Perencatan Kv1.3 Melemahkan Neuroinflammation Melalui Gangguan Isyarat Kalsium Mikroglial

ABSTRAK

Dalam 5 tahun terakhir, perencat saluran kalium KV1.3 telah ditunjukkan dapat mengurangkan keradangan saraf dalam model tikus strok iskemia, penyakit Alzheimer, penyakit Parkinson dan kecederaan otak traumatik. Pada peringkat sistemik, tindakan berfaedah ini dimediasi oleh pengurangan pengaktifan mikroglia dan penindasan pengeluaran sitokin pro-radang dan nitrik oksida.

Walau bagaimanapun, mekanisme molekul untuk tindakan menindas penyekat KV1.3 pada fungsi mikroglia pro-radang tidak diketahui sehingga kumpulan kami baru-baru ini menunjukkan bahawa saluran KV1.3 bukan sahaja mengawal potensi membran, seperti yang dijangkakan daripada saluran kalium berpagar voltan. , tetapi juga memainkan peranan penting dalam membolehkan mikroglia menentang depolarisasi yang dihasilkan oleh isyarat bahaya ATP sekali gus mengawal kemasukan kalsium melalui reseptor P2X4. Kami di sini mengkaji peranan KV1.3 dalam isyarat mikroglial dan menunjukkan bahawa, sama seperti peranannya dalam sel T, saluran KV1.3 juga mengawal kemasukan kalsium yang dikendalikan kedai dalam mikroglia.

Saluran kalium KV1.3 ialah saluran ion yang dinyatakan secara meluas dalam sel imun, yang memainkan peranan penting dalam pengawalan potensi membran sel, penghijrahan sel, dan fungsi sel imun. Penyelidikan terkini mencadangkan bahawa sebatian yang menghalang saluran kalium KV1.3 boleh membantu meningkatkan imuniti badan.

Mengawal selia sistem imun adalah bahagian penting dalam mengekalkan kesihatan yang baik. Walau bagaimanapun, banyak penyakit, seperti penyakit autoimun, kanser, dan penyakit berjangkit, mengakibatkan sistem imun tidak berfungsi. Oleh itu, penyelidik telah mencari cara untuk meningkatkan imuniti. Kajian terkini mencadangkan bahawa perencat saluran kalium KV1.3 mungkin merupakan pilihan yang menjanjikan.

Dalam sel imun, saluran kalium KV1.3 mengawal potensi membran, dengan itu menjejaskan fungsi sel. Kajian mendapati bahawa dengan menghalang saluran kalium KV1.3, adalah mungkin untuk mengurangkan penghijrahan sel T dan seterusnya menghalangnya daripada menyerang sel yang sihat, dengan itu melindungi sistem imun daripada pemusnahan yang tidak perlu.

Di samping itu, beberapa eksperimen mendapati bahawa menghalang saluran kalium KV1.3 juga boleh menggalakkan aspek lain sistem imun. Sebagai contoh, kajian telah menunjukkan bahawa dengan menghalang saluran ini, kualiti dan kuantiti sel imun dapat dipertingkatkan, dengan itu meningkatkan daya tahan tubuh terhadap patogen dan ancaman luar yang lain. Oleh itu, perencatan saluran kalium KV1.3 mungkin merupakan cara yang berkesan untuk meningkatkan imuniti.

Kesimpulannya, kajian semasa mencadangkan bahawa perencatan saluran kalium KV1.3 mungkin merupakan pendekatan yang menjanjikan untuk meningkatkan fungsi sistem imun dan meningkatkan imuniti keseluruhan badan. Tetapi sementara penemuan ini menjanjikan, penyelidikan lanjut diperlukan untuk menentukan keselamatan dan kebolehlaksanaan menggunakan pendekatan ini. Dari sudut ini, kita perlu meningkatkan imuniti kita. Cistanche boleh meningkatkan imuniti dengan ketara. Abu daging mengandungi pelbagai bahan aktif secara biologi, seperti polisakarida, dua cendawan, dan Huang Li, yang boleh merangsang sistem imun. pelbagai jenis sel, meningkatkan aktiviti imun mereka.

Klik manfaat kesihatan cistanche

pengenalan

Saluran kalium berpagar voltan KV1.3 pada asalnya diterangkan dalam sel T [1] dan kemudiannya dikejar sebagai sasaran untuk merawat penyakit autoimun pengantaraan sel T seperti multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, dan psoriasis [2-4]. Baru-baru ini KV1.3 telah muncul sebagai sasaran farmakologi yang menarik untuk mengurangkan apa yang dipanggil "radang saraf" dengan memodulasi pengaktifan mikroglia. Dalam kedua-dua model tikus dan tikus strok iskemia, penyekat KV1.3 telah ditunjukkan oleh kami dan orang lain untuk mengurangkan kawasan infark dan memperbaiki defisit neurologi [5,6]. Dalam model tetikus transgenik penyakit Alzheimer sekatan KV1.3 mengurangkan beban amiloid serebrum, meningkatkan keplastikan neuron hippocampal, dan meningkatkan defisit tingkah laku [7].

Begitu juga, dalam pelbagai model haiwan bagi pentadbiran penyakit Parkinson bagi molekul kecil penyekat KV1.3 PAP-1 menghalang degenerasi neuron dopaminergik dan hasil tingkah laku yang lebih baik [8]. Perencatan atau pemadaman genetik KV1.3 selanjutnya telah ditunjukkan untuk memperbaiki patologi bahan putih selepas kecederaan otak traumatik [9], penurunan kognitif selepas pembedahan [10], dan kecederaan otak akibat radiasi [11]. Dalam semua model haiwan penyakit neurologi ini, peningkatan ekspresi KV1.3 diperhatikan pada mikroglia yang berkaitan dengan patologi dan rawatan dengan penyekat KV1.3 menyebabkan pengaktifan mikroglia berkurangan dan paras sitokin keradangan dikurangkan dalam otak haiwan.

