Ekstrak Sel Jasminum Sambac Sebagai Penggalak Antioksidan Melawan Penuaan Kulit Bahagian 1

Abstrak: Tekanan oksidatif memainkan peranan utama dalam proses penuaan kulit melalui penghasilan spesies oksigen reaktif dan pembentukan produk akhir glikasi lanjutan (AGEs). Oleh itu, bahan-bahan antioksidan diperlukan dalam pasaran penjagaan kulit dan penggunaan molekul yang datang daripada kultur sel tumbuhan memberikan peluang yang unik. Dalam makalah ini, ciri-ciri ekstrak hidroetanol yang diperolehi oleh sel Jasminum sambac (JasHEx) telah diterokai. Sifat antioksidan dan anti-AGE telah disiasat dengan pendekatan pelbagai disiplin yang menggabungkan spektrometri jisim dan bio-informatik in vitro dan eksperimen ex vivo. JasHEx mengandungi derivatif asid fenolik, lignan, dan triterpena dan ia didapati mengurangkan pengeluaran spesies oksigen reaktif sitosol dalam keratinosit yang terdedah kepada tekanan eksogen. Ia juga menunjukkan keupayaan untuk mengurangkan pembentukan AGE dan meningkatkan pengeluaran kolagen jenis I dalam matriks ekstraselular. Data menunjukkan bahawa sifat antioksidan JasHEx berkaitan dengan aktiviti penghapusan radikal bebas dan aktiviti pengkelat logam dan pengaktifan laluan Nrf2/ARE. Ini dapat menjelaskan aktiviti anti-radang JasHEx yang berkaitan dengan penurunan paras NO dalam makrofaj yang dirangsang LPS. Oleh itu, JasHEx boleh dianggap sebagai penggalak antioksidan yang kuat terhadap penuaan kulit akibat tekanan oksidatif.

Glikosida cistanche juga boleh meningkatkan aktiviti SOD dalam tisu jantung dan hati, dan dengan ketara mengurangkan kandungan lipofuscin dan MDA dalam setiap tisu, dengan berkesan menghilangkan pelbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi daripada kerosakan DNA yang disebabkan oleh OH-radikal. Glikosida phenylethanoid cistanche mempunyai keupayaan penghapusan radikal bebas yang teguh, keupayaan pengurangan yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktiviti SOD dalam penggantungan sperma, mengurangkan kandungan MDA, dan mempunyai kesan perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida cistanche boleh meningkatkan aktiviti SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan tisu paru-paru tikus senescent eksperimen yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangkan kandungan MDA dan kolagen dalam paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, mempunyai kesan penghapusan yang baik pada DPPH, memanjangkan masa hipoksia pada tikus senescent, meningkatkan aktiviti SOD dalam serum, dan melambatkan degenerasi fisiologi paru-paru dalam tikus senescent secara eksperimen Dengan degenerasi morfologi selular, eksperimen telah menunjukkan bahawa Cistanche mempunyai keupayaan antioksidan yang baik. dan berpotensi menjadi ubat untuk mencegah dan merawat penyakit penuaan kulit. Pada masa yang sama, echinacoside dalam Cistanche mempunyai keupayaan yang ketara untuk menghilangkan radikal bebas DPPH dan boleh menghilangkan spesies oksigen reaktif, menghalang degradasi kolagen yang disebabkan oleh radikal bebas, dan juga mempunyai kesan pembaikan yang baik pada kerosakan anion radikal bebas timin.

Klik pada Di Mana Saya Boleh Beli Cistanche

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Kata kunci: penuaan kulit; spesies oksigen reaktif (ROS); produk akhir glikasi lanjutan (AGEs); Ekstrak hidroetanol Jasminum sambac (JasHEx); spektrometri jisim; metabolisme; Rangkaian Molekul Sosial Produk Asli Global (GNPS); faktor nuklear erythroid 2-faktor berkaitan 2 (Nrf2)

1. Pengenalan

Faktor intrinsik genetik dan agen ekstrinsik seperti penyinaran ultraungu, penyinaran inframerah, xenobiotik dan bahan pencemar alam sekitar menyebabkan penghasilan spesies oksigen reaktif (ROS). Mereka dihasilkan oleh pengaktifan rantai pernafasan mitokondria, cytochrome p450, dan NADPH oxidase [1]. ROS termasuk radikal bebas (anion superoksida, radikal hidroperoksil, radikal alkoksi, dan radikal hidroksil) dan molekul bukan radikal (hidrogen peroksida, dan oksigen singlet) [2]. Apabila sistem antioksidan ditenggelami, ROS terkumpul di dalam sel dan menjana apa yang dipanggil tekanan oksidatif yang merupakan penyumbang utama kepada penuaan kulit [3].

