Varian Apolipoprotein L1 yang berkaitan dengan penyakit buah pinggang Menunjukkan Keuntungan Fungsi dalam Aktiviti Saluran Kation

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Jonathan Bruno dan John C. Edwards

Varian dalam Apolipoprotein L1 (ApoL1) diketahui bertanggungjawab untuk peningkatan risiko beberapa progresifbuah pinggangpenyakitdi kalangan orang keturunan Afrika. ApoL1 ialah protein amfitropik yang boleh dimasukkan ke dalam membran fosfolipid dan memberikan kebolehtelapan selektif anion atau kation kepada membran fosfolipid bergantung kepada pH. Sama ada aktiviti ini berbeza antara varian atau sama ada ia menyumbang kepada patogenesis penyakit tidak diketahui. Kami menggunakan ujian fluks ion yang dipacu voltan daripada vesikel fosfolipid dan persatuan membran stabil untuk menilai perbezaan antara isoform ApoL1. Terdapat peningkatan ketara (kira-kira dua kali ganda) dalam aktiviti permease ion selektif kation bagi dua varian berkaitan penyakit buah pinggang berbanding dengan protein rujukan. Sebaliknya, kami mendapati tiada perbezaan dalam aktiviti permease selektif anion pada pH rendah di kalangan isoform. Berbanding dengan jujukan rujukan, kedua-dua varian berkaitan penyakit menunjukkan peningkatan perkaitan stabil dengan vesikel fosfolipid di bawah keadaan yang menyokong aktiviti kationpermease, menunjukkan bahawa peningkatan aktiviti mungkin disebabkan oleh perkaitan dan penyisipan membran yang lebih cekap. Tiada perbezaan dalam perkaitan membran antara isoform di bawah keadaan optimum untuk aktiviti permease anion. Data ini menyokong model di mana kebolehtelapan kation dipertingkatkan boleh menyumbang kepada penyakit buah pinggang progresif yang dikaitkan dengan alel ApoL1 berisiko tinggi.

Dua varian berbeza dalam protein ApoL1 diketahui bertanggungjawab terhadap peningkatan risiko progresifproteinurik yang diiktiraf.buah pinggangpenyakitpada orang keturunan Afrika, terutamanya disebabkan oleh glomerulosklerosis segmental fokus, nefrosklerosis hipertensi, dan nefropati berkaitan HIV(1–3). Peranan fungsi ApoL1 dalam sel manusia, kesan varian yang berkaitan dengan penyakit pada fungsi ini, dan bagaimana ketidakaktifan perubahan sedemikian boleh mempercepatkanpenyakit buah pinggangtidak jelas (4, 5).

Satu-satunya aktiviti biokimia yang diketahui dimiliki oleh protein ApoL1 adalah berfungsi sebagai saluran ion. Domain terminal N ApoL1 telah diperhatikan mempunyai kesamaan struktur dengan bakteria colicin A1 (6). Seperti colicin A1, ApoL1 ialah protein amfitropik yang dalam keadaan tertentu boleh memasuki membran lipid daripada larutan akueus dan kemudian berfungsi sebagai permease ion (6–9). ApoL1 jenis liar rekombinan yang telah dimurnikan stabil dalam larutan detergen pada pH neutral (8, 9). Pada pH rendah, ApoL1 boleh memasuki membran fosfolipid dan meningkatkan kebolehtelapan selektif anion bagi membran(6, 7, 9). Apabila pH cis dinaikkan kembali kepada neutral, kebolehtelapan selektif anion ditindas dan saluran selektif kation diaktifkan (8, 9). Data ini menyokong model di mana ApoL1, yang dibentangkan kepada petak berasid di sepanjang laluan eksositik atau endositik, boleh dimasukkan ke dalam membran pengehad organel yang membawa kepada peningkatan kebolehtelapan anion. Pemerdagangan protein seterusnya ke petak membran lain di mana pH cis adalah neutral (seperti membran plasma atau membran mitokondria) akan menyekat kebolehtelapan anion dan mengaktifkan kationpermease. Sama ada aktiviti meresap ion ini memainkan peranan dalam patogenesis ApoL1-yang berkaitanbuah pinggangpenyakittidak jelas.

Kami menggunakan kaedah berasaskan vesikel untuk menguji perbezaan aktiviti peresapan inion dan pengikatan membran antara jujukan rujukan (jenis liar), G0 yang ditetapkan dan varian yang berkaitan dengan dua penyakit, G1 dan G2 yang ditetapkan. Kami mendapati bahawa berbanding dengan G0, kedua-dua isoform G1 dan G2 menunjukkan peningkatan aktiviti spesifik aktiviti permease kation pada pH neutral tanpa mengubah aktiviti permease selektif anion pada pH rendah. Selanjutnya, isoform G1 dan G2 berkaitan penyakit menunjukkan perkaitan membran stabil yang meningkat berbanding dengan G{12}} dalam keadaan yang menyokong aktiviti cationpermease tetapi tidak dalam keadaan yang menyokong aktiviti permease theanion. Kami tidak menemui sebarang kesan pada corak kepekaan pH sama ada langkah pengikatan atau langkah efluks aktiviti saluran kation, dan kami mendapati tiada kesan ke atas kepekaan pH aktiviti permease selektif anion. Kami membuat kesimpulan bahawa varian ApoL1 yang berkaitan dengan penyakit secara selektif meningkatkan aktiviti saluran kation protein, kemungkinan sekurang-kurangnya sebahagiannya dengan meningkatkan kemasukan membran. Kami mencadangkan aktiviti saluran yang dipertingkatkan ini menyumbang kepada progresifbuah pinggangpenyakitpada orang yang membawa genotip berisiko tinggi.

Cistanche boleh merawatpenyakit buah pinggang

Keputusan

Isoform rekombinan ApoL1 dengan jujukan isyarat terminal N dialih keluar dan digantikan dengan tag 6His/T7epitope telah dinyatakan dan disucikan. Ketiga-tiga menunjukkan sifat kromatografi yang sama melalui penulenan dan tidak dapat dibezakan oleh elektroforesis gel Rajah 1.

