). Perisian ImageJ digunakan untuk mendigitalkan jalur dengan mengimbas gambar tiga ulangan. (D) Translokasi nuklear FOXO dalam hemosit udang Akt-knockdown telah dikesan 2 jam selepas cabaran anguillarum V. menggunakan ujian immunocytochemical pendarfluor. dsGfp digunakan sebagai kawalan. Bar skala=20 μm. (D') Analisis statistik bagi (D). Perisian WCIF ImageJ digunakan untuk menganalisis penyetempatan bersama oleh nisbah intensiti pendarfluor nukleus anti-FOXO (hijau) dan DAPI (biru) dalam hemosit selepas menetapkan nilai pendedahan. (E, F) Perubahan kandungan AKT terfosforilasi (p-AKT) dalam hemosit (E) dan usus (F) udang yang dicabar oleh V. anguillarum. Panel bawah adalah angka digital (E) dan (F) berdasarkan jalur western blotting dan analisis statistik, masing-masing.
teh cistanche
Perbincangan
FOXO, sebagai faktor transkripsi yang sangat penting, mengambil bahagian dalam banyak fungsi fisiologi dan metabolik [44,45]. Dalam kajian ini, kami mengenal pasti FOXO daripada udang (M. japonicus) dan mendapati bahawa ia mengambil bahagian dalam pengawalan homeostasis hemolimfa dan mikrobiota enterik dengan mengawal selia ekspresi AMP di bawah keadaan biasa. FOXO boleh diaktifkan oleh jangkitan bakteria pada udang dan dipindahkan ke dalam nukleus, di mana ia mengawal secara langsung dan tidak langsung (melalui laluan IMD) ekspresi AMP. FOXO mengawal selia gen berkaitan fagositosis, seperti SRC dan GTPases kecil, RAB5 dan RAB7, untuk menggalakkan fagositosis hemosit terhadap patogen. Oleh itu, udang FOXO memainkan peranan yang berbeza dalam tindak balas imun sistemik dan tempatan (enterik) terhadap patogen (Rajah 10). Berbanding dengan FOXO manusia, udang FOXO mempunyai urutan asid amino yang agak terpelihara dan tapak fosforilasi AKT; namun, tapak fosforilasi AKT kedua udang FOXO ialah threonine dan bukannya serine. Fosforilasi AKT FOXO mengawal pengangkutan nuklear dan sitoplasma FOXO [9]. Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa AKT berkaitan dengan kawalan kemasukan nuklear FOXO. Selepas jangkitan V. anguillarum, tahap AKT terfosforilasi telah berkurangan dengan ketara, yang menunjukkan bahawa aktiviti AKT telah menurun dalam udang yang dijangkiti laluan-ogen, dengan itu meningkatkan pengekalan nuklear atau translokasi nuklear FOXO, dan seterusnya mendorong ekspresi gen sasaran, seperti Relish dan Amp, untuk menentang jangkitan patogen. Kajian terdahulu telah mendapati bahawa FOXO mengambil bahagian dalam homeostasis mikroflora nal usus Drosophila dengan menindas ekspresi protein pengiktirafan peptidoglycan SC2 (pengawal selia negatif laluan IMD) untuk mengaktifkan laluan untuk ekspresi AMP [14]. RELISH dilaporkan sebagai gen sasaran utama FOXO dalam kawalan toleransi hipoksia dalam Drosophila [46]. Seperti haiwan lain, saluran gastrousus udang mengandungi mikrobiota yang agak tinggi dan berterusan. Bukti yang semakin meningkat juga mendedahkan bahawa hemolymph beberapa invertebrata akuatik