Dalam Reka Bentuk Siliko Vaksin Peptida Multi-subunit Polivalen Novel yang Memanfaatkan Kekebalan Bersilang Terhadap Leishmaniasis Viseral Dan Kulit Manusia: Pendekatan berasaskan Imunoinformatik

Abstrak

Konteks Leishmaniasis ialah sekumpulan penyakit berjangkit bawaan vektor yang disebabkan oleh lebih 20 spesies Leishmania patogenik yang endemik di banyak negara tropika dan subtropika. Kemunculan strain tahan dadah, kesan sampingan ubat anti-Leishmania yang buruk, dan ketiadaan strategi vaksinasi pencegahan mengancam populasi yang sensitif. Baru-baru ini, banyak kumpulan penyelidik telah mengeksploitasi bidang vaksinologi songsang untuk membangunkan vaksin, memberi tumpuan terutamanya pada mendorong imuniti terhadap leishmaniasis visceral atau kutaneus.

cistanche tubulosa—Anti-radang

KaedahKerja semasa ini melibatkan mendapatkan semula dua belas jujukan protein antigen leishmanial yang disahkan secara eksperimen daripada pangkalan data UniProt, diikuti dengan profil antigenisiti mereka menggunakan pelayan ANTIGENpro dan Vaxijen 2.0. Epitop pengikat MHC untuk perkara yang sama telah diramalkan menggunakan kedua-dua pelayan NetCTL 1.2 dan SYFPEITHI, manakala epitop untuk sel B dikira menggunakan pelayan ABCpred dan BepiPred 2.0. Epitop yang disaring dengan markah yang lebih tinggi telah digunakan untuk mereka bentuk binaan vaksin dengan penghubung yang sesuai dan bahan bantu semula jadi. Struktur sekunder dan tertier peptida sintetik ditentukan oleh medan rawak bersyarat, rangkaian saraf cetek, dan penjajaran benang profil profil dengan simulasi pemasangan struktur berulang. Model vaksin 3-D telah disahkan melalui penghalusan yang diuji CASP10-dan pelayan web MolProbity. Docking molekul dan simulasi analisis mod normal berbilang skala telah dilakukan untuk menganalisis kompleks vaksin-TLR terbaik. Akhirnya, penemuan simulasi imun pengiraan mendedahkan tindak balas imun selular dan humoral yang menjanjikan, menunjukkan bahawa peptida chimeric yang direka bentuk adalah vaksin spektrum luas yang berpotensi terhadap leishmaniasis visceral dan kutaneus.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Kata kunci Leishmaniasis · Vaksinologi songsang · TLR · Vaksin berbilang epitope · Simulasi dinamik molekul · Pemodelan homologi

pengenalan

Leishmaniasis adalah sekumpulan penyakit parasit yang disebabkan oleh pelbagai ahli genus Leishmania, protozoa parasit intrasel dimorfik [1]. Leishmaniasis menjejaskan kebanyakan populasi dari status sosio-ekonomi rendah negara tropika dan subtropika di seluruh dunia [2]. Ia adalah penyakit bawaan vektor, dan parasit disebarkan dengan menggigit lalat pasir phlebotomine betina yang dijangkiti (WHO, 2019). Menurut laporan terkini oleh Pertubuhan Kesihatan Sedunia, 700, 000 kepada 1 juta kes baharu dan kira-kira 26,000 hingga 65, 000 kematian berlaku setiap tahun (WHO, 2019). Di Afrika Timur, wabak leishmaniasis visceral kerap berlaku. Wilayah Mediterranean Timur menyumbang 70% daripada kes leishmaniasis kulit di seluruh dunia (WHO, 2019). Pada 2017, 20,792 daripada 22,145 (94%) kes baharu dilaporkan kepada WHO berlaku di tujuh negara: Brazil, Ethiopia, India, Kenya, Somalia, Sudan Selatan dan Sudan (WHO, 2017). Disebabkan senario yang membimbangkan itu, langkah-langkah untuk mengawal dan membasmi penyakit ini juga harus dititikberatkan di negara kita. Leishmaniasis mempunyai pelbagai manifestasi klinikal, dan terdapat tiga bentuk utama penyakit—visceral (juga dikenali sebagai kala-azar dan bentuk penyakit yang paling teruk), kutaneus (paling biasa), dan mukokutaneus (WHO, 2019) . Bukti penyembuhan sendiri dalam beberapa kes leishmaniasis kulit (CL) dan imuniti yang terhasil untuk jangkitan semula menyimpulkan kemungkinan skop vaksinasi sebagai kaedah yang boleh dilaksanakan untuk mengawal leishmaniasis sepanjang tempoh [3]. Walau bagaimanapun, sehingga kini, tiada vaksin berlesen tersedia terhadap leishmaniasis manusia. Walaupun beberapa vaksin calon berpotensi telah maju ke percubaan klinikal, kebanyakannya masih dalam fasa penyelidikan dan pembangunan awal [4]. Penjanaan vaksin peptida adalah bidang penyelidikan yang utama dan menjanjikan dalam bidang ini. Berbeza dengan parasit hidup atau dilemahkan keseluruhan atau vaksin berasaskan subunit mereka, peptida sintetik mempunyai beberapa kelebihan yang termasuk ketiadaan bahan yang berpotensi berbahaya, kerumitan antigen yang lebih rendah, kestabilan yang baik, dan kos yang rendah untuk ditingkatkan [1, 5]. Membangunkan vaksin baharu memerlukan pandangan yang lebih mendalam tentang imunologi, biologi molekul dan kejuruteraan kimia. Oleh itu, saintis di semua arena ini bekerjasama untuk mereka bentuk dan menghasilkan vaksin yang selamat dan berkesan [6]. Vaksin yang ideal terhadap leishmaniasis harus menimbulkan imuniti yang berpanjangan dan tindak balas imun pengantara TH-1 dan TH-2-yang seimbang [4, 7]. Pendekatan berasaskan imunoinformatik untuk mereka bentuk vaksin calon baharu adalah strategi yang lebih baharu yang menggunakan alat pengiraan untuk meramalkan vaksin peptida berbilang subunit yang stabil secara struktur dan imunogenik dalam masa yang singkat. Protein yang didapati terutamanya mempunyai ciri imunogenik yang diperlukan untuk memberikan imuniti terhadap penyakit dalam kajian imunologi terdahulu yang melibatkan model haiwan eksperimen atau analisis silico lain adalah calon epitope terbaik [1, 8-10]. Antara protein yang disiasat, protein LACK (antigen C-kinase yang diaktifkan Leishmania) adalah protein yang sangat terpelihara di seluruh spesies Leishmania, dan ia dianggap sebagai calon vaksin yang berdaya maju terhadap leishmaniasis manusia [11]. Ia telah terbukti menjadi sasaran utama tindak balas imun dalam tikus BAL b/c yang sensitif [12]. KMP-11 (protein membran kinetoplastid-11) terdapat dalam semua protozoa kinetoplastid dan juga dianggap sebagai calon vaksin berpotensi yang ditunjukkan dapat meningkatkan tahap IL-10 dalam model murine, menunjukkan potensi imunogeniknya [13]. Leishmanolysin, atau GP63, adalah proteinase permukaan yang telah dipostulatkan sebagai faktor virulensi yang terlibat dalam interaksi langsung parasit dengan reseptor makrofaj tuan rumah [14]. Protein membran LCR1 dan GP46 juga didapati meningkatkan pengeluaran IFN-gamma, dan oleh itu, dianggap sebagai membantu dalam membangunkan vaksin am terhadap jangkitan Leishmania [5, 15]. Protein kejutan haba (HSP) adalah molekul yang sangat terpelihara yang sangat imunogenik untuk mendorong kedua-dua laluan MHC-I dan MHCII imuniti adaptif dan dianggap mempunyai peranan penting dalam pembangunan vaksin terhadap leishmaniasis berjangkit [16]. Leishmania hydrophilic acylated surface protein-B (HASP-B) hanya dinyatakan dalam parasit infektif yang menunjukkan peranan dalam virulensi parasit dan, oleh itu, calon vaksin yang berpotensi [17]. Protein kinetoplastid parafagellar rod (PFR) juga mempunyai kepentingan terapeutik dan profilaksis kerana pengedaran evolusioner yang terhad, organisasi peringkat tinggi, dan imunogenisitas tinggi [18]. Begitu juga, protease sistein dan proteophosphoglycans juga bertindak sebagai faktor virulensi penting untuk parasit dalam perumah mamalia dan merupakan sasaran dadah yang menarik untuk leishmaniasis [19-21]. Selain itu, protein beta-tubulin juga sebelum ini telah dicirikan sebagai antigen perangsang sel T dari Leishmania, walaupun keberkesanannya sebagai calon vaksin belum dicuba lagi [22]. Beta-tubulin L. donovani juga dianggap sebagai sasaran ubat yang berpotensi terhadap leishmaniasis visceral [23]. Akhir sekali, protein faktor terjemahan eIF5A daripada L. braziliensis telah ditunjukkan untuk mendorong perlindungan heterolog terhadap leishmaniasis pada haiwan apabila diberikan sebagai vaksin dalam kombinasi dengan protein rekombinan yang lain. Ia meningkatkan rembesan sitokin khusus parasit dalam haiwan yang divaksin. Protein eIF5A juga dipelihara dalam semua eukariota [24]. Terdahulu, Khatoon et al. menerangkan pendekatan berasaskan imunoinformatik untuk mereka bentuk vaksin peptida berbilang subunit terhadap leishmaniasis (VL) viseral dengan menerokai protein rembesan L. donovani [6]. Di sini, kami memilih pelbagai antigen leishmanial merentasi pelbagai spesies berjangkit parasit. Pada masa yang sama, semua protein ini telah dikenal pasti (sama ada melalui kajian haiwan in vitro atau dengan menggunakan alat pengiraan) untuk mencetuskan tindak balas imun, mencetuskan imuniti perlindungan. Urutan protein yang dipilih adalah milik mana-mana daripada lima spesies patogenik Leishmania, iaitu, Leishmania major, Leishmania Mexicana, Leishmania donovani, Leishmania chagasi, dan Leishmania amazon, antaranya L. donovani ialah parasit utama yang menyebabkan leishmaniasis visceral (VL), manakala yang lain bertanggungjawab terutamanya untuk menyebabkan kulit (CL) atau leishmaniasis mucocutaneous (MCL). Rasional di sebalik pilihan pelbagai jenis protein terpelihara dan imunogenik sedemikian merentas spesies Leishmania yang berbeza adalah untuk mereka bentuk vaksin peptida am yang akan memberikan imuniti silang spektrum luas terhadap kedua-dua bentuk leishmaniasis (VL dan CL) yang biasa menjejaskan manusia .

