KLRG1 Menandakan Subset Sel T CD4 yang menyusup Tumor Berkaitan Dengan Perkembangan Tumor Dan Tindak Balas Imunoterapi

Abstrak

Kaedah semasa untuk penemuan biomarker dan pengenalpastian sasaran dalam imuno-onkologi bergantung pada tangkapan statik imuniti tumor. Untuk mencirikan secara menyeluruh sifat temporal tindak balas imun antitumor, kami membangunkan 34-panel sitometri aliran spektrum parameter dan melakukan analisis pemprosesan tinggi dalam konteks kritikal.

Kami memanfaatkan dua model praklinikal yang berbeza yang menyusun semula imunoediting kanser (NPKC1) dan tindak balas sekatan pusat pemeriksaan imun (ICB) (MC38), dan memprofilkan pelbagai tisu yang berkaitan di dan sekitar titik infleksi utama pengawasan imun dan melarikan diri dan/atau tindak balas ICB.

Sasaran merujuk kepada biomolekul penting dalam sel, seperti protein, enzim, dan reseptor. Pengiktirafan sasaran ialah penggunaan kaedah kimia dan biologi untuk mengenal pasti sifat dan fungsi khusus biomolekul ini untuk aplikasi dalam rawatan penyakit dan pembangunan ubat.

Kekebalan merujuk kepada keupayaan tubuh untuk menentang pencerobohan patogen asing dan pertumbuhan sel abnormal endogen. Teras sistem imun ialah sel dan molekul imun, yang mempunyai hubungan rapat dan interaksi dengan sasarannya.

Dalam rawatan penyakit dan pembangunan ubat, hubungan antara pengenalan sasaran dan imuniti adalah sangat penting. Sebagai contoh, mekanisme tindakan banyak ubat adalah melalui pengecaman sasaran, menyasarkan protein tertentu, enzim, reseptor, dan molekul lain, menjejaskan fungsinya, dan mengawal transduksi isyarat, untuk mencapai kesan terapeutik. Sel dan molekul dalam sistem imun juga boleh menjadi sasaran dadah. Sebagai contoh, ubat antikanser mencapai kesan terapeutik dengan menjejaskan tindak balas imun sel kanser dan mengawal apoptosis dan percambahan sel.

Oleh itu, dalam pembangunan ubat dan rawatan klinikal, pertimbangan menyeluruh terhadap faktor pengenalan sasaran dan imuniti boleh membawa kepada pembangunan ubat yang lebih berkesan dan kesan terapeutik yang lebih baik. Dari sudut pandangan ini, kita perlu meningkatkan imuniti. Cistanche boleh meningkatkan imuniti. Cistanche kaya dengan pelbagai bahan antioksidan, seperti vitamin C, vitamin C, karotenoid, dll. Bahan-bahan ini boleh menghilangkan radikal bebas, mengurangkan tekanan oksidatif, dan meningkatkan imuniti. rintangan sistem.

Klik serbuk ekstrak cistanche tubulosa

Analisis data dipacu pembelajaran mesin mendedahkan corak ekspresi KLRG1 yang mengenal pasti secara unik populasi sel CD4 T effector intratumoral yang secara konstitutif mengaitkan dengan beban tumor merentas model tumor, dan hilang dalam tumor yang mengalami regresi sebagai tindak balas kepada ICB. Begitu juga, Helios-KLRG1 ditambah subset sel T pengawalseliaan penyusupan tumor (Tregs) dikaitkan dengan perkembangan tumor daripada keseimbangan imun untuk melarikan diri dan juga hilang dalam tumor yang bertindak balas kepada ICB.

