Penilaian In Vitro Terhadap Interaksi Dadah-Pengantaraan P‑gp‑Ubat Menggunakan Model Sel Renal Manusia RPTEC/TERT1
Mar 01, 2022
pengenalan Penilaian in vitro potensi perencatan P-glikoprotein (P-gp) merupakan isu penting semasa proses pembangunan ubat, kerana ia membolehkan ramalan interaksi ubat-ubatan (DDI) yang berkaitan secara klinikal [1-3]. P-gp tergolong dalam superfamili pengangkut kaset pengikat ATP (ABC) dan dikodkan oleh gen rintangan multidrug MDR1 (juga dikenali sebagai ABCB1). Pengangkut membran ini diketahui terlalu tertekan dalam sel tumor dan menyebabkan ketahanan terhadap banyak ubat antikanser [4]. Terletak dalam semua halangan fisiologi, termasuk usus, hati danbuah pinggang, P-gp melindungi daripada xenobiotik dengan mengehadkan penyerapan substrat ini daripada saluran penghadaman dan memudahkan pengeluarannya ke dalam hempedu dan air kencing. Oleh itu, P-gp memainkan peranan penting dalam farmakokinetik pelbagai kelas terapeutik [5-7]. Sebilangan besar ubat seperti agen antikanser, antikulat, dan ubat kardiovaskular diketahui sebagai substrat dan/atau perencat P-gp, dan kebanyakannya terlibat dalam interaksi yang berkaitan secara klinikal [8-10]. Oleh itu, Pentadbiran Makanan dan Dadah AS (FDA) memberi mandat bahawa potensi perencatan P-gp mesti dinilai semasa peringkat awal pembangunan dadah. Ujian in vitro yang dijalankan untuk tujuan ini lazimnya berdasarkan kajian pengangkutan dadah menggunakan garisan sel pengekspres P-gp. Lebih tepat lagi, garis panduan FDA mengesyorkan penentuan nilai kepekatan perencatan separuh maksimum (IC50) in vitro untuk menilai risiko DDI klinikal yang terhasil daripada perencatan P-gp. Untuk tujuan ini, banyak ujian eksperimen telah dijalankan, dan kebanyakannya telah memfokuskan pada interaksi ubat yang berkaitan dengan penyerapan usus menggunakan model Caco-2 atau MDCK-MDR1 [11–13]
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI PENYAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
Sejakbuah pinggangpenyingkiran juga merupakan laluan penyingkiran biasa untuk pelbagai kelas ubat, rembesan tiub aktif melalui pengangkut ABC juga boleh memainkan peranan penting dalam interaksi ini [14]. Walau bagaimanapun, data in vitro padabuah pinggangDDI yang dimediasi oleh P-gp adalah terhad. Ini sebahagiannya disebabkan oleh kekurangan pembangunan dan pencirian model in vitro untuk ramalanbuah pinggangpengangkutan dadah. Di antara pelbagai barisan sel manusia, model RPTEC/TERT1 nampaknya menunjukkan janji untuk penilaianbuah pingganginteraksi dadah. Talian sel ini diperoleh daripada penderma manusia yang sihat dan telah dihasilkan daripada sel tubul proksimal yang diabadikan. Selain itu, ekspresi dan kefungsian P-gp telah ditunjukkan menggunakan model ini, dengan itu mengesahkan keupayaannya untuk meramalkan.buah pinggangdadah keluar [15, 16]. Dalam konteks ini, kajian ini telah direka untuk menyiasat potensi perencatan P-gp menggunakan model RPTEC/TERT1. Pertama, ujian saringan pengumpulan rhodamine 123 (R123) dilakukan untuk mendapatkan profil perencatan bagi setiap ubat yang diuji. Berdasarkan saringan ini, empat ubat kemudiannya dipilih untuk penilaian kesan yang bergantung kepada kepekatannya pada pengumpulan intraselular dua ubat substrat P-gp: apixaban dan rivaroxaban
Kata kunci:sel buah pinggang, model buah pinggang, ubat buah pinggang, penyingkiran buah pinggang, buah pinggang.
Bahan dan Kaedah
ReagenApixaban, [2H71 3C ] - api xa ban , ri va r oxa ban ,[13C6]-rivaroxaban, nilotinib, crizotinib, erlotinib, axitinib, idelalisib, warfarin dan dabigatran etexilate telah dibeli daripada Alsachim (Illkirch, Perancis). Verapamil, ketoconazole, simvastatin, amiodarone, rhodamine 123, larutan garam seimbang Hank (HBSS) dan larutan HEPES dibeli daripada Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Perancis).