Pecahan puncak telah dicairkan kepada 100 ug/ml dan menjalani ujian efluks tovesicle untuk keupayaan untuk memberikan kebolehtelapan klorida dan kalium. Ujian terdiri daripada dua peringkat berasingan. Pada peringkat persatuan, ApoL1 dicampur dengan vesikel fosfolipid yang dimuatkan KCl dan dibenarkan untuk dimasukkan ke dalam membran. KCl dan penimbal Ekstravehikular kemudiannya dikeluarkan melalui laluan melalui lajur putaran penyahgaraman yang diseimbangkan dalam sukrosa isotonik, menghasilkan kecerunan besar dalam-ke-luar kedua-dua Kand Ion Cl. Pada peringkat efluks, eluat lajur putaran dicairkan ke dalam larutan sukrosa terbuffer isotonik yang mengekalkan kecerunan KCl pada pH yang dikehendaki. Kepekatan Kl Ekstravehikular dipantau dengan elektrod selektif klorida. Walaupun sama ada kebolehtelapan K atau Cl-selektif hadir, tiada ion akan dapat keluar dari vesikel kerana kekurangan pergerakan balas. Efluks ion dipacu voltan dimulakan dengan penambahan kepekatan tepu ionofor balas. Penambahan ionofor selektif K, valinomycin(Val), akan mendorong potensi membran negatif dalam yang besar, jika kebolehtelapan Cl hadir, akan memacu efluks KCl yang akan dikesan oleh elektrod selektif klorida; maka selepas Val, kadar efluks Cl mencerminkan kebolehtelapan Cl. Sebaliknya, penambahan ionofor Cl-selektif, Chloride Ionophore 1(CI1), akan mendorong potensi membran positif dalam yang akan memacu efluks KCl jika kebolehtelapan K hadir. Oleh itu, selepas penambahan CI1, kadar efluks Cl mencerminkan kebolehtelapan K. Oleh itu, ujian ini boleh berfungsi sama ada sebagai ujian kebolehtelapan Cl atau K, bergantung pada ionofor yang digunakan. Kadar awal ionefflux berikutan penambahan ionofor diambil sebagai kebolehtelapan spesifik vesikel. Perhatikan, efluks Cl sebelum penambahan ionofor menunjukkan beberapa kebolehtelapan kepada kedua-dua Kand Cl. Walaupun dalam keadaan ini, kadar efluks Cl selepas penambahan lebihan ionofor pembilang mewakili kebolehtelapan kepada ion yang diminati—Cl selepas penambahan Val, dan K selepas penambahan CI1.

Cistanche boleh merawatpenyakit buah pinggang

Aktiviti meresap klorida

Kajian terdahulu kami menunjukkan bahawa kebolehtelapan anion adalah paling hebat apabila kedua-dua langkah perkaitan membran dan langkah efluks dijalankan pada pH 5.0, dan keadaan ini digunakan untuk membandingkan aktiviti kebolehtelapan Cl bagi tiga isoform, menggunakan Val untuk memulakan Efluks bergantung kepada kebolehtelapan Cl. Contoh data mentah ditunjukkan dalam Rajah 2A, yang menunjukkan keluaran daripada elektrod Cl-selektif dalam milivolt yang diplot melawan masa. Rakaman bermula sebelum penambahan eluat kolum spin yang mengandungi vesikel dan protein, nilai mV mencerminkan kepekatan 10 μM Cl. Luat lajur putaran bebas Cl ditambah pada anak panah pertama, mencairkan Cl, yang dicerminkan dalam pesongan ke atas pengesanan mV. Val tersentuh pada anak panah kedua, mencetuskan efluks Cl jika kebolehtelapan Cl hadir, yang dicerminkan oleh penurunan inmV yang progresif. Triton X-100 ditambah pada anak panah ketiga, melepaskan semua klorida intravesikular yang tinggal. Selepas penukaran daripada kepekatan mV kepada klorida menggunakan lengkung piawai yang dihasilkan untuk elektrod di bawah keadaan ujian, kadar pecahan permulaan pembebasan Cl selepas penambahan Val ditentukan dan diambil sebagai kebolehtelapan klorida. Berbanding dengan kawalan tanpa protein (jejak biru), kadar pelepasan Cl yang tinggi selepas penambahan Val menunjukkan bahawa ApoL1 memberikan kebolehtelapan Cl yang ketara yang kelihatan setanding antara tiga isoform (jejak merah, hijau dan kuning). Kadar efluks yang sangat rendah sebelum Val menunjukkan bahawa kebolehtelapan kalium adalah jauh lebih rendah daripada kebolehtelapan Cl. Pelbagai kepekatan isoform ApoL1 telah diuji untuk permeaseaktiviti Cl (Rajah 2B). Seperti yang dilaporkan sebelum ini untuk G0, kami mendapati aktiviti Clpermease berkaitan secara linear dengan jisim protein dalam ujian untuk ketiga-tiga isoform. Aktiviti permease pada setiap kepekatan tidak berbeza antara ketiga-tiga isoform. Keluk kepekatan dilakukan dua kali menggunakan dua set sediaan protein yang berbeza, menghasilkan keputusan yang sama.

Enam persediaan bebas daripada tiga protein telah diuji untuk aktiviti permease Cl pada pH 5.0 seperti yang diringkaskan dalam Rajah 2C. Dalam satu set persediaan kami tidak menemui perbezaan yang ketara dalam aktiviti permease Cl antara isoform (p > 0.05 untuk perbandingan G0 dengan G1 atau G2 dalam setiap set) . Purata kadar efluks bagi kesemua enam penyediaan (dilabel SEMUA dalam Rajah 2C) ialah 1.21 ± 0.32 peratus /s untuk jujukan rujukan G0, 1.36 ± 0.41 peratus /s untuk G1, dan 1.18 ± 0.34 untuk G2(min ± SD, n=6 bagi setiap satu; p=0.47 dan 0.94 untuk perbandingan G0 dengan G1 dan G2, masing-masing). Untuk menentukan sama ada mutasi yang berkaitan dengan penyakit mengubah sensitiviti pH permease theanion, kebolehtelapan Cl yang diberikan oleh setiap isoform telah diuji melalui julat nilai pH, menggunakan pH yang ditunjukkan untuk kedua-dua perkaitan dan langkah efluks ujian (Rajah 2D). Kami mendapati tiada perbezaan ketara antara isoform. Eksperimen ini dilakukan dua kali menggunakan dua set sediaan protein yang berbeza, menghasilkan keputusan yang sama. Oleh itu, aktiviti Clpermease tidak jauh berbeza antara varian yang berkaitan dengan dua penyakit dan urutan rujukan.