Ekspresi KV1.3 yang dikaitkan dengan penyakit itu seolah-olah diterjemahkan kepada manusia kerana ungkapan KV 1.3 yang kuat juga telah ditemui dalam otak manusia postmortem pada mikroglia di kawasan infark berikutan strok iskemia [5,12], pada mikroglia yang mengelilingi plak amiloid dalam penyakit Alzheimer [ 7,13], dan pada mikroglia dalam korteks prefrontal dan substantia nigra dalam penyakit Parkinson [8]. Diambil bersama, penemuan yang menggalakkan dalam model manusia dan haiwan ini sangat mencadangkan saluran KV1.3 mikroglial sebagai sasaran terapeutik untuk mengurangkan tindak balas keradangan yang memudaratkan di dalam otak. Tetapi bagaimanakah penyekat KV1.3 berfungsi? Bagaimanakah menyekat saluran kalium berpagar voltan dalam mikroglia, dan mungkin juga makrofaj yang berasal dari monosit yang menyusup otak mengurangkan pengeluaran sitokin radang dan kerosakan tisu pengantara keradangan?

Kesan Penyekat KV1.3 pada fungsi mikroglia

Tikus neonatal dan mikroglia tikus yang dikultur, serta mikroglia terpencil secara akut daripada otak tikus atau tisu mikroglia yang dicetak daripada otak tikus, telah ditunjukkan untuk menyatakan arus KV1.3 oleh pengapit tampalan seluruh sel yang meningkat dengan ketara berikutan rangsangan in vitro atau in vivo suntikan intracerebroventricular dengan TLR-4 ligan lipopolysaccharide (LPS) [14–18]. Rangsangan dengan komponen dinding sel gram-negatif LPS digunakan secara meluas untuk mendorong keadaan "M1-}seperti" yang diaktifkan secara "klasik" bagi mikroglia yang mensimulasikan keradangan umum yang akan dikaitkan dengan jangkitan bakteria [19,20]. Dalam bidang neuroimunologi, mikroglia yang dirangsang LPS sepatutnya dipanggil mikroglia M(LPS) berdasarkan rangsangan yang digunakan untuk mendorong polarisasi untuk mengelakkan penggunaan terminologi M1/M2, yang dianggap sebagai terlalu mudah [21], tetapi digunakan secara meluas kerana terapeutiknya. daya tarikan.

Berikutan rangsangan dengan LPS peningkatan ekspresi KV1.3 boleh diperhatikan pada tahap mRNA dan tahap protein oleh Western blotting, imunohistokimia, dan peningkatan ketumpatan arus yang diukur oleh seluruh sel patch-clamp [15-18]. Peningkatan yang serupa, tetapi sedikit kurang sengit dalam ekspresi Kv1.3 berlaku apabila mikroglia neonatal yang dikultur dirangsang dengan oligomerik amyloid- (AO) atau -synuclein [7,8], dua protein yang tersalah lipat dan diagregatkan dalam penyakit Alzheimer atau Parkinson, dan yang sering digunakan untuk mencipta model in vitro tindak balas mikroglia yang berkaitan dengan penyakit masing-masing.

Dalam jenis sistem in vitro ini, perencatan atau pemadaman genetik KV1.3 ini mengurangkan ekspresi dan pengeluaran berbilang mediator keradangan yang diukur pada 24- atau 48-jam selepas pengaktifan mikroglia. Kira-kira 20 tahun yang lalu makmal Lyanne Schlichter melaporkan bahawa perencat KV1.3 menyekat letusan pernafasan yang dirangsang phorbol ester [22] dan pengeluaran NO dalam mikroglia tikus neonatal yang dikultur, sekali gus mengurangkan pembunuhan neuron pengantara mikroglia dalam sistem kultur transwell [16].

Dalam kajian yang lebih baru dari makmal kami [17], yang membandingkan kesan penyekat KV1.3 dan KCa3.1 dengan minocycline inhibitor mikroglia yang digunakan secara meluas pada mikroglia tetikus neonatal terpolarisasi berbeza, kami mendapati bahawa perencatan Kv1.3 mengurangkan ekspresi dan pengeluaran daripada sitokin pro-radang IL-1 dan TNF- pada 24 dan 28 jam dan menghalang regulasi enzim berkaitan keradangan cyclooxygenase2 (COX-2) dan inducible nitric oxide synthase (iNOS). Kesan terakhir mungkin bertanggungjawab untuk pengurangan pengeluaran NO yang diperhatikan dalam mikroglia yang dirawat dengan perencat KV1.3 pada 24 dan 48 jam selepas rangsangan LPS. Sama seperti kerja terdahulu, kami juga memerhatikan bahawa perencat KV1.3 menghalang pembunuhan neuron pengantara mikroglia dalam kultur hirisan hippocampal organotip 3 hari selepas mikroglia diaktifkan sama ada melalui 1-jam hipoksia/glisemia untuk mensimulasikan strok iskemia [5] atau dengan rawatan dengan amiloid oligomerik- untuk mensimulasikan pengaktifan mikroglia dalam AD [7].

Selain mengurangkan pengaktifan mikroglia akibat AO, fenomena yang boleh ditunjukkan dengan jelas dengan mengotorkan mikroglia untuk CD11b atau Iba-1 dan menilai keamatan pendarfluor, perencat KV1.3 PAP-1 juga didapati dapat menghalang Kemerosotan potensiasi jangka panjang (LPT) yang disebabkan oleh O, pengantaraan mikroglia dalam kepingan hippocampal dan untuk mengurangkan pengeluaran IL-1 yang disebabkan oleh A O, TNF- dan NO dalam mikroglia tetikus berbudaya [7], sangat serupa kepada apa yang telah ditemui untuk perencat KV1.3 dengan mikroglia yang dirangsang LPS [17,18]. Dalam eksperimen di mana mikroglia tikus neonatal yang dibiakkan daripada tikus jenis liar dan KV1.3−/- telah dirangsang dengan agregat -synuclein ( SynAgg), yang mengaktifkan mikroglia melalui pengikatan kepada reseptor pengecaman corak TLR2 dan CD36 [23], kedua-dua farmakologi KV1. 3 perencatan dengan PAP-1 dan pemadaman genetik saluran mengakibatkan pengeluaran IL-1 , IL-6, IL-12 dan TNF berkurangan serta menghalang regulasi protein inflammasom NLRP3 pada 24 jam selepas rangsangan mikroglia [8]. Sebaliknya, ekspresi berlebihan KV 1.3 dalam garisan sel mikroglial meningkatkan ekspresi atau rembesan SynAgginduced IL-1 , TNF- , IL-6 dan IL-12 pada 24 jam selepas rangsangan [8].