Sesungguhnya, tekanan oksidatif menyebabkan kedua-dua kerosakan DNA dan pengoksidaan lipid dan protein bersama-sama dengan mencetuskan laluan kinase protein diaktifkan mitogen (MAPK) (AKT, JNK, ERK, dan p38) [4]. Ini, seterusnya, menggalakkan ekspresi sitokin pro-radang, faktor pertumbuhan dan molekul pelekat melalui rangsangan faktor transkripsi AP-1 dan NF-κB. Selain itu, pengaktifan laluan MAPK menyebabkan perubahan matriks dermal dengan mengurangkan tahap kolagen. Ia mempercepatkan pecahan kolagen dengan memodulasi ekspresi matriks metalloproteinase (MMP) dan perencat tisu mereka TIMPs dan ia mengurangkan sintesis kolagen baru, dengan menyekat reseptor TGF-jenis II/isyarat Smad. Di samping itu, tekanan oksidatif mengubah keadaan kulit yang mengganggu kecerunan kalsium epidermis, penting untuk integriti dan fungsi sampul berkorban, merangsang fungsi kelenjar sebum dan mendorong degenerasi melanosit [5].

Secara selari, pembentukan biomolekul diubah suai dikenali sebagai produk akhir glikasi lanjutan (AGEs) menggalakkan tekanan oksidatif dalam sel dan tisu [6]. Perkembangan biomarker penuaan ini disebabkan oleh pelbagai faktor persekitaran seperti asap rokok, tahap tinggi diet karbohidrat halus dan ringkas, makanan yang dimasak dengan suhu tinggi, dan gaya hidup yang tidak aktif; AGE adalah produk yang stabil dan tidak boleh balik yang diperoleh daripada tindak balas bukan enzim antara gula penurun dan protein, asid nukleik atau lipid, diikuti dengan penyusunan semula selanjutnya [7]. Malah, titik permulaan pembentukan AGE ialah tindak balas Maillard di mana kumpulan karbonil gula penurun bertindak balas secara berbalik dengan kumpulan amino bebas protein, asid nukleik, atau aminophospholipid untuk membentuk bes Schiff. Imines ini secara spontan disusun semula menjadi ketamin yang lebih stabil, dipanggil produk Amadori. Mereka menghasilkan dicarbonyls reaktif (sebagai glyoxal atau methylglyoxal) yang bertindak balas dengan lisin dan kumpulan berfungsi protein arginin, menghasilkan pelbagai jenis AGEs [8,9]. Mereka dikelaskan kepada kumpulan yang berbeza berdasarkan keupayaan mereka untuk memancarkan pendarfluor dan membentuk pautan silang.

Tindakan AGE dimediasi oleh reseptor untuk AGEs (RAGEs) yang merupakan protein transmembran kepunyaan superfamili imunoglobulin molekul permukaan sel jenis I, yang dinyatakan dalam jenis sel yang berbeza termasuk keratinosit, fibroblas, dan makrofaj. AGEs/RAGEs yang mengikat meningkatkan pengeluaran ROS terutamanya dengan pengaktifan NADPH oxidases (NOXes) dan rantai pernafasan mitokondria, yang membawa kepada tekanan oksidatif dan semua kesan akibat yang diterangkan di atas [6,8].