Aktiviti permease kalium

Kajian terdahulu kami menunjukkan bahawa kebolehtelapan kation adalah paling hebat apabila langkah perkaitan membran dijalankan pada pH 6.0 dan langkah efluks dijalankan pada pH 7.5, dan kami menggunakan syarat ini melainkan dinyatakan sebaliknya. Contoh data mentah daripada ujian permease K ditunjukkan dalam Rajah 3. Seperti ujian kebolehtelapan Cl, eluat lajur putaran ditambah pada anak panah pertama, ionofor (dalam kes ini, Chloride Ionophore1, CI1) ditambah pada anak panah kedua, dan detergen ditambah pada anak panah ketiga. Kadar awal efluks selepas penambahan ionofor, mewakili kebolehtelapan K, ditunjukkan oleh garis putus-putus kelabu. Pengesanan biru adalah daripada kawalan tanpa protein, menunjukkan kebolehtelapan latar belakang endogen vesikel sahaja. Pengesanan merah menunjukkan aktiviti varian G0(jenis liar), menunjukkan dengan jelas kehadiran kebolehtelapan K lebih besar daripada vesikel kawalan yang diberikan oleh protein seperti yang dilaporkan sebelum ini (9). Jejak kuning dan hijau menunjukkan aktiviti varian G1 dan G2, masing-masing. Cerun awal selepas penambahan ionofor jelas lebih besar untuk G1 dan G2 berbanding G0, menunjukkan bahawa varian yang berkaitan dengan penyakit menyokong aktiviti permease K yang lebih besar daripada G0.

Berbeza dengan ujian kebolehtelapan Cl, dan seperti yang dilaporkan sebelum ini untuk isoform G0 (9), di bawah keadaan ujian permease K, terdapat beberapa efluks sebelum ionofor dalam vesikel yang mengandungi mana-mana daripada tiga isoform, yang diwakili oleh cerun ke bawah. daripada rakaman selepas penambahan sampeldan sebelum penambahan ionofor. Walaupun kadar efluks yang tinggi selepas penambahan ionofor menunjukkan kehadiran kebolehtelapan K yang besar, efluks sebelum ionofor menunjukkan kewujudan beberapa kebolehtelapan Cl juga, membenarkan kedua-dua ion keluar dari vesikel tanpa ketiadaan ionofor. Ini secara jelas menyumbang kepada kedua-dua kenaikan tumpul dalam output elektrod sejurus selepas penambahan eluat lajur putaran dan cerun ke bawah yang berikutnya sebelum CI1 yang dilihat dengan semua rakaman yang mengandungi ApoL1. Dengan mengandaikan kebocoran ini bermula apabila sampel melalui lajur putaran, ia juga akan mengambil kira perbezaan dalam kepekatan Cl akhir selepas penambahan detergen, kerana sebarang kehilangan KCl pada lajur putaran bermakna kurang jumlah KCl yang ditambahkan pada ujian. Tafsiran kuantitatif bagi kadar ionofor tidak mudah selain ia mestilah fungsi kebolehtelapan kepada kedua-dua Kand Cl. Seperti sebelum ini (9), kami mengaitkan aktiviti ini kepada aktiviti permease sisaCl yang kami lihat pada pH 7.5 seperti dalam Rajah 2D (lihat juga Bruno et al. (9), Rajah 4D).

Ujian permease kalium telah dijalankan ke atas julat kepekatan protein (Rajah 4A). Aktiviti ini berkaitan secara linear dengan jisim protein dalam ujian untuk setiap isoform, tetapi kedua-dua isoform yang berkaitan dengan penyakit menunjukkan peningkatan aktiviti efluks dengan ketara berbanding dengan G0. Keluk kepekatan ini dihasilkan semula dengan tiga set penyediaan protein yang berasingan yang menghasilkan keputusan yang hampir sama.

Enam persediaan bebas daripada tiga isoform telah diuji untuk aktiviti K efflux menggunakan 2 ug protein dalam setiap ujian. Dalam setiap satu daripada enam set, aktiviti untuk isoform G1 dan G2 adalah jauh lebih besar daripada G0 (Rajah 4B). Purata kesemua enam set data menghasilkan kadar efluks 0.349 ± 0.063 peratus /s untuk G{{10}}, {{15} }.709 ± 0.176 peratus /s untuk G1 dan 0.673 ± 0.142 peratus /s untuk G2 (min ± SD, n=6 untuk setiap; p < 0.00001="" untuk="" perbandingan="" g0="" dengan="" sama="" ada="" g1="" atau="" g2).="" aktiviti="" khusus="" permease="" k="" g1="" dan="" g2="" ialah="" 2.03-="" dan="" 1.93-lipat="" ganda,="" masing-masing,="" daripada="" g0="" oleh="" ujian="">

Kebergantungan aktiviti K permease pada pH langkah perkaitan membran dan langkah efluks ion dianalisis secara berasingan. Walaupun kami mengesahkan bahawa jumlah aktiviti efluks G1 dan G2 adalah lebih besar daripada G0 dalam keadaan "standard" (mengikat pada pH 6, efluks pada pH 7.5), kami mendapati tiada perbezaan ketara dalam bentuk lengkung keaktifan berbanding pH luaran (cis) sama ada langkah perkaitan membran (Rajah 4C) atau langkah efluks ion (Rajah 4D). Kami juga mendapati tiada perbezaan antara isoform dalam pergantungan aktiviti pada pH intravesikular (trans) yang tinggi atau keperluan untuk kehadiran kation divalen (Rajah 4E), dan selanjutnya ambil perhatian bahawa sama ada kalsium atau magnesium adalah sama cekap dalam menyediakan kation divalen yang diperlukan untuk penuh. aktiviti. Setiap eksperimen ini dilakukan dua kali menggunakan set protein yang disucikan yang berbeza, menghasilkan keputusan yang sama.

Persatuan membran yang stabil

Kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa rekombinanApoL1 yang disucikan secara spontan mengikat membran fosfolipid yang menunjukkan pergantungan yang sama pada komposisi pH dan fosfolipid seperti aktiviti permease ion (9). Dengan menggunakan kaedah yang sama, kami membandingkan sifat mengikat vesikel lipid versi rujukan ApoL1 dengan varian berkaitan penyakit buah pinggang di bawah keadaan yang menyokong aktiviti permease Cl atau K optimum (Rajah 5). Untuk keadaan Clpermease, protein diinkubasi dengan lipid vesiclesat pH 5.0 sebelum pengekstrakan chaotropic untuk mengeluarkan protein yang tidak dikaitkan secara stabil dengan vesikel. Protein terikat membran telah diasingkan dengan pengapungan melalui sukrosecushion dan dinilai oleh western blotting kuantitatif. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 5A. Tiada perbezaan ketara dalam jumlah protein yang terikat kepada vesikel antara G{{10}} dan sama ada isoform G1 atau G2. Daripada 500 protein dalam setiap tindak balas, jumlah yang terikat pada vesikel ialah 223 ± 33 ng untuk G0,239 ± 38 ng untuk G1 dan 191 ± 28 ng untuk G2 (min ± SD ; n=8 untuk setiap kumpulan, p=0.35 dan 0.076 untuk perbandingan G0 denganG1 dan G2, masing-masing). Kira-kira 40–50 peratus daripada protein dalam ujian terikat pada membran di bawah keadaan ini. Eksperimen ini dilakukan dua kali menghasilkan keputusan yang hampir sama.