yang sihat, termasuk udang juga mempunyai jumlah bakteria yang stabil [47]. Kajian terdahulu kami mendapati bahawa lektin jenis C mengambil bahagian dalam peraturan homeostasis mikrobiota hemolymph dengan mengekalkan ekspresi AMP [34], tetapi kami tidak tahu laluan isyarat apa yang terlibat dalam pengawalan ekspresi AMP. Di sini, keputusan kami mencadangkan bahawa FOXO terlibat dalam pengawalan hemolymph dan homeostasis mikroflora enterik melalui isyarat IMD di bawah keadaan normal. Dalam udang yang tidak dijangkiti, ketukan Foxo mengakibatkan ekspresi Relish berkurangan dengan ketara, dan kadar kemandirian udang menurun dengan ketara, walaupun tanpa jangkitan bakteria. Kami juga menemui sejumlah kecil FOXO dalam nukleus sel udang biasa. Oleh itu, kami berpendapat bahawa FOXO mengambil bahagian dalam peraturan homeostasis hemolymph dan flora enterik dalam keadaan normal dengan mempromosikan ekspresi Relish dan selepas itu meningkatkan ekspresi AMP oleh laluan IMD. Keputusan ini mencadangkan bahawa FOXO mengambil bahagian dalam imuniti tempatan dan sistemik untuk menggalakkan homeostasis mikrobiota hemolimfa dan saluran gastrousus dalam udang. Kekebalan humoral memainkan peranan penting dalam penentangan terhadap jangkitan patogen dalam kadar songsang melalui pengeluaran bateri AMP [21,48]. Tindak balas humoral terdiri daripada sintesis dan rembesan AMP yang boleh diinduksi, yang dilepaskan ke dalam hemolimfa sebagai tindak balas sistem-temik, atau dilepaskan ke permukaan epidermis atau rongga saluran gastrousus sebagai tindak balas tempatan [19]. Ekspresi AMP dikawal terutamanya oleh laluan isyarat Toll/Dif dan IMD/Relish dalam lalat buah [49]. Pada masa ini, beberapa keluarga AMP telah dikenal pasti dalam udang, termasuk kerak, faktor anti-lipopolysaccharide (Alfs), dan penaeidin [50]. Kajian ini menunjukkan bahawa FOXO boleh secara langsung atau tidak langsung (melalui isyarat IMD/Relish) mengawal ekspresi AMP, termasuk CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 dan Alf-E1. Kami berpendapat bahawa pengaktifan rendah FOXO dalam hemosit dan usus udang dalam keadaan biasa boleh mengawal gen sasaran utama Foxo, iaitu, Relish, untuk mengekalkan homeostasis mikrobiota in vivo. Semasa jangkitan, patogen yang menyerang mengaktifkan FOXO, yang kebanyakannya dipindahkan ke dalam nukleus, di mana ia mengawal lebih banyak gen sasaran, termasuk beberapa AMP, seperti Alf-E1 dan CrusI-3, sebagai tambahan kepada Relish. Diambil bersama, FOXO mengambil bahagian dalam pengawalan homeostasis hemolymph dan mikrobiota usus dalam udang yang sihat melalui pengaktifan tahap basal isyarat IMD dalam hemolymph dan saluran gastrousus. Jangkitan patogen mengaktifkan FOXO dengan mengurangkan aktiviti AKT dan menggalakkan ekspresi AMP secara langsung dan tidak langsung dalam imuniti sistemik dan imuniti tempatan (usus). Fagositosis adalah fenomena pengantara reseptor, aktin dan bergantung kepada ATP, yang dicetuskan