Penyahaktifan RPX1 dalam Arabidopsis Memberi Rintangan Kepada Plutella Xylostella Melalui Pengumpulan Homoterpene DMNT

Abstrak

Perosak tanaman lepidopteran Plutella xylostella menyebabkan kekangan yang teruk pada penanaman Brassica. Di sini, kami melaporkan peranan baru untuk RPX1 (rintangan kepada P. xylostella) dalam penentangan terhadap perosak ini dalam Arabidopsis thaliana. Mutan rpx1‐1 menangkis larva P. xylostella, dan memakan mutan rpx1‐1 dengan teruk merosakkan struktur matriks peritropik dalam usus tengah larva, dengan itu memberi kesan negatif kepada pertumbuhan larva dan kepompong. Rintangan ini terhasil daripada pengumpulan sebatian pertahanan, termasuk monoterpene (3E)−4,8‐dimetil‐1,3,7‐nonatriene (DMNT), disebabkan oleh pengawalseliaan PENTACYCLIC TRITERPENE SYNTHASE 1 (PEN1), yang mengkodkan enzim biosintetik DMNT utama. Serangan P. xylostella dan mencederakan mendorong kemerosotan protein RPX1, yang mungkin memberikan tindak balas pantas kepada serangan serangga. Penyahaktifan RPX1 dan ekspresi berlebihan PEN1 tidak dikaitkan dengan pertukaran negatif untuk pertumbuhan tumbuhan tetapi mempunyai pengeluaran benih yang lebih tinggi daripada jenis liar dengan kehadiran serangan P. xylostella. Kajian ini menawarkan strategi baharu untuk pembiakan molekul tumbuhan terhadap P. xylostella.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

  KATA KUNCI

rintangan perosak, metabolisme sekunder, pelepasan yang tidak menentu

1|PENGENALAN

Perosak serangga bukan sahaja mengurangkan hasil tanaman tetapi juga menjejaskan kualiti produk tanaman (Johnson & Züst, 2018; Wu et al., 2016; Zhao et al., 2016). Antaranya, rama-rama berlian Plutella xylostella ialah perosak lepidopteran yang tersebar luas dan berbahaya yang memakan tanaman silang seperti kembang kol dan kubis, menyebabkan kerugian ekonomi yang besar. Pada masa ini, dalam pengurusan pertanian, kawalan perosak menggunakan agrokimia (contohnya, racun perosak) telah sangat berjaya dan banyak digunakan, tetapi pendekatan ini menjadi bermasalah kerana potensi pencemaran alam sekitar dan ancaman kepada kesihatan manusia (Shakeel et al., 2017). Pendekatan alternatif untuk pengeluaran tanaman ialah penggunaan tanaman kejuruteraan genetik dengan ketahanan yang lebih baik terhadap perosak, contohnya dalam ekspresi planta Bacillus thuringiensis (Jouzani et al., 2017) atau protein entomotoksik heterolog lain (Douglas, 2018). Usaha yang meluas telah dibuat untuk mengenal pasti pendekatan baharu untuk mengawal P. xylostella dalam pertanian; walau bagaimanapun, gen yang berkesan, racun perosak semula jadi dan plasma nutfah tahan kekal terhad (Zhou & Jander, 2021). Melalui perlumbaan senjata yang berterusan dengan perosak serangga, tumbuhan telah mengembangkan pelbagai kebolehan untuk memerangi serangan serangga. Sehubungan itu, tumbuhan mensintesis susunan metabolit pertahanan seperti benzoxazinoid (Handrick et al., 2016; Varsani et al., 2019), metil benzoat (Feng & Zhang, 2017), dan serotonin (Lu et al., 2018) sebagai tindak balas kepada kecederaan perosak. Asid Jasmonic (JA), juga dipanggil 'hormon luka', memainkan peranan utama dalam pelbagai tindak balas kerosakan berkaitan luka yang dimulakan oleh serangan serangga (Lortzing & Steppuhn, 2016). Bukti yang semakin meningkat menunjukkan bahawa JA berfungsi secara sinergistik dan/atau antagonis dengan fitohormon lain, seperti asid salisilik (SA) dan etilena (Costarelli et al., 2020; Ma et al., 2019). Selain pertahanan langsung, tumbuhan yang rosak akibat serangan serangga membebaskan pelbagai sebatian meruap yang menarik musuh semula jadi herbivor (Gols, 2014). Daripada adunan meruap kompleks ini, sebatian homoterpena (3E)−4,8‐dimetil‐1,3,7‐nonatriene (DMNT) dan (E, E) −4,8,12‐trimetil‐1,3,7, 11-tridecatetraene (TMTT) telah dilaporkan dalam pelbagai spesies tumbuhan seperti Arabidopsis (Lee et al., 2010; Sohrabi et al., 2015), beras (Li et al., 2018), jagung (Gouinguené et al., 2005). Richter et al., 2016) dan kapas (Liu et al., 2018). Beberapa kajian juga telah menunjukkan bahawa DMNT bertindak sebagai molekul isyarat yang mendorong pertahanan antiherbivor semasa komunikasi tumbuhan-tumbuhan (Arimura et al., 2000; Meents et al., 2019). Sebagai contoh, selepas mengalami kerosakan daripada serangga yang mengunyah, sesetengah ubi keledek mengeluarkan DMNT, yang mengakibatkan induksi sistemik perencat protease terseliuh dalam tumbuhan ubi jiran dan menjadikannya tidak dapat dihadam oleh serangga (Meents et al., 2019). Keputusan yang sama telah diperhatikan untuk tanaman teh (Jing et al., 2020). Baru-baru ini, kami mendapati bahawa DMNT memainkan peranan dalam membunuh larva P. xylostella dengan mengganggu penghalang matriks peritropik (PM) dalam usus tengah serangga (Chen et al., 2021).

Dalam tumbuhan yang lebih tinggi, laluan biosintesis DMNT dan TMTT telah dicirikan dengan baik melalui genetik terbalik dan analisis biokimia. Dalam jagung, DMNT dan TMTT dihasilkan daripada degradasi oksidatif (E) -nerolidol dan (E, E) -geranyl linalool oleh dua P450 monooxygenase, CYP92C5 dan CYP92C6 (Richter et al., 2016). Dalam kapas, dua gen CYP (GhCYP82L1 dan GhCYP82L2) bertanggungjawab untuk penukaran (E) -nerolidol kepada DMNT dan (E, E) -geranyl linalool kepada TMTT (Liu et al., 2018). Dalam akar Arabidopsis, DMNT dimangkinkan daripada prekursor C30 triterpene diol, cannabidiol, oleh cytochrome P450 monooxygenase yang dikodkan oleh gen spesifik akar CYP705A1 (Sohrabi et al., 2015). Satu kajian menggunakan yis sebagai organisma model telah membentangkan bukti bahawa cannabidiol dihasilkan daripada 2,3-oxidosqualene oleh cannabidiol synthase PEN1 (Xiang et al., 2006), dan ekspresi yang dikaitkan secara sinergi dengan CYP705A1 (Sohrabi et al. ., 2015). Walau bagaimanapun, peraturan gen utama dalam biosintesis DMNT masih tidak diketahui. Gen RPX1 yang diterangkan dalam kajian ini mengekod untuk protein pengikat topi novel (CBP), yang merupakan ahli keluarga gen faktor permulaan eukariotik 4E (eIF4E). Dalam tumbuhan, keluarga eIF4E terdiri daripada eIF4E1, eIF4E2, eIF(iso)4E, dan nCBP, yang memainkan peranan penting dalam memulakan terjemahan mRNA yang bergantung kepada cap (Rhoads, 2009). Ahli keluarga eIF4E ialah sumber utama rintangan resesif terhadap virus kentang Y (PVY) -patogen paling berbahaya yang menjejaskan hasil dan kualiti kentang, dan penggunaan teknologi CRISPR-Cas9 yang menyasarkan gen eIF4E1 memanjangkan spektrum rintangan virus kentang Y Solanum tuberosum. (Lucioli et al., 2022). Begitu juga, penyuntingan CRISPR/Cas9-pengantara isoform ubi kayu eIF4E nCBP‐1 dan nCBP‐2 mengurangkan keterukan dan kejadian gejala yang disebabkan oleh penyakit coretan coklat ubi kayu (Gomez et al., 2019). Selain itu, kajian dalam Arabidopsis menunjukkan bahawa kekurangan nCBP memainkan peranan dalam mengehadkan pergerakan sel-ke-sel virus tumbuhan (Keima et al., 2017). Walau bagaimanapun, fungsi nCBP dalam pertahanan herbivor belum dilaporkan. Di sini, kami menggunakan pendekatan integratif untuk mencirikan gen Arabidopsis RPX1 secara fungsional, yang memainkan peranan penting dalam rintangan tumbuhan terhadap P. xylostella. Keputusan kami menunjukkan bahawa kejatuhan RPX1 menghasilkan gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) dan pengumpulan sebatian. Salah satu gen terkawal ialah PEN1, yang merupakan kunci untuk biosintesis DMNT. Serangan mutan rpx1 dan pengumpulan DMNT menjejaskan struktur PM P. xylostella dan menyebabkan kecacatan perkembangan larva dan kematian. Bukti lanjut menunjukkan bahawa serangan dan pencederaan P. xylostella mendorong kemerosotan protein RPX1, yang mungkin, seterusnya, membawa kepada ketahanan tumbuhan terhadap serangga.

2|BAHAN DAN KAEDAH

2.1|Bahan tumbuhan dan keadaan pertumbuhan

Benih Arabidopsis telah dipesan dari Pusat Saham Arabidopsis Nottingham (NASC, http://Arabidopsis.info/). Biji benih telah disterilkan di permukaan, disemai pada medium Murashige dan Skoog (MS), dan berstrata pada 5 darjah dalam ruang pertumbuhan di bawah fotoperiod hari pendek (8 jam terang, 16 jam gelap) selama 3 hari. Mereka kemudiannya dipindahkan ke 22 darjah di rumah hijau di bawah fototempoh hari yang panjang (16 jam cahaya, 8 jam gelap) dengan penyelenggaraan tumbuhan biasa.