Kultur sel Sel-sel RPTEC/TERT1 diperolehi daripada Koleksi Budaya Jenis Amerika (ATCC, Molsheim, Perancis) dan dibiakkan dalam medium bebas serum yang dipertahankan secara hormon yang terdiri daripada Dulbecco's Modifed Eagle's Medium F12 (ATCC) ditambah dengan kit faktor pertumbuhan (ATCC) dan 1 peratus campuran antibiotik/antimikotik (penicillin–streptomycin, amphotericin B) pada 37 darjah dan 5 peratus CO 2. Untuk semua eksperimen, sel telah disemai dalam 96-plat perigi pada ketumpatan 50,000 sel setiap telaga dan digunakan untuk berkembang selepas 14 hari kultur. Medium diperbaharui setiap 2 hari dan sel digunakan dari laluan 27 hingga laluan 34. Sel Caco{14}} turut dibeli daripada ATCC. Sel-sel itu dikekalkan dalam medium kultur yang terdiri daripada Medium Minimal Essential Eagle (Sigma–Aldrich, Missouri, Amerika Syarikat) ditambah dengan 10 peratus FBS, 1 peratus asid amino tidak penting, dan 1 peratus campuran antibiotik/antimikotik (penicillin-streptomycin, amphotericin B ) pada 37 darjah dan 5 peratus CO2. Sel Caco-2 telah disemai dalam 96-plat perigi pada ketumpatan 5 × 10 3 sel setiap telaga dan digunakan untuk tumbuh selepas 14 hari kultur. Sel epitelium tiub proksimal manusia (HPTECs) diperoleh daripada BIOPREDIC (Rennes, Perancis) dan dibiakkan dalam DMEM/F12 ditambah dengan hidrokortison, EGF, insulin, transferrin, dan natrium selenit. Sel telah disemai dalam 96-plat kultur bersalut kolagen dengan ketumpatan 6600 sel setiap telaga dan digunakan untuk membesar selepas 11 hari kultur.
Ujian Saringan Pengumpulan Rhodamine 123 Potensi perencatan P-gp ditentukan dengan mengukur pengumpulan intraselular rhodamine 123 dalam sel RPTEC/TERT1 dengan kehadiran dan ketiadaan pelbagai kelas ubat. Antara 14 ubat yang diuji, siklosporin A (10 µM), ketokonazol (50 µM), verapamil (100 µM), dan amiodarone (50 µM) digunakan sebagai perencat P-gp. Apixaban, rivaroxaban dan dabigatran etexilate—tiga antikoagulan oral langsung (DOACs)—digunakan sebagai substrat P-gp (10 µM). Warfarin (50 µM) digunakan sebagai bukan perencat, dan lima ubat antikanser termasuk nilotinib, crizotinib, erlotinib, dan idelalisib telah digunakan tanpa mengetahui profil perencatannya pada kepekatan 10 µM. Beberapa keadaan telah dihasilkan semula dengan sel Caco{14}}, yang diluluskan oleh FDA untuk kajian pengangkutan dadah. Dengan cara ini, pengekalan intraselular rhodamine 123 ditentukan dalam sel Caco{16}} dengan kehadiran dan ketiadaan verapamil (100 µM), siklosporin A (10 µM), nilotinib (10 µM) dan DOAC (10 µM). ). Secara ringkas, selepas 14 hari kultur dalam 96-plat telaga, sel-sel tersebut telah dipra-inkubasi selama 10 minit pada 37 darjah dengan setiap ubat dilarutkan dalam HBSS dengan 10 mM HEPES (v/v). Kemudian sel diinkubasi dengan 10 µM rhodamine 123 selama 45 minit pada 37 darjah. Akhir sekali, selepas tiga kali cucian dalam larutan HBSS/HEPES sejuk, sel-sel telah dilisiskan pada suhu bilik selama 45 minit dalam larutan natrium dodesil sulfat (SDS) yang mengandungi 1 peratus natrium borat. Jumlah intraselularrhodamine 123 dikira menggunakan nanospektrofuorometer Infnite M (Sains Hayat, TECAN, Switzerland), menetapkan panjang gelombang kepada 485/535 nm. Data dinyatakan sebagai peratusan pengumpulan rhodamine 123 dalam sel kawalan yang tidak terdedah kepada sebarang perencat P-gp yang berpotensi dan ditetapkan secara sewenang-wenangnya pada pengumpulan 100 peratus.