oleh pengikatan zarah atau patogen kepada reseptor sitomembran tertentu, dan mewakili proses imun yang penting di mana perumah boleh melindungi dirinya daripada patogen [24]. GTPase kecil, seperti RAB5 dan RAB7, terlibat dalam pembentukan semula membran yang berterusan dan trafik vesikel dalam fagositosis. Kajian terdahulu kami melaporkan bahawa reseptor pemulung SRB dan SRC terlibat dalam fagositosis hemosit sebagai reseptor dalam udang [38,39]. Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa selepas kejatuhan Foxo, ekspresi Src menurun dengan ketara, dan kadar fagositosis hemosit menurun dengan ketara, menunjukkan bahawa Src adalah gen sasaran FOXO dan FOXO terlibat dalam fagositosis pengantara SRC bakteria patogen. FOXO juga boleh mempromosikan ekspresi dua GTPase kecil, RAB5 dan RAB7. GTPase kecil ini terlibat dalam pengangkutan berurutan dan merupakan penentu utama, fagosom awal dan akhir [51]. Fagosom berhijrah dari pinggir sel ke kawasan intrasel, dengan RAB5 digantikan oleh RAB7 semasa pengangkutan, dan barang akhir diangkut ke lisosom untuk degradasi [52,53]. Kami juga mendapati bahawa RAB5 dan RAB7 boleh menyetempatkan bersama patogen dalam hemosit, yang menunjukkan bahawa patogen telah difagosit oleh hemosit dalam udang dengan melalui fagosom awal dan lewat sebelum akhirnya terdegradasi dalam lisosom. Oleh itu, FOXO terlibat dalam tindak balas imun selular dengan menggalakkan fagositosis hemosit. Kesimpulannya, keputusan kami menunjukkan bahawa FOXO bukan sahaja mengambil bahagian dalam peraturan homeostasis mikrobiota di bawah keadaan normal tetapi juga dalam pembersihan bakteria patogen dalam udang yang dijangkiti dengan mempromosikan ekspresi AMP dan fagositosis hemosit.
Rajah 6. FOXO melaksanakan peranan antibakterianya dalam udang dengan mengawal selia ekspresi AMP. (A, B) Ekspresi Amps dalam hemosit (A) dan usus (B) udang Foxo-knockdown, seperti yang ditentukan oleh qPCR menggunakan ungkapan min geometri bagi -actin dan Ef-1 sebagai gen kawalan endogen; Suntikan dsGfp dalam udang digunakan sebagai kawalan. Data dianalisis secara statistik menggunakan ujian Mann-Whiteny U. (C, D) Ekspresi Amps dalam hemosit (C) dan usus (D) udang knockdown Akt telah dianalisis oleh qPCR menggunakan ungkapan min geometri -actin dan Ef-1 sebagai gen kawalan endogen; Suntikan dsGfp dalam udang digunakan sebagai kawalan. Perbezaan yang ketara dianalisis menggunakan ANOVA sehala. (E) Gambarajah skematik tapak pengikat FOXO yang diramalkan pada promoter Alf-E1. (F) ChIP dan RT-PCR digunakan untuk mengesan pengikatan FOXO pada jujukan promoter Alf-E1 menggunakan primer (Alf-E1-F dan Alf-E1-R, Jadual 1). RT-PCR juga digunakan untuk menguatkan kawasan pengekodan Alf-E1 dengan primer RT-PCR (Alf-E1-RT-F dan Alf-E1-RT-R. Jadual 1) menggunakan ChIP memperoleh DNA sebagai templat. Antibodi IgG digunakan sebagai kawalan, dan serpihan genomik DNA yang dikuatkan biasa digunakan untuk mengesahkan jalur sasaran.