Apa yang dilakukan oleh herba cistanche—Anti-radang

Bahan dan kaedah

Pemilihan dan pengambilan urutan protein antigen Leishmania

Jujukan asid amino lengkap dua belas protein antigenik khusus Leishmania telah diambil daripada pangkalan data Uniprot (Universal Protein Resource) (https://www.unipr ot.org/uniprot/) dalam format FASTA (diakses pada 21.{{16} }3.2022). Seperti yang dinyatakan sebelum ini, semua protein ini dilaporkan sebagai calon vaksin imunogenik, sangat konservatif, dan berpotensi, seperti yang terdapat dalam kajian imunologi terdahulu yang melibatkan model haiwan atau kaedah ramalan dalam silico pengiraan. Antigenicity protein yang dipilih telah dikira dengan menggunakan pelayan ANTIGENpro (// scratch.proteomics.ics.uci.edu/) yang mengira antigenicity urutan protein input dengan mengeksploitasi pengelas dua peringkat berasaskan SVM yang disahkan oleh sepuluh kali ganda pendekatan pengesahan silang [25]. Protein tersebut kemudiannya tertakluk kepada analisis peptida isyarat menggunakan pelayan SignalP 4.1 (SignalP—4.1— Services—DTU Health Tech) untuk mendiskriminasi antara protein rembesan klasik dan bukan rembesan (transmembrane). Kaedah ini menggabungkan ramalan tapak belahan dan ramalan peptida isyarat/bukan isyarat peptida berdasarkan gabungan beberapa rangkaian saraf tiruan [26]. Ramalan penyetempatan untuk semua protein dilakukan seterusnya menggunakan DeepLoc (DeepLoc—1.0—Services—DTU Health Tech), algoritma bebas templat yang menggunakan rangkaian saraf dalam untuk meramalkan penyetempatan subselular protein yang mengeksploitasi hanya maklumat urutan, mencapai ketepatan yang baik [27]. Semua jujukan protein berfungsi, seperti yang diperoleh daripada pelayan SignalP 4.1, seterusnya tertakluk kepada meramalkan kehadiran penentu antigenik (epitop) yang akan diiktiraf oleh reseptor sel B dan T. Ini dilakukan untuk memastikan bahawa binaan vaksin yang direka hanya mengandungi sel T dan epitop sel B yang dominan imun dan, oleh itu, akan dapat memacu tindak balas imun yang cekap melibatkan kedua-dua laluan humoral dan sel-pengantara mekanisme imun.

Ramalan epitop limfosit T sitotoksik (CTL).

Ramalan epitope limfosit T sitotoksik (CTL) adalah aspek penting dalam mereka bentuk peptida yang ideal [28]. Pelayan web yang boleh diakses secara bebas, iaitu, NetCTL1.2 (https://www. cbs.dtu.dk/services/NetCTL), telah digunakan untuk meramalkan epitop CTL untuk semua protein yang dipilih. Kaedah ini menyepadukan ramalan pengikatan peptida MHC kelas I, belahan terminal proteasomal C, dan kecekapan pengangkutan TAP [29], yang kesemuanya merupakan ciri penting yang perlu dimiliki oleh urutan epitope pengikat CTL. Pelayan membenarkan ramalan epitop CTL terhad kepada 12 supertip kelas MHC I, antaranya hanya superjenis A1 digunakan untuk kajian ini. Pengikatan MHC kelas I dan pembelahan proteasomal dilakukan menggunakan rangkaian saraf tiruan. Kecekapan pengangkutan TAP diramalkan menggunakan matriks berat [29]. Urutan dengan skor pengikatan yang lebih tinggi dianggap epitop CTL yang kuat. Sebagai tambahan kepada NetCTL 1.2, satu lagi pendekatan berasaskan pelayan web yang tersedia secara terbuka, iaitu, SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm), juga digunakan untuk ramalan epitop CTL daripada semua protein Leishmania yang dipilih. Ramalan adalah berdasarkan motif yang diterbitkan dan mempertimbangkan asid amino dalam sauh dan kedudukan sauh tambahan dan asid amino kerap yang lain [30]. Daripada senarai jenis MHC yang disediakan dalam pelayan ini, HLA-A*01, HLA-A*02:01 dan HLA-A*03 telah dipilih untuk ramalan. Carian epitope telah ditentukan untuk jujukan nonamer untuk perbandingan seragam dengan keputusan yang diberikan oleh pelayan NetCTL 1.2. Hanya epitop biasa daripada setiap protein (jika ada), yang telah diramalkan oleh kedua-dua pelayan NetCTL 1.2 dan SYFPEITHI dengan skor lebih tinggi yang serasi, telah dipilih untuk pembinaan vaksin akhir.

Ramalan epitop limfosit T Helper (HTL).

Limfosit T Helper ialah sel imun yang paling penting kerana ia diperlukan dalam semua jenis tindak balas imun adaptif. Ramalan epitop HTL (terutamanya jenis Th-1), oleh itu, menjadi elemen penting untuk mereka bentuk vaksin peptida yang berkesan. Dalam kajian semasa, alat analisis MHC-IIbinding dalam pelayan IEDB (Immuno Epitope Datan base and Analysis) (http://tools.iedb.org/mhcii/) telah digunakan untuk ramalan 15-mer HTL epitop untuk satu set tiga alel manusia, iaitu, HLA-DRB1*01:01, HLADRB1*01:02 dan HLA-DRB1*01:03. Alel HLA manusia dipilih untuk anggaran yang lebih realistik tentang pertalian MHC-IIbinding epitop kerana vaksin itu direka bentuk terhadap leishmaniasis manusia. Output yang diramalkan diberikan dalam unit IC50nM untuk perpustakaan gabungan dan penjajaran SMM. Oleh itu, nombor yang lebih rendah menunjukkan pertalian yang lebih tinggi. Kaedah ramalan yang disyorkan IEDB telah digunakan dalam pendekatan ini di mana kedudukan terlaras rendah menunjukkan pengikat MHC-II yang sesuai dan, oleh itu, boleh ditakrifkan sebagai epitop HTL yang kuat.

Pengenalpastian dan pemilihan epitop HT yang mendorong sitokin

Sitokin adalah sangat penting untuk berfungsi dengan baik sistem imun. Bateri sitokin seperti IL-2, IL-4, IL-6 dan interferon- boleh mendorong kedua-dua tindak balas imun pengantara CTL dan humoral [31]. Oleh itu, epitop HTL yang boleh mencetuskan pengeluaran sitokin adalah lebih baik untuk mereka bentuk vaksin profilaksis imun. Dengan pandangan ini, pelayan IFNepitope (http://crdd.osdd.net/raghava/ ifnepitope/) telah digunakan untuk mengenal pasti epitop HTL yang mempunyai kebolehan mendorong sitokin. IFNepitope ialah pelayan ramalan dalam talian yang bertujuan untuk meramalkan peptida daripada jujukan protein yang boleh mendorong IFN-gamma dikeluarkan daripada CD4+ sel T. Pelayan web telah dibangunkan berdasarkan set data yang terdiri daripada pengikat kelas II MHC-gamma-inducing dan non-inducing MHC [32]. Epitop HTL yang diramalkan oleh pelayan IEDB dengan pertalian mengikat MHC-II yang lebih tinggi (kedudukan terlaras yang lebih rendah) telah disediakan sebagai input untuk menyemak keupayaan menghasilkan sitokin mereka oleh pelayan IFNepitope. Epitop yang dikenal pasti kemudiannya tertakluk kepada tahap analisis seterusnya oleh pelayan IL4pred (IFNepitope(iiitd.edu.in) dan juga oleh pelayan IL10Pred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il10pred/predict3 .php) untuk memastikan bahawa epitop HTL terpilih juga akan membangkitkan rembesan IL-4 dan IL-10, masing-masing. Mereka juga mempertimbangkan pemuliharaan kedudukan sisa asid amino dan komposisi asid amino bagi peptida untuk ramalan yang lebih tepat [33, 34]. Epitop HTL pengikat MHC-II yang diramalkan positif oleh ketiga-tiga pelayan telah dipilih untuk digabungkan dalam binaan akhir vaksin. Strategi ini telah diterima pakai untuk meningkatkan keberkesanan vaksin kerana ia boleh mencetuskan tindak balas sengit yang melibatkan pelbagai jenis sitokin (IFN-gamma, IL-4 dan IL-10), yang membawa kepada imuniti yang dipercepatkan dan tahan lama.