Ujian Pengumpulan Intraselular DOAC dan Penentuan IC50 Daripada ujian saringan rhodamine 123 sebelumnya, empat ubat telah dipilih untuk menyiasat kesan yang bergantung kepada kepekatannya pada pengumpulan intraselular apixaban dan rivaroxaban (10 µM) dalam sel RPTEC/TERT1. Ketoconazole, crizotinib, dan nilotinib dipilih sebagai perencat P-gp, dan warfarin dipilih sebagai bukan perencat. Siklosporin A (10 µM) telah digunakan sebagai perencat spektrum luas pengangkut. Kajian tentang interaksi antara DOAC dan nilotinib untuk menentukan nilai IC50 telah dihasilkan semula dalam sel Caco-2 untuk membandingkan dua model selular. Semua sebatian telah dicairkan sama ada secara bersendirian atau dengan perencat yang berkaitan dalam penampan pengangkutan HBSS ditambah dengan 1 peratus HEPES (v/v) dan 1 peratus DMSO (v/v). Sebelum pengeraman, semua larutan telah dipanaskan terlebih dahulu kepada 37 darjah dan pH diselaraskan kepada 7.4. Untuk ubat antikanser crizotinib dan nilotinib, disebabkan keterlarutan yang lemah dan potensi sitotoksik, kepekatannya adalah antara 0.1 hingga 25 µM. Untuk ketokonazol dan warfarin, kepekatan antara 0.1 hingga 100 µM. Secara ringkas, selepas 14 hari kultur, semua ubat yang dibubarkan dalam HBSS dengan 1 peratus HEPES (v/v) telah dipra-inkubasi selama 10 minit pada 37 darjah . Kemudian, sel diinkubasi dengan 10 µM apixaban atau rivaroxaban selama 60 minit pada 37 darjah. Akhirnya, selepas tiga kali cucian dalam larutan HBSS/HEPES sejuk, sel-sel telah dilisiskan pada suhu bilik selama 45 minit dalam larutan 0.2 peratus Triton X-100. Jumlah DOAC intraselular kemudiannya dikira dengan spektrometri jisim kromatografi cecair (LC-MS). Data dinyatakan sebagai peratusan peningkatan dalam pengumpulan DOAC, dan pengumpulan lular intrasel DOAC ditetapkan secara sewenang-wenangnya pada 100 peratus dalam sel kawalan. Nilai IC50 untuk perencatan aktiviti P-gp, yang sepadan dengan nilai kepekatan berkesan separuh maksimum (EC50) untuk meningkatkan pengumpulan DOAC, ditentukan daripada pemodelan regresi kuasa dua terkecil tak linear tidak berwajaran bagi peningkatan pengumpulan dengan fungsi 'nls()' dalam R perisian, mengikut persamaan berikut (Pers. 1):
Kromatografi Cecair–Analisis Spektrometri JisimKuantifikasi apixaban (m/z 460.19793) dan rivaroxaban (m/z 436.07285) telah dilakukan menggunakan Ultimate U300{{18 }} sistem kromatografi cecair (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) ditambah dengan spektrometer jisim Q-Exactive Plus (ThermoFisher, Bremen, Jerman). Pemisahan LC dicapai menggunakan lajur analisis Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2.1 mm) (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, USA) dan kadar fow 0.6 mL/min . Fasa mudah alih A ialah air dengan 0.1 peratus asid formik (FA) dan fasa mudah alih B ialah asetonitril dengan 0.1 peratus FA. Untuk rivaroxaban, kecerunan ialah: 0–0.3 min, 10 peratus B; 0.3–1 min, linear daripada 10 peratus kepada 70 peratus B; 1–1.5 min, 70 peratus B; 1.51 min, kembali ke keadaan permulaan sehingga 3 min. Untuk apixaban, kecerunan ialah: 0–0.3 min, 10 peratus B; 0.3–0.7 min, linear dari 10 hingga 90 peratus B; 0.7–1.5, 90 peratus B; 1.51 min, kembali ke keadaan permulaan sehingga 3 min. Pengesanan dilakukan dalam mod pemantauan tindak balas selari positif semburan (PRM) pada resolusi 35,000 (pada m/z 200). Piawaian dalaman (IS) ialah [13C,2H7]-apixaban (m/z 468.2452) untuk apixaban dan [13C6]-rivaroxaban (m/z 442.09297) untuk rivaroxaban. Bagi setiap ubat dan IS masing-masing, ion sasaran (untuk kuantifikasi) dan ion pengesahan telah dipantau. Bagi rivaroxaban dan ISnya, ion sasaran ialah m/z 144.95125 dan ion pengesahan masing-masing adalah m/z 231.11280 dan m/z 237.13298. Untuk apixaban dan ISnya, ion sasaran ialah m/z 199.08656 dan ion yang disahkan masing-masing adalah m/z 282.12387 dan m/z 241.06062.