Untuk menilai pengikatan dalam keadaan optimum untuk aktiviti Kpermease, protein diinkubasi dengan vesikel pada pH6.0, kemudian beralih kepada pH 7.5 sebelum pengekstrakan huru-hara untuk membuang protein yang tidak dimasukkan secara stabil. Protein terikat membran telah diasingkan dengan pengapungan vesikel membran melalui kusyen asukrosa dan dinilai dengan pembongkaran barat kuantitatif. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 5B. Varian yang berkaitan dengan penyakit menunjukkan pengikatan yang jauh lebih cekap berbanding dengan G0. Daripada 500 ng protein yang ditambahkan pada setiap tindak balas, jumlah yang terikat pada vesikel ialah 43.5 ± 14.5 ng (n=8) untuk G{{30}} ,73.0 ± 17.7 ng (n=7) untuk G1 dan 69.3 ± 10.3 ng (n=8) untuk G2(min ± SD; p=0.00076 dan 0.0018 untuk perbandingan G0 dengan G1 dan G2, masing-masing). Kira-kira 9 peratus daripada protein G0 dalam tindak balas telah dikaitkan secara stabil dengan vesikel berbanding dengan kira-kira 14 peratus daripada G1 dan G2 di bawah keadaan ini. Eksperimen ini dilakukan dua kali menggunakan persediaan bebas yang menghasilkan keputusan yang sama.

Perbincangan

Kami di sini membentangkan hasil kajian aktiviti permease ion ApoL1 dannyabuah pinggang-penyakit-varian berkaitan yang menghasilkan beberapa keputusan penting. Pertama, kami mendapati bahawa varian ApoL1 yang berkaitan dengan penyakit telah meningkatkan aktiviti Kpermease dengan ketara, iaitu lebih kurang dua kali ganda daripada isoform G0 dalam ujian kami. Kedua, berbeza dengan Kpermease, tiada perbezaan ketara dalam kekhususan aktiviti Cl permease pada pH 5.0 antara isoform. Ketiga, tiada perbezaan dalam kepekaan pH sama ada aktiviti K atau Cl permease, atau keperluan untuk pH trans tinggi dan keperluan kation divalen untuk aktiviti Kpermease di kalangan isoform. Keempat, di bawah keadaan optimum yang menyokong permease K, varian berkaitan penyakit menunjukkan perkaitan membran stabil yang dipertingkatkan berbanding dengan G0, tetapi tiada perbezaan dalam perkaitan membran di bawah keadaan optimum untuk aktiviti permease Cl.

Penemuan kami menunjukkan peningkatan K permease tanpa kesan pada Cl permease adalah sangat teguh. Dengan menggunakan keadaan optimum untuk setiap aktiviti permease, kami mendapati pada dasarnya hasil yang sama antara enam set persediaan bebas, dengan aktiviti Kpermease bagi varian yang berkaitan dengan penyakit jauh lebih besar daripada G0 dalam setiap satu. Setiap set disediakan dan diuji pada masa yang sama menggunakan reagen biasa. Kesahihan kepekatan protein yang ditentukan oleh ujian BCA telah disahkan oleh keamatan setanding pewarnaan Coomassie pada SDS-PAGE. Data ini termasuk semua percubaan yang berjaya pada penulenan serentak—kami tidak pernah berjaya menjana aset bagi ketiga-tiga varian yang aktiviti relatif ini tidak diperhatikan.

Begitu juga, ketiadaan perbezaan dalam aktiviti khusus anion-permease pada pH 5 adalah konsisten di antara semua set persediaan. Oleh itu kesimpulan utama kami adalah bahawa varian ApoL1 yang berkaitan dengan penyakit memberikan keuntungan terpilih fungsi dalam aktiviti K permease tanpa menjejaskan aktiviti permease Cl, seperti yang diuji di bawah keadaan optimum untuk setiap aktiviti ini. Kehadiran perbezaan besar dalam aktiviti saluran kation varian ApoL1 yang berkorelasi dengan kapasiti untuk memacu penyakit mempunyai implikasi untuk kemungkinan mekanisme patogenik. Sifat selektif kebolehtelapan ion yang meningkat menunjukkan bahawa peningkatan aktiviti resapan kation bagi varian yang berkaitan dengan penyakit boleh menyumbang kepada penyakit, tetapi aktiviti resapan anion pada pH rendah, yang tidak berbeza antara isoform, tidak mungkin memainkan peranan yang kritikal.

Penyiasatan tentang kesan varian pada kepekaan pH aktiviti dan sejauh mana pengikatan membran stabil oleh protein memberi penerangan tentang mekanisme yang mana aktiviti K permease boleh dipertingkatkan. Pertama, selain daripada mengesahkan aktiviti dipertingkatkan permease K dalam keadaan optimum, kami mendapati tiada perbezaan dalam bentuk lengkung yang menunjukkan kesan pH pada perkaitan membran dan langkah-langkah efluks aktiviti K permease atau kesan pH ke atas keseluruhan aktiviti Cl permease. Selanjutnya, tiada perbezaan dalam keperluan untuk pH tinggi bahagian dalam vesikel atau dalam keperluan untuk kehadiran kation divalen dalam tindak balas untuk aktiviti permease K di antara semua isoform. Oleh itu, kami tidak menemui bukti untuk perbezaan dalam sifat intrinsik saluran itu sendiri. Sebaliknya, varian menunjukkan perkaitan stabil yang meningkat dengan ketara dengan vesikel fosfolipid di bawah keadaan yang menyokong aktiviti Kpermease, dengan skala kesan ini adalah kira-kira julat yang sama dengan ketidakaktifan perubahan. Secara keseluruhannya, data menunjukkan bahawa asas untuk peningkatan aktiviti permease K adalah pemasukan membran yang lebih cekap di bawah keadaan yang menyokong aktiviti tersebut, tanpa memerlukan perubahan asas dalam sifat protein yang dimasukkan.