Selain itu, protein matriks ekstraselular (ECM), terutamanya kolagen, sangat sensitif terhadap glikasi. Malah, paras struktur AGE pentosidine, yang diperoleh daripada kolagen, adalah lebih tinggi pada orang tua berbanding subjek muda [10]. Pengglikasian kolagen bukan sahaja mengubah sifat mekanikal kolagen itu sendiri, yang menjadi lebih kaku dan lebih rapuh [11] tetapi juga matriks ekstraselular, yang menjejaskan tingkah laku sel pemastautin (pertumbuhan, pembezaan, motilitas, ekspresi gen, dan tindak balas terhadap sitokin) dan interaksi sel matriks [12].

Dalam senario ini, bahan-bahan antioksidan sangat diperlukan dalam bidang kosmetik untuk mengurangkan pembentukan AGE dan lata oksidatif yang berkaitan: ekstrak yang diperolehi daripada spesies Jasminum sambac, kepunyaan keluarga Oleaceae, menarik kerana sifat antioksidannya dan penggunaan bersamanya dalam rakyat. ubat untuk merawat penyakit kulit [13]. Walau bagaimanapun, ekstrak tumbuhan memaparkan beberapa kelemahan seperti kelestarian bio yang lemah, potensi pencemaran dengan racun perosak, baja atau patogen, dan kebolehubahan komposisi kualitatif dan kuantitatifnya, dipengaruhi oleh musim dan keadaan persekitaran. Alternatif yang sah kepada tumbuhan, sebagai sumber bahan kosmetik bioaktif, diwakili oleh kultur sel tumbuhan yang menawarkan beberapa kelebihan: (i) kemampanan proses pengeluaran yang tinggi, kerana tiada tanah pertanian diperlukan; (ii) bekalan berterusan produk semula jadi tanpa pergantungan geografi, musim dan kitaran pembiakan tumbuhan; (iii) tiada risiko pencemaran oleh patogen, pencemar alam sekitar, dan sisa agrokimia; (iv) keadaan pertumbuhan piawai yang membolehkan memperoleh kadar hasil biojisim dan metabolit yang lebih tinggi dan boleh dihasilkan semula; (v) serba boleh yang tinggi, kerana kepekatan sebatian boleh dioptimumkan dengan mengubah keadaan kultur dan (vi) protokol pengekstrakan yang lebih mudah dan kurang memakan masa, mengurangkan keperluan pelarut yang agresif [14,15].

Di sini, ekstrak hidroetanol yang diperoleh daripada kultur sel Jasminum sambac (JasHEx) telah dikaji. Matlamat kajian kami ialah pencirian kimia dan biologi yang luas bagi JasHEx, terutamanya meneroka sifat anti-glikasi dan anti-penuaannya. Pertama, pendekatan berasaskan spektrometri jisim termaju digunakan untuk mendapatkan pencirian struktur terperinci ekstrak. Kemudian, eksperimen in vitro dan ex vivo telah dilakukan untuk membuktikan aktiviti biologi JasHEx sebagai anti-oksidan.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Kultur Tisu Tumbuhan dan Penyediaan Ekstrak

Melati Arab yang diperakui (Jasminum sambac) diperoleh daripada tapak semaian tempatan ("Ladre di Piante", Pistoia, Wilayah Toscana, Itali). Daun sambac melati direndam dalam 70 peratus etanol (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) selama 1 minit dan disterilkan permukaan dengan 1 peratus (v/v) peluntur komersial ditambah dengan Tween 2{{ 9}} (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) selama 8 minit, diikuti dengan tiga bilas dalam air suling steril. Kemudian, daun dipotong menjadi 0.5–1.0 cm dan dikultur pada medium MS kekuatan penuh [16] yang mengandungi 3 peratus (w/v) sukrosa, 0 .2 mg/L 2,4D dan 8 g/L phyto-agar. Eksplan disubkultur setiap bulan ke medium segar selama tiga bulan. Setelah kalus kuning-hijau, rapuh dan cepat tumbuh diperoleh, sel tumbuhan dipindahkan ke medium MS cecair, ditambah dengan 3 peratus (b/v) sukrosa dan 0.2 mg/L 2,4D. Suspensi dikacau dalam penggoncang gyratory pada 110 malam dan 27 ◦C dalam bilik beriklim gelap. Sel-sel yang tumbuh gelap dinaikkan setiap minggu daripada kelalang berskala kecil kepada berskala besar sehingga budaya ampaian cecair kira-kira 177 g/L dicapai. Penyediaan ekstrak hidro-etanol kultur sel Jasminum sambac (JasHEx) dilakukan dengan penambahan 2000 mL larutan etanol/air (90/10, v/v) kepada 500 g sel. Campuran dihomogenkan selama 3 minit pada 1500 rpm dan 6 minit pada 3800 rpm menggunakan kilang pisau Grindomix GM300 (Retsch GmbH, Haan, Jerman). Suspensi yang diperolehi dikacau pada 400 rpm selama 2 jam pada 25 ◦C, mengelakkan pendedahan cahaya. Suspensi kemudiannya disentrifugasi pada 6300 rpm selama 10 minit pada 4 ◦C. Supernatan dikeluarkan, ditapis, dan kemudian dipekatkan di bawah vakum dalam penyejat berputar (IKA RV8, IKA-Werke GmbH & Co., Staufen, Jerman) ditetapkan kepada 25 ◦C. Akhirnya, pH dibawa ke 7.0 dengan 10 N NaOH dan kemudian dikeringkan beku sehingga mendapat serbuk halus.