2.2|Eksperimen dan bioassay pilihan (keutamaan) dan tiada pilihan

Telur P. xylostella telah dibeli daripada Syarikat Henan Jiyuan Baiyun (Cat: HJB004, dibangunkan pada tahun 2009, dibiakkan untuk penyelidikan saintifik dalam persekitaran terkawal) dan diinkubasi dalam ruang pertumbuhan yang ditetapkan kepada 26 darjah , 16 jam terang/8 jam gelap. Untuk eksperimen pilihan, kami memindahkan tumbuhan Arabidopsis berusia 3 minggu (masing-masing lapan jenis liar dan tumbuhan mutan) ke dalam tangki ujian yang disambungkan ke setiap hujung tabung uji kaca, dan langkah eksperimen yang selebihnya dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini ( Chen et al., 2021). Larva instar keempat telah digunakan dan 15 larva dimasukkan dalam setiap replika eksperimen.

Untuk eksperimen tanpa pilihan, tumbuhan jenis liar dan mutan berumur 3 minggu telah dipindahkan ke cawan Petri yang berasingan dan separa terbuka yang mengandungi bilangan 15 larva P. xylostella s-instar yang sama. Langkah-langkah seterusnya telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini (Chen et al., 2021).

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

2.3|Penyaringan mutan Arabidopsis yang tahan terhadap P. xylostella

Kami mengumpul 179 mutan sisipan T-DNA Arabidopsis untuk pemeriksaan rintangan P. xylostalle. Mutan ditanam pada medium MS dan dipindahkan ke dalam pasu P7 (saiz: 7 × 7 cm) di bawah keadaan pertumbuhan hari yang panjang (22 darjah, 16 jam terang/8 jam gelap). Untuk mengelakkan potensi pengaruh alam sekitar, kami mengalihkan dan memutar periuk setiap hari. Untuk saringan mutan awal, kami menyediakan dua replika dengan mengembangkan setiap mutan dalam dua pasu, dengan tumbuhan Col‐0 sebagai kawalan. Selepas pertumbuhan 2 minggu selepas pemindahan, semua mutan telah tertakluk kepada ujian keutamaan larva P. xylostella instar ketiga dengan membandingkannya dengan Col‐0, seperti yang diterangkan di atas. Mutan yang menunjukkan pilihan larva yang berbeza daripada Col‐0 dianggap sebagai mutan tahan calon atau sensitif dan telah dipilih untuk pengesahan eksperimen dan kajian fungsi selanjutnya.

2.4|Pembinaan plasmid dan transformasi gen

Untuk binaan RPX1pro: RPX1, rantau pengekodan genomik RPX1 dengan jujukan hulu 1.6 kb dan jujukan hiliran 1 kb telah dikuatkan PCR daripada DNA genom yang diekstrak daripada Col‐0. Serpihan DNA yang dipasang telah diklonkan ke dalam vektor pGreenII‐0179 dan diubah menjadi mutan rpx1‐1 menggunakan kaedah celupan bunga (Clough & Bent, 1998). Untuk membina RPX1pro: RPX1‐GFP, promoter RPX1 (1.6 kb), rantau pengekodan dan 1 kb 3′ jujukan tidak diterjemahkan telah PCR-dikuatkan daripada DNA genomik Col‐0. Serpihan GFP telah dikuatkan daripada plasmid yang mengandungi jujukan GFP. Serpihan DNA ini telah dipasang ke dalam vektor pGreenII‐0179 menggunakan kaedah potong-dan-ligasi dan kemudian diubah menjadi mutan rpx1‐1. Untuk 35Spro: binaan RPX1‐FLAG, jujukan pengekodan RPX1 telah dikuatkan PCR daripada cDNA yang ditranskripsi terbalik daripada mRNA Col‐0 . Serpihan PCR telah diklonkan menjadi vektor pCambia1300‐FLAG menggunakan kaedah infusi (Clontech) dan diubah menjadi Col‐0. 35Spro: PEN1, 35Spro: MRN1 (MARNERAL SYNTHASE 1) dan 35Spro: THAS (THALIANA THALIANOL SYNTHASE 1): Urutan pengekodan gen ini telah PCR-dikuatkan daripada Col‐0 cDNA, dan diikat ke dalam vektor pLGNL‐35S. MikroRNA buatan (amiR) yang menyasarkan PEN1 telah direka seperti yang diterangkan sebelum ini (Schwab et al., 2006), dikuatkan menggunakan plasmid pRS300 sebagai templat, dan disambungkan ke dalam versi diubah suai bagi vektor pCambia1300m. Semua jujukan primer disenaraikan dalam Maklumat Sokongan: Jadual S1.

2.5|Ujian aktiviti glutathione s-transferase (GST) dan cytochrome P450 (CYP450) dalam larva P. xylostella

Selepas larva P. xylostella instar kedua diberi makan dengan anak benih Col‐0 atau rpx1‐1 selama 72 jam, ia dikumpulkan dan dikisar menjadi serbuk halus dalam nitrogen cecair. Ujian dilakukan menggunakan GST (Nanjing Jiancheng Biology Company, cat: A004) dan kit analisis aktiviti CYP450 (Beijing Huabaitai Biology Company, cat: P450), mengikut arahan pengilang. Setiap ujian mempunyai tiga replika biologi, dan setiap replika terdiri daripada 30 larva P. xylostella.

2.6|Ujian Smurf

Anak benih Col‐0 atau rpx1‐1 yang berumur tiga minggu telah digunakan untuk memberi makan larva P. xylostella instar kedua. Ujian dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini dengan pengubahsuaian kecil (Chen et al., 2021). Enam replika biologi digunakan, dan setiap replika mengandungi 15 larva P. xylostella.

2.7|Pemerhatian mikroskopik struktur PM larva

Analisis anatomi struktur PM larva dan analisis keratan rentas parafin usus larva telah dijalankan seperti yang diterangkan sebelum ini (Chen et al., 2021).

2.8|Analisis ekspresi gen dan penjujukan transkrip (RNA-seq)

Anak benih Col‐{{{0}} dan rpx1‐1 ditanam di bawah keadaan pertumbuhan hari yang panjang (16 jam terang, 8 jam gelap) pada 22 darjah. Anak benih Col‐0 dan rpx1‐1 yang berumur dua minggu telah digunakan untuk penjujukan transkrip. Setiap sampel mengandungi tiga replika biologi. Jumlah RNA diekstrak menggunakan Kit Tumbuhan Tulen RNAprep (TIANGEN, nombor katalog: DP441). CDNA untaian pertama telah disintesis melalui transkripsi terbalik menggunakan sistem One-Step RT (Takara Bio) mengikut arahan pengilang. qRT‐PCR telah dijalankan dengan primer khusus gen yang disenaraikan dalam Maklumat Sokongan: Jadual S1 pada instrumen Roche Light Cycler 480. Pembinaan dan penjujukan perpustakaan RNA‐seq dilakukan menggunakan Biomarker (Beijing, China) pada platform Illumina HiSeq. Akhir sekali, kami menggunakan edgeR untuk melakukan analisis ungkapan pembezaan (ambang perbezaan ketara telah ditetapkan:|log2foldchange|Lebih daripada atau sama dengan 1, p <0.05). Tiga replika biologi telah dilakukan untuk Col‐0 dan rpx1‐1, dan gen yang dinyatakan secara berbeza disenaraikan dalam Set Data S1.

2.9|Pengekstrakan dan kromatografi gas dan analisis spektrometri jisim (GC-MS) DMNT dan DMNT- 2 H dalam Arabidopsis

Pengekstrakan dan analisis DMNT telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini dengan pengubahsuaian kecil (Sohrabi et al., 2015). Dalam ujian, 2 g anak benih Arabidopsis berusia 3 minggu digunakan untuk pengekstrakan dan pengukuran DMNT.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.10|Penyediaan dan pencirian DMNT

DMNT telah disintesis seperti yang diterangkan sebelum ini, dengan pengubahsuaian kecil (HJ Huang & Yang, 2007). Secara ringkas, kelalang alas bulat 500 ml yang dilengkapi dengan bar kacau magnet bersalut Teflon telah dicas dengan 1 g (6.48 mmol) alkohol allylic dan 50 ml diklorometana. Larutan dikacau dengan kuat dan dirawat dengan 3.6 g mangan dioksida aktif, diikuti dengan penambahan 1−2 g oksidan setiap 2−3 jam sehingga selesai tindak balas. Produk itu kemudiannya digunakan untuk menghasilkan sebatian yang diingini melalui tindak balas witting. Struktur dan ketulenan DMNT telah disahkan oleh 1 H nuklear resonans magnetik (NMR) dan pendekatan spektroskopi 13C NMR.

2.11|Rawatan DMNT P. xylostella

Ujian dilakukan dalam piring Petri yang ditutup dengan filem plastik berpaut jernih dengan berbilang lubang. DMNT telah dicairkan dalam minyak parafin (Sigma‐Aldrich) kepada dos yang dikehendaki (2.5 nmol/L−25 μmol/L) dan disuntik ke dalam makanan ternakan seperti yang diterangkan dalam teks. Semua ujian dilakukan dalam enam replika biologi, dengan setiap replika terdiri daripada 15 larva. Pertumbuhan larva direkodkan dengan dokumentasi fotografi. Makanan ternakan yang disuntik dengan jumlah pelarut minyak parafin yang sama digunakan sebagai kawalan.

2.12|Pengukuran kandungan JA dan SA dalam anak benih Arabidopsis

Ujian telah dijalankan oleh Nanjing Convinced-test Technology Company. Anak benih Col‐{{0}} dan rpx1‐1 yang berumur dua minggu telah diserang dengan 15 larva P. xylostella s-instar, dengan anak benih yang tidak diserang sebagai kawalan. Kami meletakkan dua larva pada setiap tumbuhan kumpulan serangan untuk memastikan semua tumbuhan dijangkiti. Selepas 24 jam, sampel tumbuhan dikumpulkan dan dibekukan dengan cepat dalam nitrogen cecair untuk penentuan JA dan SA. Sampel telah dikisar kepada serbuk halus dalam nitrogen cecair dan diekstrak dengan larutan pengekstrakan asid isopropanol-air-hidroklorik, diikuti dengan penambahan 8 ul asid salisilik deuterated (D-SA) dan asid dihydro jasmonic (2HJA) (1 ug /ml setiap satu) sebagai piawaian dalaman. Diklorometana kemudiannya ditambah, dan larutan itu dicampur dengan baik pada pemutar selama 3{17}} min. Selepas fasa organik yang lebih rendah diperoleh melalui sentrifugasi pada 13,{{11}} rpm selama 5 minit, ia ditiup kering dengan nitrogen, dilarutkan semula dalam metanol (0 .1% asid formik), dan kemudian disentrifugasi pada 13,000 g selama 10 min. Akhirnya, supernatan itu ditapis melalui membran penapis organik 0.22 μm dan dianalisis dengan kromatografi cecair berprestasi tinggi ditambah dengan spektrometri jisim (HPLC-MS/MS). Semua langkah pengekstrakan dilakukan pada 4 darjah . Identiti JA dan SA ditentukan berdasarkan masa puncak bahan sasaran dan nisbah jisim-ke-cas (m/z) ion yang sepadan. Kuantifikasi JA dan SA telah dipasang menggunakan persamaan regresi linear yang diperoleh daripada lengkung piawai dalaman. Untuk pemerolehan lengkung piawai dalaman, larutan piawai SA dan JA dengan kecerunan 0.1, 0.2, 0.5, 2, 5, 20, 50, dan 200 ng/ml telah disediakan menggunakan metanol (0.1% asid formik) sebagai pelarut, dan larutan piawai dalaman dengan kepekatan akhir 20 ng/ml telah ditambah kepada plot sebenar. Anomali lineariti telah dikeluarkan daripada persamaan lengkung piawai. JA: y=0.853 x + 0.00152 (r=0.9958); SA: y=1.76 x + 0.0403 (r=0.9936).