Tiga domain telah dikenal pasti dalam struktur ApoL1(6). Aktiviti saluran ion dianggap terletak pada domain "membentuk liang" homolog colicin, yang menduduki kira-kira 60 peratus protein di terminal Nnya. Variasi jujukan berkaitan penyakit tidak berada dalam domain pembentuk liang tetapi terletak pada jarak daripadanya dalam domain gegelung bergelung, yang terdiri daripada kira-kira 16 peratus daripada protein di terminal C. Pemadaman domain ini tidak mempunyai kesan ke atas aktiviti trypanolytic tetapi sangat dipelihara di kalangan isoform Apol dalam dan antara spesies (10). Telah dicadangkan rantau ini berfungsi sebagai domain terkawal (10), dan data kami menunjukkan bahawa mutan penyebab penyakit dalam domain ini sememangnya telah meningkatkan pengikatan membran di bawah keadaan yang menyokong aktiviti saluran kation dan peningkatan aktiviti saluran kation. Satu tafsiran ialah domain terminal-C berfungsi untuk menyekat perkaitan/penyisipan membran yang diperlukan untuk aktiviti permease kation, dan mutasi domain ini melegakan penindasan ini.

Cistanche boleh merawatbuah pinggangpenyakit

Pemerhatian pada pengikatan membran mempunyai implikasi selanjutnya dan menerangkan beberapa aspek hubungan antara aktiviti permease anion dan kation. Kami di sini mendapati bahawa lebih banyak protein terikat pada membran pada keadaan aktiviti permease anion optimum (pH 5.0) daripada keadaan pengikatan tidak optimum yang menyokong aktiviti permease kation (pH 6.0), dan ini benar untuk semua isoform (Rajah 5). Perhatikan perbezaan kepekaan pH aktiviti permease anion (Rajah 2D) dan langkah pengikatan membran bagi aktiviti permease kation (Rajah 4C): permease anion meningkat secara mendadak di bawah pH 6, manakala keupayaan protein dimasukkan ke dalam membran untuk menyokong kation aktiviti meresap turun dengan ketara. Data kami yang dilaporkan sebelum ini menunjukkan bahawa perkaitan membran stabil G0 meningkat dengan ketara apabila pH jatuh melalui julat pH yang sama, dan itu adalah julat di mana pendarfluor protein intrinsik paling ketara ditindas(9), menunjukkan peralihan yang ketara dalam struktur protein. . Secara keseluruhan, data menunjukkan bahawa pemasukan membran pada pH 6.0 pada asasnya berbeza daripada pemasukan membran pada pH 5.0. Pada pH 6.0, pecahan yang lebih kecil daripada protein berkait dengan membran, disertai dengan hanya perubahan kecil dalam pendarfluor intrinsik dan keaktifan anion yang terhad, tetapi dengan kapasiti untuk beralih kepada bentuk telap kation apabila petak cis dititrasi kepada pH7 .5. Selanjutnya, kecekapan pengikatan ini adalah lebih besar untuk varian yang berkaitan dengan penyakit, selari dengan peningkatan aktiviti cationpermease selepas peralihan pH. Sebaliknya, pada pH 5.0 pecahan protein yang lebih besar dikaitkan dengan membran; pengikatan ini disertai dengan perubahan besar dalam pendarfluor intrinsik dan kemunculan aktiviti anionpermease yang lebih besar. Tiada aktiviti mengikat membran mahupun anionpermease berbeza antara isoform. Kapasiti protein yang dimasukkan ini untuk beralih kepada pengesahan permease kation sangat berkurangan. Kami membuat hipotesis bahawa perubahan yang dilaporkan sebelum ini dalam pendarfluor intrinsik apabila pH jatuh daripada 6 hingga 5 mencerminkan perubahan struktur kepada bentuk yang tidak berupaya untuk beralih kepada penyesuaian permeas kation, dan perbezaan antara isoform tidak mempunyai kesan ke atas sifat permease ion konformasi ini.

Pemerhatian baru tambahan ialah ion kalsium dan magnesium adalah sama berkesan dalam menyokong aktiviti saluran kation ApoL1. Ini sangat menunjukkan bahawa peranan kation divalen bukan melalui beberapa pengikatan pertalian tinggi oleh protein, tetapi lebih berkemungkinan kesan penjembatan cas yang kurang spesifik yang membolehkan protein bercas negatif berinteraksi dengan permukaan membran fosfolipid yang bercas negatif.

Penyiasatan lain yang menilai perbezaan dalam aktiviti saluran ion isoform ApoL1 telah diterbitkan. Thompson dan Finkelstein (8) menggunakan kaedah elektrofisiologi dengan teknik dwilapisan lipid planar untuk menilai aktiviti saluran ApoL1 rekombinan yang telah dimurnikan, melaporkan tiada perbezaan dalam ciri saluran antara isoform. Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa kaedah dwilapisan lipid planar dan ujian efluks berasaskan vesikel, sementara kedua-duanya adalah ujian saluran, menghasilkan pelbagai jenis maklumat dan boleh dianggap sebagai sistem eksperimen pelengkap. Kaedah dwilapisan lipid ialah pendekatan yang tiada tandingan untuk mentakrifkan sifat saluran tunggal bagi protein yang telah dimurnikan tetapi merupakan alat yang kurang berkuasa untuk mengukur aktiviti tertentu, manakala ujian efluks vesikel boleh memberikan data kuantitatif tentang aktiviti populasi, tetapi sedikit maklumat tentang sifat saluran tunggal. Oleh itu, pemerhatian Thomp son dan Finkelstein tidak bertentangan dengan pemerhatian kami, yang juga tidak menunjukkan perbezaan ketara dalam sifat intrinsik saluran, tetapi hanya perbezaan dalam aktiviti khusus kira-kira dua kali ganda, skala perbezaan yang agak sukar untuk mengesan dalam sistem lipid dwilapisan.

Penyiasatan menggunakan protein dan lipid yang telah dimurnikan mempunyai sifat mendedahkan sifat yang jelas disebabkan oleh protein itu sendiri dan tidak diubah oleh mana-mana komponen lain, kinetik ekspresi, atau pemerdagangan membran yang menjejaskan sistem yang lebih kompleks. Walau bagaimanapun, mereka semestinya senyap terhadap kesan muktamad aktiviti ini terhadap sel hidup. Kajian menggunakan sistem ekspresi berasaskan sel untuk mengusik aktiviti saluran ion ApoL1 telah dilaporkan (disemak dalam Friedman dan Pollak, 2019 (3)). Olabisi et al.(11) menyatakan isoform ApoL1 dalam sel HEK dan menilai kepekatan kalium intraselular keadaan mantap. Mereka mendapati kalium intrasel yang lebih rendah dalam sel yang menyatakan G1 dan G2 berbanding dengan sel yang menyatakan G0. Walaupun pemerhatian ini boleh konsisten dengan peningkatan kebolehtelapan membran K plasma, K intrasel yang lebih rendah juga boleh menjadi akibat tidak spesifik daripada kesan sitotoksik varian yang lebih besar melalui sebarang mekanisme, yang membawa kepada aktiviti NaK ATPase yang kurang aktif dan/atau pecahan integriti membran plasma. O'Toole et al. (12) ditentukur dengan teliti tahap ekspresi dalam sel HEK dan menilai penampilan aktiviti saluran kation membran plasma, mencari nodifferences antara isoform. Shah et al. (13) melaporkan penyasaran ApoL1 kepada mitokondria di mana varian yang berkaitan dengan penyakit mendorong pembukaan liang peralihan kebolehtelapan mitokondria, selaras dengan bukti terkini untuk sitotoksisiti trypanosome. Sama ada kesan ini memerlukan aktiviti saluran ion ApoL1 tidak jelas. Dengan setiap kajian ini, disebabkan oleh kerumitan sistem ekspresi berasaskan sel, tidak dapat dipastikan sama ada sebarang perbezaan yang dinyatakan adalah disebabkan oleh sifat intrinsik protein atau komponen berinteraksi lain yang terdapat dalam sel.