Keputusan
Ujian Saringan Pengumpulan Rhodamine 123Ujian saringan pengumpulan rhodamine 123 telah dilakukan dalam sel RPTEC/TERT1 dengan 14 ubat dengan profil perencatan yang berbeza (Rajah 1). Seperti yang dijangkakan, pengumpulan intraselular rhodamine 123 dengan kehadiran cyclosporin A, perencat spektrum luas, adalah antara yang tertinggi, dengan peningkatan pengumpulan sebanyak 75 peratus berbanding dengan sel kawalan. Kehadiran verapamil, perencat P-gp spesifik, membawa kepada peningkatan pengumpulan rhodamine 123 sebanyak 57 peratus, menunjukkan penglibatan P-gp. Dengan cara yang sama, ketokonazol, yang digambarkan sebagai perencat P-gp yang kuat, membawa kepada peningkatan yang lebih besar (66 peratus) dalam pengumpulan intraselular rhodamine 123 berbanding verapamil, membuktikan profil perencatannya. Sebaliknya, penambahan amiodarone, yang dicirikan sebagai perencat P-gp sederhana, menyebabkan peningkatan dalam pengumpulan sebanyak 59 peratus, yang serupa dengan yang disebabkan oleh verapamil. Profil perencatan yang berbeza telah diperhatikan untuk agen antikanser nilotinib, axitinib, crizotinib, erlotinib, dan idelalisib. Penambahan nilotinib menyebabkan peningkatan kuat dalam pengumpulan rhodamine 123 (71 peratus), mencadangkan potensi perencatan yang ketara, diikuti oleh axitinib, yang menyebabkan peningkatan pengekalan sebanyak 57 peratus. Sebaliknya, crizotinib dan erlotinib menunjukkan potensi perencatan sederhana hingga rendah, dengan peningkatan dalam pengumpulan rhodamine 123 masing-masing sebanyak 23 peratus dan 16 peratus. Idelalisib tidak menjejaskan pengumpulan rhodamine 123; begitu juga dengan warfarin, iaitu
dipilih sebagai bukan penghalang. Antara tiga DOAC, apixaban dan rivaroxaban menyebabkan sedikit peningkatan dalam pengekalan rhodamine 123: 33 peratus dan 12 peratus, masing-masing. Menariknya, dabigatran etexilate, prodrug dabigatran dan substrat P-gp yang diketahui, menyebabkan peningkatan pengekalan rhodamine 123 kira-kira 50 peratus , walaupun ia tidak digambarkan sebagai perencat P-gp yang berpotensi. Akhirnya, penambahan simvastatin hanya menyebabkan sedikit peningkatan dalam pengumpulan substrat fuoresen (32 peratus). Berdasarkan pemeriksaan ini, empat ubat telah dipilih untuk menilai kesan yang bergantung kepada kepekatan mereka pada pengumpulan intraselular apixaban dan rivaroxaban dalam model RPTEC/TERT1. Ketoconazole dipilih sebagai keadaan kawalan positif untuk perencatan P-gp, dan warfarin dipilih sebagai bukan perencatan P-gp untuk keadaan kawalan negatif. Nilotinib dan crizotinib dipilih sebagai perencat P-gp yang kuat dan sederhana, masing-masing. Beberapa keadaan telah dihasilkan semula dengan model rujukan, Caco-2. Pengumpulan intrasel R123 dalam sel ditentukan selepas gabungan (atau tidak) dengan apixaban dan rivaroxaban (10 μM), nilotinib (10 μM), dan dengan cyclosporin A (10 μM) dan verapamil (100 μM) untuk keadaan kawalan untuk perencatan. (Gamb. 2A). Seperti yang dijangkakan, verapamil dan siklosporin A menyebabkan peningkatan tinggi dalam pengekalan R123 masing-masing sebanyak 297 peratus dan 275 peratus. Dengan cara yang sama, nilotinib menyebabkan peningkatan yang tinggi dalam pengumpulan intraselular R123 (229 peratus), membuktikan potensi perencatannya. Menggabungkan R123 dengan DOAC menghasilkan peningkatan kecil dalam pengumpulan R123 (40–44 peratus ) berbanding dengan ubat lain. Selain itu, pengumpulan intraselular rhodamine 123 jika tiada dan kehadiran cyclosporin A dalambuah pinggangsel manusia primer juga disiasat dalam kajian ini untuk memeriksa kebolehpercayaan keputusan yang diperoleh dengan sel RPTEC/TERT1 (Rajah 2B). Analisis ini menunjukkan bahawa kehadiran siklosporin A meningkatkan pengekalan R123 sebanyak 71 peratus. Nilai ini hampir dengan yang diperoleh di bawah keadaan yang sama dengan sel RPTEC/TERT1 (peningkatan 75 peratus dengan siklosporin A). Oleh itu, aktiviti P-glikoprotein adalah serupa dalam model RPTEC/TERT1 dan sel manusia primer.