Pelbagai kajian oleh kumpulan lain mengesahkan bahawa penyekat KV1.3 mengurangkan fungsi mikroglia pro-radang apabila menggunakan rangsangan atau rangsangan serupa yang berkaitan dengan patologi keradangan lain. Contohnya, dalam mikroglia tikus kultur yang diaktifkan dengan protein HIV Tat atau dengan glikoprotein 120 (gp120) untuk mensimulasikan1-gangguan neurokognitif berkaitan HIV, perencatan atau knockdown KV1.3 dengan siRNA didapati mengurangkan IL-1 , TNF-, dan pengeluaran NO dan menekan neurotoksisiti [24,25]. Menggunakan model strok iskemia dan kekurangan oksigen/glukosa mikroglia kultur Ma et al. melaporkan bahawa perencatan KV1.3 mengalihkan fenotip mikroglial daripada M{15}}pro-radang kepada tindak balas seperti M2-dan mengurangkan pengaktifan inflammasom NLRP3 [5,6], serupa dengan kajian yang diterangkan di atas dalam model penyakit Parkinson [8].

Menggunakan sel CD11b plus yang baru diasingkan, yang terdiri daripada makrofaj yang menyusup CNS dan mikroglia pemastautin otak daripada otak tikus yang telah dirawat secara sistemik dengan LPS dengan kehadiran dan ketiadaan peptida penyekat KV1.3 ShK-223, Rangaraju et al. mengesahkan bahawa perencatan KV 1.3 mengurangkan ekspresi sitokin radang seperti IL-1 tetapi menunjukkan bahawa perencatan KV1.3 juga mengurangkan ekspresi TAP1 dan menghalang regulasi EHD1 dalam CD11b ditambah mikroglia rendah CD45 seperti yang diukur oleh sitometri aliran [26]. Kedua-dua TAP1 dan EDH1 adalah protein yang terlibat dalam perhimpunan kelas-I MHC dan pemerdagangan ke permukaan sel. Oleh itu, pengarang seterusnya menyiasat kesan rawatan ShK-223 pada ekspresi kelas MHC-1 pada mikroglia yang diasingkan secara akut, dan, berdasarkan ungkapan MHC yang dikurangkan, membuat hipotesis bahawa peningkatan yang disebabkan oleh LPS dalam kapasiti pembentangan antigen bagi microglia ialah KV 1.3-proses bergantung, menunjukkan bahawa perencatan KV1.3 boleh mengurangkan pembentangan antigen kepada sel T sitotoksik CD8 ditambah.

Dalam analisis rangkaian ekspresi bersama wajaran berikutnya yang digunakan pada set data transkriptik mikroglial daripada model tetikus penyakit neuroinflamasi dan neurodegeneratif kumpulan yang sama mengenal pasti KV1.3 sebagai sebahagian daripada tandatangan gen proinflamasi yang juga termasuk Tlr2, Ptgs2, Il12b, Il1b, CD44, NFκB, Stat1 dan RelA [27]. Sekatan KV1.3 dengan ShK-223 boleh mengalihkan tandatangan pro-radang ini kepada satu dengan peningkatan ekspresi gen anti-radang dalam mikroglia yang berkaitan dengan penyakit. Apa yang menarik dalam konteks ini, ialah perencat Kv1.3 telah dilaporkan dalam kajian lain untuk meningkatkan lagi penghijrahan mikroglia kultur yang dirangsang dengan sitokin anti-radang IL-4 dan IL-10 [28] dan untuk tidak menjejaskan fagositosis mikroglial microbeads [26] atau bahkan meningkatkan fagositosis amiloid- [7].

Oleh itu, terdapat banyak bukti bahawa mikroglia mengekspresikan KV1.3 dan penyekat KV1.3 menyekat fungsi mikroglia yang pro-radang, neurotoksik dan mungkin juga mengalihkan mikroglia ke arah fenotip yang lebih neuroprotektif. Kami di sini kebanyakannya menumpukan pada meringkaskan data yang diperolehi dengan kultur mikroglial atau hirisan terkultur kerana, dalam sistem reduksionis ini, tidak syak lagi bahawa kalah mati, knockdown, atau sekatan farmakologi memberi kesannya secara langsung melalui perencatan saluran KV1.3 mikroglial dan bukan secara tidak langsung melalui kesan. Saluran KV1.3 dalam sel T, sel B, sel dendritik atau monosit, yang semuanya menyatakan KV1.3 [29], dan dengan itu boleh menyumbang kepada kesan in vivo penyekat KV1.3 atau penemuan yang dibuat dengan KV1.3−/- tikus. Walau bagaimanapun, kami ingin menunjukkan di sini bahawa sebagai tambahan kepada banyak kajian yang menunjukkan ekspresi KV1.3 pada mikroglia dalam tikus dan manusia oleh imunohistokimia, makmal Kettenmann dan kumpulan kami telah berulang kali menunjukkan bahawa peningkatan ekspresi KV1.3 pada mikroglia diaktifkan bukan sekadar fenomena kultur tisu dan bahawa arus Kv1.3 boleh direkodkan daripada mikroglia dalam kepingan akut [30,31] dan daripada mikroglia terpencil akut daripada otak tikus 5xFAD [7] atau dari kawasan infark selepas oklusi arteri serebrum tengah [5, 12], model untuk strok iskemia.