Rajah 7. FOXO meningkatkan fagositosis hemosit patogen dalam udang dengan menggalakkan ekspresi SRC. (A) Fagositosis hemosit V. anguillarum diperhatikan menggunakan ujian immunocytochemical pendarfluor di bawah mikroskop pendarfluor. V. anguillarum dilabelkan dengan FITC (hijau) dan nukleus sel diwarnai dengan DAPI (biru). Anak panah merah menunjukkan hemosit fagosit. Bar skala=20 μm. (A') Analisis statistik kadar fagositik dan indeks fagositik dalam udang Foxo-knockdown. Kumpulan suntikan dsGfp digunakan sebagai kawalan. Lima ratus hemosit dikira di bawah mikroskop pendarfluor dalam setiap eksperimen. Data dianalisis secara statistik menggunakan ujian-t Pelajar. (B) Fagositosis bakteria oleh hemosit dianalisis menggunakan sitometri aliran. Hemosit berfagositosis yang mengandungi bakteria (R2) diasingkan daripada hemosit tidak berfagositosis (R3) berdasarkan isyarat pendarfluor bakteria berlabel dalam hemosit menggunakan perisian IDEAS Application v6.0. (B') Kadar fagositik hemosit berdasarkan data aliran sitometri. Tiga ribu hemosit dikira untuk setiap analisis dan tiga ulangan telah dijalankan. Kumpulan dsGfp digunakan sebagai kawalan. (C) Hemocyte phagocytosis of V. anguillarum dalam Akt knockdown udang amati di bawah mikroskop pendarfluor. Bar skala=10 μm. (C') Analisis statistik kadar fagosit dan indeks fagosit berdasarkan data dalam panel (C). (D) Tahap ekspresi mRNA Srb dan Src dalam hemosit daripada udang knockdown Foxo dianalisis oleh qPCR menggunakan ungkapan min geometri bagi -actin dan Ef-1 sebagai gen kawalan endogen. Suntikan dsGfp digunakan sebagai kawalan. (E) Ekspresi mRNA Srb dan Src dalam usus udang Foxo-RNAi dianalisis oleh qPCR menggunakan ungkapan min geometri bagi -actin dan Ef-1 sebagai gen kawalan endogen. (F) Ekspresi mRNA Src dalam hemosit udang Akt-RNAi dianalisis oleh qPCR menggunakan ungkapan min geometri bagi -actin dan Ef-1 sebagai gen kawalan endogen. (G) Tahap protein SRC dalam hemosit udang Foxo-RNAi atau Akt-RNAi, seperti yang dianalisis menggunakan western blotting. Suntikan dsGfp digunakan sebagai kawalan. (G') Analisis statistik berdasarkan data tiga replika panel (G).
Bahan dan kaedah
Kenyataan etika
Semua eksperimen haiwan dilakukan dengan mematuhi Arahan Kebangsaan China (GB 14922.2–2011 dan GB 14925–2010). Eksperimen arnab untuk penyediaan antibodi dalam kajian telah dijalankan mengikut protokol yang diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan & Kebajikan Haiwan di Sekolah Sains Hayat Universiti Shandong (SYDWLL-2021-54). Kelulusan mengikut peraturan penggunaan udang dalam kajian kami tidak diperlukan kerana penyelidikan kami menggunakan bilangan terhad udang biasa yang kerap dimakan oleh masyarakat luas.
Haiwan
Udang yang sihat (Marsupenaeus japonicus), seberat kira-kira 6–10 g setiap satu, diperoleh daripada pasaran produk akuatik di Qingdao, wilayah Shandong, China. Sebelum eksperimen, udang dikultur selama sekurang-kurangnya 1 hari dalam sistem kultur udang dengan air laut berudara pada suhu 23–25˚C untuk menyesuaikan diri dengan persekitaran baharu.
Rajah 8. RAB5 dan RAB7 terlibat dalam fagositosis pengantara FOXO bagi hemosit dalam udang. (A, B) qPCR digunakan untuk menganalisis tahap ekspresi mRNA Rab5 dan Rab7 dalam hemosit udang Foxo-knockdown (A) dan Akt-knockdown (B) dengan dan tanpa jangkitan bakteria. qPCR menggunakan ungkapan min geometri bagi -actin dan Ef-1 sebagai gen kawalan endogen. (C) Tahap protein RAB5 dan RAB7 dalam hemosit udang Foxo-knockdown pada 2 jam selepas cabaran anguillarum V. ditentukan menggunakan western blotting. (C') Analisis statistik berdasarkan data tiga replika panel (C). (D) Tahap protein RAB5 dan RAB7 dalam hemosit udang Akt-knockdown pada 2 jam selepas cabaran anguillarum V. ditentukan menggunakan western blotting. (D') Analisis statistik berdasarkan data tiga replika panel (D).