Ujian Pengumpulan Intraselular DOAC: Penentuan Nisbah IC50 dan I1/IC50 Kajian pengumpulan intraselular dilakukan untuk menilai pengangkutan apixaban dan rivaroxaban yang dimediasi P-gp pada kepekatan malar 10 µM dalam sel RPTEC/TERT1 secara in vitro dan dengan kehadiran peningkatan kepekatan nilotinib, crizotinib, ketoconazole , dan warfarin (Gamb. 2, 3). Pemodelan peningkatan pengekalan apixaban dan rivaroxaban dinilai untuk menentukan nilai IC50. Menggabungkan DOAC dengan nilotinib membawa kepada nilai IC50 terendah: 0.85 µM dan 1.37 µM untuk rivaroxaban dan apixaban, masing-masing (Gamb. 4, 5). Gabungan dengan crizotinib menghasilkan nilai IC50 masing-masing sebanyak 10.1 µM dan 12.2 µM untuk rivaroxaban dan apixaban. Yang menghairankan, menggabungkan DOAC dengan keto conazole tidak menghasilkan nilai IC50 yang paling rendah (masing-masing 16.5 µM dan 16.9 µM untuk rivaroxaban dan apixaban). Akhirnya, seperti yang dijangkakan, kombinasi dengan warfarin, iaitu
dipilih sebagai bukan penghalang, tidak menjejaskan pengekalan intraselular kedua-dua DOAC. Pengumpulan intraselular apixaban dan rivaroxaban dalam sel Caco-2 dengan kehadiran peningkatan kepekatan nilotinib telah disiasat untuk perbandingan dengan model selular. Menariknya, seperti yang diperhatikan dengan model RPTEC/TERT1, nilai IC50 untuk rivaroxaban (4.16 µM) adalah lebih rendah daripada yang diperoleh untuk apixaban (9.35 µM). Menarik juga untuk diperhatikan bahawa nilai IC50 yang diperhatikan dalam sel Caco-2 adalah lebih tinggi daripada nilai yang diperoleh dalam sel RPTEC/TERT1 untuk perencat yang sama. Kaitan klinikal DDI boleh diramalkan daripada data in vitro. Menurut garis panduan FDA, nisbah [I1]/IC50 dikira untuk setiap gabungan ubat. Nisbah ini membolehkan kepekatan in vivo dibandingkan dengan yang diketahui menghasilkan kesan yang relevan secara in vitro. Untuk apixaban dalam sel RPTEC / TERT1, nisbahnya adalah 3.1, 0.06, dan 17.4 dengan nilotinib, crizotinib, dan ketoconazole, masing-masing (Jadual 1). Dalam sel Caco-2, nisbah [I1]/IC50 ialah 0.46 untuk interaksi antara apixaban dan nilotinib (Jadual 1). Untuk rivaroxaban, nisbahnya lebih tinggi sedikit daripada yang diperoleh untuk apixaban dalam sel RPTEC/TERT1: 5.1, 0.08, dan 17.7, masing-masing, untuk nilotinib, crizotinib, dan ketoconazole (Jadual 2). Dengan cara yang sama, nisbah [I1]/IC50 yang diperhatikan untuk interaksi antara rivaroxaban dan nilotinib dalam sel Caco-2 ialah 1.03, iaitu lebih tinggi daripada yang diperoleh untuk apixaban (Jadual 2).