Mutasi gain-of-function patogenik biasanya menunjukkan corak pewarisan dominan, manakalafenotip penyakit buah pinggangdikaitkan dengan varian ApoL1 adalah resesif. Satu mekanisme yang menyebabkan mutasi keuntungan fungsi mungkin bereses adalah jika protein berfungsi sebagai homomultimer, dan WT boleh memberikan kesan negatif dominan pada varian yang diaktifkan. Sama ada ApoL1 berfungsi sebagai saluran sebagai monomeror multimer pada masa ini tidak diketahui.

Data kami mencadangkan bahawa peningkatan kebolehtelapan kation pada tahap ekspresi protein yang serupa boleh menyumbang kepada tositotoksik dalam podosit atau sel lain. Walau bagaimanapun, nampaknya hanya peningkatan dua kali ganda dalam aktiviti boleh menukar molekul yang kelihatan jinak menjadi satu penyakit memandu. Walau bagaimanapun, penyakit yang dikaitkan dengan varian ApoL1 cenderung menjadi progresif yang perlahan, dan perbezaan halus dalam tempoh masa yang berpanjangan (bulan hingga tahun) boleh dibayangkan mempunyai kesan kumulatif yang besar. Mekanisme potensi ApoL1action lain yang bertanggungjawab untukbuah pinggangkecederaantelah dicadangkan dan disokong oleh bukti (3-5, 11-16), termasuk kesan pada poptosis, autophagy, fungsi mitokondria, pemerdagangan membran intraselular, dan kesan pengantaraan molekul isyarat ekstraselular, antara lain. Kepentingan relatif perbezaan dalam aktiviti saluran ApoL1 yang diterangkan di sini berbanding mekanisme tindakan yang berpotensi dalam penyakit memandu masih perlu ditentukan.

Cistanche boleh merawatbuah pinggangpenyakit

Prosedur eksperimen

Konstruk ungkapan

Pengekodan pET-ApoWT N-terminal 6His dan T7 berteg epitope ApoL1 (versi G0) telah diterangkan sebelum ini (9). Protein yang dikodkan adalah sama dengan kesertaan Genbank#BC143038 (haplotaip 150K, 228I, 255K) daripada asid amino 28 hingga 398, menghapuskan jujukan isyarat dalam asid amino 1–27dan dengan penambahan N-terminal {{ 17}}Tag epitope beliau dan T7 dikodkan oleh plasmid pET28a. Pengekodan plasmid varian G1 dan G2 dihasilkan daripada pET-ApoWT dengan menggantikan serpihan sekatan AleI kepada XhoI dengan serpihan yang mengandungi jujukan varian, disintesis oleh Teknologi DNA Bersepadu, Coralville, IA, dan identiti plasmid yang terhasil yang disahkan oleh penjujukan langsung. Ketiga-tiga binaan adalah sama kecuali penggantian asid amino S342G dan I384M dalam isoform G1 dan pemadaman N388-Y389 dalam isoform G2. Isoform ApoL1 rekombinan telah dinyatakan dalam bakteria dan disucikan seperti yang diterangkan(8) kecuali penimbal lajur S200 mengandungi 0.03 peratus n dodecyl- -D-maltoside (DDM) (Millipore-Sigma). Untuk semua set eksperimen yang membandingkan isoform, bahan-bahan telah dikupas pada masa yang sama di bawah keadaan yang sama menggunakan reagen yang sama. Kepekatan protein ditentukan dengan Kit Ujian ProteinBCA (Thermo Fisher Scientific) menggunakan piawaian albumin bovineserum. Untuk jumlah protein seperti dalam Rajah 1, gel diwarnai dengan Instant Blue (Expedeon Inc). Protein dalam S200buffer dibekukan kilat dalam nitrogen cecair dan disimpan pada -80 C. Aliquot dicairkan di atas ais dan dicairkan dalam penimbal S200 sebelum ujian.

Ionofor

Valinomycin (Millipore Sigma) telah dilarutkan pada 50 mM etanol tak mutlak dan dicairkan kepada 1 mM dalam etanol mutlak sejurus sebelum digunakan. Chloride Ionophore 1 (MilliporeSigma) telah dilarutkan pada 100 mM dalam 1-heksanol dan dicairkan kepada0.2 mM dalam etanol mutlak sejurus sebelum digunakan.

Vesikel membran

Asolectin (fosfatidilkolin kacang soya jenis II, Sigma) adalah diekstrak dari aseton seperti yang diterangkan (30), dikeringkan, dan kemudian dilarutkan dalam kloroform dan disimpan pada –20 C. Aliquot fosfolipid dalam kloroform telah dikeringkan di bawah aliran nitrogen dan terampai pada 20 mg/ml dalam 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH8.0 dengan lima kitaran pencairan beku dan vorteks yang kuat. Suspensi ini disimpan pada -20 darjah. Untuk menghasilkan vesikel KCl-loadedunilamellar kira-kira 200 nm diameter, suspensi lipid telah diluluskan 15 kali melalui penapis membran porepolycarbonate 200 nm menggunakan ruang penyemperit (Avanti Polar Lipid) dan protokol yang disediakan oleh pengilang (17, 18). Vesikel tersemperit disimpan di atas ais dan digunakan dalam masa 24 jam.