Analisis bioinformatik
Urutan cDNA penuh Foxo diperolehi daripada penjujukan tome transkrip hemosit dan usus M. japonicus (BGI, Shenzhen, China). Bingkai bacaan terbuka (ORF) Foxo telah dikuatkan menggunakan sepasang primer (Foxo-EX-F dan Foxo-EX-R; Jadual 1) untuk pengesahan jujukan. CDNA yang sepadan telah diterjemahkan secara konsep untuk mendapatkan urutan protein yang disimpulkan menggunakan alat ExPASy-Translation (//cn.expasy.org/). Analisis persamaan telah dijalankan menggunakan BLAST (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/), dan ramalan seni bina domain dilakukan menggunakan SMART (//smart.emblheidelberg.de). Pokok filogenetik FOXO daripada spesies berbeza telah dibina menggunakan program MEGA 6.0 [54].
Rajah 9. RAB5 dan RAB7 menyetempat bersama dengan V. anguillarum. Penyetempatan bersama RAB5 dan RAB7 dengan FITC berlabel-V. anguillarum dalam hemosit udang, seperti yang dianalisis menggunakan ujian immunocytochemical pendarfluor. Bakteria telah dilabelkan dengan FITC (hijau) dan disuntik ke dalam udang. Hemosit dikumpul daripada lima ekor udang pada 30 minit dan 1 jam selepas suntikan bakteria dan diinkubasi dengan antibodi anti-RAB5 atau anti RAB7. Antibodi kedua ialah antiarnab IgG Alexa-546 (merah). Nukleus diwarnai dengan DAPI (biru). Penyetempatan bersama dalam hemosit ditunjukkan oleh anak panah putih. Bar skala=10 μm.
Rajah 10. Perwakilan skematik penglibatan FOXO dalam imuniti semula jadi tempatan dan sistemik dalam udang. (A) Dalam keadaan yang tidak dijangkiti, FOXO mengekalkan homeostasis hemolymph dan mikrobiota usus dengan mempromosikan Relish dan seterusnya ekspresi AMP. (B) Dalam keadaan yang dijangkiti, fosforilasi AKT dikurangkan oleh jangkitan patogen, mengakibatkan peningkatan kandungan FOXO dalam nukleus. FOXO secara langsung mempromosikan ekspresi Relish dan AMP untuk menghapuskan patogen invasif; sebaliknya, FOXO menggalakkan fagositosis patogen melalui laluan fagositosis pengantara SRC.
Cabaran bakteria dan pengumpulan sampel
Vibrio anguillarum (ATCC 43305) diperoleh daripada Kolej Marin, Universiti Shandong (Wei hai, China) dan kini disimpan di makmal kami. V. anguillarum dibiakkan semalaman pada suhu 37˚C dalam medium LB dan dikultur semula selama 4 jam pada inokulasi 1:100 pada hari kedua. Bakteria dalam fasa pertumbuhan logaritma dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 5000 × g selama 5 minit pada 4˚C dan dibasuh dua kali dengan garam penampan fosfat (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, dan 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4). V. anguillarum digantung semula dalam salin buffer fosfat untuk cabaran udang. Kira-kira 2 × 107 unit pembentuk koloni (CFU)/ udang disuntik ke dalam perut setiap udang menggunakan picagari mikro. Kumpulan kawalan disuntik dengan jumlah PBS yang sama. Hemosit, jantung, hepatopankreas, insang, perut, dan usus dikumpulkan daripada sekurang-kurangnya tiga ekor udang untuk pengekstrakan RNA dan protein. Untuk pengumpulan hemosit, hemolymph diekstrak daripada sinus ventral menggunakan picagari yang dimuatkan dengan 0.8 ml penimbal antikoagulan (10% natrium sitrat), dan kemudian disentrifugasi dengan cepat pada 700 × g selama 8 minit pada 4˚C untuk pengasingan hemosit.
Pengekstrakan RNA dan protein, dan sintesis cDNA
Jumlah RNA diekstrak daripada hemosit dan organ udang yang berbeza menggunakan TRIzol (ET101, Transgen, Beijing, China). Protein daripada organ yang berbeza telah diekstrak menggunakan Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) Lysis Buffer (P0013B, Beyotime, Jiangsu, China). Sintesis cDNA untaian pertama dilakukan menggunakan Kit Sintesis cDNA (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Kanada), mengikut arahan pembuat manufac.