2.13|Analisis pengangkutan DMNT dalam Arabidopsis

DMNT telah dibubarkan dalam DMSO dan ditambah kepada medium MS tanpa glukosa. Tumbuhan Arabidopsis berusia tiga minggu telah dipindahkan ke tabung uji dan akarnya direndam dalam medium MS dengan DMNT atau DMSO (kawalan). Untuk mengelakkan pencemaran, tabung uji ditutup dengan dua lapisan parafilem, dan lubang kecil dibuat di dalam filem, di mana akar tumbuhan diletakkan dalam medium MS untuk pertumbuhan selanjutnya. Selepas 24 jam, akar tumbuhan yang dirawat dibuang dan daunnya digunakan untuk memberi makan P. xylostella, dan kemudian kemandirian larva dan kadar kepompong dianalisis. Eksperimen yang sama diulang dengan medium pertumbuhan yang mengandungi sama ada 2 DMNT berlabel H atau DMSO sebagai kawalan. Selepas 24 jam pengeraman, daun dikumpulkan dan diproses untuk analisis GC-MS. Untuk menolak kemungkinan DMNT boleh meruap dari medium DMNT ke bahagian udara dan menyebabkan pencemaran pengesanan, kumpulan kawalan telah ditubuhkan dengan cara yang sama, tetapi akar tumbuhan ditanam dengan kapas lembap dan tidak direndam dalam medium DMNT. Selepas 24 jam, bahagian udara dituai untuk bioassay atau pengesanan DMNT menggunakan GC-MS.

Kebaikan cistanche tubulosa-menguatkan sistem imun

2.14|Pengekstrakan protein dan analisis imunoblotting RPX1 dalam Arabidopsis selepas serangan P. xylostella dan rawatan mencederakan

Kami menyediakan dua jenis rawatan pada RPX1pro transgenik: RPX1‐GFP dan 35Spro: RPX1‐FLAG anak benih Arabidopsis: P. xylostella infestation dan mencederakan. Untuk serangan larva, kami menanam anak benih Arabidopsis selama 2 minggu dan memberi mereka makan kepada larva instar kedua (letak sekurang-kurangnya satu larva pada setiap anak benih), selepas 15-120 minit, larva dikeluarkan, dan anak benih yang diserang telah dipilih dan dituai untuk eksperimen selanjutnya. Untuk meniru kecederaan, kami menggunakan jarum picagari 1 ml untuk membuat lubang pada setiap daun Arabidopsis. Selepas 15-120 minit pertumbuhan, anak benih dikumpulkan.

Untuk menentukan sama ada tumbuhan yang diserang P. xylostella boleh menyebabkan kemerosotan RPX1, kami menyemai anak benih Col‐0 dengan P. xylostella selama 15−120 min dan menguji pengaruhnya terhadap RPX1‐GFP dalam tumbuhan transgenik. Semua sampel dikisar hingga menjadi serbuk dalam nitrogen cecair, dan kemudian jumlah Col‐{12}} yang sama dan tidak dijangkiti dicampur secara berasingan dengan jumlah tisu RPX1‐GFP yang sama dan diinkubasi dalam larutan pada 4 darjah selama 15 minit. Akhirnya, campuran telah disentrifugasi, dan supernatan tertakluk kepada analisis imunoblotting. Untuk analisis western blot, jumlah protein telah diekstrak dengan penimbal pengekstrakan protein [50 mmol/L Tris‐HCl pH8.0, 2.5 mmol/L EDTA pH8.0, 150 mmol/L NaCl, 1/1000 IGPAL ( v/v), 10% gliserol (v/v), 7% 2‐mercaptoethanol (v/v), 1 mmol/L PMSF dan 1×proteinase inhibitor cocktail (Roche)]. Ekstrak protein kemudiannya digunakan untuk pemisahan PAGE dan analisis immunoblotting dengan antibodi terhadap GFP (Roche, pencairan: 1/1000) dan FLAG (Abcam, pencairan: 1/2000). Imej ditangkap menggunakan sistem analisis chemiluminescence Tanon 5200.

3|KEPUTUSAN

3.1|Mutan Arabidopsis rpx1 telah meningkatkan ketahanan terhadap P. xylostella

Untuk mengenal pasti gen yang terlibat dalam rintangan P. xylostella, kami mengumpul 179 mutan Arabidopsis dan membesarkannya dalam rumah hijau terkawal. Dua minggu selepas pemindahan, kami menjalankan ujian keutamaan larva P. xylostella instar ketiga, sebagai tindak balas kepada setiap Col‐0 jenis mutan dan liar. Dalam eksperimen saringan ini, 15 mutan menunjukkan pengaruh yang berbeza pada keutamaan larva (data tidak ditunjukkan), dan salah seorang daripada mereka telah dipilih untuk kajian ini dan ditetapkan sebagai rpx1‐1 (rintangan kepada P. xylostella). RPX1 mengekod untuk protein pengikat topi novel (nCBP) (Ruud et al., 1998). Mutan sisipan T‐DNA ialah SALK_131503, dan ekspresi gen RPX1 telah dirobohkan dengan ketara berbanding Col‐0 jenis liar (Rajah 1a, Maklumat Sokongan: Rajah S1a, Maklumat Sokongan: Jadual S1). Apabila ditanam berdekatan, tumbuhan rpx1‐1 menunjukkan tahap kerosakan yang ketara oleh larva P.xylostella berbanding tumbuhan jenis liar (Maklumat Sokongan: Rajah S1b).

RAJAH 1 Menyahaktifkan RPX1 memberikan rintangan kepada Plutella xylostella dalam Arabidopsis. (a) Struktur gen RPX1 (At5g18110). Kotak jingga menunjukkan ekson dan garis pepejal mewakili intron dan kawasan yang tidak diterjemahkan. Sisipan T‐DNA dalam SALK_131503, dinamakan rpx1‐1, berada pada ekson keempat. (b) Larva P. xylostella lebih suka bergerak ke arah garis pelengkap Col‐0 dan RPX1 jenis liar (RPX1pro:RPX1/rpx1‐1, RPX1com), berbanding rpx1‐ 1. (c) Perbandingan Col‐ 0, rpx1‐1 dan daun RPX1com yang diserang P. xylostella. (d) Larva P. xylostella terjejas teruk oleh rpx1‐1, berbanding dengan larva jenis liar Col‐0 dan garisan RPX1com, berkenaan dengan ketinggian, saiz dan warna larva. (e, f) Larva P. xylostella yang diberi makan rpx1‐1 menunjukkan kadar kematian (e) dan kepompong (f) yang lebih tinggi berbanding baris Col‐0 dan RPX1com jenis liar. (g, h) Larva P. xylostella yang diberi makan tumbuhan rpx1‐1 telah meningkatkan aktiviti glutathione S-transferase (GST, g) dan cytochrome P450 (CYP450, h), manakala dalam larva yang diberi makan RPX1com, aktiviti tersebut tidak menunjukkan perbezaan daripada aktiviti tersebut. pada Col‐0. Dalam (b, e–h), data dibentangkan sebagai min ± sem Huruf yang berbeza pada setiap rawatan menunjukkan perbezaan yang ketara (analisis varians sehala, n=3 untuk b, g, h, n {{ 36}} untuk e, f).

Untuk menentukan mekanisme yang mendasari rintangan rpx1‐1 terhadap serangan P. xylostella, kami melakukan ujian keutamaan dan tiada pilihan. Dalam eksperimen keutamaan, larva P. xylostella diletakkan di tengah-tengah tabung uji kaca pada jarak yang sama dari anak benih Col‐0 dan rpx1‐1, selepas 10–6{{11} } min, jauh lebih banyak larva berkumpul di bahagian Col‐0 berbanding yang di bahagian rpx1‐1 (Rajah 1b). Dalam eksperimen tanpa pilihan, kami memberi anak benih Col‐0 dan rpx1‐1 secara berasingan kepada larva P. xylostella dan mendapati Col‐0 kehilangan lebih banyak tisu daun berbanding mutan rpx1‐1 (Rajah 1c). Untuk mengesahkan bahawa RPX1 ialah gen penyebab bagi rintangan yang diperhatikan, kami memperkenalkan binaan pelengkap RPX1 ke dalam mutan rpx1‐1. Barisan pelengkap RPX1 ini (RPX1pro: RPX1/rpx1‐1, RPX1com) terdedah kepada serangan P. xylostella, seperti yang ditentukan oleh ujian keutamaan dan tiada pilihan (Rajah 1b, c), yang menunjukkan bahawa RPX1 terlibat dalam rintangan Arabidopsis terhadap P. xylostella.