Ujian aktiviti

Ujian aktiviti resapan ion menggunakan efluks KCl dipacu potensi membran yang dikesan dengan elektrode selektif klorida dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini (9). Dua puluh mikroliter ApoL1 dalam penimbal S200 (15{{20}} mM NaCl, 10 mM Tris pH8.3, 0.3 peratus DDM) ditambah hingga 380 ul campuran tindak balas terdiri daripada 82 mM KCl, 127 mM sukrosa, 42.1 mM penimbal pada pH yang ditunjukkan (MES untuk pH 5–6.5, HEPES untuk pH 7.0–8.0), 2.63 mMCa(glukonat)2, dan 1.84 mg/ml ekstrusi vesikel.Campuran diinkubasi pada suhu bilik selama 4 minit sebelum melalui kolum 3 ml Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad) yang diseimbangkan dalam sukrosa 330 mM. eluat segera ditambah kepada 2 ml 330 mM sukrosa, 10-5 M KCl,2.5 mM Ca(glukonat)2, dan 10 mM penimbal (MES untuk pH 5–6.5; HEPES untuk pH 7–8) seperti yang ditunjukkan, dengan pemantauan berterusan dengan elektrod selektif klorida dan direkodkan seperti yang diterangkan. Selepas 20 saat, efluks dipacu voltan dimulakan dengan penambahan ionofor (2.5 ul sama ada 1 mM valinomycin atau 0.2 mMChloride Ionophore 1 dalam etanol) dan dibenarkan untuk meneruskan selama 30 saat diikuti dengan penambahan Triton X-100 kepada 0.1 peratus untuk melepaskan baki klorida intravesikular. Data mentah dalam mV telah ditukar kepada kepekatan Cl menggunakan lengkung piawai yang dihasilkan untuk elektrod di bawah keadaan ujian. Kadar pecahan awal pembebasan klorida diperoleh daripada 3 saat semasa tindak balas segera maksimum kepada penambahan ionofor.

Semua perbandingan aktiviti dilakukan dengan menggunakan bahan daripada penyediaan serentak ketiga-tiga isoform yang telah dicairkan kepada 100 ug/ml protein dalam penimbal S200 sebelum ujian.

Ujian persatuan membran

Ujian perkaitan membran telah dijalankan secara berasingan di bawah keadaan optimum untuk aktiviti permease Cl dan untuk aktiviti permease K. Untuk keadaan yang menyokong aktiviti Clpermease, 5 ul daripada 100 protein ug/ml dalam 1{{30}} mM Tris pH8.2, 150 mM NaCl , 0.03 peratus DDM telah ditambah kepada 95 ul campuran tindak balas (3.4 mg/ml vesikel isoletin (dimuat dengan 200 mM KCl,5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 5.0, 2.5 mM Ca(glukonat) 2, 100 mM KCl, 100 mM sukrosa) dan diinkubasi pada suhu bilik selama 1 minit. Nisbah protein-ke-lipid dalam ujian ialah 1:680 jisim/jisim. Sampel dicairkan tanpa anjakan pH dengan penambahan 200 ul 60 mM MES pH 5.0, 2.5 mMCa(glukonat)2, 100 mM KCl, 100 mM sukrosa dan diinkubasi selama 20 saat. Seratus mikroliter 8 M urea ditambah, dicampur, dan kemudian diinkubasi pada suhu bilik selama 15 minit. Kepekatan sukrosa dibawa kepada 40 peratus dengan penambahan 1.6 ml 50 peratus sukrosa. Sampel 2 ml dilapisi di bawah 1 ml 30 peratus sukrosa dalam 8 mM MES pH 5.0, yang seterusnya di bawah 1.7 ml 8 mM MES pH 5.0 tanpa sukrosa. Kecerunan curam diempar pada 200,000g dalam pemutar Beckman Coulter TLA-110selama 90 minit pada 4 C. Vesikel dikumpulkan dari antara muka sukrosa 0 hingga 30 peratus. Pecahan yang sama sampel telah dicairkan 4 kali ganda dan diempar pada 100,000g selama 1 jam. Pelet membran telah dikeringkan, dipisahkan oleh SDS-PAGE, membran topolyvinylidene fluoride yang dipadamkan, dan disiasat dengan westernblotting dengan antibodi kepada epitope T7 (MilliporeSigmaproduct no. 69522-3) dengan pengesanan chemiluminescence menggunakan sistem pengimejan digital. Pencairan bersiri protein yang telah dimurnikan telah disertakan pada gel untuk menjana isotype dan lengkung piawai khusus blot untuk setiap protein.

Untuk keadaan yang menyokong aktiviti K permease, 5 ul daripada 100ug/ml protein dalam 10 mM Tris pH 8.2, 150 mM NaCl, 0.03 peratus DDM telah ditambah kepada 95 ul daripada campuran tindak balas (3.4 ug/ml isolektinvesikel (dimuat dengan 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 6.0, 2.5 mM Ca(glukonat)2, 100 mM KCl, 100 mM sukrosa) dan diinkubasi pada suhu bilik untuk1 min. Sampel telah dicairkan dengan peralihan pH kepada 7.5 dengan penambahan 200 ul 60 mM HEPES pH 8.0, 2.5 mM Ca(glukonat)2,100 mM KCl, 100 mM sukrosa dan diinkubasi selama 20 saat. Seratus mikroliter 500 mM Na2CO3 telah ditambah dan diinkubasi pada suhu bilik selama 15 minit. Kepekatan sukrosa dibawa kepada 40 peratus dengan penambahan 1.6 ml 50 peratus sukrosa. Sampel 2 ml dilapisi di bawah 1 ml 30 peratus sukrosa dalam 8 mM Tris pH 8.3, yang seterusnya di bawah 1.7 ml 8 mM Tris pH 8.3 tanpa sukrosa. Kusyen sukrosa telah disentrifugasi dan sampel dikumpulkan dan diproses seperti di atas.

Perangkaan

Kepentingan perbezaan antara pasangan min dalam set data ditentukan menggunakan analisis varians (ANOVA)(19). Parameter statistik ditentukan menggunakan fungsi yang dibenamkan dalam Excel. Nilai P dikira menggunakan socscistatistics.com. Semua titik data dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai (SD), ditentukan dengan fungsi STDEV.S Excel untuk setiap kumpulan individu replika.

Ketersediaan dataSemua data yang menyokong kertas kerja ini akan dikongsi atas permintaan kepada Dr. John C. Edwards, john.edwards@health.slu.edu.

Cistanche boleh merawatbuah pinggangpenyakit

Ucapan terima kasih—Kami mengucapkan terima kasih kepada Bahagian Nefrologi dan Jabatan Perubatan Dalaman Universiti Saint Louis atas sokongan yang penting untuk melaksanakan kerja ini.

Sumbangan pengarang—JCE menyusun dan menyelia kajian, menjamin pembiayaan, melakukan ujian efflux, mentafsir data, dan menulis kertas kerja; JB membersihkan protein, melakukan ujian persatuan membran, mentafsir data, menyediakan angka dan menyunting kertas.