Jadual 1. Urutan primer yang digunakan dalam kajian ini.
MasterMix; Bahan Biologi Gunaan-abm, Vancouver, Kanada), mengikut arahan pengilang.
Ekspresi rekombinan dan penyediaan antibodi
Urutan cDNA Foxo telah dikuatkan oleh tindak balas rantai polimerase transkripsi terbalik (RT-PCR) menggunakan primer Foxo-EX-F dan Foxo-EX-R (Jadual 1). Produk PCR yang telah disucikan kemudiannya dicerna menggunakan enzim sekatan dan diikat ke dalam plasmid pGEX-4T-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). dan plasmid yang dibina telah diubah menjadi sel Escher ichia coli Rosseta (DE3). Ekspresi protein diinduksi menggunakan 1 mM isopropil- - D-thio galactopyranoside pada 37˚C. Protein rekombinan tertakluk kepada kromatografi pertalian menggunakan resin glutation (GST) (C600031, BBI, Shanghai, China), mengikut arahan pengilang. Antisera arnab terhadap FOXO telah disediakan mengikut kaedah yang diterangkan sebelum ini [55].
Western blotting
Protein yang diekstrak daripada organ atau hemosit yang berbeza diasingkan menggunakan 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Protein dalam gel SDS-PAGE telah dipindahkan ke membran selulosa nitrat menggunakan penimbal pemindahan (25 mM Tris–HCl, 20 mM glisin, 0.037% mM SDS dan 20% etanol) dan diinkubasi dalam 5% susu skim atau 3% bovine serum albumin (BSA) dalam garam Tris-buffered (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8.0) selama 1 jam dengan goncangan lembut pada suhu bilik. Membran kemudian diinkubasi dengan antiserum primer: Anti-FOXO pada pencairan 1:100, anti-RAB5 pada 1:25, anti Rab7 pada 1:25, anti-beta actin (ACTB) pada 1:250 (disediakan di makmal kami ); Antibodi poli klon histon{29}} (A2348, ABclonal, Wuhan, China, 1:2500); antibodi poliklonal anti-fosforilasi (p)-AKT (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, China, 1:500) dan digoncang perlahan-lahan sepanjang malam pada suhu 4˚C. Selepas mencuci tiga kali dengan TBST (0.1% Tween-20 ditambahkan pada TBS), bran mem telah diinkubasi dengan antibodi sekunder (ZB2308 ZSGB-Bio, Beijing, China, 1:5,000) atau ( ZB2301 ZSGB-Bio, Beijing, China, 1:5,000) selama 3 jam pada suhu bilik dengan goncangan lembut. Jalur protein imunoreaktif telah dibangunkan menggunakan larutan nitrotetrazolium blue chloride (A610379, BBI) dan garam P-toluidine (A610072, BBI) dalam keadaan gelap atau menggunakan chemiluminescence (ECL) yang dipertingkatkan. -actin atau Histone-3 telah digunakan sebagai rujukans.