2.2. Analisis UPLC–MS/MS untuk Pencirian Kimia JasHEx

Pengekstrakan butanol/air dwifasa telah dicapai. Pecahan butanol telah dikeringkan dan dicairkan dalam metanol (10 mg/mL) sebelum analisis UPLC-MS/MS dijalankan pada Spektrometer Jisim Klasik Q-Exactive yang dilengkapi dengan sistem UPLC UltiMate™ 3000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ). Semua larian kromatografi telah dijalankan seperti yang telah diterangkan oleh Ceccacci et al. [17].

2.3. Analisis Rangkaian Molekul Sosial Produk Semulajadi Global

Untuk pengenalan metabolit, Rangkaian Molekul Sosial Produk Asli Global telah digunakan [18]. Semua isyarat MS dan MSMS yang tidak diberikan oleh GNPS telah diperiksa dengan bijak dan diberikan mengikut kesusasteraan. Fail mentah telah ditukar kepada format mzXML oleh perisian Antara Muka Pengguna Umum MS Converter, sebelum carian perpustakaan spektrum GNPS. Ia telah dijalankan menggunakan toleransi jisim ion prekursor 0.025 Da, toleransi jisim ion serpihan 0.02 Da, puncak sepadan minimum 2 dan ambang skor 0.7. Keputusan disahkan secara manual.

Pra-pemprosesan data telah dijalankan oleh Mzmine (Versi 2.53, Softpedia, Bucharest, Romania) [19] dan kerja Rangkaian Molekul Berasaskan Ciri (FBMN) [20] telah dilakukan seperti yang dilaporkan oleh Ceccacci et al. [17]. Fail rangkaian yang diperoleh telah diimport ke Cytoscape (Versi 3.9.1, Institut Sains Perubatan Am Kebangsaan AS (NIGMS), Bethesda, MD, Amerika Syarikat) [21].