3.2|Pertumbuhan larva P. xylostella terjejas secara negatif oleh mutasi rpx1‐1

Untuk menyiasat tindak balas fisiologi P. xylostella terhadap pemakanan dengan mutan rpx1‐1, kami memeriksa perkembangan larva selepas memberi makan dengan tumbuhan Col‐0, rpx1‐1 dan RPX1com berusia 3 minggu. Larva yang diberi makan tumbuhan rpx1‐1 menunjukkan perkembangan yang terjejas teruk dari segi saiz badan. Warna badan larva juga berbeza daripada larva yang diberi makan tumbuhan Col‐0. Walau bagaimanapun, kami tidak melihat perubahan sedemikian dalam larva yang diberi makan dengan anak benih RPX1com (Rajah 1d). Analisis fenotip selanjutnya menunjukkan bahawa larva P. xylostella yang diberi makan dengan rpx1‐1 mempunyai kadar kematian yang lebih tinggi dan kadar pupasi yang lebih rendah daripada yang diberi makan dengan Col‐0 atau RPX1com (Rajah 1e,f). Di samping itu, larva yang diberi makan dengan rpx1‐1 mempamerkan aktiviti enzimatik GST dan CYP45 yang lebih tinggi0, yang merupakan biomarker untuk kerosakan organ atau tisu (Cheng et al., 2018; Mikstacki et al., 2015), berbanding yang terdapat pada Col‐0 dan RPX1com (Rajah 1g, h), menunjukkan bahawa tisu larva mungkin tercedera oleh pemakanan rpx1‐1.

3.3|Usus tengah larva P. xylostella rosak selepas makan dengan tumbuhan rpx1‐1

Kami memerhatikan bahawa larva yang diberi makan rpx1‐1 menggunakan lebih sedikit tisu tumbuhan dan menghasilkan lebih sedikit najis daripada yang diberi makan dengan Col‐0 jenis liar; oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa pencernaan larva yang diberi makan rpx1‐1 mungkin terjejas. Untuk memeriksa sama ada kebocoran berlaku dalam usus larva yang diberi makan rpx1‐1, kami menjalankan 'ujian Smurf'. Larva yang diberi makan dengan garis Col‐0 dan RPX1com jenis liar telah membuang pewarna, dan tiada pewarna tertinggal secara visual dalam badan larva, manakala larva yang diberi makan rpx1‐1 mengekalkan sejumlah besar pewarna dalam midgut dan tisu sekeliling, dan larva menjadi biru (Rajah 2a). Analisis kuantitatif larva biru ('Smurf') dan normal ('tiada Smurf') menunjukkan bahawa pemakanan tumbuhan rpx1‐1 menghasilkan lebih daripada tiga kali ganda individu menunjukkan 'Smurf' berbanding mereka yang diberi makan Col‐{{ 14}} atau RPX1com (Rajah 2b). Keputusan ini menunjukkan bahawa pemberian rpx1‐1 boleh menyebabkan lesi dan kebolehtelapan yang lebih tinggi dalam usus tengah larva.

3.4|Matriks peritropik P. xylostella rosak dengan memberi makan anak benih rpx1‐1

Kami selanjutnya membedah dan mengasingkan matriks peritropik (PM) daripada larva yang diberi makan dengan anak benih Col‐{{0}}, rpx1‐1, dan RPX1com untuk analisis struktur di bawah stereomikroskop. Berbanding dengan PM utuh dan tegak bagi larva yang diberi makan dengan Col‐0 dan RPX1com, larva yang diberi makan dengan rpx1‐1 menunjukkan ciri kerosakan dan nipis, longgar dan tidak berterusan (Rajah 2c–f). Untuk mengesahkan lagi ciri kerosakan PM, kami memperoleh bahagian melintang sampel larva. Keputusan pewarnaan Hematoxylin-eosin (HE) mendedahkan bahawa PM larva yang diberi makan dengan Col‐0 adalah tebal dan utuh dan terdapat ruang ektoperitropik (ES) antara PM dan sel epidermis midgut (Rajah 2g). Sebaliknya, PM di bahagian tengah larva yang diberi makan rpx1‐1 telah terganggu dengan teruk, dan kandungan usus berada dekat dengan dinding usus (tiada es, Rajah 2h). Apabila larva diberi makan dengan anak benih RPX1com, PM dan ES mereka tidak berubah dengan ketara (Rajah 2i, j). Keputusan ini mengesahkan bahawa ketukan RPX1 menjejaskan PM larva P. xylostella.

3.5|Pengumpulan kandungan DMNT dalam rpx1‐1 memberikan ketahanan terhadap larva P. xylostella

Untuk menyiasat sama ada kejatuhan RPX1 membentuk semula metabolit Arabidopsis dan membawa kepada penentangan terhadap larva P. xylostella, kami membandingkan sebatian organik meruap (VOC) yang dikeluarkan daripada tumbuhan rpx1‐ 1 dan Col‐0 jenis liar. Empat VOC (Heksanol,3-etil-5metil, Oktans,2,6-dimetil, Nonana,2,6-dimetil, dan DMNT) telah terkumpul secara berbeza antara rpx1‐1 dan Col‐0 (Rajah 3a). Untuk membedah lebih lanjut mekanisme molekul rpx1‐1 dalam rintangan P. xylostella, kami melakukan analisis RNA‐seq. Berbanding dengan Col‐0, mutan rpx1‐1 mempamerkan 211 gen yang diungkap secara berbeza (DEG) (Maklumat Sokongan: Set Data S1). Analisis pengayaan KEGG menunjukkan bahawa DEG ini tergolong dalam lebih daripada 2{57}} laluan metabolik yang berbeza, termasuk biosintesis sesquiterpenoid dan triterpenoid, metabolisme asid alfa-linolenik dan laluan metabolisme tyrosine (Rajah 3b, Maklumat Sokongan: Jadual S2). Terutamanya, laluan yang paling ketara diperkayakan ialah biosintesis seskuiterpenoid dan triterpenoid, yang terdiri daripada tiga DEG: At4g15340, At5g42600, dan At5g48010 (Rajah 3b, Maklumat Sokongan: Rajah S2a–c). At4g15340 telah dilaporkan mengekod untuk PEN1, oxidosqualene cyclase yang menukarkan 2,3-oxidosqualene kepada arabidiol dan membawa kepada sintesis DMNT bioaktif melalui CYP705A1 (Field & Osbourn, 2008; Sohrabi et al., 2015). At5g42600 mengekod untuk mineral synthase 1 (MRN1), yang merupakan komponen utama dalam biosintesis mineral. At5g48010 mengekod untuk thalianol synthase (THAS), enzim yang terlibat dalam biosintesis thalianol. Marneral dan thalianol telah dilaporkan terlibat dalam penyelenggaraan pembangunan tumbuhan (Field & Osbourn, 2008; Go et al., 2012) (Maklumat Sokongan: Rajah S3). Kami mengkaji potensi peranan MRN1 dan THAS dalam rintangan serangga dengan menyiasat keutamaan, mortaliti, dan kadar kepompong P. xylostella dengan memberi mereka makan dengan anak benih Arabidopsis transgenik yang mengekspresikan MRN1 (35Spro: MRN1) dan THAS (35Sproup: THAS) (35Spro: THAS) Maklumat: Rajah S4a,b). Tiada perbezaan ketara dikesan antara kedua-dua transgen dan Col‐0 jenis liar (Maklumat Sokongan: Rajah S4c–n), menunjukkan bahawa rintangan serangga rpx1‐1 tidak mungkin bergantung kepada kedua-dua gen ini.

RAJAH 2 Penyahaktifan RPX1 merosakkan struktur matriks peritropik (PM) dalam usus tengah larva. (a) Imej perwakilan larva yang diberi makan dengan baris Col‐0, rpx1‐1, dan RPX1com yang menunjukkan pengekalan pewarna, seperti yang dibuktikan oleh penampilan birunya, seperti watak kartun Smurf. (b) Kuantifikasi keputusan ditunjukkan dalam (a). Data dibentangkan sebagai min ± sem; huruf yang berbeza menunjukkan perbezaan yang ketara (analisis varians sehala, n=6). (c–f) Ultrastruktur PM larva yang diberi makan dengan garisan Col‐0 (c), rpx1‐1 (d), dan RPX1com (e, f). Ambil perhatian bahawa PM larva yang diberi makan dengan Col‐0 dan RPX1com adalah gebu dan utuh, tetapi PM larva yang diberi makan dengan rpx1‐1 adalah nipis, halus dan tidak berterusan di sesetengah kawasan. (g–j) Bahagian melintang dan pewarnaan hematoxylin‐eosin menunjukkan kerosakan PM daripada larva yang diberi makan dengan garisan Col‐0 (g), rpx1‐1 (h), atau RPX1com (i, j). [Warna angka boleh dilihat di wileyonlinelibrary.com]

Pengayaan biosintesis terpenoid dalam analisis KEGG (Rajah 3b) dan pengumpulan pembezaan DMNT yang dikesan dalam rpx1‐1 (Rajah 3a) mencadangkan bahawa DMNT mungkin merupakan salah satu sebatian yang terlibat dalam rintangan tumbuhan terhadap P. xylostella. Sama seperti laporan sebelumnya yang hampir tidak mengesan DMNT oleh analisis GC‐MS dalam Col‐0 (Liu et al., 2018; Sohrabi et al., 2015), kita boleh mengesan jumlah surih DMNT dalam Col‐0 yang tidak dijangkiti (Rajah 4a,b). Sebaliknya, tahap DMNT sangat diperkaya (~8 ng/g) dalam rpx1‐1, dan talian RPX1com menunjukkan tahap DMNT yang sangat rendah, sama seperti dalam tumbuhan Col‐0 (Rajah 4). Di samping itu, apabila serangan P. xylostella, tahap DMNT meningkat (~20 ng/g) dalam rpx1‐1, yang lebih tinggi daripada baris Col‐0 dan RPX1com (Rajah 4) . Kami mensintesis DMNT secara in vitro menggunakan kaedah yang diubah suai (Chen et al., 2021). Selaras dengan pemerhatian sebelumnya (Chen et al., 20}21), DMNT menyekat pertumbuhan P. xylostella, seperti yang dibuktikan oleh keutamaan (2.5 μmol/L) dan prestasi tanpa pilihan (0.25–25 μmol/L) ( Maklumat Sokongan: Rajah S5a,b). Selain itu, hasil pewarnaan HE menunjukkan bahawa PM larva kawalan adalah tebal dan utuh (Maklumat Sokongan: Rajah S5c), manakala PM larva yang dirawat dengan 2.5 μmol/L DMNT selama 48 jam adalah nipis dan tidak berterusan di sesetengah kawasan (Maklumat Sokongan: Rajah S5d). Diambil bersama, penemuan kami mencadangkan bahawa mutasi rpx1‐1 menyebabkan pengumpulan DMNT, yang menyumbang kepada pembunuhan larva P. xylostella dalam Arabidopsis. JA dan SA adalah metabolit sekunder tumbuhan yang berkait rapat dengan tegasan biotik. Untuk menentukan sama ada bahan ini menyumbang kepada rintangan serangga rpx1‐1, kami menyemak tahap JA dan SA bagi Col‐0 dan rpx1‐1 sebelum dan selepas serangan oleh P. xylostella. Di bawah keadaan yang tidak dirawat, tidak terdapat perbezaan yang ketara dalam tahap JA dan SA antara tumbuhan rpx1‐1 dan Col‐0 (Maklumat Sokongan: Rajah S6), dan tahap kedua-dua hormon meningkat dengan ketara pada 24 jam selepas serangan dengan P. xylostella . Terutamanya, selepas serangan, kandungan SA jauh lebih rendah dalam rpx1‐1 berbanding dengan Col‐0, manakala kandungan JA jauh lebih tinggi dalam rpx1‐1 berbanding Col‐0 (Maklumat Sokongan: Rajah S6).