Taburan tisu dan corak ekspresi dalam udang yang dicabar oleh bakteria
Taburan tisu Foxo/FOXO dalam hemosit, jantung, insang, sputum, perut, dan usus dianalisis menggunakan RT-PCR dengan primer Foxo-F dan Foxo-R (Jadual 1) dan dengan western blotting dengan antibodi anti-FOXO, masing-masing. Prosedur PCR terdiri daripada pengeraman awal pada 94˚C selama 3 minit; diikuti dengan 35 kitaran 94˚C selama 30 saat, 50˚C selama 30 saat, dan 72˚C selama 30 saat; diikuti dengan 72˚C selama 10 minit. Produk PCR dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarose (1.5% agarose). Gen -actin ( -actin-F dan -actin-R; Jadual 1) digunakan sebagai kawalan dalaman. Corak ekspresi kursus masa Foxo/FOXO pada tahap RNA dan protein dalam udang yang dicabar dengan V. anguillarum telah dianalisis menggunakan PCR masa nyata kuantitatif (qPCR) dalam kitar haba (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Jerman) dan oleh west ern blotting, masing-masing. Prosedur qPCR terdiri daripada: 95˚C selama 10 minit; 40 kitaran pada 95˚C selama 10 saat dan 60˚C selama 50 saat; dan kemudian tempoh lebur dari 65˚C hingga 95˚C. Fail pro ungkapan Foxo dihasilkan menggunakan kaedah 2-ΔΔCT [56] menggunakan min geometri bagi dua gen kawalan dalaman -actin dan Ef-1 untuk penormalan. Kecekapan pasangan primer dalam qPCR telah dianalisis mengikut kaedah MIQE [57] dengan 10-pencairan logaritma kali ganda bagi campuran cDNA untuk menjana lengkung piawai linear.
Pengasingan protein nuklear dan sitoplasma
Tisu usus telah dibedah daripada udang dan dicuci dalam PBS sebanyak tiga kali. Pengekstrakan protein telah dijalankan dengan menggunakan kit pengekstrakan protein nuklear dan sitoplasma (R0050, Solarbio, Beijing, China) mengikut arahan pengilang. Sekurang-kurangnya tiga ekor udang digunakan untuk pengekstrakan protein untuk menghapuskan perbezaan individu.
Ujian gangguan RNA
Untuk menganalisis fungsi gen, kami melakukan ujian gangguan RNA (RNAi). Beberapa pasang primer yang mengandungi jujukan promoter T7 (Foxo-RI-F dan Foxo-RI-R; Rab5-RI-F dan Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F dan Rab7 -RI-R; Akt-RI-F dan Akt-RI-R. Jadual 1) telah direka bentuk untuk menguatkan templat untuk sintesis dsRNA. Menggunakan polimerase RNA T7 (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dan templat cDNA, kami mensintesis serpihan dsRNA. RNA dsGfp protein pendarfluor Hijau dua helai berfungsi sebagai kawalan, yang dikuatkan menggunakan Gfp-RI-F dan Gfp -RI-R (Jadual 1) sebagai primer untuk sintesis dsGfp. Kemudian, serpihan dsRNA (50 ug/setiap satu) disuntik ke dalam segmen perut M. japonicus menggunakan picagari mikro dan suntikan kedua dilakukan 12 jam kemudian menggunakan dos yang sama. Kecekapan gangguan RNA dianalisis menggunakan PCR transkripsi terbalik masa nyata kuantitatif (qRT-PCR, yang terdiri daripada transkripsi terbalik RNA untuk membentuk cDNA, yang kemudiannya digunakan sebagai templat dalam ujian qPCR) atau western blotting 24 jam selepas suntikan kedua. -aktin digunakan sebagai rujukan dalaman.
Rujukan
1. Calnan DR, Brunet A. Kod FoxO. Onkogen. 2008; 27(16):2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.
2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS, et al. Rangsangan laluan pembaikan DNA disekat oleh faktor transkripsi forkhead FOXO3a melalui protein Gadd45. Sains. 2002; 296 (5567):530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.
3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Hidup FOXO: membongkar peranan protein FOXO dalam penuaan dan umur panjang. Sel Penuaan. 2016; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.
4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. Kawalan tiga lapisan-fosforilasi, asetilasi dan ubiquitination protein FOXO. Kitaran Sel. 2005; 4(7):908–913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. Peraturan faktor transkripsi FoxO oleh asetilasi dan interaksi pro tein-protein. Bba-Mol Sel Sel. 2011; 1813(11):1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.
6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. Faktor transkripsi FOXO: kepentingan dan peraturan klinikal mereka. Biomed Res Int. 2014; 2014:1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.