Kajian pengesahan mengesahkan tandatangan KLRG1 dalam sel CD4 T yang menyusup tumor manusia yang dikaitkan dengan perkembangan penyakit dalam kanser buah pinggang. Penemuan ini menamakan populasi sel KLRG1 ditambah CD4 T sebagai subset untuk penyiasatan lanjut dalam imuniti kanser dan menunjukkan kegunaan pemprofilan aliran spektrum membujur sebagai enjin biomarker dinamik dan/atau penemuan sasaran.

pengenalan

Imunoterapi kini menjadi tonggak rawatan kanser. Walau bagaimanapun, tindak balas kepada kebanyakan agen imunoterapeutik kekal jarang berlaku, terhad kepada bilangan jenis tumor yang terhad, dan sukar untuk diramal (1). Meningkatkan kadar tindak balas dan membangunkan biomarker yang meramalkan tindak balas adalah matlamat utama bidang imunologi tumor, tetapi ini masih mencabar.

Pelbagai interaksi multi-selular yang kompleks boleh mengawal hasil tindak balas imun antitumor dalam mana-mana pesakit tertentu. Oleh itu, adalah perkara biasa bahawa biomarker tunggal - atau modulasi terapeutik laluan tunggal - cenderung mempunyai utiliti dalam sesetengah, tetapi bukan kebanyakan pesakit kanser.

Sebagai contoh, terdapat tiga biomarker berkaitan imun yang kini digunakan secara meluas secara klinikal; (i) beban mutasi tumor (TMB), seperti yang diukur secara langsung atau disimpulkan melalui kehadiran mutasi yang melumpuhkan dalam jentera pembaikan DNA(2-4), (ii) ungkapan PD-L1 oleh imunohistokimia (IHC)(5), dan (iii) keimunan sedia ada seperti yang diukur dengan kehadiran sel T CD8 di dalam dan di sekeliling tumor, yang dipanggil Immunoscore(6).

Walaupun masing-masing secara signifikan dikaitkan dengan tindak balas kepada imunoterapi dalam konteks tertentu, kepekaan dan kekhususan peramal ini kekal di bawah optimum(7). Pendekatan unimodal ini mungkin gagal menangkap sepenuhnya mekanisme kompleks yang mendasari imuniti antitumor, termasuk sifat dinamik tindak balas sedemikian yang berlaku merentasi tisu dan dari masa ke masa.

Oleh itu, aplikasi pendekatan pemprofilan imun sel tunggal yang sangat bermultipleks kepada pengesanan biomarker dan penemuan sasaran dalam merentas tisu, cara membujur boleh memberikan fenotip imun bernuansa dengan utiliti ramalan dan translasi yang lebih besar.

Untuk tujuan ini, kami membangunkan 34-panel sitometri aliran spektrum parameter dan saluran paip analisis data dimensi tinggi untuk menyoal soal fenotip imun peringkat protein yang dikaitkan dengan fasa berbeza kitaran imunoediting kanser, termasuk pelarian imun dan pertumbuhan tumor serta pusat pemeriksaan imun tindak balas sekatan (ICB) merentas model praklinikal.

Kami memprofilkan model MC38 yang dirawat NPK-C1 dan ICB, menganalisis berbilang tisu (tumor, penyaliran berbanding nodus limfa yang tidak mengering dan darah) di atas dan di sekitar titik infleksi utama dalam perkembangan tumor. Ini memudahkan pencirian mendalam dinamik yang mendasari regresi tumor semula jadi dan yang disebabkan oleh ICB, peralihan kepada keseimbangan imun, dan peralihan seterusnya daripada keseimbangan kepada pelepasan tumor yang tidak terkawal. Kajian pengesahan dalam kumpulan data sel tunggal manusia kanser buah pinggang mengesahkan perkaitan translasi penemuan ini.

Bahan dan Kaedah

tikus. Tikus C57BL/6J jantan dan betina (berusia 5-6 minggu) telah dibeli dari Makmal Jackson (Bar Harbor, ME). Tikus berumur 6-8 minggu pada masa penggunaan. Semua haiwan ditempatkan mengikut peraturan NIH dan American Association of Laboratory Animal Care. Semua eksperimen dan prosedur untuk kajian ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Pusat Perubatan Universiti Columbia (IACUC).