Analisis pemuliharaan epitope

Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>100% (lalai).

Mereka bentuk jujukan vaksin berbilang epitope

Berdasarkan analisis imunoinformatik, urutan utama vaksin subunit telah dibina dengan menggabungkan urutan epitop CTL dan HTL terpilih. Epitope ini dikaitkan bersama oleh penyambung AAY dan GPGPG, masing-masing [28, 31]. Penyambung dimasukkan untuk pemisahan yang betul bagi epitope individu yang diperlukan untuk berfungsi dengan cekap binaan vaksin [28, 36]. Kedua, penambahan adjuvant yang sesuai adalah penting dalam vaksin subunit untuk meningkatkan tindak balas imun [31]. Pilihan adjuvant yang sesuai adalah penting dalam mereka bentuk vaksin untuk ujian manusia. IL-12 yang dihasilkan oleh pelbagai sel imun adalah penting dalam membangunkan imuniti pengantaraan sel terhadap leishmaniasis, dan potensi IL-12 sebagai adjuvant dalam vaksin terhadap leishmaniasis telah dilaporkan dalam model murine [3, 37, 38]. IL-12 ini telah dipilih sebagai adjuvant untuk mereka bentuk vaksin dan jujukan yang sama telah dimasukkan dalam terminal N bagi binaan vaksin menggunakan penyambung EAAK [28, 31]. Jujukan rantai alfa IL{14}} manusia telah diambil daripada pangkalan data Uniprot (www.uniprot.org; No. Aksesion P29459). Akhirnya, binaan vaksin peptida diperolehi mempunyai adjuvant, penghubung, epitop CTL, dan epitop HTL (dengan penghubung AAY dan GPGPG intra-epitopik) dalam urutan yang bergerak dari terminal N ke terminal C.

Ramalan epitope sel B konformasi dan linear

Imuniti humoral melibatkan sintesis dan rembesan antibodi khusus oleh sel B yang diaktifkan, yang memerlukan kehadiran penentu antigen yang diiktiraf oleh reseptor sel B yang terdapat pada permukaan limfosit B. Vaksin peptida pelindung imun yang ideal harus mempunyai komponen sedemikian untuk berinteraksi dengan dan, dengan itu, merangsang sel B. Oleh itu, dua pelayan, iaitu ABCpred dan BepiPred 2.0, digunakan untuk ramalan tepat epitop sel B dalam jujukan utama vaksin yang direka bentuk. Pelayan ABCpred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/ abcpred/ABC_submission.html) ialah pendekatan berasaskan rangkaian saraf tiruan (ANN) yang meramalkan epitop sel B dalam jujukan antigen tertentu menggunakan parameter panjang tetap. Set data latihan yang digunakan dalam kaedah ini mengandungi epitop sel B daripada pangkalan data epitop sel B (BCIPEP). Pelayan dapat meramalkan epitope dengan ketepatan 65.93% menggunakan rangkaian saraf berulang [39]. Urutan utama binaan vaksin akhir telah disediakan sebagai input dalam format biasa dan parameter lalai pelayan ABCpred, termasuk nilai ambang 0.51 dengan panjang tetingkap 16 sisa asid amino, telah digunakan untuk ramalan itu. Pelayan BepiPred 2.0 (BepiPred—2.0—Services—DTU Health Tech), sebaliknya, meramalkan epitop sel B berjujukan daripada jujukan input oleh algoritma hutan rawak yang dilatih pada epitop dan asid amino bukan epitope ditentukan daripada struktur kristal diikuti dengan pelicinan ramalan berurutan [40]. Urutan utama vaksin disediakan dalam format FASTA sebagai input. Aplikasi dua pelayan berbeza yang meramalkan epitop sel B berdasarkan dua algoritma berbeza menjadikan ramalan lebih realistik. Kebanyakan penentu antigen yang diiktiraf oleh reseptor sel B dan antibodi adalah tidak berterusan, bermakna ia mengandungi residu asid amino yang terletak jauh dalam struktur utama imunogen tetapi dibawa bersebelahan antara satu sama lain semasa lipatan protein [41]. Ramalan epitop sel B yang tidak berterusan dalam struktur tertiari vaksin yang disahkan telah dilakukan dengan menggunakan pelayan ElliPro (http://tools.iedb.org/ellip ro/) yang digabungkan dalam portal IEDB. ElliPro ialah alat web yang boleh diakses secara bebas yang melaksanakan kaedah Thronton yang diubah suai dan mengambil kira setiap pusat jisim sisa dan bukannya atom C. Melakukannya mengaitkan setiap epitop dengan skor yang ditetapkan sebagai PI (indeks protrusion) yang dipuratakan ke atas sisa epitop. Epitop tak selanjar ditentukan berdasarkan nilai PI masing-masing dan dikelompokkan berdasarkan jarak antara pusat jisim sisa (R). Nilai R yang lebih besar berkorelasi dengan epitop terputus yang lebih ketara yang diramalkan [42]. Pada masa yang sama, epitop sel B linear dalam model protein input juga boleh diramal dan divisualisasikan dengan menggunakan ElliPro. Pengesanan kedua-dua epitop sel B linear dan tak selanjar dalam model 3D yang diperhalusi bagi vaksin memastikan strategi mereka bentuk vaksin yang berjaya.

Pemprofilan antigenik, alergenik dan ketoksikan binaan vaksin

Antigenicity adalah kriteria penting untuk vaksin imun-prophylactic. Untuk memastikan bahawa binaan vaksin yang direka bentuk akan menimbulkan tindak balas imun yang berpanjangan dengan berinteraksi dengan reseptor sel B dan T, antigenisiti yang sama telah dinilai dengan menggunakan pelayan ANTIGENpro dan VaxiJen 2.0. Pelayan ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci. edu/) dengan betul mengklasifikasikan 82% daripada antigen pelindung yang diketahui apabila dilatih menggunakan hanya set data mikroarray protein. Ketepatan set data gabungan dianggarkan pada 76% dengan sepuluh kali ganda eksperimen pengesahan silang yang membolehkan pengiktirafan peptida antigenik dengan ketara lebih baik. Ia berjalan pada seni bina dua peringkat, termasuk pengelas peringkat kedua berasaskan SVM. Untuk jujukan protein input baharu, kebarangkalian yang dikira oleh peramal SVM peringkat kedua ialah skor ramalan ANTIGENpro akhir [25]. VaxiJen2.0 (http://www. dog-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) ialah satu lagi pelayan web yang boleh diakses secara umum yang menilai antigenisiti jujukan protein melalui pendekatan bebas penjajaran yang berasaskan pada transformasi auto rentas kovarian (ACC) jujukan protein kepada vektor seragam sifat asid amino utama dan membenarkan pengelasan antigen semata-mata berdasarkan pelbagai sifat fizikokimia protein tanpa merujuk kepada penjajaran jujukan [43]. Kedua, untuk menolak sebarang kemungkinan bahawa binaan vaksin boleh mencetuskan tindak balas alahan pada individu, pelayan AlgPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpr ed/submission.html) telah digunakan untuk tentukan alergeniknya. Alat pelayan menyediakan pelbagai pendekatan, termasuk pemetaan epitop IgE, motif MEME/MAST, kaedah SVM berdasarkan komposisi dipeptida dan ARP BLAST, yang kesemuanya dieksploitasi untuk ramalan yang tepat. Ambang ditetapkan pada 0.4 (lalai) untuk ketepatan ramalan yang lebih tinggi. Selain itu, AllerTop v.2.{{20}} (https://www. dog-pharmfac.net/AllerTOP/index.html), alat berasaskan pelayan web yang boleh diakses secara bebas, turut digunakan untuk mengesahkan sifat bukan alahan bagi binaan vaksin. Kaedah ini adalah berdasarkan kepada transformasi auto-kovarian (ACC) bagi jujukan protein kepada vektor sama panjang yang seragam. Ia telah digunakan untuk kajian hubungan struktur-aktiviti kuantitatif (QSAR) peptida dengan panjang yang berbeza, dan protein dikelaskan oleh algoritma jiran k-terdekat [44]. Ketoksikan, jika ada, telah diramalkan dengan menggunakan pelayan ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/prote in.php). Alat ramalan ini berfungsi berdasarkan kedua-dua teknik pembelajaran mesin dan kaedah kuantitatif yang dilatih pada set data pelbagai peptida toksik dan bukan toksik yang diperoleh daripada SwissProt dan TrEMBL [45]. Pemprofilan ketoksikan adalah penting untuk menilai keselamatan vaksin dan peptida imunoterapeutik lain yang dimaksudkan untuk percubaan manusia. Analisis dilakukan dengan memilih pendekatan berasaskan motif SVM (TrEMBL)+pada ambang nilai E 10.0 untuk kaedah berasaskan motif dan ambang SVM 0.1.