Laluan isyarat terjejas oleh perencatan KV1.3 atau ekspresi Kv1.3 yang memodulasi

Kajian yang menyelidik laluan isyarat (Rajah 1) yang dipengaruhi oleh penyekat KV1.3 untuk menghasilkan pengurangan bermanfaat dalam fungsi mikroglia pro-radang ini 24 atau 48 jam kemudian telah memberikan hasil yang agak bercanggah, menunjukkan bahawa kesan penyekat KV1.3 adalah bergantung pada rangsangan dan mungkin spesies. Manakala Fordyce et al. melaporkan bahawa penyekat KV1.3 tidak menjejaskan fosforilasi p38MAPK dalam mikroglia tikus neonatal yang dirawat LPS [16], beberapa kajian lain menggunakan mikroglia tetikus mendapati bahawa penyekat KV1.3 sangat mengurangkan fosforilasi p38MAPK serta pengaktifan NF-κB berikutan rangsangan dengan LPS, AO, SynAgg atau HIV{17}} glikoprotein 120 [7,8,24]. Dalam garisan sel mikroglial, BV2 KV1.3 juga telah ditunjukkan untuk mengawal fosforilasi S727 STAT1 [26]. Menariknya, sama ada penyekat KV1.3 menghalang translokasi NFAT, salah satu kesan penyekat KV1.3 yang terbaik dikaji dalam sel T [2,32,33] belum disiasat dalam mikroglia setakat ini.

Peningkatan dalam ekspresi KV1.3 berikutan rangsangan mikroglia dengan LPS, AO atau SynAgg nampaknya melibatkan banyak lata isyarat yang sama yang dipengaruhi oleh perencatan KV1.3, dan penyekat KV1.3 biasanya menghalang peningkatan dalam ekspresi Kv1.3. Penganjur KV1.3 mengandungi berbilang tapak pengikatan NF-κB dan SP1 dan perencat NF-κB atau p38MAPK secara bebas mengurangkan pengawalseliaan Kv1.3 yang dirangsang SynAgg dalam mikroglia [8], menunjukkan bahawa kedua-dua p38MAPK dan laluan NF-κB klasik menengahi peraturan transkrip KV1.3 (Rajah 1). Kinase keluarga Src Fyn berfungsi di hulu faktor transkripsi NF-κB dengan mengawal selia translokasi nuklear komponennya p65 [34] dan dengan memfosforilasi isoform PKC PKCδ. Sarkar et al. melaporkan bahawa kalah mati Fyn mengurangkan kedua-dua LPS dan SynAgg yang disebabkan peningkatan dalam ketumpatan arus KV1.3 dalam mikroglia berbudaya, kesan yang boleh ditiru oleh rawatan mikroglia dengan perencat Fyn saracatinib atau oleh kekurangan untuk PKCδ, menunjukkan bahawa isyarat kinase Fyn/PKCδ lata terlibat dalam pengantaraan KV1.3 upregulation sebagai tindak balas kepada rangsangan keradangan [8]. Seperti yang ditunjukkan dalam ujian ligation proximity Duolink, Fyn berinteraksi secara langsung dengan Kv1.3 dan memfosforilasi saluran pada Y135 untuk meningkatkan aktivitinya.

Kv1.3 mengawal potensi membran dan menentang depolarisasi'

Walaupun diterangkan di atas kesan amelioratif penyekat KV1.3 yang didokumentasikan dengan baik pada neuroinflammation in vivo dan pada lata isyarat mikroglial dan ekspresi dan rembesan mediator radang secara in vitro, mekanisme molekul asas bagaimana penyekat KV1.3 mempengaruhi fungsi mikroglial telah lama tidak jelas. Ramai penyiasat, termasuk makmal kami, hanya menganggap bahawa KV1.3 menjalankan fungsi yang sama dalam mikroglia yang dipenuhi dalam sel T, iaitu mengawal potensi membran dan kemasukan kalsium [29,32,33].

Dalam sel T, perencatan KV1.3 membawa kepada depolarisasi membran dan mengurangkan kemasukan kalsium melalui saluran kalsium diaktifkan pelepasan kalsium (CRAC) berikutan rangsangan reseptor sel T [33,35,36]. Kemasukan kalsium melalui saluran CRAC amat diperlukan untuk nyahfosforilasi dan translokasi nuklear seterusnya bagi faktor transkripsi yang bergantung kepada kalsium/calmodulin NFAT [29], yang mencetuskan transkripsi sitokin IL-2 [29,33]. IL{11}} dilepaskan daripada sel T yang diaktifkan semasa sintesis dan merangsang pengembangan klon sel T secara autokrin dan parakrin. Dengan menghalang pengeluaran kalium pengimbang yang diperlukan untuk mengekalkan kemasukan kalsium melalui saluran CRAC Penyekat KV1.3 mengganggu pengaktifan sel T, menghalang penyahfosforilasi NFAT dan translokasi nuklear [32] yang membawa kepada pengurangan percambahan sel T dan mengurangkan pengeluaran dan rembesan sitokin radang pada 48 jam [5,33,35,36].

Walau bagaimanapun, ia tidak pernah diuji dalam mikroglia, yang tidak seperti sel T juga mengekspresikan penerus masuk Kir2.1 [17,37,38] dan saluran kalium dua liang THIK-1 (K2P 13.1) [39], sama ada penyekat KV1.3 akan mempunyai kesan molekul yang sama atau jika peranan KV1.3 telah diambil alih oleh saluran kalium yang lain ini. Dalam kajian baru-baru ini, kumpulan kami dengan sewajarnya menangani soalan ini dengan mengkaji semula kepentingan asas KV1.3 dalam mengekalkan potensi membran berehat dan menentang depolarisasi [40]. Seperti yang dijangkakan, ekspresi berlebihan KV1.3 dalam sel CHO menurunkan potensi membran rehat yang biasanya sangat terdepolarisasi sel-sel ini daripada -20 mV kepada -50 mV, manakala perencatan KV1.3 dengan mikroglia terdepolarisasi ShK-223, yang secara semula jadi mengekalkan a potensi membran rehat yang lebih hiperpolarisasi, yang di tangan kami purata sekitar -90 mV dalam mikroglia yang tidak dibezakan yang kebanyakannya menyatakan Kir2.1 dan sekitar -65 mV dalam LPS merangsang mikroglia yang menyatakan KV1.3 yang lebih tinggi dan ketumpatan arus Kir2.1 yang lebih rendah [40].