RAJAH 3 Perbandingan sebatian meruap dan ekspresi gen yang diperkaya secara berbeza antara Col‐{1}} dan rpx1‐1. (a) Sebatian meruap yang diperkaya secara berbeza dalam Col‐0 dan rpx1‐1 telah dikesan oleh kaedah spektrometri jisim kromatografi gas (GC‐MS). Data dibentangkan sebagai min ± sem; asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara (*p < 0.05, **p < 0.01, ujian t tidak berpasangan dua ekor). (b) Analisis transkriptik Col‐0 dan rpx1‐1. Analisis KEGG tentang pengayaan laluan daripada gen yang dinyatakan secara berbeza antara Col-0 dan mutan rpx1-1. Satu laluan diperkaya (anak panah merah) berkaitan dengan biosintesis sesquiterpenoid dan triterpenoid dan terdiri daripada tiga gen, seperti yang ditunjukkan dalam rajah. [Warna angka boleh dilihat di wileyonlinelibrary.com]

3.6|RPX1 mengawal pengumpulan DMNT bergantung pada PEN1

Untuk menyiasat sumbangan PEN1 dalam pengumpulan DMNT terkawal rpx1‐1, kami menghasilkan binaan yang mengandungi miRNA buatan (PEN1amiR) dan mengubahnya menjadi mutan rpx1‐1. Kami juga menjana binaan ekspresi berlebihan PEN1, yang telah diubah menjadi Col‐0 (35pro: PEN1/Col‐{{10}}). Analisis ekspresi gen menunjukkan bahawa PEN1 telah dirobohkan (4‐7 lipatan) dalam PEN1amiR/rpx1‐1 berbanding dengan rpx1‐1, dan telah diekspresikan secara berlebihan (~2.5 kali) dalam 35Spro: PEN1 berbanding dengan Col‐0 (Rajah 5a). Dalam garisan transgenik ini, ungkapan RPX1 tidak dipengaruhi oleh ketukan atau overexpression PEN1 (Rajah 5b). Apabila diserang P. xylostella selama 6‐24 jam, ekspresi PEN1 dikawal dengan ketara dalam Col‐0 dan rpx1‐1, dan ungkapan PEN1 yang jauh lebih tinggi dicapai dalam rpx1‐1 selepas 24 jam serangan (Rajah 5c) . Seterusnya, kami mengukur kandungan DMNT dalam Col‐0, rpx1‐1, PEN1amiR/rpx1‐1 dan 35Spro: PEN1/Col‐{{50}}. Tanpa serangan P. xylostella, rpx1‐1 menghasilkan tahap DMNT yang lebih tinggi daripada Col‐0 (Rajah 5d,e,f,k,l), dan apabila PEN1 ditumbangkan oleh mikroRNA buatan dalam rpx1‐1 (PEN1amiR /rpx1‐1), tahap DMNT telah dikurangkan, menunjukkan tahap yang jauh lebih rendah daripada tahap rpx1‐1 (Rajah 5d,g,h,m,n). Selepas serangan larva, tahap DMNT dalam anak benih Col‐0 dan rpx1‐1 telah dikawal dengan ketara, tetapi dalam anak benih PEN1amiR/rpx1‐1, tahap DMNT tidak boleh diinduksi dan jauh lebih rendah daripada rpx1‐1 (Rajah 5d, g, h, m, n), menunjukkan bahawa PEN1 mungkin memainkan peranan penting dalam biosintesis DMNT terkawal RPX1, seperti yang digambarkan dalam Maklumat Sokongan: Rajah S3. Selaras dengan ini, DMNT sangat terkumpul dalam anak benih 35Spro: PEN1/Col‐0 (Rajah 5d, i, j, o, p).

RAJAH 4 Kehilangan RPX1 meningkatkan pengumpulan dimetil‐1,3,7‐nonatriena (DMNT). (a) analisis kromatografi gas-spektrometri jisim (GC-MS) DMNT dalam baris Col‐0, rpx1‐1 dan RPX1com (RPX1pro:RPX1/rpx1‐1). Standard DMNT ditunjukkan di bahagian bawah. (b) Jumlah kromatografi ion (TIC) DMNT yang ditangkap daripada Col‐0, rpx1‐1 dan RPX1com. (c) Kandungan DMNT meningkat dalam mutan rpx1‐ 1 tetapi kembali ke tahap jenis liar dalam tumbuhan transgenik RPX1com. Data dibentangkan sebagai min ± sem; huruf yang berbeza menunjukkan perbezaan yang ketara (analisis varians sehala, n=3). [Warna angka boleh dilihat di wileyonlinelibrary.com]

3.7|PEN1 menyumbang kepada membunuh P. xylostella dalam rpx1‐1

Memandangkan pemerhatian bahawa knockdown PEN1 boleh melemahkan pengumpulan DMNT yang disebabkan oleh penyahaktifan RPX1 (Rajah 5), kami melakukan bioassays pada PEN1 knockdown dan overexpression transgenik Arabidopsis untuk menunjukkan peranan biologinya. Kami mendapati bahawa larva P. xylostella tidak menunjukkan keutamaan untuk tumbuhan amiR‐PEN1/rpx1‐1 berbanding dengan Col‐0 (Maklumat Sokongan: Rajah S7). Sementara itu, larva P. xylostella yang diberi makan PEN1‐amiR/rpx1‐1 menunjukkan kadar kematian yang jauh lebih rendah dan kadar pupasi yang lebih tinggi daripada rpx1‐1, manakala larva yang diberi makan dengan 35Spro: PEN1/Col‐0 menunjukkan kematian yang lebih tinggi dan pupasi yang lebih rendah. kadar daripada yang diberi makan dengan Col‐0 (Rajah 6a,b). Selaras dengan keputusan ini, 'Ujian Smurf' dan eksperimen transeksi selanjutnya menunjukkan bahawa PEN1‐amiR/rpx1‐1 mempunyai usus dan PM yang normal dan utuh berbanding larva yang diberi makan rpx1‐1 (Rajah 6c,d,g,h), dan lebihan ekspresi PEN1 menyebabkan kerosakan teruk pada usus tengah dan PM larva P. xylostella (Rajah 6c, d, i, j). Keputusan ini menunjukkan bahawa penembusan PEN1 boleh menyekat kesan negatif ke atas pertumbuhan larva yang disebabkan oleh penyahaktifan RPX1, dengan itu memainkan peranan penting dalam pengaruh toksik yang disebabkan oleh rpx1-1-pada larva P. xylostella.

3.8|DMNT mengangkut dari akar ke bahagian udara Arabidopsis 

PEN1 telah dilaporkan terutamanya dinyatakan dalam akar Arabidopsis (AC Huang et al., 2019; Sohrabi et al., 2015) (Maklumat Sokongan: Rajah S8a), yang berbeza daripada hasil yang ditunjukkan oleh bahagian udara rpx1‐1 ketoksikan kepada P. xylostella dalam cara yang bergantung kepada PEN1 (Rajah 6). Oleh itu, kami merumuskan hipotesis alternatif: tumbuhan mensintesis DMNT terutamanya dalam akar dan mengangkutnya ke bahagian udara, di mana ia menggalakkan ketahanan terhadap serangga. Untuk menguji hipotesis ini, kami melakukan dua ujian pengangkutan DMNT. Dalam ujian pertama (Rajah 7a), kami mengeramkan akar anak benih Arabidopsis berumur 3- 3-minggu dalam medium pertumbuhan tumbuhan cecair yang mengandungi 2.5 μmol/L DMNT, menggunakan DMSO sebagai kawalan. Selepas mengkultur selama 24 jam, kami mengeluarkan daun Arabidopsis dan menawarkannya kepada larva P. xylostella. Berbanding dengan kawalan DMSO, daun daripada tumbuhan yang dirawat DMNT menyebabkan kematian larva yang jauh lebih tinggi dan kadar pupasi yang lebih rendah daripada kawalan (Rajah 7b, c). Dalam percubaan kedua yang bertujuan untuk mendapatkan pengesahan bebas selanjutnya bagi pengangkutan DMNT, kami melabelkan DMNT dengan 2 H dan menambah DMNT‐ 2 H pada medium pertumbuhan tumbuhan cecair. Selepas 24 jam pengeraman, DMNT‐ 2 H sangat diperkaya dalam daun (Rajah 7d–i). Untuk menolak kemungkinan DMNT boleh meruap daripada medium pertumbuhan cecair ke udara dan mencemari bahagian udara tumbuhan, kami menyediakan kawalan selari, yang dilakukan dengan cara yang sama seperti dalam Rajah 7a, kecuali akar Arabidopsis tidak direndam dalam cecair. medium pertumbuhan. Keputusan menunjukkan bahawa tiada DMNT‐ 2 H dikesan di bahagian udara tumbuhan (Maklumat Sokongan: Rajah S8b,c). Oleh itu, kami mencadangkan bahawa DMNT bergerak dari akar, di mana ia dihasilkan, ke daun Arabidopsis, di mana ia menyebabkan kematian perosak.