Penilaian sifat fizikokimia

Menggambarkan ciri fizikal dan kimia peptida chimeric menjadi penting kerana, apabila ditadbir sebagai vaksin, ia sepatutnya dapat mendorong tindak balas imun yang betul. Pelayan ProtParam yang tersedia dengan portal ExPASY (Sistem Analisis Protein Pakar) (https://web.expasy.org/ program/) telah digunakan untuk mengira pelbagai parameter fizikokimia binaan vaksin utama yang termasuk ciri seperti berat molekul, pI teori, indeks ketidakstabilan, indeks alifatik, separuh hayat in vivo dan in vitro, purata besar hidrofobisiti (GRAVY), dan lain-lain.

Ramalan struktur sekunder peptida vaksin

Elemen struktur sekunder binaan vaksin yang direka bentuk telah diramalkan dengan menggunakan pelayan PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) dan pelayan harta RaptorX (http://raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/ predict/) kedua-duanya adalah pelayan analisis struktur protein dalam talian yang boleh diakses secara bebas. Urutan utama peptida vaksin telah disediakan sebagai input. PSIPRED meramalkan struktur sekunder jujukan protein input dengan mengeksploitasi dua rangkaian neural suapan ke hadapan yang berfungsi berdasarkan matriks pemarkahan khusus kedudukan (PSSM) yang dihasilkan oleh PSI-BLAST [46]. Ia menggabungkan pengenalpastian jujukan yang homolog dengan binaan vaksin kami oleh PSI-BLAST, diikuti dengan penjanaan PSSM. PSIPRED 3.2 dan versi yang lebih tinggi didapati mencapai purata skor Q3 sebanyak 81.6% seperti yang dinilai oleh kaedah pengesahan silang tiga kali ganda yang ketat yang menjadikan pendekatan ini sangat tepat dan tepat. Pelayan web hartanah RaptorX menggunakan teknik pembelajaran mesin yang sangat terkini yang dipanggil DeepCNF (medan neural convolutional dalam) untuk meramalkan pelbagai ciri seperti struktur sekunder, kebolehcapaian pelarut dan kawasan yang tidak teratur secara serentak. DeepCNF ialah pendekatan bersepadu yang menggabungkan kedua-dua medan rawak bersyarat (CRF) dan rangkaian saraf cetek yang memodelkan hubungan struktur jujukan yang kompleks dengan seni bina hierarki yang mendalam dan boleh memperoleh kira-kira 84% ketepatan Q3 untuk 3-struktur sekunder kelas [47] .

Ramalan struktur tertier

Struktur tertier peptida vaksin akhir telah diramalkan dengan menggunakan pelayan web dalam talian I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/). I-TASSER ialah pendekatan pemodelan struktur protein hierarki berdasarkan penjajaran benang profil profil (PPA) dan simulasi pemasangan struktur lelaran diikuti dengan penghalusan struktur peringkat atom. Ia berfungsi dalam tiga peringkat: pengenalan templat struktur, pemasangan struktur berulang, dan anotasi fungsi berasaskan struktur. Model struktur kedudukan teratas dengan anggaran ketepatan global dan tempatan dikembalikan dengan skor C dan skor TM wakilnya, yang dikaitkan dengan kualiti model yang diramalkan. Program I-TASSER mewakili salah satu kaedah paling berjaya yang ditunjukkan dalam CASP untuk ramalan automatik struktur dan fungsi protein [48, 49].

Penapisan struktur tertiari vaksin

Pemodelan pengiraan konvensional bagi struktur protein sahaja tidak menjamin ketulenan dan ketepatan model yang diramalkan kerana strategi pemodelan sedemikian sebahagian besarnya bergantung pada tahap kemungkinan input (sasaran) dengan struktur templat yang tersedia. Oleh itu, peningkatan kualiti model berasaskan templat di luar ketepatan dianggap perlu, dan ini boleh dicapai dengan menapis keseluruhan struktur protein. Dengan perspektif ini, output model tridimensi daripada pelayan I-TASSER dengan skor C yang terbaik tertakluk kepada penghalusan lanjut oleh pelayan GalaxyRefne (http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type{ {4}} TAPIS). Ia ialah pendekatan penghalusan CASP10-yang diuji di mana rantai sisi protein dibina semula dahulu, dan kemudian pembungkusan semula rantai sisi dan kelonggaran struktur keseluruhan dilakukan oleh simulasi dinamik molekul. Ini membawa kepada peningkatan tepat kedua-dua struktur tertiari tempatan dan global protein sasaran [50].

faedah tambahan cistanche—Anti-radang

Pengesahan struktur tertiari vaksin

Struktur tertiari yang diperhalusi bagi vaksin perlu disahkan untuk mengesan kemungkinan ralat yang mungkin berlaku dalam model 3D yang diramalkan. Model yang diperhalusi yang diperoleh daripada pelayan GalaxyRefne telah disediakan sebagai struktur input dalam format a.pdb. Selain itu, plot Ramachandran ialah satu lagi pendekatan yang sangat berguna untuk menggambarkan kawasan sudut dihedral phi (ϕ) dan psi (ψ) yang dibenarkan secara bertenaga dan tidak dibenarkan bagi rantai sisi asid amino yang dianggap sebagai komponen penting untuk pengesahan struktur protein. Oleh itu, pelayan MolProbity [Halaman utama—MolProbity (duke.edu)] telah digunakan yang menjana plot Ramachandran untuk model vaksin yang diberikan berdasarkan pengesahan Phenix gaya MolProbity berasaskan Python [51]. Kami selanjutnya menggunakan pelayan ERRAT [SAVESv6.0—Structure Validation Server (UCLA. edu)] yang menganalisis statistik interaksi tidak terikat antara atom berbeza dalam model dan memplot nilai fungsi ralat berbanding {{ 6}}sisa gelongsor [52]. Pelayan web ProSA (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php), platform berasaskan web interaktif berdasarkan program ProSA standard, telah digunakan untuk tujuan ini [53]. Langkah ini dilakukan untuk mendapatkan pengesahan yang lebih canggih dan tepat bagi struktur yang dimodelkan.

Kejuruteraan disulfida peptida vaksin

Ikatan disulfida menyumbang kepada kestabilan protein dengan menurunkan entropi konformasi dan juga dengan meningkatkan tenaga bebas keadaan denaturasi. Pengenalan ikatan disulfida novel telah dianggap sebagai alat bioteknologi kritikal untuk meningkatkan kestabilan termos protein asli yang dilipat. Pelayan Disulfide by Design 2 (DbD 2) v 2.12 telah digunakan untuk meningkatkan kestabilan struktur keseluruhan vaksin yang direka dengan memperkenalkan kaitan disulfida. Kaedah ini menggunakan geometri asli dan mengira nilai tenaga untuk setiap potensi disulfida, dengan itu menyediakan cara untuk menentukan kedudukan bon disulfida calon. Ikatan disulfida yang memberikan kestabilan maksimum adalah calon yang mempunyai nilai chi3 yang tinggi, tenaga ikatan, dan faktor B [54]. Kawasan fleksibel peptida telah dipilih berdasarkan parameter yang dinyatakan sebelum ini, dan mutasi penstabilan yang sepadan dicipta dengan membentuk hubungan disulfida antara sisa pasangan yang dipilih.

Docking molekul binaan vaksin dengan reseptor imun (TLR Manusia‑2, 4, 5, 8, dan TLR tetikus‑9)