Perbincangan
Banyak kajian yang dijalankan dalam dekad kebelakangan ini telah melaporkan peranan penting P-gp dalam farmakokinetik dadah [17-19]. Memandangkan minat kawal selia yang semakin meningkat dalam interaksi ubat yang dimediasi oleh P-gp, ujian in vitro untuk menyiasat potensi perencatan ubat adalah aspek penting dalam pembangunan ubat dan amalan klinikal. Untuk tujuan ini, banyak ujian in vitro telah dijalankan, dan kebanyakan data yang berkaitan tentang penyerapan usus yang diramalkan telah dihasilkan daripada garisan sel Caco-2 dan MDCK-MDR1 [20–22]. Walau bagaimanapun, beberapa data tersedia mengenai rembesan tubular aktif ubat, yang juga memainkan peranan penting dalam pelupusan dadah dan bergantung kepada kehadiran pengangkut ABC. Pemerhatian ini jelas dikaitkan dengan kekurangan ciribuah pingganggarisan sel untuk meramal dadahbuah pinggangefux. Matlamat ini memerlukan in vitrobuah pinggangmodel yang hampir meniru halangan fisiologi. Barisan sel manusia RPTEC/ TERT1, yang menyatakan beberapa pengangkut ABC (terutamanya P-gp), nampaknya merupakan alternatif yang baik, seperti yang ditunjukkan dalam kajian terdahulu [16]. Dalam konteks ini, kerja ini menyiasat penggunaan model RPTEC/TERT1 untuk menilai potensi perencatan P-gp. Untuk pengetahuan terbaik kami, kerja ini adalah yang pertama untuk menyediakan data daripada kajian perencatan P-gp menggunakan manusiabuah pinggangsel.
Ujian in vitro untuk menentukan potensi perencatan P-gp biasanya berdasarkan penggunaan substrat P-gp rujukan khusus, seperti digoxin atau rhodamine 123 [23-25]. Disebabkan kemudahan penggunaannya, probe fuorescent berfaedah untuk ujian throughput tinggi. Selain itu, rhodamine 123 telah digunakan secara meluas untuk pengesanan aktiviti P-gp dalam pelbagai kajian [26-28]. Dengan cara ini, ujian pengumpulan rhodamine 123 dalam sel RPTEC/TERT1 dilakukan dalam kajian ini untuk mengenal pasti profil perencatan 14 ubat. Di antara ubat-ubatan ini, cyclosporin A, ketoconazole, dan verapamil dipilih sebagai perencat P-gp yang kuat. Inhibitor ini telah dicirikan secara meluas untuk potensi perencatan P-gp yang penting, yang membawa kepada modulasi pengangkutan digoxin dan rhodamine 123 [27, 29, 30]. Seperti yang dijangkakan, ubat-ubatan ini menyebabkan pengekalan rhodamine 123 tertinggi dalam sel RPTEC/TERT1. Sebaliknya, tiada peningkatan dalam pengekalan R123 diperhatikan dengan warfarin, yang digunakan sebagai kawalan negatif, mengesahkan kebolehpercayaan model RPTEC/TERT1. Menariknya, antara semua ubat yang diuji, DOAC-termasuk dabigatran etexilate, apixaban, dan rivaroxaban-menyebabkan peningkatan yang berbeza dalam pengekalan R123, walaupun sebelum ini mereka tidak dicirikan sebagai perencat, hanya substrat P-gp [31, 32]. Pemerhatian ini mungkin disebabkan oleh kewujudan apa yang dipanggil perencatan "kompetitif", di mana ubat-ubatan boleh berinteraksi dengan tapak pengikat yang sama pada P-gp. Tapak yang dicirikan dengan baik untuk P-gp ialah tapak H (untuk mengikat Hoechst 33342) dan tapak R (untuk mengikat rhodamine 123). Walau bagaimanapun, beberapa tapak pengikat dadah lain yang tidak diketahui boleh memainkan peranan dalam interaksi ini, yang boleh menjelaskan kesan berbeza DOAC pada pengumpulan R123 [33, 34]. Perencatan P-gp yang diperhatikan untuk ubat tertentu bergantung kepada substrat yang digunakan semasa kajian in vitro [28, 35]. Oleh itu, penggunaan substrat P-gp yang berbeza yang berinteraksi dengan tapak pengikat dadah yang berbeza harus dipertimbangkan untuk menerangkan dengan tepat potensi perencatan P-gp ubat. Menarik juga untuk diperhatikan bahawa beberapa syarat daripada saringan rhodamine 123 turut dilakukan dalam sel Caco{44}} untuk membandingkan sel