2.4. Analisis Kuantitatif Lignans dan Triterpenes

Tetapan UPLC yang sama yang dinyatakan untuk eksperimen kualitatif digunakan untuk analisis kuantitatif lignan, manakala bagi triterpena, ia telah diperbaiki untuk memisahkan dua pasang isomer, asid arjunolik/Asiatik, dan asid oleanolik/ursolik. Analisis telah dijalankan pada Spektrometer Jisim Klasik Q-Exactive seperti yang ditakrifkan sebelum ini. Pemisahan telah dilakukan oleh Phenomenex Kinetex (Torrance, CA, USA) EVO C18 300 Å (150 × 2.1 mm, saiz zarah 5 µm). Fasa mudah alih terdiri daripada A (larutan berair ammonium asetat 5 mM, pH 9.00 dilaraskan oleh ammonium hidroksida) dan B (1{{4{0}}0 peratus asetonitril) menggunakan elusi kecerunan 13–28 peratus B pada 0–20 min, 28–65 peratus B pada 20–24 min, 65–75 peratus B pada 24–28min, 75–95 peratus pada 28–28.5 min, 95 peratus pada 28.5 –32 min, 95–13 peratus pada 32–32.1 min dan 13 peratus pada 32.1–44 min. Kadar alir ialah 0.450 mL/min dan isipadu suntikan ialah 5 µL. Bagi kedua-dua lignan dan triterpene, data diperoleh dengan kaedah jisim yang diterangkan oleh Ceccacci et al. [17]. Kami membeli nortachelogenin (#LCA52174) daripada Biosynth Carbosynth, matairesinol (#80497) dan asid maslinik (#83209) daripada PhytoLab GmbH & Co.KG, secoisolariciresinol (#60372) dan asid arjunolic (#SMB001119) , MI, USA), asid Asiatik (#0027), asid oleanolik (#0041 S) dan asid ursolik (#0037 S) daripada Extrasynthèse (Genay, Perancis). Keluk penentukuran diperoleh dengan menyuntik piawaian pada kepekatan 0.05 hingga 25 µM untuk lignan dan 0.1 hingga 25/250 µM untuk triterpena. Had pengesanan (LOD) dan had kuantifikasi (LOQ) untuk piawaian ditentukan berdasarkan nisbah isyarat kepada hingar (S/N).

2.5. Kultur dan Eksplan Sel Kulit

Keratinosit Manusia Abadi (HaCaT), yang dibeli daripada Addexbio Technologies (San Diego, CA, Amerika Syarikat), dipelihara dalam Medium Helang Modified Dulbecco (DMEM; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) yang ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (FBS; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) dalam 95 peratus udara, 5 peratus CO2, dan suasana lembap pada 37 ◦C. Fibroblas kulit manusia (HDF) telah dipelihara dalam Medium Helang Modified Dulbecco (DMEM; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (FBS; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat ) dalam 95 peratus udara, 5 peratus CO2, dan atmosfera lembap pada 37 ◦C. Eksplan kulit, yang diperoleh daripada kulit penderma wanita yang sihat (berumur 31 dan 40 tahun) di pusat pembedahan Villa Cinzia (Naples, Itali), telah dikultur dalam 24-plat transwell dalam DMEM/FBS serta antibiotik dalam keadaan cecair udara pada 37 ◦C dalam 5 peratus CO2 udara lembap. Semua penderma telah memberikan persetujuan bertulis mereka untuk penggunaan tisu kulit, menurut Deklarasi Helsinki.

2.6. Ujian ROS Sitosolik dalam H2O2-Sel HaCaT Tertekan

Untuk proses ini, 1.8 × 104 HaCaT telah disemai dalam 96-plat perigi dan ditanam selama 20 jam. Sel-sel tersebut kemudiannya dirawat selama 2 jam dengan kepekatan JasHEx yang berbeza (0.0006 peratus , 0.002 peratus dan 0.006 peratus p/v) atau dengan asid askorbik 500 µM, digunakan sebagai kawalan positif. Selepas itu, mereka dibasuh dalam PBS (garam penampan Fosfat) dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C dengan 100 µL/telaga larutan yang mengandungi: 10 mM Hepes, 1.3 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM glukosa, dan 5 µM CM-H2DCFDA (5-(dan-6)-chloromethyl-20,70 -dichlorodihydrofluorescein diacetate, Invitrogen). Selepas 45 minit, pencucian PBS dilakukan dan keamatan pendarfluor asas sel diukur pada 535 nm (pengujaan 485 nm), menggunakan instrumen EnVision (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Kemudian, tegasan oksidatif diinduksi dengan menambah 450 µM H2O2, dan pendarfluor sampel diukur selepas 30 minit.

2.7. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) untuk Pengesanan AGE dalam Sel Glyoxal Stressed Human Dermal Fibroblast (HDF)

Untuk langkah ini, 1.5 × 104 HDF telah disemai dalam 96-plat perigi dan ditanam selama 2 hari. Selepas mencuci dengan PBS, sel dibetulkan selama 1{{10}} min dengan 100 µL 4 peratus formaldehid dalam PBS. Selepas itu, mereka dirawat dengan JasHEx (0.0006 peratus dan 0.002 peratus p/v) atau kawalan positif 1 µM Aminoguanidine dengan kehadiran 0.5 peratus glioksal pada 50 ◦C selama 1 minggu. Selepas pengeraman, mereka diproses untuk ujian imunosorben berkaitan enzim (ELISA) menggunakan antibodi khusus terhadap AGE (Abcam ab23722).