Walaupun KV1.3 pastinya menyumbang kepada mengawal selia potensi membran rehat dalam mikroglia (Rajah 2), kami percaya, peranannya yang lebih penting, dan sebab mengapa ekspresi Kv1.3 meningkat dalam mikroglia diaktifkan, adalah keupayaan saluran untuk mengimbangi yang melampau dan berpanjangan depolarisasi membran yang berpotensi boleh memberi kesan negatif kepada kesihatan dan fisiologi mikroglial seperti yang didedahkan oleh eksperimen suntikan semasa. Walaupun suntikan semasa 25 pA tidak dapat menyahkutub KV 1.3 mengekspresikan mikroglia melebihi -30 mV jika tiada penyekat, mikroglia yang diprarawat dengan penyekat KV 1.3 menyahkutub kepada potensi tambah 50 mV sebagai tindak balas kepada suntikan semasa 25 pA yang sama [40] , mencadangkan bahawa KV1.3 boleh "mengikat" potensi membran berhampiran dengan potensi ambang pengaktifan saluran untuk mengelakkan penyahkutuban membran yang berlebihan (Rajah 2).

Situasi dalam fisiologi mikroglial di mana kapasiti ini penting ialah apabila mikroglia terdedah kepada ATP ekstraselular, isyarat bahaya yang boleh mencapai kepekatan dalam julat mikromolar tinggi akibat pembebasan ATP sitosol daripada neuron yang rosak atau ATP yang mengandungi vesikel sinaptik [41], yang mengaktifkan saluran reseptor P2X yang membawa kepada depolarisasi yang sengit [42]. Di tangan kita sendiri, eksperimen pengapit semasa yang dilakukan pada mikroglia yang tidak dibezakan dan dirangsang LPS menunjukkan bahawa pendedahan akut kepada 100 μM ATP, yang daripada reseptor P2X yang dinyatakan dalam mikroglia terutamanya mengaktifkan P2X4, membawa kepada depolarisasi yang lebih ketara dalam mikroglia yang tidak dibezakan, walaupun lebih banyak. potensi membran rehat hiperpolarisasi daripada mikroglia yang dirangsang LPS tinggi KV1.3, yang tidak menyahkutub melebihi −40 mV. Penyekat KV1.3 menjejaskan keupayaan ini untuk menentang depolarisasi yang disebabkan oleh ATP dan mikroglia terdepolarisasi di hadapan mereka [40].

KV1.3 memodulasi kemasukan kalsium pengantara reseptor P2X4 dalam mikroglia

Eksperimen pengimejan kalsium mendedahkan bahawa keupayaan saluran KV1.3 ini untuk menentang penyahkutuban P2X4- yang disebabkan oleh ATP meningkatkan kemasukan Ca2 ditambah ke dalam mikroglia melalui reseptor P2X4 yang dirangsang dengan 100 μM ATP [40]. Sebagai contoh, kami mendapati bahawa penyekat KV1.3 ShK-223 dan PAP-1 mengurangkan kemasukan Ca2 campur ATP melalui reseptor P2X4 dalam mikroglia yang dibezakan LPS yang menyatakan ketumpatan arus KV1.3 yang tinggi, lebih banyak lagi lebih kuat daripada mikroglia yang tidak dirangsang walaupun rangsangan LPS merendahkan ekspresi reseptor P2X4 dalam mikroglia berbudaya. Sebaliknya, sekatan KV1.3 tidak mempunyai kesan ke atas transien kalsium yang disebabkan oleh ATP dalam mikroglia yang dirangsang IL-4, yang menyatakan tahap KV1.3 yang sangat rendah. Menariknya, manakala LPS juga meningkatkan KV1.3 dan mengurangkan ekspresi P2X4 pada mikroglia dalam vivo, kedua-dua ekspresi KV1.3 dan P2X4 meningkat secara selari dalam penetapan strok iskemia seperti yang ditunjukkan oleh makmal kami pada mikroglia yang diasingkan secara akut daripada hemisfera otak tikus yang infark. tertakluk kepada strok iskemia dan oleh kumpulan lain pada tikus dan mikroglia manusia oleh imunohistokimia atau qPCR [5,12,43-46]. Ini menunjukkan bahawa berikutan strok iskemia KV1.3 mungkin mengawal isyarat kalsium mikroglial purinergik yang lebih kompleks yang dimulakan oleh isyarat bahaya ATP dengan lebih kuat daripada in vitro. ATP dan serpihan neuron lain di kawasan infark otak mengaktifkan mikroglia, yang kemudiannya secara berterusan menghasilkan dan melepaskan lebih banyak mediator keradangan dalam masa 24 hingga 72 jam dan dengan itu merosakkan dan membunuh lebih banyak neuron di penumbra yang membawa kepada pengembangan keradangan infark.