RAJAH 5 PEN1 menyumbang peranan penting dalam pengumpulan dimetil‐1,3,7‐nonatriene (DMNT) dalam rpx1‐1. (a) Analisis ekspresi PEN1 dalam Col‐0, rpx1‐1, PEN1 knockdown dalam latar belakang rpx1‐1 (PEN1‐amiR/rpx1‐1) dan PEN1 overexpression (35Spro:PEN1/Col‐{{2{{ 22}}}}) baris. (b) Ungkapan RPX1 dalam Col‐{{30}}, rpx1‐1, PEN1‐amiR/rpx1‐1 dan 35Spro:PEN1/Col‐0. (c) Ekspresi PEN1 diinduksi oleh serangan Plutella xylostella dalam Col‐0 dan rpx1‐1. (d) Perbandingan pengumpulan DMNT antara Col‐0, rpx1‐1, PEN1‐amiR/rpx1‐1 dan 35Spro:PEN1/Col‐0. (e–j) analisis kromatografi gas–spektrometri jisim (GC‐MS) bagi meruap yang dipancarkan daripada Col‐0 (e), rpx1‐1 (f), PEN1‐amiR/rpx1‐1 (g, h) dan 35Spro: garis PEN1/ Col‐0 (i, j). (k–p) TIC DMNT ditangkap daripada baris Col‐0 (k), rpx1‐1 (l), PEN1‐amiR/rpx1‐1 (m, n) dan 35Spro: PEN1/Col‐0 (o, p) , sepadan dengan data dalam (e–j). Dalam (a–d), data dibentangkan sebagai min ± sem; huruf yang berbeza menunjukkan perbezaan yang ketara (analisis varians sehala, n=3). [Warna angka boleh dilihat di wileyonlinelibrary.com]

3.9|RPX1 terdegradasi oleh serangan P. xylostella dan rawatan mencederakan

Kami menunjukkan bahawa ekspresi PEN1 telah dikawal selia dalam rpx1‐1 dan anak benih Arabidopsis yang diserang larva P. xylostella (Rajah 5a, c), meningkatkan kemungkinan bahawa RPX1 juga mungkin bertindak balas terhadap serangan larva. Untuk mengesahkan ramalan ini, kami menyiasat kemungkinan tindak balas RPX1 terhadap serangan P. xylostella. Analisis ekspresi gen menunjukkan bahawa RPX1 dinyatakan dalam tisu yang berbeza (Maklumat Sokongan: Rajah S9a), tetapi tidak mempunyai tindak balas yang ketara terhadap serangan larva 6-24 jam (Maklumat Sokongan: Rajah S9b). Oleh itu, kami menyemak tahap protein RPX1 dalam RPX1pro: tumbuhan transgenik RPX1‐GFP dengan melakukan immunoblotting. Keputusan menunjukkan bahawa tanpa serangan larva, RPX1‐GFP adalah stabil selama 0‐12{{40}} min; sebaliknya, selepas serangan larva selama 15 minit, RPX1‐GFP mula merosot; selepas 120 min, protein RPX1‐GFP turun secara berterusan kepada kira-kira 6% daripada titik masa mula (Rajah 8a, Maklumat Sokongan: Rajah S10a). Sebagai kawalan, dalam anak benih Arabidopsis yang mengandungi transgene GFP, GFP agak stabil selepas serangan larva (Rajah 8b). Untuk menolak kemungkinan pengaruh teg GFP pada kestabilan RPX1, kami menghasilkan tumbuhan RPX1 transgenik dengan tag FLAG (35Spro: RPX1‐FLAG) untuk melakukan eksperimen serangan larva, yang menunjukkan hasil yang konsisten bahawa RPX1‐FLAG juga boleh dihina oleh larva serangan, serupa dengan RPX1‐GFP (Rajah 8c). Serangan serangga sering menyebabkan kecederaan pada tumbuhan, dan kerosakan fizikal sebahagiannya boleh mensimulasikan proses pemakanan serangga herbivor. Untuk menunjukkan sama ada kecederaan boleh menyebabkan kemerosotan RPX1, kami menggunakan jarum untuk membuat lubang pada daun tumbuhan untuk meniru kecederaan dan mendapati bahawa RPX1‐GFP merosot selepas 3{48}} min rawatan (Rajah 8d, Maklumat Sokongan: Rajah S10b). Untuk memahami dengan lebih baik sebab kemerosotan RPX1 apabila serangan P. xylostella, kami mengeram tisu tumbuhan transgenik RPX1‐GFP bersama-sama dalam larutan selama 15 minit dengan Col‐0, yang telah diserang oleh P. xylostella selama 15–120 minit , atau tisu Col‐0 tanpa serangan. Analisis immunoblotting menunjukkan bahawa tahap RPX1-GFP daripada sampel yang diinkubasi dengan Col‐0 pra-dijangkiti adalah jauh lebih rendah daripada yang tidak dijangkiti Col‐0 (Rajah 8e), menunjukkan bahawa serangan P. xylostella menyebabkan beberapa faktor atau isyarat dalam Col‐0 yang boleh membawa kepada kemerosotan RPX1.

3.10|Mutasi rpx1‐1 memberikan kelebihan dalam pembangunan dan pembiakan tumbuhan

Ciri umum tindak balas pertahanan khusus herbivori ialah pertukaran antara rintangan perosak dan pertumbuhan dan pembiakan tumbuhan (Li et al., 2018). Untuk menentukan sama ada genotip di lokus RPX1 tertakluk kepada pertukaran tersebut, kami membandingkan pengeluaran benih dalam Col‐{{10}} dan mutan rpx1‐1. Dengan ketiadaan serangan P. xylostella, hasil benih setiap tumbuhan adalah serupa antara kedua-dua genotip (Maklumat Sokongan: Rajah S11). Sebaliknya, mendedahkan tumbuhan rpx1‐1 dan Col‐0 berumur 3 minggu kepada serangan 15 s‐instar P. xylostella selama hanya 72 jam mengurangkan hasil akhir benih Col‐0 sebanyak tiga kali ganda, manakala hasil benih dalam rpx1‐1 tidak terjejas dengan ketara. Selain itu, hasil benih RPX1com adalah serupa dengan Col‐0, tetapi jauh lebih rendah daripada rpx1‐1, menunjukkan bahawa penyahaktifan RPX1 memberikan kelebihan dalam pengeluaran benih apabila serangan larva (Maklumat Sokongan: Rajah S11). Kami juga menilai pengeluaran benih dalam 35Spro: PEN1 transgenik Arabidopsis dan memerhatikan bahawa ekspresi berlebihan PEN1 menghasilkan hasil benih yang lebih tinggi di bawah kedua-dua keadaan yang diserang larva dan tidak dijangkiti (Maklumat Sokongan: Rajah S11). Keputusan ini menunjukkan bahawa mutasi rpx1‐1 dan ekspresi PEN1 yang lebih tinggi memberikan rintangan kepada P. xylostella tanpa ketiadaan pertukaran pertumbuhan yang biasanya dikaitkan, menonjolkan potensi RPX1 dan PEN1 dalam program pembiakan molekul yang bertujuan untuk meningkatkan pengeluaran tanaman.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

4|PERBINCANGAN

Perosak merendahkan hasil dan kualiti agronomik secara mendadak, menjadikan perlindungan tumbuhan sebagai keutamaan dan objektif jangka panjang untuk petani dan penternak. Dalam kajian ini, kami mengenal pasti mutan Arabidopsis rpx1‐1, yang menunjukkan rintangan yang tinggi terhadap P. xylostella, perosak tanaman lepidopteran yang penting. Analisis kami mendedahkan bahawa mutasi rpx1‐1 menghasilkan tahap transkrip PEN1 yang lebih tinggi, pengumpulan DMNT, dan rintangan tumbuhan yang lebih baik terhadap perosak. Kami juga menunjukkan bahawa protein RPX1 boleh terdegradasi oleh serangan larva dan rawatan mencederakan.

RAJAH 6 PEN1 menyumbang kepada peningkatan rintangan rpx1‐1 kepada Plutella xylostella. (a, b) transgen PEN1‐amiR dengan ketara mengurangkan rintangan rpx1‐1 kepada serangan P. xylostella, manakala 35Spro: PEN1 meningkatkan kesan rintangan, seperti yang ditunjukkan oleh kadar kematian (a) dan pupation (b) larva P. xylostella . (c) Imej perwakilan larva yang diberi makan dengan Col‐0, rpx1‐1, PEN1‐amiR/rpx1‐1, dan 35Spro: anak benih PEN1 menunjukkan pengekalan pewarna, seperti yang dibuktikan oleh penampilan birunya, seperti kartun Smurf watak. (d) Keputusan kuantifikasi imej yang ditunjukkan dalam (c). (e–j) Bahagian melintang dan pewarnaan hematoxylin‐eosin menunjukkan kerosakan PM daripada larva yang diberi makan dengan Col‐0 (e), rpx1‐1 (f), PEN1‐amiR/rpx1‐1 (g, h) dan 35Spro: anak pokok PEN1 (i, j). Data dibentangkan sebagai min ± sem; huruf yang berbeza pada setiap rawatan menunjukkan perbezaan yang ketara dalam (a, b, d) (analisis varians sehala, n=6). [Warna angka boleh dilihat di wileyonlinelibrary.com]

Dalam ujian tanpa pilihan, mutan rpx1-1 menunjukkan rintangan yang ketara terhadap serangan P. xylostella (Rajah 1c). Sebaliknya, larva P. xylostella yang diberi makan tumbuhan rpx1‐1 menunjukkan masalah perkembangan negatif yang teruk (Rajah 1d, e). Fenotip ini berpunca daripada penyahaktifan RPX1, kerana garisan pelengkap RPX1 (RPX1com) adalah rentan seperti Col‐{10}} jenis liar (Rajah 1c–e), menyokong kesimpulan bahawa RPX1 terlibat dalam rintangan perosak. Selain membunuh larva, mutan rpx1‐1 juga mempunyai kesan jangka panjang terhadap perkembangan larva, termasuk pupation (Rajah 1f), yang membawa kepada pengurangan pembiakan perosak.