RPTEC/ TERT1 dengan model rujukan dalam kajian pengangkutan dadah. Seperti yang dijangkakan, siklosporin A, verapamil, dan nilotinib menyebabkan peningkatan tertinggi dalam pengekalan rhodamine. Profil perencatan yang sama diperhatikan dengan kedua-dua sel Caco-2 dan RPTEC/TERT1. Walau bagaimanapun, peningkatan dalam pengekalan rhodamine 123 yang dijana oleh interaksi dalam model Caco-2 adalah lebih besar daripada yang diperhatikan dalam sel RPTEC/TERT1, menunjukkan potensi perbezaan dalam ekspresi P-glikoprotein antara model Oleh itu, pada masa kini kajian, kaedah kedua telah digunakan untuk menilai dan mengesahkan potensi perencatan P-gp oleh ubat.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI DIALISIS BUAH PINGGANG/PINGGUL
Berdasarkan ujian pengumpulan rhodamine 123, empat ubat telah dipilih untuk menentukan kesan bergantung kepekatannya pada pengumpulan intraselular apixaban dan rivaroxaban. P-gp telah ditunjukkan memainkan peranan utama dalam efux apixaban dan rivaroxaban [32, 36]. Oleh itu, nilai IC50 nilotinib, crizotinib dan ketoconazole telah dinilai, dengan DOAC dipilih sebagai ubat "mangsa". Untuk pengetahuan terbaik kami, kajian ini adalah yang pertama untuk melakukan kajian pengumpulan intraselular dengan DOAC dalam manusia.buah pinggangsel. Nilai IC50 yang diperolehi untuk nilotinib dan crizotinib adalah mengikut profil perencatan mereka yang diperoleh daripada ujian pengumpulan rhodamine 123. Nilotinib, yang menyebabkan peningkatan kukuh dalam pengekalan R123, membentangkan nilai IC50 terendah untuk kedua-dua DOAC, mengesahkan potensi perencatannya yang tinggi. Keputusan ini juga selaras dengan kajian terdahulu yang menunjukkan peningkatan bergantung kepekatan dalam pengumpulan intraselular [3 H]-paclitaxel dalam sel transfeksi MDR1-, menunjukkan bahawa ia mempunyai profil perencat [37]. Untuk crizotinib, ujian R123 menunjukkan potensi perencatan sederhana, dengan kurang peningkatan pengekalan R123 daripada yang disebabkan oleh nilotinib. Pemerhatian ini disokong oleh kajian terdahulu di mana crizotinib meningkatkan pengumpulan intraselular R123 dan doxorubicin dalam MDR1-sel transfected [38]. Keputusan ini juga selaras dengan nilai IC50 yang ditentukan dengan DOAC, yang lebih tinggi daripada nilai yang sepadan untuk nilotinib, mengesahkan profil perencatannya yang sederhana. Walau bagaimanapun, adalah menarik untuk diperhatikan bahawa kepekatan 10 µM sama ada nilotinib atau crizotinib tidak menyebabkan peningkatan yang sama dalam pengekalan rhodamine 123 dan DOACs. Dalam pemeriksaan rhodamine, nilotinib meningkatkan pengekalan substrat sebanyak kira-kira 71 peratus, manakala kira-kira 40 peratus untuk DOAC. Sebaliknya, crizotinib menyebabkan peningkatan kecil dalam pengekalan rhodamine (23 peratus ) tetapi peningkatan yang lebih besar dalam pengekalan DOAC (kira-kira 50 peratus ) pada kepekatan yang sama. Seperti yang dibincangkan sebelum ini, pemerhatian ini boleh dijelaskan oleh perbezaan dalam tapak pengikatan pada P-gp. Adalah diketahui bahawa banyak ubat berinteraksi dan bersaing dengan tapak pengikatan H dan bukannya tapak pengikatan R (di mana rhodamine 123 mengikat), dan sebaliknya [39]. Menariknya, ketokonazol, yang dikenali sebagai perencat P-gp yang kuat, menyebabkan peningkatan sedikit lebih kecil dalam pengekalan rhodamine 123 daripada nilotinib (masing-masing 66 peratus berbanding 71 peratus). Namun begitu, nilai yang sama diperhatikan dengan sel Caco-2, di mana kehadiran ketokonazol menyebabkan peningkatan sebanyak 60 peratus dalam pengumpulan R123 [40]. Pengumpulan intraselular DOAC untuk menentukan nilai IC50 juga menunjukkan nilai yang lebih tinggi berbanding dengan nilotinib dan crizotinib. Menariknya, kebanyakan nilai