7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J, et al. Gen yang bertindak menuruni aliran DAF-16 untuk mempengaruhi jangka hayat Caenorhabditis elegans. alam semula jadi. 2003; 424(6946):277– 284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Laluan Insulin/IGF-1R, SIRT1 dan FOXOs-bentuk plat interaksi yang menarik untuk tulang dan osteosarcoma. Endokrinol hadapan (Lausanne). 2019; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.
9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, et al. Akt menggalakkan kemandirian sel dengan memfosforilasi dan menghalang faktor transkripsi forkhead. sel. 1999; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.
10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA, et al. Skp2 menghalang FOX01 dalam penindasan tumor melalui degradasi pengantara ubiquitin. P Natl Acad Sci USA. 2005; 102(5):1649– 1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.
11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA, et al. Faktor transkripsi kepala Fork DAF-16 memindahkan isyarat metabolik dan jangka hayat seperti insulin dalam C. elegans. alam semula jadi. 1997; 389 (6654):994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.
12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Isyarat FoxO usus diperlukan untuk bertahan hidup jangkitan mulut dalam Drosophila. Immunol mukosa. 2016; 9(4):927–936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.
13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO mengawal gangguan RNA dalam Drosophila dan melindungi daripada jangkitan virus RNA. P Natl Acad Sci USA. 2015; 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.
14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 menggalakkan homeostasis Imun usus untuk mengehadkan disbiosis komen sal dan memanjangkan jangka hayat. sel. 2014; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.
15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P, et al. Peraturan homeostasis imun semula jadi yang bergantung kepada FOXO. alam semula jadi. 2010; 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.
16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M, et al. Faktor transkripsi FOXO mengawal mekanisme imun semula jadi dalam sel epitelium pernafasan. J Immunol. 2013; 190(4):1603– 1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.
17. Graves DT, Milovanova TN. Imuniti mukosa dan faktor transkripsi FOXO1. Imunol hadapan. 2019; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.
18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Peptida anti-mikrob: daripada invertebrata kepada vertebrata. Immunol Rev. 2004; 198:169–184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.
19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Kekebalan dalam Drosophila melanogaster-daripada pengiktirafan mikrob kepada fisiologi keseluruhan organisma. Nat Rev Immunol. 2014; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.
20. Hoffmann JA, Reichhart JM. Imuniti semula jadi Drosophila: perspektif evolusi. Nat Immunol. 2002; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.
21. Hultmark D. Drosophila imuniti: laluan dan corak. Curr Opin Immunol. 2003; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.
22. Li FH, Xiang JH. Kemajuan terkini dalam penyelidikan mengenai imuniti semula jadi udang di China. Dev Comp Immunol. 2013; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.
23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. Pengikatan domain gegelung bergelung jenis C lektin ke reseptor Domeless secara langsung mengaktifkan laluan JAK/STAT dalam tindak balas imun udang terhadap jangkitan bakteria. Pathog PLoS. 2017; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.
24. Gordon S. Fagositosis: proses imunobiologi. Kekebalan. 2016; 44(3):463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.
25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ, et al. FoxO1-autophagy pengantara diperlukan untuk pembangunan sel NK dan imuniti semula jadi. Nat Commun. 2016; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.
26. Dong G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J, et al. FOXO1 mengawal aktiviti neutrofil yang disebabkan oleh bakteria. Imunol hadapan. 2017; 8:1088–1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.
27. Wang XW, Zhao XF, Wang JX. Lektin jenis C mengikat beta-Integrin untuk menggalakkan fagositosis hemositik dalam invertebrata. J Biol Chem. 2014; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.
28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. Mengajar udang mempertahankan diri untuk melawan jangkitan. Trend Bioteknol. 2019; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.
29. Flegel TW. Sejarah kemunculan, kesan dan status terkini patogen udang di Asia. J Invertebr Pathol. 2012; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.
30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. Pertahanan antiviral dalam udang: Daripada imuniti semula jadi kepada intionfec virus. Antivir Res. 2014; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.
31. Obsil T, Obsilova V. Hubungan struktur/fungsi yang mendasari peraturan faktor transkripsi FOXO. Onkogen. 2008; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.