Reseptor seperti tol (TLR) ialah sifat utama tindak balas imun selular yang mengiktiraf corak molekul berkaitan patogen (PAMP) dan membangkitkan tindak balas imun semula jadi terhadap jangkitan. Pengaktifan langsung TLR-2 dengan komponen Leishmania kemudiannya dilaporkan [55]. Dalam kajian eksperimen lain yang berkaitan, kekurangan TLR-4 mengakibatkan peningkatan pertumbuhan parasit dan kelewatan penyembuhan lesi kulit yang disebabkan oleh jangkitan utama L. yang menunjukkan peranan munasabah TLR-4 dalam mendorong imuniti terhadap Leishmania [56 ]. Sebaliknya, TLR-2, 4, dan 9 didapati terlibat dalam spektrum imunopatologi CL yang disebabkan oleh L. braziliensis dan L. amazonensis [57]. TLR-9 juga dinilai sebagai pemain utama dalam pengaktifan sel dendritik dalam patogenesis VL pada manusia [58]. Beberapa komponen terbitan Leishmania telah ditunjukkan untuk mengaktifkan TLR-2, 4 dan 9 dalam kebanyakan kajian yang dijalankan dalam bidang ini. Pemerhatian ini menekankan fakta bahawa pelbagai TLR terlibat dalam mencetuskan imuniti perlindungan terhadap Leishmania. Oleh itu, interaksi antara TLR dan binaan vaksin yang direka bentuk dianggap perlu untuk menimbulkan imuniti yang berkesan terhadap jangkitan Leishmania. Ini telah diperiksa dengan melakukan dok molekul peptida vaksin berbilang epitopik dengan TLR manusia-2, 4, 5, 8 dan TLR tetikus-9 menggunakan pelayan PatchDock [PatchDock Server (tau.ac.il )]. Algoritma PatchDock mempunyai tiga peringkat utama, iaitu, perwakilan bentuk molekul, padanan tampalan permukaan, dan penapisan dan pemarkahan. Ia adalah algoritma dok molekul berasaskan geometri yang pada asasnya beroperasi pada pelengkap bentuk molekul antara reseptor dan ligan. Tampalan pelengkap dipadankan, dan transformasi calon dijana. Setiap penjelmaan ini dipertingkatkan lagi dengan memberikan fungsi pemarkahan yang mempertimbangkan kedua-dua tenaga penyahlarutan atom dan kaki geometri [59, 60]. Dalam kajian kami, TLR manusia-2 (id PDB: 6NIG), TLR-4 (id PDB: 4G8A), TLR-5 (id PDB: 3J0A), dan TLR-8 (id PDB: 4QC0), dan TLR tetikus-9 (id PDB: 3WPF) telah dipilih sebagai penerima dan fail PDB berasingan mereka telah diambil daripada Protein DataBank (www .rcsb.org). Model 3D yang diperhalusi bagi peptida vaksin digunakan sebagai ligan untuk semua simulasi dok. Pelayan PatchDock telah ditetapkan pada parameter lalai (mengelompokkan RMSD: 4.0). Kami selanjutnya menganalisis model dok terbaik menggunakan pelayan Cluspro berdasarkan algoritma putaran ikatan yang mungkin, dan bon telah dinilai menggunakan perisian PyMOL [61].

Pengoptimuman kodon, ramalan struktur mRNA, dan pengklonan dalam siliko untuk ekspresi protein vaksin

Pengoptimuman kodon diperlukan untuk mencapai ekspresi maksimum gen asing dalam organisma perumah apabila penggunaan kodon oleh perumah berbeza dengan ketara daripada perumah asli yang daripadanya urutan asal untuk binaan vaksin akhir telah dimusnahkan. JCat (Alat Penyesuaian Kodon Java), tersedia secara terbuka di (http://www.jcat.de/), digunakan untuk terjemahan terbalik dan pengoptimuman kodon dengan menyediakan urutan utama binaan vaksin akhir sebagai input. Penggunaan kodon telah dioptimumkan kepada organisma prokariotik yang paling berjujukan, E. coli K12 [6]. Tiga pilihan tambahan yang disediakan oleh alat telah dipilih untuk mengelakkan penamat transkripsi bebas rho, tapak pengikat ribosom prokariotik, dan tapak belahan sekatan yang tidak diingini. Indeks penyesuaian kodon (CAI) dan kandungan GC, seperti yang dikira oleh alat JCat, menunjukkan betapa baiknya pengoptimuman itu. Pengoptimuman yang lebih baik memastikan ekspresi protein vaksin yang lebih tinggi. Selanjutnya, tapak sekatan untuk enzim XhoI dan NdeI telah dimasukkan ke dalam urutan cDNA yang dioptimumkan yang disediakan oleh alat JCat untuk memudahkan pengklonan. Urutan yang diubah suai (dengan tapak sekatan) kemudiannya dimasukkan ke dalam vektor plasmid E. coli pET 28-a(+) dengan menggunakan modul pengklonan sekatan alat SnapGene [6, 31, 62, 63]. Perisian SnapGene tersedia di web di (https:// www.snapgene.com/). Selain itu, kami juga menggunakan pelayan web mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi ng-Form) untuk ramalan struktur sekunder mRNA yang dikodkan oleh gen peptida chimeric. Urutan teroptimum terjemahan terbalik yang diperoleh daripada alat JCat telah disediakan sebagai input. Program mfold adalah berdasarkan algoritma teras yang meramalkan tenaga bebas minimum, ∆ G, dan tenaga bebas minimum untuk lipatan yang mengandungi sebarang pasangan asas tertentu. Pelbagai kekangan lipatan juga digunakan untuk ramalan tenaga lipatan yang tepat. Tenaga lipatan untuk lipatan RNA ditetapkan pada 37 darjah , manakala keadaan ionik ditetapkan pada [Na+]=1 M dan [Mg++]=0 [64].

Simulasi imun berasaskan C-immsim

C-immsim (https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index. php?page=1) ialah alat ramalan tindak balas imun berasaskan pelayan yang menggunakan kelas berasaskan ejen dan ramalannya bergantung pada rangkaian saraf. Ia boleh meramalkan tindak balas imun humoral dan pengantaraan sel. C-immsim menggunakan model Celda Seiden, model kekisi poliklonal rentetan bit, dan indeks Simpson untuk mencirikan ramalan sel aktif, berehat dan ingatan serta umur panjangnya. Ia membantu untuk meramalkan profil sitokin tindak balas yang diberikan untuk menilai tindak balas keradangan [65].

Serbuk ekstrak cistanche

Simulasi dinamik molekul

Simulasi dinamik molekul telah dilakukan untuk menilai kestabilan kompleks terbaik kami, iaitu, TLR, dengan vaksin yang dicadangkan menggunakan pelayan iMOD (halaman utama iMod Server (csic.es). Pelayan berasaskan web ini menggunakan analisis mod biasa (NMA) yang dipertingkatkan. untuk pencirian pelbagai sifat dinamik biomolekul, seperti fleksibiliti dan kestabilan protein, melalui medan daya intra-atom. Dalam kajian semasa ini, kami menganalisis ubah bentuk rantai utama, faktor B, nilai eigen, faktor kovarians dan model rangkaian elastik sebagai parameter NMA standard untuk penilaian kompleks protein-protein yang diperolehi oleh pendekatan dalam siliko [66-69].

Keputusan

Pemilihan dan pengambilan urutan protein antigen Leishmania

The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0.51), mencerminkan potensi yang lebih tinggi untuk reka bentuk vaksin (Jadual 1). Protein didiskriminasi sebagai rembesan dan bukan rembesan berdasarkan ramalan tapak belahan peptida isyarat oleh pelayan SignalP 1.4. Dua daripada protein Leishmania terpilih iaitu. L. mexicana cysteine ​​​​protease A (Uniprot id: P25775) dan L. amazoensis surface glycoprotein GP-46/M2 (Uniprot id: P21978) didapati mengandungi peptida isyarat dan, oleh itu, diramalkan sebagai protein rembesan. Selebihnya daripada sepuluh antigen Leishmania tidak didapati mempunyai sebarang peptida isyarat yang menunjukkan sifat bukan rembesannya. Analisis penyetempatan meramalkan bahawa protein sistein proteinase A L. mexicana (Uniprot id: P25775) akan disetempatkan dalam lisosom/vakuol, protein leishmanolysin C1 dan proteophosphoglycan L. mexicana (Uniprot id: P43150 dan Q9TW13, masing-masing menjadi protein) , KURANGNYA antigen pelindung L. donovani (Uniprot id: Q9BIJ5) untuk berada dalam nukleus dan kejutan haba 70 berkaitan protein 1 L. major (Uniprot id: P12076) untuk disetempatkan dalam mitokondria. Semua protein lain diramalkan sebagai sitoplasma (Jadual 1). Di samping itu, jujukan asid amino rantai alfa IL manusia-12 juga diperoleh daripada pangkalan data Uniprot (Uniprot id: P29459) untuk digunakan sebagai pembantu dalam binaan vaksin akhir.

Ramalan epitop CTL dan HTL

Daripada semua protein yang sedang disiasat, sejumlah 59 epitop CTL bukan amerika biasa telah dikenal pasti secara bersama oleh pelayan NetCTL 1.2 dan SYFPEITHI. Setiap epitope CTL yang diramalkan telah diberikan skor tertentu yang dikira oleh pelayan masing-masing. Hanya 26 daripada 9-motif CTL biasa ini dipilih kerana skornya yang lebih tinggi (menunjukkan pertalian pengikat I MHC yang lebih tinggi). Dua puluh enam epitop CTL yang dikenal pasti secara lazim oleh kedua-dua pelayan dengan skor lebih tinggi yang serasi telah dimasukkan ke dalam binaan vaksin akhir (Jadual tambahan S1). Begitu juga, alat analisis pengikat IEDB MHCII meramalkan 15-epitop HTL lebih daripada semua protein terpilih terhadap satu set tiga alel HLA manusia (HLA- DRB1*01:01, HLA- DRB1*01:02 dan HLADRB1* 01:03). Epitop HTL yang diramalkan dengan kedudukan terlaras terendah bagi setiap satu daripada alel ini didokumenkan seperti dalam Jadual S2 tambahan. Daripada kumpulan ini, sejumlah sembilan jujukan telah dipilih berdasarkan kedudukan terlaras rendahnya (Jadual 2) yang menjadikan epitop HTL ini sebagai pengikat MHC-II yang paling mujarab untuk mana-mana daripada tiga alel HLA. Epitop HTL terpilih seterusnya tertakluk kepada analisis pengiraan selanjutnya untuk meramalkan kebolehan menghasilkan sitokin mereka.