Ekspresi KV1.3 yang meningkat yang diperhatikan pada mikroglia dalam sempadan infark dalam masa 2-5 hari [5] mungkin membolehkan mikroglia diaktifkan untuk mengekalkan isyarat kalsium yang lebih kuat melalui peningkatan bilangan reseptor P2X4 dan dengan itu menghasilkan lebih banyak mediator keradangan, merosakkan lebih banyak neuron. dan mengaktifkan lebih banyak mikroglia. Hipotesis ini akan selari dengan penemuan bahawa PAP penyekat KV1.3-1 mengurangkan pengaktifan mikroglia dan tahap otak IL-1 dan IFN- , membawa kepada kira-kira 40 peratus kawasan infark yang lebih kecil dan defisit neurologi yang bertambah baik. skor dalam kedua-dua model tikus dan tikus strok iskemia [5]. Dengan menyahpolarisasi penyekat mikroglia Kv1.3 mengurangkan kemasukan kalsium melalui reseptor P2X4 yang dicetuskan oleh ATP yang dibebaskan daripada neuron yang rosak dan dengan itu melembapkan pengaktifan yang bergantung kepada kalsium dari inflammasom NLRP3, NF-κB dan faktor transkripsi lain yang membawa kepada pengurangan pengeluaran mediator keradangan (Rajah 1) dan mengurangkan patologi.

Apakah laluan kemasukan kalsium lain dalam mikroglia yang dikawal oleh KV1.3?

Walaupun sekatan KV1.3 jelas mengurangkan kemasukan kalsium yang disebabkan oleh ATP melalui reseptor P2X4 [40] dan dengan itu membentuk pengawal selia penting laluan kemasukan kalsium ini dalam mikroglia (Rajah 2), ini bukan satu-satunya isyarat kalsium yang bergantung kepada KV1.3 atau ATP. proses dalam mikroglia. Sebagai tambahan kepada saluran reseptor P2X, mikroglia juga mengekspresikan reseptor purinergik P2Y metabotropik yang berikutan pengaktifan oleh ATP atau UTP boleh mendorong pembebasan kalsium dari stor dalaman [47] dan mengaktifkan kemasukan Ca2 tambah (SOCE) yang dikendalikan stor berikutan kekurangan simpanan kalsium intraselular yang agak kecil. dalam mikroglia [38]. Oleh itu, adalah mungkin bahawa SOCE tambahan menyumbang kepada isyarat Ca2 tambah yang disebabkan oleh ATP yang telah kami gambarkan dan bahawa beberapa kesan penyekat KV1.3 telah dimediasi dengan mengurangkan SOCE tambahan.

Ini adalah hipotesis yang sangat mungkin kerana mekanisme molekul "klasik" untuk penyekat KV1.3 dalam sel T ialah pengurangan SOCE melalui saluran CRAC berikutan pengaktifan reseptor sel T dan seterusnya mengurangkan pengaktifan faktor transkripsi dan pengeluaran dan pembebasan sitokin [29,33, 36,48]. Mikroglia tikus dan tetikus telah berulang kali dilaporkan mempamerkan arus dengan sifat biofizik yang tipikal untuk arus CRAC [49,50] dan untuk menyatakan komponen molekul saluran CRAC, Orai, dan STIM [51,52]. Terdapat juga bukti bahawa pemadaman genetik Orai1, STIM1 dan STIM2 mengurangkan arus CRAC dan/atau SOCE dan menghalang penghijrahan dan fagositosis dalam mikroglia tetikus berbudaya [52], manakala penyekat saluran CRAC molekul kecil CM-EX-137 mempunyai baru-baru ini telah dilaporkan mengurangkan pengaktifan mikroglia dan saiz lesi dalam model tetikus kecederaan otak traumatik [53].

Sekatan saluran KV1.3 melemahkan kemasukan kalsium yang dikendalikan kedai dalam mikroglia yang dirangsang LPS

Sebagai percubaan susulan kepada kertas kerja kami sebelum ini tentang peranan KV1.3 dalam mengawal kemasukan kalsium pengantara P2X4, kami di sini secara khusus bertanya soalan sama ada penyekat KV1.3 ShK-223 juga akan mengurangkan SOCE dalam mikroglia yang dibezakan LPS , keadaan rangsangan yang sama, di mana kami telah memerhatikan ketumpatan semasa KV1.3 tertinggi dan kesan terbesar perencatan KV1.3 pada isyarat kalsium teraruh ATP [40]. Menggunakan penunjuk kalsium nisbahmetrik Fura-2 untuk mengesan perubahan dalam kepekatan kalsium intrasel bebas ([Ca2 tambah ]i) kami mendapati bahawa mikroglia yang dibezakan LPS mempunyai kepekatan kalsium sitosol yang berehat [Ca2 tambah ] I yang berubah antara 60 nM dan 370 nM, dengan purata 150 ± 8.8 nM (n=50; Rajah 3a,c,g), yang konsisten dengan laporan sebelumnya [54]. Untuk mendapatkan SOCE, simpanan kalsium intraselular mula-mula dihabiskan dengan thapsigargin (Tg), penyekat retikulum endoplasma Ca2 ditambah -ATPase, digunakan dalam larutan mandian tanpa Ca2 ditambah - tanpa nominal.

Removal of extracellular calcium produced a roughly 25 nM decrease in [Ca2+] I (Figure 3a) indicating the presence of a calcium influx at rest. Subsequent application of Tg (1 μM) elicited small amplitude (>25 nM) ketinggian tak segerak dalam [Ca2 plus ] I disebabkan oleh pengerahan kalsium pasif dari stor. Penambahan semula kalsium ke dalam larutan mandian menimbulkan peningkatan pesat dalam [Ca2 tambah ] I melebihi paras rehat yang disebabkan oleh SOCE. Magnitud SOCEinduced [Ca2 plus ] I transients ("peak SOCE") diukur sebagai perbezaan antara aras [Ca2 plus ] I dalam larutan mandi bebas Ca2 plus dan ketinggian maksimum [Ca2 plus ] I selepas penambahan semula kalsium berubah-ubah. ketara di kalangan sel individu dengan pengedaran SOCE puncak memaparkan maksimum pada 120 nM dan ekor sehingga 1800 nM (Rajah 1b). Keheterogenan dalam kekuatan SOCE ini berkemungkinan disebabkan oleh variasi dalam potensi membran berehat, yang memberikan daya penggerak untuk kemasukan kalsium semasa SOCE. Potensi membran rehat mikroglia yang dibezakan LPS didapati berbeza antara -90 mV dan -40 mV dalam sel individu [40,55] dan dengan itu boleh menyumbang kepada perbezaan yang diperhatikan dalam SOCE.