RAJAH 7 Dimetil‐1,3,7‐nonatriene (DMNT) mengangkut dari akar Arabidopsis ke daun. ( a ) Ilustrasi ujian pengangkutan DMNT menggunakan anak benih Arabidopsis. DMNT telah dibubarkan dalam medium cecair Murashige dan Skoog. Selepas kultur 24-jam, akar dipotong, dan daunnya digunakan untuk memberi makan larva Plutella xylostella untuk pemarkahan kadar kematian dan kepompong. (b, c) DMNT, diangkut dari akar ke daun, menghasilkan kadar kematian yang lebih tinggi (b) dan kepompong yang lebih rendah (c) larva P. xylostella. (d–f) 2 DMNT berlabel H (DMNT‐ 2 H) diangkut dari akar ke daun. DMNT‐ 2 H telah dibubarkan dalam medium MS cecair seperti dalam (a) selama 24 jam, dan kemudian daun dituai untuk analisis GC‐MS (e). DMSO digunakan sebagai kawalan (d). Piawaian DMNT‐ 2 H ditunjukkan untuk rujukan (f). (g–i) TIC DMNT‐ 2 H yang diperoleh semasa ujian pengangkutan ditunjukkan dalam (d–f). Data dibentangkan sebagai min ± sem, dalam (b, c) n=6, nilai-p ditunjukkan bersebelahan dengan lajur histogram untuk menunjukkan perbezaan yang ketara (ujian t tidak berpasangan dua ekor). Ambil perhatian bahawa lebih banyak kawalan untuk ujian pengangkutan disertakan dalam Maklumat Sokongan: Rajah S8. [Warna angka boleh dilihat di wileyonlinelibrary.com]

Tambahan pula, ujian keutamaan menunjukkan bahawa mutan Col‐{{0}} dan rpx1‐1 jenis liar mungkin mengeluarkan sebatian meruap yang berbeza; salah satunya ialah DMNT, yang berkesan dalam menghalau perosak (Rajah 1b, 3a, Maklumat Sokongan: Rajah S5a). Berdasarkan keputusan di atas, kami mencadangkan pengumpulan DMNT dalam rpx1‐1 adalah salah satu sebab keracunan serangga. Laluan isyarat JA dan SA telah dilaporkan terlibat dalam rintangan serangga (Costarelli et al., 2020; Lortzing & Steppuhn, 2016). Dalam kajian ini, selepas 24 jam makan serangga, kandungan JA dan SA dalam kedua-dua Col‐0 dan rpx1‐1 mutan meningkat, dan peningkatan kandungan SA dalam rpx1‐1 adalah jauh lebih rendah daripada kandungan Col‐0, manakala peningkatan kandungan JA adalah lebih tinggi (Maklumat Sokongan: Rajah S6), menunjukkan bahawa JA dan SA juga mungkin memainkan peranan penting dalam rintangan rpx1‐1 terhadap P. xylostella. Oleh itu, kami mencadangkan bahawa kedua-dua kesan langsung dan tidak langsung rpx1-1 menyumbang kepada peningkatan rintangan Arabidopsis terhadap serangga.

RAJAH 8 Degradasi protein RPX1 disebabkan oleh serangan Plutella xylostella dan rawatan mencederakan. (a) RPX1‐GFP daripada RPX1pro: Tumbuhan transgenik RPX1‐ GFP terdegradasi apabila diserang P. xylostella selama 15−120 min. (b) Sebagai kawalan untuk (a), GFP sendiri daripada 35Spro: Tumbuhan transgenik GFP tidak menunjukkan degradasi apabila serangan larva. (c) Bendera RPX1 daripada 35Spro: Tumbuhan transgenik bendera RPX1 terdegradasi apabila diserang larva. (d) RPX1‐GFP daripada RPX1pro: Tumbuhan transgenik RPX1‐GFP terdegradasi dengan rawatan kecederaan selama 15−120 minit. (e) RPX1‐GFP daripada RPX1pro: Tumbuhan transgenik RPX1‐GFP terdegradasi apabila tisu diinkubasi dalam larutan dengan tisu daripada tumbuhan Col‐0 yang telah dijangkiti oleh P. xylostella selama 15−120 min. Nilai di bawah jalur imun-blotting menunjukkan kelimpahan protein relatif yang dikira menggunakan ImageJ. Semua eksperimen ini telah diulang sekurang-kurangnya tiga kali, dan hasil yang mewakili ditunjukkan. Lebih banyak data eksperimen dengan talian transgenik bebas ditunjukkan dalam Maklumat Sokongan: Rajah S10. [Warna angka boleh dilihat di wileyonlinelibrary.com]

Kami membentangkan beberapa baris bukti yang menunjukkan cara PEN{{0}}pengantaraan pengumpulan DMNT menyumbang kepada fungsi RPX1 dalam rintangan tumbuhan kepada P. xylostella. PEN1, gen utama kepunyaan laluan biosintesis sesquiterpenoid dan triterpenoid, telah dikenal pasti daripada analisis KEGG data RNA-seq daripada rpx1-1 mutant (Rajah 3b), menyediakan hubungan antara RPX1, PEN1, dan DMNT (Sohrabi et al. , 2015). Untuk menyokong DMNT sebagai salah satu sebatian penyebab yang membunuh larva perosak, DMNT terkumpul lebih tinggi dalam mutan rpx1‐1 berbanding Col‐0 (Rajah 3a), tetapi paras dalam talian RPX1com telah diterbalikkan kepada Col‐0 ( Rajah 4a–c). Selain itu, DMNT yang disintesis secara kimia boleh menangkis dan membunuh larva P. xylostella (Maklumat Sokongan: Rajah S5a,b), yang selaras dengan keputusan rpx1‐1 (Rajah 1b,e). Tambahan pula, tumbuhan transgenik yang mengekspresi berlebihan PEN1 menghasilkan lebih daripada empat kali DMNT dalam Col‐0 dan memberikan rintangan yang serupa kepada P. xylostella sebagai rpx1‐1 (Rajah 5d, i,j,o,p dan 6).

Yang penting, mengurangkan tahap transkrip PEN1 dalam rpx1‐1 menyekat biosintesis DMNT (Rajah 5d,g,h,m,n) dan mengurangkan kesan pembunuhan pada larva P. xylostella, yang terdedah kepada serangan P. xylostella (Rajah 6a,b). ). Keputusan gabungan ini menunjukkan bahawa mutasi PEN1 boleh menyekat fungsi penyahaktifan RPX1 dalam rintangan perosak. Lesi RPX1 menyebabkan kelimpahan PEN1 yang lebih tinggi (Rajah 5a), namun bagaimana tepatnya RPX1 mengawal PEN1 dan mengantara biosintesis DMNT memerlukan kajian lanjut. Memandangkan RPX1 diramalkan sebagai protein pengikat topi novel kepunyaan keluarga eIF4E (Rhoads, 2009; Ruud et al., 1998), kemungkinan RPX1 boleh menjejaskan PEN1 dengan mempengaruhi kestabilan mRNA atau kecekapan terjemahan protein, yang akan menjadi penting. topik dalam kajian akan datang. Selain itu, perlu diingatkan bahawa tahap DMNT masih boleh didorong ke tahap yang lebih tinggi oleh serangan P. xylostella dalam mutan rpx1‐1 (Rajah 5d), menunjukkan bahawa mungkin terdapat beberapa laluan lain yang mengawal pengumpulan DMNT bebas daripada RPX1. DMNT telah dikesan dalam pelbagai spesies tumbuhan, seperti Arabidopsis (Sohrabi et al., 2015), kapas (Liu et al., 2018) dan jagung (Richter et al., 2016). Di samping itu, ia memberikan perlindungan tidak langsung terhadap perosak herbivor dengan menarik pemangsa, membolehkan tumbuhan menghilangkan ancaman perosak (Kappers et al., 2005; Lee et al., 2010; Li et al., 2018). Kami baru-baru ini melaporkan bahawa ia boleh menangkis dan membunuh larva P. xylostella dengan merosakkan PM dalam usus tengah larva (Chen et al., 2021). Di sini, kami mendapati bahawa struktur PM boleh rosak teruk apabila larva diberi makan dengan anak benih berlebih rpx1‐1 atau PEN1 (Rajah 2c–j dan 6i,j). Keputusan ini selaras dengan penemuan dalam eksperimen rawatan DMNT yang kami huraikan sebelum ini (Chen et al., 2021), sekali lagi menyokong cadangan bahawa pengumpulan DMNT dalam rpx1‐1 mungkin merupakan salah satu faktor yang menyumbang kepada penolakan perosak dan kematian. RPX1 tergolong dalam keluarga gen eIF4E (Rhoads, 2009) dan terlibat dalam pergerakan sel-ke-sel virus tumbuhan (Keima et al., 2017). Walau bagaimanapun, sama ada pengumpulan DMNT berkaitan dengan rintangan virus dalam tumbuhan masih tidak jelas. PEN1 secara khusus dinyatakan dalam akar Arabidopsis, di mana ia memangkinkan biosintesis DMNT (Sohrabi et al., 2015).

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Secara konsisten dalam kajian ini, kami mengesan ekspresi PEN1 yang tinggi dalam akar dan ekspresi yang sangat rendah dalam daun (Maklumat Sokongan: Rajah S8a). Kami memerhatikan bahawa daun mutan rpx1‐1 adalah toksik kepada larva P. xylostella (Rajah 1), menunjukkan bahawa pengumpulan DMNT dan rintangan perosak yang berkaitan dalam daun tidak boleh dijelaskan secara ringkas dengan ungkapan PEN1 minit dalam tisu ini. Secara bermakna, kami mendapati bahawa DMNT boleh diangkut dari akar tumbuhan ke bahagian udara, seperti yang ditunjukkan oleh ujian pengangkutan DMNT dan analisis GC-MS bagi ekstrak daun daripada tumbuhan yang diinkubasi dengan DMNT- 2 H pada akarnya (Rajah 7). Cara sebatian ini diangkut dalam tumbuhan tidak jelas, dan ia mungkin menjadi topik untuk siasatan lanjut. Tumbuhan mempunyai keupayaan untuk bertolak ansur dan melawan serangan serangga dalam pelbagai cara. Di sini, dengan melakukan analisis imunoblotting RPX1pro: RPX1‐GFP dan 35Spro: RPX1‐FLAG tumbuhan transgenik, kami mendapati bahawa apabila serangan P. xylostella, protein RPX1 boleh terdegradasi dengan cepat (Rajah 8a,c, Maklumat Sokongan: Rajah S10a), manakala , pada tahap ekspresi mRNA, RPX1 kekal tidak terjejas (Maklumat Sokongan: Rajah S9b). Pada masa ini, bagaimana protein RPX1 terdegradasi masih tidak jelas, tetapi data kami terutamanya mencadangkan bahawa mekanisme degradasi protein mungkin terlibat dalam laluan isyarat kecederaan (Rajah 8d, Maklumat Sokongan: Rajah S10b).