Talian Sel. Talian sel NPK-C1 (asalnya LM7304) disediakan oleh Dr. Cory AbateShen di Universiti Columbia. Lihat rujukan terdahulu untuk butiran lanjut(8,9). Sel NPK-C1 dikekalkan dalam R10, yang terdiri daripada medium RPMI (Corning; Corning, NY) ditambah dengan 10 peratus FBS (HyClone; Logan, UT), 100 U/mL penisilin, dan 100 mg/mL streptomycin (Gibco; Gaithersburg, MD). Sel karsinoma kolon MC38 dibeli dari Kerafast dan dibiakkan dalam D10 yang terdiri daripada DMEM (Corning; Corning, NY) ditambah dengan 10 peratus FBS, 100 U/mL penisilin, dan 100 mg/mL streptomycin (Gibco; Gaithersburg, MD).

Cabaran Tumor dan Suntikan Terapi. Sel NPK-C1 pada 70-90 peratus pertemuan atau sel MC38 pada 50-75 peratus pertemuan telah dituai dengan 0.05 peratus trypsin (Gibco, Gaithersburg, MD), dicuci dengan PBS, dikira dan digantung semula pada 10x106 sel/mL dalam PBS sejuk ais. Pada hari 0, 6-8 minggu tikus telah ditanam pada sayap kanan dengan sel 1x106 NPK-C1 atau MC38. Pengukuran tumor direkodkan dalam dimensi X, Y dan Z (masing-masing diameter terbesar, diameter terkecil dan ketinggian terbesar) setiap 2-3 hari dengan angkup digital dan volum tumor dikira dengan mendarabkan X*Y*Z. Anti-PD-1 (RMP1- 14 IgG2a,κ) atau antibodi isotype Rat IgG2a (Bio X Cell; Lebanon, NH) telah dicairkan dalam PBS steril dan ditadbir melalui suntikan intraperitoneal (IP) pada 200 ug/ mL setiap tetikus pada hari 3, 6, 9, dan 12 implantasi selepas MC38.

Penuaian Tisu. Berikutan euthanasia tikus, ~200 ul darah telah diasingkan melalui tusukan jantung menggunakan jarum picagari bersalut heparin (StemCell Technologies; Vancouver, BC) 0.2 peratus dan diletakkan di atas ais dalam tiub yang mengandungi 10 ul 0.5M EDTA (Corning; Corning, NY). Nodus limfa inguinal yang mengeringkan tumor dan tidak mengeringkan telah dibedah dan diletakkan dalam 48-plat perigi yang mengandungi media 150 ul R10 di atas ais.

Tumor dituai, dijisim, dan sehingga 50 mg tumor dipotong dadu dan diletakkan dalam media X-Vivo 15 (Lonza; Basel, Switzerland) dalam 5mL tiub Eppendorf di atas ais. DNase (40 ul larutan 20 mg/mL; Roche; Basel, Switzerland) dan Collagenase D (125 ul larutan 40 mg/mL; Roche; Basel, Switzerland) telah ditambah kepada sampel tumor sebelum pengeraman pada shaker pada suhu 37o C untuk 30 minit. Tindak balas penghadaman telah dipadamkan dengan vorteks (30 saat) dan menambah media 5mL R10. Pencernaan tumor telah ditapis melalui penapis 70 μm (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) dan pellet. Sampel darah telah dilisiskan RBC dengan dua kali inkubasi 2-minit berturut-turut dalam penimbal ACK 2mL (Biologi Berkualiti; Gaithersburg, MD) dan pelindapkejutan dalam R10 sebelum pelleting. Nodus limfa diasingkan secara fizikal dengan pelocok picagari 1mL dalam 48-plat perigi, kemudian ampaian ditapis melalui penapis 40-um. Semua sampel diletakkan dalam plat perigi 96-U-bawah untuk pewarnaan.