IC50 yang terdapat dalam model LLC-PK1 atau Caco-2 menggunakan digoxin sebagai substrat P-gp adalah antara 3 dan 4 µM untuk ketoconazole [41, 42]. Nilai ini agak berbeza daripada yang terdapat dalam kajian ini (masing-masing 16.5 µM dan 16.9 µM dengan apixaban dan rivaroxaban). Pemerhatian ini mengesahkan bahawa pilihan substrat dan model yang digunakan adalah pengaruh penting apabila menentukan potensi perencatan P-gp. Di samping itu, kajian baru-baru ini melaporkan bahawa tahap ekspresi pengangkut ABC dalam model selular in-vitro mempunyai kesan ke atas ujian pengangkutan dadah dan oleh itu pada penilaian DDI yang berkaitan dengan P-gp [43]. Sesungguhnya, penentuan nilai IC50 untuk verapamil menggunakan rivaroxaban sebagai substrat P-gp mendedahkan kepelbagaian antara model sel MDCKMDR1 dan Caco-2, dengan nilai IC50 masing-masing 6.94 µM dan 21.2 µM [43]. Tambahan pula, kesan bergantung kepekatan nilotinib pada pengumpulan intraselular apixaban dan rivaroxaban turut disiasat dalam sel Caco{61}} dalam kajian ini. Menariknya, nilai IC50 untuk nilotinib adalah lebih tinggi dalam sel Caco-2 berbanding sel RPTEC/TERT1. Pemerhatian ini boleh dijelaskan oleh perbezaan dalam ekspresi P-gp antara model ini. Di samping itu, diketahui bahawa taburan P-gp bergantung pada tisu yang dipertimbangkan. Fallon et al. menunjukkan bahawa tahap P-gp lebih tinggi dalambuah pinggangdaripada dalam tisu hati pada manusia [45]. Sebaliknya, tahap ekspresi P-gp nampaknya lebih tinggi dalam usus berbanding dalambuah pinggangtisu [46]. Penggunaan sel manusia seperti model RPTEC/TERT1, yang tidak terlalu mengekspresikan pengangkut, oleh itu boleh memberikan data tambahan. Data ini boleh digunakan dan dikira dalam pemodelan farmakokinetik berasaskan fisiologi (PBPK) dengan menyepadukan beberapa parameter, seperti kuantiti P-gp dalam tisu atau model in vitro atau nilai IC50.
Walaupun nilai IC50 yang ditemui untuk ketokonazol dalam model RPTEC/TERT1 adalah lebih tinggi daripada yang diperhatikan dalam kesusasteraan, nisbah [I1]/IC50—disahkan sebagai peramal kemungkinan DDI yang berkaitan secara klinikal untuk ubat yang diberikan secara oral—menunjukkan nilai tinggi yang melebihi ambang 0.1 yang dipertahankan oleh FDA. Keputusan ini adalah selaras dengan kajian klinikal yang menunjukkan peningkatan dua kali ganda dalam pendedahan apixaban dengan pentadbiran bersama ketoconazole [44]. Diambil bersama, semua keputusan ini menunjukkan bahawa model RPTEC/ TERT1 ialah alat yang menjanjikan untuk menilai potensi perencatan P-gp.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI SAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
Kesimpulan
Kajian kami menunjukkan bahawa penggunaan model RPTEC/TERT1 adalah mudah untuk menilai potensi perencatan P-gp pelbagai kelas ubat. Ujian pengumpulan Rhodamine 123 membenarkan pemeriksaan ubat awal dilakukan. Walau bagaimanapun, potensi perencatan P-gp ubat yang tidak berinteraksi dengan tapak R P-gp juga mesti disiasat menggunakan substrat tambahan untuk mengesahkan ramalan. Nilai IC50 yang ditentukan daripada pengumpulan intraselular apixaban dan rivaroxaban adalah mengikut profil perencatan yang diperhatikan dengan rhodamine 123. Selain itu, penggunaan ketokonazol dan warfarin sebagai perencat kuat dan bukan perencat P-gp, masing-masing, mengesahkan kebolehpercayaan model RPTEC/TER1 apabila ia digunakan untuk mendapatkan data in vitro tentang potensi perencatan ubat terhadap P-gp. Akhir sekali, perbandingan keputusan yang diperoleh menggunakan model RPTEC/TERT1 dengan yang diperoleh menggunakan sel Caco{12}} menyerlahkan kepentingan menjalankan kajian in vitro dalam model selular yang berbeza untuk mengesahkan profil perencatan bagi ubat tertentu.