Selain itu, P. xylostella pra-dijangkiti Col‐0 menyebabkan kemerosotan RPX1‐GFP dalam tumbuhan berbeza (Rajah 8e), menunjukkan bahawa serangan P. xylostella boleh menyebabkan pengumpulan isyarat dalam tumbuhan yang boleh, seterusnya, membawa kepada Kemerosotan RPX1. Ia akan menjadi menarik untuk mengetahui identiti isyarat pada masa hadapan. Ciri degradasi RPX1 ini penting untuk tumbuhan, yang mungkin membawa kepada pengumpulan DMNT dan memberikan tindak balas pantas kepada kerosakan perosak (Maklumat Sokongan: Rajah S3). Peningkatan toleransi tumbuhan terhadap perosak selalunya mengorbankan kecergasan. Pemerhatian bahawa mutasi rpx1‐1 membawa kepada rintangan yang dipertingkatkan (Rajah 1) dan pengeluaran benih yang lebih tinggi (Maklumat Sokongan: Rajah S11) dalam Arabidopsis tanpa pertukaran yang ketara menawarkan jalan yang menjanjikan untuk tanaman kejuruteraan dengan rintangan perosak yang lebih tinggi. Sebagai contoh, pengeditan genom melalui CRISPR‐Cas9 ialah alat yang berkuasa untuk penambahbaikan tanaman (Yang et al., 2017) yang membolehkan pengenalan mutasi dalam RPX1 dan berpotensi mengembangkan aplikasinya kepada pelbagai tanaman.

RUJUKAN

Arimura, G., Ozawa, R., Shimoda, T., Nishioka, T., Boland, W. & Takabayashi, J. (2000) Herbivori-induced volatiles menimbulkan gen pertahanan dalam daun kacang Lima. Alam, 406, 512–515.

Chen, C., Chen, H., Huang, S., Jiang, T., Wang, C., Tao, Z. et al. (2021) DMNT yang meruap secara langsung melindungi tumbuhan daripada Plutella xylostella dengan mengganggu penghalang matriks peritropik dalam usus tengah serangga. eLife, 10, e63938.

Cheng, X., Hu, J., Li, J., Chen, J., Wang, H., Mao, T., et al. (2018) Kerosakan kelenjar sutera dan tindak balas transkrip untuk menyahtoksik gen berkaitan enzim Bombyx mori di bawah pendedahan phoxim. Chemosphere, 209, 964–971.

Clough, SJ & Bent, AF (1998) Floral dip: kaedah yang dipermudahkan untuk transformasi Agrobacterium-mediated Arabidopsis thaliana. Jurnal Tumbuhan, 16, 735–743.

Costarelli, A., Blanchet, C., Ederli, L., Salerno, G., Piersanti, S., Rebora, M. et al. (2020) Asid salisilik yang disebabkan oleh pemakanan herbivor menentang pertahanan tumbuhan pengantara asid jasmonik terhadap serangan serangga. Isyarat & Kelakuan Tumbuhan, 15, e1704517.

Douglas, AE (2018) Strategi untuk meningkatkan ketahanan tanaman terhadap perosak serangga. Kajian tahunan biologi tumbuhan, 69, 637–660.

Feng, Y. & Zhang, A. (2017) Haruman bunga, metil benzoat, ialah racun perosak hijau yang cekap. Laporan Saintifik, 7, 42168.

Field, B. & Osbourn, AE (2008) Perhimpunan bebas kepelbagaian metabolik bagi kelompok gen seperti operon dalam tumbuhan berbeza. Sains, 320, 543–547.

Pergi, YS, Lee, SB, Kim, HJ, Kim, J., Park, HY, Kim, JK et al. (2012) Pengenalpastian sintase mineral, yang penting untuk pertumbuhan dan perkembangan dalam Arabidopsis. Jurnal Tumbuhan, 72, 791–804.

Gols, R. (2014) Pertahanan kimia langsung dan tidak langsung terhadap serangga dalam rangka kerja multitropik. Tumbuhan, Sel & Persekitaran, 37, 1741–1752.

Gomez, MA, Lin, ZD, Moll, T., Chauhan, RD, Hayden, L., Renninger, K., et al. (2019) Pengeditan serentak CRISPR/Cas9 bagi isoform ubi kayu eIF4E nCBP‐1 dan nCBP‐2 mengurangkan keterukan dan kejadian simptom penyakit coretan coklat ubi kayu. Jurnal Bioteknologi Tumbuhan, 17, 421–434.

Gouinguené, S., Pickett, JA, Wadhams, LJ, Birkett, MA & Turlings, TCJ (2005) Tindak balas elektrofisiologi antena tiga tebuan parasit kepada bahan meruap yang disebabkan oleh ulat daripada jagung (Zea mays), kapas (Gossypium herbaceum), dan kacang lembu (Vigna unguiculata). Jurnal Ekologi Kimia, 31, 1023–1038.

Handrick, V., Robert, CAM, Ahern, KR, Zhou, S., Machado, RAR, Maag, D. et al. (2016) Biosintesis sebatian pertahanan benzoxazinoid 8-O-metilasi dalam jagung. Sel Tumbuhan, 28, 1682-1700.

Huang, AC, Jiang, T., Liu, YX, Bai, YC, Reed, J., Qu, B. et al. (2019) Rangkaian metabolik khusus secara selektif memodulasi mikrobiota akar Arabidopsis. Sains, 364, eaau6389.

Huang, HJ & Yang, WB (2007) Sintesis moenocinol dan analognya menggunakan BT-sulfon dalam olefinasi Julia-Kocienski. Huruf Tetrahedron, 48, 1429–1433.

Jing, T., Du, W., Gao, T., Wu, Y., Zhang, N., Zhao, M. et al. (2020) DMNT yang disebabkan oleh herbivor yang dimangkin oleh CYP82D47 memainkan peranan penting dalam induksi rintangan herbivor yang bergantung kepada JA tumbuhan teh jiran. Tumbuhan, Sel & Persekitaran, 44, 1178–1191.

Johnson, SN & Züst, T. (2018) Perubahan iklim dan perosak serangga: rintangan tidak sia-sia? Trend dalam Sains Tumbuhan, 23, 367–369.

Jouzani, GS, Valijanian, E. & Sharafi, R. (2017) Bacillus thuringiensis: racun serangga yang berjaya dengan ciri dan berita alam sekitar yang baharu. Mikrobiologi Gunaan dan Bioteknologi, 101, 2691–2711.

Kappers, IF, Aharoni, A., van Herpen, TWJM, Luckerhoff, LLP, Dicke, M. & Bouwmeester, HJ (2005) Kejuruteraan genetik metabolisme terpenoid menarik pengawal peribadi kepada Arabidopsis. Sains, 309, 2070–2072.

Keima, T., Hagiwara‐Komoda, Y., Hashimoto, M., Neriya, Y., Koinuma, H., Iwabuchi, N., et al. (2017) Kekurangan isoform eIF4E nCBP mengehadkan pergerakan sel-ke-sel bagi virus tumbuhan yang mengekod protein blok tiga-gen dalam Arabidopsis thaliana. Laporan Saintifik, 7, 39678.

Lee, S., Badieyan, S., Bevan, DR, Herde, M., Gatz, C. & Tholl, D. (2010) Meruap monoterpena yang disebabkan oleh herbivor dan bunga dibiosintesis oleh enzim P450 tunggal (CYP82G1) dalam Arabidopsis . Prosiding Akademi Sains Kebangsaan, 107, 21205–21210.

Li, B., Förster, C., Robert, CAM, Züst, T., Hu, L., Machado, RAR, et al. (2018) Evolusi menumpu suis metabolik antara rintangan aphid dan ulat dalam bijirin. Kemajuan Sains, 4, eat6797.

Liu, D., Huang, X., Jing, W., An, X., Zhang, Q., Zhang, H. et al. (2018) Pengenalpastian dan analisis fungsi dua enzim P450 Gossypium hirsutum yang terlibat dalam biosintesis DMNT dan TMTT. Jurnal Bioteknologi Tumbuhan, 16, 581–590.

Lortzing, T. & Steppuhn, A. (2016) Isyarat Jasmonate dalam tumbuhan membentuk ekologi interaksi serangga tumbuhan. Pendapat Semasa dalam Sains Serangga, 14, 32–39.

Lu, H., Luo, T., Fu, H., Wang, L., Tan, Y., Huang, J., et al. (2018) Rintangan beras terhadap perosak serangga yang dimediasi oleh penindasan biosintesis serotonin. Tumbuhan Alam Semula Jadi, 4, 338–344.

Lucioli, A., Tavazza, R., Baima, S., Fatyol, K., Burgyan, J. & Tavazza, M. (2022) CRISPR‐Cas9 menyasarkan gen eIF4E1 memanjangkan spektrum rintangan virus kentang Y Solanum tuberosum L. cv. keinginan. Sempadan dalam Mikrobiologi, 13, 873930.

Ma, F., Yang, X., Shi, Z. & Miao, X. (2019) Perbincangan silang novel antara tindak balas laluan asid etilena dan jasmonik kepada serangga yang menghisap menusuk dalam beras. Phytologist Baharu, 225, 474–487.

Meents, AK, Chen, SP, Reichelt, M., Lu, HH, Bartram, S., Yeh, KW et al. (2019) DMNT yang tidak menentu secara sistem mendorong pertahanan antiherbivor langsung bebas jasmonate dalam daun tumbuhan ubi keledek (Ipomoea batatas). Laporan Saintifik, 9, 17431.

Mikstacki, A., Zakerska‐Banaszak, O., Skrzypczak‐Zielinska, M., Tamowicz, B., Szalata, M. & Slomski, R. (2015) Glutathione S-transferase sebagai penunjuk ketoksikan dalam anestesia am: genetik dan fungsi biokimia. Jurnal Anestesia Klinikal, 27, 73–79.

Rhoads, RE (2009) eIF4E: ahli keluarga baharu, rakan kongsi baharu yang mengikat, peranan baharu. Jurnal Kimia Biologi, 284, 16711–16715.

Richter, A., Schaff, C., Zhang, Z., Lipka, AE, Tian, ​​F., Köllner, TG et al. (2016) Pencirian laluan biosintetik untuk pengeluaran homoterpena meruap DMNT dan TMTT dalam Zea mays. Sel Tumbuhan, 28, 2651–2665.

Ruud, KA, Kuhlow, C., Goss, DJ & Browning, KS (1998) Pengenalpastian dan pencirian protein pengikat topi novel daripada Arabidopsis thaliana. Jurnal Kimia Biologi, 273, 10325–10330.