Sitometri Aliran. Sampel telah dibasuh dengan PBS. Sel-sel mati telah diwarnai oleh penggantungan semula dalam 100 ul PBS ditambah pewarna Biru Boleh Dibetulkan Hidup/Mati (1:500; Invitrogen; Waltham, MA). Ini dan semua langkah pewarnaan atau penetapan selanjutnya dilakukan selama 30 minit pada suhu bilik pada penggoncang plat, dilindungi daripada cahaya. Sampel telah dibasuh 2x dengan PBS, kemudian digantung semula dalam FACS (PBS ditambah 3 peratus FBS ditambah 1mM EDTA ditambah 10mM HEPES) ditambah dengan TruStain FcX (1:50; BioLegend; San Diego, CA) dan TruStain Monocyte Blocker (1:20; BioLegend; San Diego, CA) dan diletakkan di atas ais.

Antibodi permukaan disediakan pada pencairan optimum (lihat Jadual Tambahan S1) dalam FACS ditambah dengan penimbal Brilliant Stain Plus (BD; Franklin Lakes, NJ), kemudian ditambah kepada sampel dalam larutan penyekat. Selepas pewarnaan, sampel dibasuh 2x dengan penimbal FACS dan difiksasi dalam 100 ul penampan Kit Penetapan/Permeabilisasi FoxP3 (eBioscience; San Diego, CA). Sampel telah dibasuh dua kali dengan penimbal Permeabilisasi 1X (1X PW) dan kemudian diwarnakan dalam 1X PW ditambah antibodi intrasel. Sampel kemudian dibasuh dua kali dalam 1X PW kemudian difiksasi dalam 100 ul penimbal FluoroFix (BioLegend: San Diego, CA), dibasuh dua kali dengan FACS, kemudian digantung semula dalam 200 ul FACS dan dimeteraikan dalam 96 plat telaga untuk pemerolehan pada hari berikutnya pada Cytek Aurora 5-sitometer laser.

Sampel splenosit yang diwarnakan secara serentak digunakan untuk kawalan noda tunggal. Analisis dan Statistik. Eksperimen pemprofilan membujur telah dijalankan sekali setiap satu untuk model MC38 dan NPK-C1. Sejumlah n=10-25 tikus setiap titik masa telah dinilai. Data sitometri aliran dianalisis dalam FlowJo v10.8.1 (BD; Franklin Lakes, NJ), dan algoritma pemalam dimensi tinggi UMAP dan FlowSOM telah dimuat turun daripada FlowJo Exchange. Sehingga 30k CD45 hidup ditambah sel penyusupan tumor dan sehingga 15k CD45 hidup ditambah darah atau sel terhasil LN bagi setiap sampel telah digabungkan untuk analisis dimensi tinggi.

Semua pengurangan dimensi dan pengelompokan telah dilakukan dalam FlowJo. Analisis statistik telah dilakukan dalam GraphPad Prism v9.3.1. Korelasi Pearson digunakan untuk menjana pekali korelasi, dan ujian-T Pelajar yang tidak berpasangan dengan pembetulan Welch digunakan untuk membandingkan frekuensi kelompok antara kumpulan. Kaedah analisis sel tunggal telah diterangkan sebelum ini(10,11).

Regulon KLRG1 diekstrak daripada regulon metaVIPER KLRG1 konsensus dari Obradovic, et al (11). Untuk mengira tandatangan regulon KLRG1, kami menyesuaikan model regresi hutan rawak dengan gen regulon sebagai ciri dan KLRG1 sebagai sasaran, kemudian mengira skor kepentingan Gini bagi gen regulon untuk menentukan kesannya terhadap ekspresi KLRG1. Skor regulon KLRG1 setiap sel diberikan oleh jumlah wajaran ukuran ekspresi semua gen regulon dalam sel dengan skor kepentingan sebagai pemberat.

For more information:1950477648nn@gmail.com