2.8. Ujian ImmunoHistoFluorescence pada Eksplan Kulit Tertekan Methyl-Glyoxal untuk Pengesanan Fibrillin{3}}

Eksplan kulit diperoleh daripada dua pesakit, 31 dan 40 tahun. Daripada setiap biopsi kulit, tiga pukulan dihasilkan untuk setiap rawatan yang berlaku pada antara muka cecair udara. Pada hari pertama, tumbukan telah dirawat dengan JasHEx (0.002 peratus dan 0.006 peratus p/v) atau kawalan positif (1 mM Aminoguanidine) dan selepas 24 jam, 500 µM metil- glioxal telah ditambah. Rawatan itu disegarkan setiap dua hari selama tujuh hari. Pada penghujung tempoh, tumbukan telah diproses untuk analisis histologi, ditetapkan dalam 4 peratus PFA, diinkubasi dalam 15 peratus sukrosa, kemudian dalam 30 peratus sukrosa, dan cryo-disimpan dalam sebatian OCT (suhu pemotongan optimum) pada -80 ◦C . Cryosection 5 µm diperolehi dengan cryostat CM1520 Leica (Leica Biosystems, Buffalo, IL, USA). Slaid dengan cryosections telah dihidratkan selama 30 minit dalam PBS dan diletakkan dalam larutan "menyekat" (6 peratus BSA, 5 peratus serum, 20 mM MgCl2, 0.2 peratus Tween) selama 1 jam. Selepas itu, mereka diinkubasi dengan antibodi anti-Fibrillin 1 utama (MA5-12770, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). selama 16 jam pada 4 ◦C. Slaid telah dibasuh dengan PBS selama 30 minit dan kemudian diinkubasi dengan antibodi Alexa-Fluor 546 anti-arnab sekunder (A11035, Thermo Scientific, Waltham, MA, Amerika Syarikat) selama 1 jam. Nukleus telah diwarnakan dengan DAPI (40, 6-5 diamidino-2-phenylindole) 1 g/mL dalam PBS selama 10 minit. Imej-imej itu diperoleh dengan mikroskop pendarfluor dan dianalisis dengan perisian ImageJ (Versi 1.53a, Institut Kesihatan Nasional, Amerika Syarikat).

2.9. Ujian AlphaLISA untuk Mengukur Kandungan C-Peptide (PIP) Procollagen Type I

Dalam langkah ini, 8 × 103 HDF telah disemai dalam 96-plat perigi dan dirawat selama 24 jam dengan JasHEx (0.0006 peratus , 0.002 peratus , dan 0.006 peratus p/v) atau dengan TGF- (2.5 ng/mL). Selepas rawatan, sel-sel telah diproses mengikut arahan pembekal kit kolagen alpha LISA hPIP (AL353HV, (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)).

2.10. Ujian Pengaktifan Transkripsi Berasaskan Nrf2 Luciferase

Di sini, 6 × 103 sel HaCaT dalam plat telaga 96-dibenih dan ditanam selama 16 jam. Selepas itu, mereka tertakluk kepada ujian pengaktifan transkripsi berasaskan Nrf2 luciferase, menggunakan kit wartawan ARE BPS Bioscience (San Diego, CA, USA, #60514). Vektor wartawan ARE luciferase transfection-ready (mengandungi gen luciferase firefly di bawah kawalan elemen responsif ARE yang terletak di hulu promoter minimum) bersama-sama dengan kawalan dalaman (vektor Renilla luciferase yang mengekspresikan secara konstitutif) telah dipindahkan secara sementara ke dalam sel HaCaT menggunakan Reagen pemindahan DNA HP gen X-TREME (Roche, Basilea, Switzerland, #6366244001). Selepas transduksi selama 24 jam, sel dirawat selama 2 jam dengan ekstrak (0.0006 peratus, 0.002 peratus dan 0.006 peratus p/v) atau kawalan positif Resveratrol (50 µM). Selepas itu, mereka telah menjalani ujian luciferase dengan Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Rom, Itali #E2920). Secara ringkas, sel telah diinkubasi dengan substrat luciferase kelip-kelip selama 10 minit sebelum mengukur pendaran dalam 96-pembaca plat telaga (Victor Nivo, Waltham, MA, Amerika Syarikat). Nisbah pendaran daripada kelip-kelip dan Renilla dikira untuk menormalkan dan membandingkan aktiviti transkrip Nrf2.