Kajian terdahulu melaporkan bahawa ketinggian dalam rehat [Ca2 plus ] I dikaitkan dengan pengurangan keupayaan rangsangan luar seperti UTP agonis reseptor P2Y atau faktor pelengkap 5a untuk mendapatkan [Ca2 plus] I transien dalam mikroglia diaktifkan LPS [54]. Kerana dalam kajian kami kedua-dua tahap rehat [Ca2 tambah ]i dan nilai SOCE puncak berbeza-beza di kalangan sel individu, kami meneroka sama ada variasi dalam rehat [Ca2 tambah] i mungkin menyumbang kepada heterogenitas dalam nilai SOCE puncak. Memplot nilai SOCE puncak berbanding rehat [Ca2 tambah ] I, mendedahkan korelasi positif antara SOCE puncak dan rehat [Ca2 tambah ] I (Rajah 3c). Apabila kami membahagikan data kepada dua kumpulan dengan nilai cutoff 600 nM untuk SOCE puncak, hubungan antara rehat [Ca2 plus ] I dan SOCE puncak dalam setiap kumpulan adalah lebih kuat daripada keseluruhan populasi, menunjukkan kehadiran sekurang-kurangnya dua sel populasi, yang berbeza dalam kedua-dua magnitud SOCE dan kekuatan korelasi antara rehat [Ca2 tambah ] I dan SOCE puncak. Oleh itu, dalam populasi sel yang dirawat LPS, peningkatan dalam rehat [Ca2 plus ] i tidak dikaitkan secara bersebab dengan pengurangan keupayaan mikroglia diaktifkan untuk bertindak balas terhadap rangsangan luar dengan [Ca 2 plus] I sementara, seperti yang dicadangkan sebelum ini. oleh Hoffman et al. Data kami mencadangkan bahawa pengaruh yang sama, seperti tahap potensi membran, yang dikawal oleh pelbagai saluran, termasuk KV1.3, Kir2.1 dan THIK-1, mungkin bertanggungjawab untuk korelasi positif antara berehat [Ca2 plus ] I dan puncak SOCE diperhatikan dalam kajian kami. Sebagai contoh, ekspresi berlebihan atau penyelarasan fungsi saluran hiperpolarisasi boleh menyebabkan hiperpolarisasi membran dan meningkatkan daya penggerak untuk kedua-dua kemasukan kalsium melalui saluran telap kalsium yang aktif secara konstitutif seperti saluran potensi reseptor sementara (TRP) diaktifkan secara metabolik dan saluran kendalian stor diaktifkan berikutan kehabisan stor. seperti saluran CRAC.

Pre-incubation of cells with the KV1.3 inhibitor ShK-223 did not significantly affect resting [Ca2+] I (Figure 3d,g), but eliminated peak SOCE responses larger than 300 nM and shifted the maximum of the distribution of peak SOCE values from 130 nM (Figure 3b, control) to 70 nM (Figure 3e, ShK223). The difference between the values of peak SOCE in control cells and cells preincubated with ShK-223 was significant (Figure 3h). The relationship between resting [Ca2+] I and peak SOCE still displayed a mild positive correlation (figure 3f). Taken together, our data indicate that similarly to T lymphocytes, blockade of KV1.3 channels significantly reduces SOCE in LPS differentiated microglia. The extent of the inhibition varied among cells with a greater effect on cells expressing large magnitude (>300 nM) SOCE. Ciri-ciri khusus sel dengan SOCE puncak tinggi dan rendah masih perlu ditentukan.

Di bawah keadaan fisiologi, SOCE boleh dicetuskan kemudiannya untuk menyimpan kehabisan berikutan pengaktifan reseptor P2Y berganding protein G dan menyumbang kepada gabungan peningkatan [Ca2 tambah ] I semasa pengaktifan reseptor P2Y dan P2X yang ditimbulkan oleh agonis purinergik biasa, seperti ATP. Magnitud SOCE berbeza dengan ketara di antara sel-sel yang dibezakan LPS, yang mungkin merupakan fungsi gabungan unik ekspresi pembezaan saluran dikendalikan kedai dan saluran yang mengawal potensi membran, seperti KV1.3. Pengurangan dalam SOCE puncak oleh ShK-223 menunjukkan bahawa saluran KV1.3 adalah pengawal selia SOCE yang kuat dan mendedahkan mekanisme tambahan di mana penyekat KV1.3 melemahkan isyarat kalsium dan tindak balas berfungsi seterusnya (cth pengeluaran sitokin) berikutan transkripsi yang bergantung kepada kalsium pengaktifan faktor dalam mikroglia.