Jadual 1 Dua belas peptida antigen berpotensi daripada spesies Leishmania yang berbeza telah dieksploitasi untuk pembinaan vaksin dan dipilih berdasarkan skor antigen tinggi mereka seperti yang diramalkan oleh pelayan ANTIGENpro

Pemeriksaan untuk epitop HTL dengan kebolehan mendorong sitokin

Kesemua sembilan epitope HTL yang dipilih (Jadual 2) dinilai untuk keupayaan mereka untuk menghasilkan interferon- dengan menggunakan pelayan IFNepitope. Pelayan meramalkan (IFN- vs. nonIFN, menggunakan SVM dan analisis hibrid berasaskan motif) hanya tiga peptida seperti FRRLYKTLGQLVYKK daripada protein rod parafagellar 2C L. major, DNGAYLGMEPSSVAA daripada proteophosphoglycan L. mexicana, dan RLHFFMMGFAPLTSR daripada rantai beta tubulin L. mexicana sebagai "positif" dengan markah kurang daripada 1.0 (Jadual 3). Ketiga-tiga peptida ini telah disemak selanjutnya untuk kebolehan menghasilkan IL-4 dan IL-10-nya masing-masing menggunakan pelayan IL4pred dan pelayan IL10pred. Kedua-dua pelayan menggunakan pengelas SVM dan mempertimbangkan pelbagai parameter input SVM seperti komposisi asid amino, komposisi dipeptida, kecenderungan asid amino, dan sifat fizikokimia untuk ramalan [32, 33]. Pelayan masing-masing meramalkan bahawa ketiga-tiga 15-epitop penghasil IFN- -ini adalah inducer untuk IL-4 dan IL-10 juga (Jadual Tambahan S3). Oleh itu, ketiga-tiga epitop HTL 15-mer HTL yang mengikat MHC-II ini akhirnya dipilih untuk pembinaan vaksin memandangkan keupayaannya untuk menimbulkan pengeluaran sitokin IFN- , IL-4 dan IL{{24 }} dengan itu mengantarkan tindak balas imun yang meningkat.

Analisis pemuliharaan epitope

Modul IEDB "pemuliharaan merentas antigen" yang tersedia dalam pelayan IEDB telah digunakan untuk mencari tahap pemuliharaan epitop CTL dan HTL terpilih yang akan digabungkan dalam binaan vaksin akhir. Setiap daripada dua puluh enam epitop CTL dan tiga epitop HTL telah disaring secara individu terhadap set urutan protein homolog tertentu yang diperoleh oleh Uniprot BLAST. Keputusan BLAST menunjukkan tahap pemuliharaan tinggi protein terpilih dalam pelbagai spesies Leishmania dan juga dalam protozoa parasit lain yang berkaitan, kebanyakannya Trypanosoma. Semua epitop HTL didapati sangat terpelihara (100%) merentas set protein Leishmania yang berkaitan yang digunakan dalam analisis, manakala julat pemuliharaan untuk epitop CTL terpilih berbeza-beza dari 0 hingga 100% (Jadual Tambahan S4). Penggabungan epitop CTL dan HTL yang dipelihara sedemikian dalam binaan vaksin akhir akan memastikan imuniti silang spektrum luas terhadap pelbagai spesies Leishmania patogenik yang biasanya menjangkiti manusia.

Jadual 2 Butiran epitop HTL terpilih (15 mer) dengan protein sumbernya, alel pengikat yang sepadan dan kedudukan terlaras yang diramalkan oleh alat pengikat IEDB MHC-II.

Jadual 3 Pelayan IFNepitope meramalkan epitop penggerak MHC II yang mampu menghasilkan interferon

Pembinaan jujukan vaksin berbilang epitope

Urutan utama vaksin peptida berbilang subunit telah dibina dengan menggabungkan jujukan dua puluh enam epitop CTL dan tiga epitop HTL yang dipilih berdasarkan antigenisiti, pertalian pengikat MHC, dan keupayaan mendorong sitokin. Epitop CTL dan HTL individu telah digabungkan dengan menggunakan penghubung AAY dan GPGPG, masing-masing, dan panjang keseluruhan peptida vaksin yang terhasil ialah 369 asid amino. Adjuvant, 219 asid amino rantai alfa panjang IL manusia-12 (Uniprot id: P29459), telah ditambahkan pada terminal N peptida yang direka oleh penyambung EAAK. Penambahan IL-12 sebagai adjuvant semulajadi sepatutnya meningkatkan keberkesanan vaksin dengan mempercepatkan tindak balas imun, seperti yang telah disahkan dalam kajian haiwan [3, 37]. Selain itu, tag 6XHis juga telah ditambahkan pada terminal C peptida untuk memudahkan pengenalpastian dan penulenan protein berikutan pengeluarannya oleh teknologi DNA rekombinan. Selepas penambahan penyambung, adjuvant dan tag histidine, panjang peptida vaksin akhir didapati ialah 598 sisa asid amino (Rajah 1).

Ramalan epitop sel B linear, berterusan dan tak selanjar

Kehadiran penentu antigen dalam jujukan utama vaksin yang direka bentuk telah dikenal pasti dengan menggunakan dua pelayan berbeza, iaitu, ABCpred dan BepiPred 2.0, untuk ramalan yang lebih berkesan. Pelayan ABCpred meramalkan epitop sel B dengan menggunakan rangkaian saraf berulang terlatih dan mewakili jujukan calon sebagai 16-mer peptida yang ditarafkan mengikut skor mengikatnya (Jadual Tambahan S5). Skor peptida yang lebih tinggi bermakna kebarangkalian yang lebih tinggi untuk menjadi epitope. Peptida vaksin yang direka bentuk didapati mempunyai tujuh peptida 16-mer yang tidak bertindih dengan skor ramalan sebanyak 0.90 dan ke atas pada nilai ambang lalai 0.51 , mencerminkan potensinya yang sangat tinggi untuk mengikat dan merangsang sel B. Pelayan lain, BepiPred 2.0, meramalkan kebarangkalian setiap sisa asid amino dalam jujukan input menjadi sebahagian daripada epitope sel B dan menggambarkan output sebagai ilustrasi dengan penggredan warna oren yang menunjukkan tahap kebarangkalian. Sisa ramalan yang tergolong dalam epitop sel B ditandakan sebagai "E." Pelayan mengenal pasti sejumlah besar residu sebagai epitop sel B linear dengan kebarangkalian tinggi dalam regangan sisa 380–53{{20}} kedudukan peptida (Gamb. 2) apabila ambang epitope ditetapkan pada 0.5 (lalai). Oleh itu, pengenalpastian penentu antigen untuk reseptor sel B oleh dua pelayan bebas membuktikan fakta bahawa peptida, apabila diberikan sebagai vaksin, akan dapat merangsang pengeluaran antibodi oleh sel B untuk melindungi individu daripada jangkitan Leishmania. Sut Ellipro (tersedia dalam portal IEDB) meramalkan sejumlah 323 sisa asid amino yang terdapat dalam lapan epitop sel B terputus dalam struktur tertier yang ditapis bagi vaksin peptida, dengan skor antara 0.509 hingga 0.802. Antaranya, epitope konformasi terbesar mengandungi 107 sisa asid amino dengan skor ramalan 0.772. Parameter lalai pelayan digunakan untuk analisis. Ellipro juga meramalkan dua belas epitop sel B linear dengan jumlah 324 sisa dalam julat skor 0.535-0.885 (Jadual Tambahan S6 dan imej tambahan M1).

Profil antigen, alergenik dan ketoksikan bagi binaan vaksin

Antigenicity jujukan vaksin akhir (dengan adjuvant) telah dinilai oleh pelayan ANTIGENpro dan VaxiJen 2.0. Pelayan ANTIGENpro meramalkan yang sama sebagai antigen berkemungkinan dengan skor antigenik 0.745396. VaxiJen 2.0 pelayan menilai peptida vaksin sebagai anti-gen berkemungkinan dengan skor 0.5325 pada ambang {{10}}.5 apabila organisma sasaran telah dipilih untuk menjadi parasit (Jadual 4). Walau bagaimanapun, apabila jujukan vaksin asal tanpa adjuvant dianalisis oleh VaxiJen 2.0, ia juga telah diramalkan sebagai antigen berkemungkinan dengan skor 0.5768 dalam model parasit. Skor ramalan ANTIGENpro untuk jujukan asal ialah 0.714582. Oleh itu, kedua-dua urutan vaksin yang dibina (dengan dan tanpa adjuvant) didapati bersifat antigenik, menyokong fakta bahawa komponen peptida vaksin adalah antigen dengan sendirinya, walaupun ketiadaan adjuvant tambahan (Jadual 4). Berkenaan dengan alergenik, jujukan vaksin terakhir didapati bukan alergen oleh AlgPred dengan skor ramalan 0.4018 pada ambang 0.4. Di samping itu, jujukan protein tidak didapati mengandungi sebarang epitop IgE yang terbukti secara eksperimen, dan tiada hits ditemui untuk keputusan BLAST untuk peptida wakil alergen (ARP), yang menunjukkan sifat bukan alergen bagi vaksin. Pelayan AllerTOP v.2.0 juga mentakrifkan protein sebagai kemungkinan bukan alergen. Analisis ketoksikan oleh pelayan ToxinPred meramalkan peptida tidak toksik apabila pendekatan berasaskan motif SVM (TrEMBL)+diguna pakai pada ambang SVM 0.1, dan potongan nilai E untuk berasaskan motif ditetapkan pada 10.0. Oleh itu, jujukan vaksin yang dijana telah diramalkan sebagai kemungkinan antigen, bukan alergen dan bukan toksik, yang kesemuanya merupakan kriteria penting untuk vaksin peptida berbilang subunit yang ideal.