2.11. Analisis Ungkapan SOD-1(NM_000454.5) dan OH-1(NM_002133.3) Gen dalam Sel HaCaT

Untuk proses ini, 1.5 × 105 sel HaCaT setiap telaga telah ditanam dalam 6-plat perigi selama 16 jam dan diinkubasi selama 6 jam dengan ekstrak (0.002 peratus dan 0.006 peratus p/v) atau 50 µM Resveratrol sebagai kawalan positif. Pada akhir pengeraman, jumlah RNA telah diekstrak menggunakan kit "GenElute™ Total RNA Purification" (dari Sigma-Aldrich (Saint Louis, MI, USA) dan dirawat dengan DNase I (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) pada 37 ◦C selama 30 minit, untuk membuang bahan cemar DNA genom. 500 ng daripada jumlah RNA telah ditranskripsikan secara retro menggunakan enzim Reverse transcriptase (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). RT-PCR separa kuantitatif telah dijalankan menggunakan pasangan sejagat. primer 18S primer/pesaing (Invitrogen- Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) sebagai piawaian dalaman. Produk PCR diasingkan pada 1.5 peratus gel agarose, dan dilihat menggunakan instrumen iBright (Invitrogen Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Urutan primer yang digunakan untuk amplifikasi adalah seperti berikut: HsSOD1Fw: GAAAGTAATGGACCAGTGAAGG; HsSOD1Rv: ATTGGGCGATCCCAATTACACC; OH-1Fw GAACTTTCAGAAGGGTCAGG; OH-1Rv GCTCAATGTTGA.

2.12. Ujian Oksida Nitrik dalam RAW Dirangsang LPS 264.7

Kepekatan NO ditentukan dalam makrofaj murine RAW 264.7, disemai pada kepekatan 1.5 × 105 sel/telaga dalam 96-plat perigi selama 24 jam, dan pra-rawatan dengan ekstrak ({{1 0}}.0006 peratus , 0.002 peratus dan 0.006 peratus p/v) atau dengan 10 µM TPCK (kawalan positif) selama 2 jam, sebelum pengeraman dengan 2 µg/mL LPS selama 18 jam. Jumlah NO, ditukar kepada nitrit, dikira dengan menambahkan reagen Griess (larutan N-(1-}naphthyl)ethylenediamine dan asid sulfanilik, Invitrogen- Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) dan, selepas 30 minit, penyerapan diukur pada 540 nm oleh pembaca multiwell-plate (EnVision, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)

3. Keputusan

3.1. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Ekstrak Hydro-Ethanolic Kultur Sel Jasminum sambac (JasHEx)

Analisis UPLC-MS/MS JasHEx telah dilakukan dan data spektrometri resolusi tinggi dianalisis menggunakan Rangkaian Molekul Sosial Produk Asli Global (GNPS), sistem spektrometri jisim berasaskan web yang membantu dalam anotasi produk semula jadi (NPs) [18] . Khususnya, perpustakaan spektrum GNPS telah dilakukan untuk mencapai dereplikasi dalam talian. Spesies kimia yang tidak dikenal pasti oleh GNPS telah diberikan mengikut kesusasteraan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1 dan 2 dan Jadual 1, lebih daripada 50 sebatian kepunyaan beberapa kelas metabolit sekunder, terutamanya polifenol dan terpenes, telah dikenalpasti. Malah, ekstrak JasHEx mengandungi derivatif asid fenolik, lignan (secoisolariciresinol, nortrachelogenin, dan matairesinol), dan triterpenoid (asid arjunolik, asid aspartik, asid maslinik, asid oleanolik dan asid ursolik).

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】