Kesimpulan

Walaupun pastinya mencabar untuk menyelesaikan kesan sumbangan ke atas sel sistem imun periferi, terutamanya pada sel T memori dan makrofaj terbitan monosit, memberi kesan menguntungkan penyekat KV1.3 pada keradangan dalam CNS, ia adalah jelas bahawa KV1.3 memainkan peranan penting dalam mengawal selia potensi membran, mencegah depolarisasi dan mengawal kejadian isyarat kalsium yang seterusnya membawa kepada pengaktifan mikroglia dan pengeluaran mediator keradangan. Kami ingin mencadangkan bahawa dari perspektif terapeutik, mungkin adalah wajar untuk menghalang KV1.3 dalam pelbagai jenis sel sistem imun. Walau bagaimanapun, secara intelek adalah sangat memuaskan dan membantu pembangunan terapi untuk menjelaskan sasaran selular utama perencat KV1.3 dan sama ada terapeutik perlu menembusi otak untuk memberikan kesan pemulihan yang optimum dalam penyakit CNS. Soalan-soalan ini sebaiknya ditangani secara farmakologi dengan menguji molekul kecil yang menembusi otak secara bersebelahan dengan perencat KV1.3 peptida terhad secara periferi atau antibodi anti-KV1.3 [58,59] dalam model haiwan penyakit Alzheimer dan Parkinson. Ia akan menjadi sangat bermaklumat untuk membandingkan kesan penghapusan KV1.3 bersyarat dalam mikroglia, makrofaj yang diperolehi monosit, dan subset sel T yang berbeza dengan kesan rawatan dadah untuk mendapatkan pemahaman yang lebih terperinci tentang peranan KV1.3 dalam neuroinflammation. dan sasaran selular perencat KV1.3. Walau bagaimanapun, kami percaya bahawa pada peringkat selular, peranan asas KV1.3 akan sentiasa menjadi apa yang pertama kali diterangkan dalam sel T, iaitu pengawalan potensi membran dan kemasukan kalsium dan pengaktifan seterusnya faktor transkripsi yang bergantung kepada kalsium. Apa yang kadangkala tidak cukup tertekan dalam hal ini, mungkin sifat biofizikal KV1.3 seperti voltan separuh pengaktifan dan penyahaktifannya yang agak perlahan [60,61], dengan sempurna "melayakkan" saluran untuk menentang depolarisasi membran dan dengan itu membolehkan KV1 .3 untuk bukan sahaja mengawal SOCE, seperti yang diterangkan 30 tahun lalu dalam sel T tetapi juga kemasukan kalsium pengantara reseptor P2X.

Kenyataan pendedahan

Tiada potensi konflik kepentingan dilaporkan oleh pengarang.

Pembiayaan

Kerja ini disokong oleh anugerah Institut Penyakit Neurologi dan Strok Kebangsaan NS100294 (kepada HW) dan Geran Perkongsian Penyelidikan Sekolah Perubatan UC Davis (kepada AFF).

Rujukan

[1] DeCoursey TE, Chandy KG, Gupta S, et al. Saluran K plus berpagar voltan dalam limfosit T manusia: peranan dalam mitogenesis? alam semula jadi. 1984;307(5950):465–468.

[2] Beeton C, Wulff H, Standifer NE, et al. Saluran Kv1.3 ialah sasaran terapeutik untuk penyakit autoimun pengantaraan sel T. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103 (46):17414–17419.

[3] Tarcha EJ, Chi V, Munoz-Elias EJ, et al. Tindak balas farmakologi tahan lama daripada peptida ShK-186, perencat saluran Kv1.3 khusus yang menyekat mediator sel T penyakit autoimun. J Pharmacol Exp Ther. 2012;342(3):642–653.

[4] Chandy KG, Norton RS. Penyekat peptida saluran Kv1.3 dalam sel T sebagai terapeutik untuk penyakit autoimun. Curr Opin Chem Biol. 2017;38:97–107.

[5] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I, et al. Perencatan saluran kalium Kv1.3 mengurangkan infarksi dan keradangan dalam strok iskemia. Ann Clin Transl Neurol. 2018;5(2):147–161.

[6] Ma DC, Zhang NN, Zhang YN, et al. Sekatan saluran Kv1.3 mengurangkan kecederaan iskemia/reperfusi serebrum dengan membentuk semula fenotip M1/M2 dan menjejaskan pengaktifan inflammasom NLRP3 dalam mikroglia. Exp Neurol. 2020;332:113399.

[7] Maezawa I, Nguyen HM, Di Lucente J, et al. Perencatan Kv1.3 sebagai terapi sasaran mikroglia yang berpotensi untuk penyakit Alzheimer: bukti konsep praklinikal. Otak. 2018;141(2):596–612.

[8] Sarkar S, Nguyen HM, Malovic E, et al. Kv1.3 memodulasi neuroinflammation dan neurodegeneration dalam penyakit Parkinson. J Clin Invest. 2020;130 (8):4195–4212.

[9] Reeves TM, Trimmer PA, Colley BS, et al. Menyasarkan saluran Kv1.3 untuk mengurangkan patologi bahan putih selepas kecederaan otak traumatik. Exp Neurol. 2016;283(PtA):188–203.

[10] Lai IK, Valdearcos M, Morioka K, et al. Menyekat saluran kalium Kv1.3 menghalang neuroinflammation selepas pembedahan dan penurunan kognitif tanpa menjejaskan penyembuhan luka pada tikus. Br J Anesth. 2020;125 (3):298–307.

[11] Peng Y, Lu K, Li Z, et al. Sekatan saluran Kv1.3 memperbaiki kecederaan otak akibat sinaran. Neuro Oncol. 2014;16(4):528–539.

[12] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I, et al. Saluran kalium KCa3.1 membentuk sasaran farmakologi untuk neuroinflammation yang berkaitan dengan strok iskemia/reperfusi. J Metab Aliran Darah Serebrum. 2016;36 (12):2146–2161.

[13] Rangaraju S, Gearing M, Jin LW, et al. Saluran kalium Kv1.3 sangat dinyatakan oleh mikroglia dalam penyakit Alzheimer manusia. J Alzheimers Dis. 2015;44 (3):797–808.

[14] Norenberg W, Gebicke-Haerter PJ, Illes P. Rangsangan keradangan mendorong arus keluar K tambah baharu dalam mikroglia tikus berbudaya. Neurosci Lett. 1992;147 (2):171–174.

[15] Kotecha SA, Schlichter LC. Suis Kv1.5 kepada Kv1.3 dalam mikroglia hippocampal endogen dan peranan dalam percambahan. J Neurosci. 1999;19(24):10680–10693. [16] Fordyce CB, Jagasia R, Zhu X, et al. Saluran Microglia Kv1.3 menyumbang kepada keupayaannya untuk membunuh neuron. J Neurosci. 2005;25(31):7139–7149.

[17] Nguyen HM, Grossinger EM, Horiuchi M, et al. Ekspresi Kv1.3, KCa3.1 dan Kir2.1 pembezaan dalam mikroglia diaktifkan "secara klasik" dan "sebagai alternatif". Glia. 2017;65(1):106–121.

For more information:1950477648nn@gmail.com