Rajah 1 Gambaran skematik vaksin peptida berbilang epitope yang direka bentuk mengandungi sejumlah 598 jujukan asid amino yang mewakili kemungkinan binaan vaksin dengan adjuvant semulajadi terminal N (hijau) yang dikaitkan dengan EAAK (ungu) dengan 26 CTL (oren) menggunakan penghubung AAY (biru). , dan 3HTL (kuning) disambungkan dengan pemaut GPGPG (merah). Ia berakhir dengan 6-Tegnya di terminal C untuk tujuan penulenan

Rajah 2 Epitope sel B yang diramalkan oleh pelayan Bepipred 2.0. Regangan pada titik berbeza daripada 1 hingga 590 jujukan asid amino telah diramalkan dengan potensi epitope melebihi paras ambang lalai. Baris pertama yang ditandakan sebagai E menunjukkan lokasi epitop yang diramalkan

Penilaian parameter fizikokimia

Parameter fizikokimia binaan vaksin akhir telah dikira oleh pelayan Protparam berdasarkan sisa asid amino yang terdapat dalam urutan yang diberikan. Berat molekul (MW) peptida yang direka bentuk dikira sebagai 65.68 kDa yang menjadikannya sesuai untuk mendorong tindak balas imunogenik. PI teoretikal (titik isoelektrik) dikira sebagai 5.98, yang menetapkan peptida sebagai sifat sedikit berasid. Jumlah bilangan sisa bercas positif dan bercas negatif dalam peptida ialah 48 dan 55, masing-masing. Separuh hayat dikira sebagai 3{15}} jam dalam retikulosit mamalia in vitro, lebih daripada 20 jam dalam yis dan lebih daripada 10 jam dalam E. coli in vivo. Kegigihan protein selama 30 jam dalam sel mamalia (termasuk manusia) adalah mencukupi untuk menimbulkan tindak balas imun yang diingini kerana mekanisme itu memerlukan pemprosesan dan pembentangan protein oleh sel imun. Indeks alifatik (isipadu relatif yang diduduki oleh rantai sisi alifatik) diramalkan ialah 78.34, menunjukkan protein itu bersifat termostabil kerana indeks alifatik boleh dianggap sebagai faktor positif yang menyumbang kepada peningkatan kestabilan termostabil protein globular. Indeks ketidakstabilan dikira kepada 47.10. Nilai purata besar hidropati (GRAVY) bagi konstruk vaksin diramalkan ialah -0.140; nilai negatif mentakrifkannya sebagai hidrofilik dalam alam semula jadi dan akan berinteraksi dengan molekul air [28, 70–72]. Untuk membuat kesimpulan, analisis imunoinformatik meramalkan binaan peptida yang direka bentuk sebagai antigenik, termostabil, berterusan dalam sel mamalia, dan hidrofilik. Kesemua faktor ini memberi kesan kepada keberkesanan konstruk sebagai calon vaksin yang berkemungkinan.

Ramalan struktur sekunder

Ramalan struktur sekunder untuk 592 sisa peptida chimeric panjang oleh pelayan PSIPRED mendedahkan kehadiran heliks alfa 45.77%, helaian beta 4.89% dan gegelung 49.32%, seperti yang digambarkan dalam Rajah 3 berikut. Selain itu, struktur RaptorX pelayan ramalan menganalisis kebolehcapaian pelarut yang berkaitan untuk peptida di mana 36% sisa diramalkan terdedah, 28% diramalkan sebagai sederhana tertimbus, dan 35% daripada sisa diramalkan tertimbus, menunjukkan bahawa protein akan mempunyai hubungan yang adil secara keseluruhan. dengan air (pelarut). Hanya 32 sisa (5% daripada peptida) diramalkan berada dalam domain protein yang tidak teratur oleh pelayan RaptorX.

Ramalan struktur tertier

I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5 menunjukkan model dengan lipatan yang betul. Skor TM ialah parameter bebas panjang jujukan untuk mengukur persamaan struktur model yang diramalkan dengan protein serupa lain dalam keluarga lipatan SCOP/CATH yang sama [47].

Jadual 4 Keputusan antigenisiti dikira daripada pelayan ANTIGENpro dan pelayan Vaxijen2.0 dengan dan tanpa antigen

Rajah 3 Ramalan struktur sekunder kepada jujukan vaksin linear oleh pelayan PSIPRED

Rajah 4 Ramalan dan penghalusan struktur tertier 3-D pemodelan struktur vaksin seperti yang diramalkan oleh pelayan I-TASSER. b Penapisan model 3-D mentah oleh pelayan GalaxyRefne

Penapisan dan pengesahan model 3-D vaksin

Model tertiari "kasar" untuk vaksin peptida telah ditapis secara berurutan dengan memprosesnya melalui pelayan GalaxyReone. GalaxyRefne menghasilkan lima model, yang mana model 1 didapati terbaik selepas penilaian dan perbandingan parameter yang berkaitan seperti GDT-HA (0.8826); RMSD (0.608); MolProbity (2.398); skor pertembungan (21.1); pemutar yang lemah (0.6); dan wilayah yang digemari Rama (88.8) dengan model yang lain (Rajah 4b). Plot Ramachandran yang dijana oleh pelayan MolProbity menunjukkan bahawa model 3-D yang diperhalusi mempunyai 88.8% sisa di wilayah yang digemari, 98.6% sisa di wilayah yang dibenarkan dan hanya 0.013% outlier. Sebaliknya, model mentah awal didapati mempunyai 77.1%, 94.2%, dan 0.057% residu masing-masing di kawasan yang digemari, dibenarkan dan terpencil. Keputusan ini jelas menyimpulkan bahawa kualiti model tertiari yang ditapis telah meningkat dengan ketara. Pelayan ERRATA juga telah dieksploitasi untuk pengesahan tambahan model yang diperhalusi. Pelayan ERRATA menganalisis model dengan faktor kualiti keseluruhan 43.542, yang sebenarnya mewakili peratusan model protein input yang jatuh di bawah had penolakan 95%. Oleh itu, kami berjaya memperoleh struktur tertiari yang diperhalusi dan disahkan untuk pembinaan vaksin. Struktur tertier yang diperhalusi bagi vaksin, bersama-sama dengan plot yang diperoleh daripada pelayan MolProbity dan pelayan ERRAT, ditunjukkan dalam Rajah 5. Pelayan web ProSA telah menunjukkan skor Z -1.08 (imej tambahan M2), di mana negatif nilai menunjukkan bahawa model berada di luar julat skor protein serupa dengan saiz yang setanding yang strukturnya telah ditentukan oleh pembelauan sinar-X atau oleh NMR [51].

Kejuruteraan disulfida peptida vaksin

Pelayan Disulfide by Design 2.12 mengembalikan 45 pasang sisa asid amino yang merupakan tapak berkemungkinan untuk pembentukan ikatan disulfida. Kami telah mengenal pasti empat pasangan sisa calon yang paling penting yang mungkin terletak di kawasan gelung fleksibel protein vaksin berdasarkan tenaga ikatan tinggi dan nilai Chi3 (Jadual Tambahan S7). Sisa ini, THR58-PHE61 (chi3:+126.18), LEU216-ALA234 (chi3:+125.92), THR323-GLU359 (chi3 :+121.54), dan TYR472-ARG504 (chi3: + 125.75), telah digantikan dengan sistein dalam model tertier yang ditapis bagi protein vaksin akhir, dengan itu meningkatkan kestabilan terma daripada peptida (Rajah 6). Walau bagaimanapun ketepatan faktor B adalah terhad kepada pengecilan penyerakan neutron atau sinar-X oleh gerakan terma molekul dalam kristalografi protein. Oleh itu, kami dengan ketat memilih tenaga ikatan tinggi dan nilai Chi3 berbanding faktor B untuk model vaksin ditapis berbantukan komputer ini [73, 74].