Pembiayaan dan maklumat tambahan—Kerja ini dibiayai oleh sumber institusi Universiti Saint Louis dan oleh NationalInstitutes of Health memberikan R01 DK120651 kepada JCE Kandungan kertas kerja ini adalah tanggungjawab pengarang semata-mata dan tidak semestinya mewakili pandangan rasmi Institut Kesihatan Nasional.

Konflik kepentingan—Pengarang mengisytiharkan bahawa mereka tidak mempunyai konflik kepentingan dengan kandungan artikel ini.

Singkatan—Singkatan yang digunakan ialah: ApoL1, apolipoproteinL1; CI1, klorida ionofor 1; DDM, n-dodecyl- -D-maltoside;PVDF, polivinilidena fluorida; SD, sisihan piawai; Val,valinomycin.

Daripada: 'buah pinggang-penyakit-varian berkaitan Apolipoprotein L1 menunjukkan keuntungan fungsi dalam aktiviti saluran kation' olehJonathan Bruno dan John C. Edwards

---J. biol. Kimia. (2021) 296 100238

Rujukan

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Tombol Uscinski, AL, Bernhardy, AJ, Hicks, PJ, Nelson, GW, Vanhollebeke, B., Winkler, CA, et al. (2010) Persatuan varian trypanolytic ApoL1 denganbuah pinggangpenyakitdalam orang Afrika Amerika. Sains 329, 841–845
2. Parsa, A., Kao, WH, Xie, D., Astor, BC, Li, M., Hsu, CY, Feldman, HI, Parekh, RS, Kusek, JW, Greene, TH, Fink, JC, Anderson , AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP, et al. (2013) Varian risiko APOL1, bangsa, dan perkembangan kronikbuah pinggangpenyakit. N. Inggeris. J. Med. 369, 2183–2196
3. Friedman, DJ, dan Pollak, MR (2020) APOL1 danbuah pinggangpenyakit: Daripada genetik kepada biologi. Annu. Rev. Physiol. 82, 323–342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF, and Sedor, JR (2017) Mengenal pasti fungsi intrasel APOL1. J. Am. Soc. Nephrol. 28, 1008–1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H., dan Okamoto, K. (2018) Apolipoprotein L1 nefropati: 2017 dalam semakan. Curr. Pendapat. Nephrol. Hipertensi. 27, 153–158
6. Perez-Morga, D., Vanhollebeke, B., Paturiaux-Hanocq, F., Nolan, DP, Lins, L., Homble, F., Vanhamme, L., Tebabi, P., Pays, A., Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R., and Pays, E. (2005) Apolipoprotein LI menggalakkan lisis trypanosome dengan membentuk liang dalam membran lisosom. Sains 309, 469–472
7. Harrington, JM, Howell, S., and Hajduk, SL (2009) Permeabilisasi membran oleh faktor litik trypanosome, lipoprotein berketumpatan tinggi manusia sitolitik. J. Biol. Kimia. 284, 13505–13512
8. Thomson, R., and Finkelstein, A. (2015) Faktor trypanolytic manusia APOL1 membentuk saluran selektif kation berpagar pH dalam dwilapisan lipid planar: Perkaitan dengan lisis trypanosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112, 2894–2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J., dan Edwards, JC (2017) Apolipoprotein L1 memberikan kebolehtelapan ion boleh tukar pH kepada vesikel fosfolipid. J. Biol. Kimia. 292, 18344–18353
10. Vanhollebeke, B., dan Pays, E. (2006) Fungsi apolipoprotein L. Sel Mol. Life Sci. 63, 1937–1944
11. Olabisi, OA, Zhang, JY, Verplank, L., Zahler, N., DiBartolo, S., 3rd, Heneghan, JF, Schlondorff, JS, Suh, JH, Yan, P., Alper, SL, Friedman, DJ, dan Pollak, MR (2016) APOL1buah pinggangpenyakitvarian risiko menyebabkan sitotoksisiti dengan mengurangkan kalium selular dan mendorong
kinase protein yang diaktifkan oleh tekanan. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113, 830–837
12. O'Toole, JF, Schilling, W., Kunze, D., Madhavan, SM, Konieczkowski, M., Gu, Y., Luo, L., Wu, Z., Bruggeman, LA dan Sedor, JR (2018) Ekspresi berlebihan ApoL1 memacu sitotoksisiti bebas varian. J. Am. Soc. Nephrol. 29, 869–879
13. Shah, SS, Lannon, H., Dias, L., Zhang, JY, Alper, SL, Pollak, MR dan Friedman, DJ (2019) APOL1buah pinggangvarian risiko mendorong kematian sel melalui translokasi mitokondria dan pembukaan liang peralihan kebolehtelapan mitokondria. J. Am. Soc. Nephrol. 30, 2355–2368
14. Hayek, SS, Koh, KH, Grams, ME, Wei, C., Ko, YA, Li, J., Samelko, B., Lee, H., Dande, RR, Lee, HW, Hahm, E. , Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V., et al. (2017) Kompleks tiga pihak suPAR, varian risiko APOL1 dan alphavbeta3 integrin pada podosit menjadi pengantara kronikbuah pinggang penyakit. Nat. Med. 23, 945–953
15. Ma, L., Chou, JW, Snipes, JA, Bharadwaj, MS, Craddock, AL, Cheng, D., Weckerle, A., Petrovic, S., Hicks, PJ, Hemal, AK, Hawkins, GA, Miller, LD, Molina, AJ, Langefeld, CD, Murea, M., et al. (2017) Varian risiko buah pinggang APOL1 mendorong disfungsi mitokondria. J. Am. Soc. Nephrol. 28, 1093–1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z., and Hu, CA (2008) Apolipoprotein L1, domain homologi Bcl{3}} novel {{4 }}hanya protein pengikat lipid, mendorong kematian sel autofagik. J. Biol. Kimia. 283, 21540–21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G., and Cullis, PR (1985) Pengeluaran vesikel unilamellar besar melalui prosedur penyemperitan pantas: Pencirian taburan saiz, isipadu terperangkap dan keupayaan untuk mengekalkan potensi membran. Biochim. Biophys. Akta 812, 55–65
18. Olson, F., Hunt, CA, Szoka, FC, Vail, WJ, dan Papahadjopoulos, D. (1979) Penyediaan liposom dengan taburan saiz yang ditentukan melalui penyemperitan melalui membran polikarbonat. Biochim. Biophys. Akta 557, 9–23
19. Armitage, P. (1971) Kaedah Statistik dalam Penyelidikan Perubatan, Blackwell Scientific Publications, Oxford, United Kingdom