Analisis interaksi dok peptida vaksin dengan TLR

Interaksi peptida chimeric dengan reseptor imun (TLR manusia{{0}}, 4, 5, 8 dan TLR tetikus-9) telah dikaji dengan melakukan analisis dok menggunakan pelayan PatchDock di mana pengikatan pertalian vaksin (ligan) dengan pelbagai TLR (reseptor) telah dinilai. Sepuluh model teratas yang dijana oleh PatchDock untuk setiap dok telah dipertimbangkan, antaranya model kedudukan terbaik dengan skor dok tertinggi telah dipilih untuk setiap kes. Skor mewakili bentuk dan elektrostatik pelengkap amal antara reseptor dan ligan. Komplementari terbaik ditemui dalam kes TLR manusia-2 (id PDB: 6NIG) dengan skor 18,714, luas permukaan 3963.10 dan tenaga sentuhan atom (ACE) 217.99 (Gamb. 7a) . Vaksin juga menunjukkan pengikatan yang cekap dengan TLR-5 (id PDB: 3J0A) dan TLR-9 (id PDB: 3WPF) dengan skor dok 18,258; luas permukaan 2879.80 dan ACE sebanyak−666.94 dan skor dok 18,164; dan luas permukaan 4090.70 dan ACE masing-masing 495.74. Dok dengan TLR lain menunjukkan pertalian ikatan yang lebih lemah seperti yang ditunjukkan oleh skor dok yang lebih rendah yang dijana oleh PatchDock, 16,708 untuk TLR-4 (id PDB: 4G8A) dan 17,800 untuk TLR-8 (id PDB: 4QC0). Oleh itu, binaan vaksin kami dapat mengikat dengan reseptor imun yang berbeza dengan pertalian pengikatan yang berbeza-beza. Ini adalah sangat diingini untuk vaksin yang berkesan dari segi mendorong imuniti yang betul dan meningkat untuk mencegah jangkitan Leishmania. Selanjutnya, alat web FireDock digunakan untuk memperhalusi dan menskor semula kompleks terbaik (kompleks vaksin TLR-2), yang memperhalusi sama dengan tenaga global minimum−19.01, persatuan Van Der Waals (−25.74), sentuhan atom tenaga (−0.03), dan tenaga bebas mengikat (−24.26). Keputusan ini menyokong fakta bahawa peptida vaksin berinteraksi dengan paling cekap dengan TLR manusia-2 dan, dengan itu, membentuk kompleks yang agak stabil yang mungkin menyebabkan tindak balas imun yang ketara terhadap parasit Leishmania. Di samping itu, kami menyiasat selanjutnya dok antara TLR-2 dan vaksin; menggunakan pelayan web Cluspro, model teratas (Rajah 7b) dipilih berdasarkan FFT putaran 5D dan CAPRI (penilaian kritikal interaksi yang diramalkan) dengan skor wajaran seimbang−1192.5 yang mempunyai saiz kelompok terbesar sebanyak 42 ahli. Jadual 5 mengandungi senarai 10 sisa asid amino yang berinteraksi daripada Rajah 7b yang membentuk kompleks reseptor-ligan yang stabil.

Rajah 5 plot Ramachandran untuk model GalaxyRefne. b pelayan ERRAT meramalkan penilaian kualiti struktur protein

Rajah 6 Disulfida mengikut reka bentuk 2.0 meramalkan empat (ditandakan dengan anak panah) potensi pembentukan ikatan disulfida untuk meningkatkan kestabilan terma binaan vaksin akhir

Pengoptimuman kodon dan pengklonan dalam siliko untuk ekspresi protein vaksin

Dalam usaha untuk mengatasi masalah bias kodon, alat JCat telah digunakan untuk pengoptimuman kodon yang mengembalikan urutan asid amino input peptida vaksin dalam bentuk urutan cDNA diterjemahkan terbalik dengan nilai CAI yang dioptimumkan sebanyak 1. Nilai ini terletak dalam julat nilai CAI yang diterima iaitu 0.8–1.0 [28], memastikan kadar ekspresi gen yang tinggi dalam organisma hos, E. coli K12. Semakin tinggi nilai CAI, semakin baik kadar ekspresi gen asing. Di samping itu, kandungan GC bagi jujukan yang dipertingkatkan didapati 51.85%, menunjukkan pengoptimuman kodon yang baik. Untuk ekspresi gen yang lebih baik, kandungan GC 35-70% diperlukan [63]. Tapak sekatan untuk enzim XhoI dan NdeI dicipta pada hujung 5/ dan 3/ jujukan, diikuti dengan penyisipan jujukan yang diubah suai ke dalam vektor pET28 a(+). Sisipan klon, yang diwakili dalam warna merah, terletak di antara tapak sekatan yang ditentukan dalam vektor. Regangan enam sisa histidin juga terletak di kedua-dua hujung jujukan klon untuk memudahkan proses penulenan selepas penghasilan protein vaksin rekombinan [6, 31]. Saiz binaan vektor plasmid akhir dengan serpihan gen yang dimasukkan adalah kira-kira 7 kb (Rajah 8). Pelayan web mfold meramalkan sejumlah lima puluh konformasi lipatan mRNA, antaranya struktur teratas dipilih kerana skor tenaga terendahnya (ΔG= −492.50). Konformasi terlipat tertentu ini diramalkan mengandungi gelung luaran tunggal dan empat tindanan dengan tenaga bebas minimum yang menunjukkan kestabilan konformasi. Gelung itu dibentuk dengan 21 tapak beruntai tunggal dan dua helik penutup. Plot titik tenaga mengira tenaga optimum (δG) menjadi 494.4 kcal/mol. Titik-titik berwarna yang berbeza dalam medan merujuk kepada gred tenaga yang berbeza bagi pasangan asas tertentu yang terdapat dalam mRNA dengan mengambil kira δG yang dikira oleh pelayan [64]. Menurut plot, tenaga bebas kebanyakan pasangan asas berada dalam lingkungan -487.5<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">

Jadual 5 PyMOL menghasilkan sepuluh residu asid amino berinteraksi reseptor dan ligan daripada Rajah 7b, dan nombor dalam () menunjukkan kedudukan asid amino masing-masing dalam reseptor dan ligan

Simulasi imun

Simulasi imun dalam silico menggunakan pelayan web C-immsim meramalkan kiraan antigen mencecah sehingga 6.9× 105 /ml dalam masa 2 hari dari dos awal suntikan dan tahap antigen menurun kepada 0 pada hari keempat dan seterusnya. Peningkatan kiraan antigen ini dikaitkan dengan peningkatan yang luar biasa dalam kepekatan kedua-dua tahap IgG IgM dan tahap IgM sahaja semasa tempoh jangkitan awal dan mencapai tahap puncak kira-kira dalam tempoh 12 hari dari kitaran jangkitan pada skala sewenang-wenangnya. Subjenis lain tahap IgG1+IgG2 dan IgG1 meningkat dengan ketara akibat tindak balas imun sekunder (Rajah 9a). Profil sitokin menunjukkan mediator inflamasi seperti tahap INF yang mencapai sehingga 4×106 ng/ml pada hari ke-12, manakala tahap sitokin lain kekal agak rendah (Rajah 9b). Tindak balas imunologi pengantaraan sel yang dicadangkan oleh kehadiran limfosit T sitotoksik aktif dan berehat meningkat selepas 2-3 hari selepas suntikan awal, dan kehadiran sel T penolong ingatan proliferatif juga menonjol (Rajah 9c dan d). Jumlah populasi sel B juga meningkat dalam masa 2-3 hari, bersama-sama dengan penjanaan sel B memori selepas 1 minggu pemberian dos primer (Rajah 9e).

Rajah 8 Sistem ekspresi vaksin Leishmania menggunakan vektor pET28 a(+), kawasan merah menunjukkan urutan asid nukleik yang dimasukkan bagi vaksin yang diapit oleh tapak sekatan NdeI dan XhoI

Tafsiran simulasi dinamik molekul

Skor dok terbaik yang dicapai oleh kompleks vaksin2-TLR telah dianalisis selanjutnya oleh simulasi dinamik molekul bantuan NMA. Kebolehubah bentuk rantai utama diwakili oleh engsel tinggi (Rajah 10a), yang bermaksud kebolehubah bentuk yang tinggi. Faktor B (Rajah 10b) dikira oleh NMA, yang menandakan fleksibiliti protein berdasarkan parameter anjakan atom [73]. Nilai eigen (Rajah 10c) menerangkan tentang tenaga yang diperlukan untuk mengubah bentuk struktur. Kompleks vaksin TLR-2 menunjukkan nilai eigen kira-kira 7.778× 10−7. Varians (Rajah 10d) berkait songsang dengan nilai eigen. Matriks kovarians (Rajah 10e) menggambarkan sama ada pasangan sisa berkorelasi (merah), tidak berkorelasi (putih), atau anti-berkorelasi (biru). Model rangkaian anjal (Rajah 10f) mengira spring antara pasangan atom yang sepadan, titik dalam graf yang diwakili oleh kecerunan warna yang menunjukkan ketegaran atau fleksibiliti spring, dan warna yang lebih gelap mencerminkan spring yang lebih kaku. Oleh itu, keputusan simulasi dinamik molekul mencadangkan bahawa cadangan vaksin peptida kami adalah stabil.

Perbincangan

Leishmaniasis dianggap sebagai salah satu penyakit tropika yang paling diabaikan yang terutamanya memberi kesan kepada orang yang tinggal di kawasan yang dilanda kemiskinan di negara membangun, termasuk India [2]. Menurut laporan WHO India adalah endemik untuk kedua-dua bentuk penyakit, CL dan VL. CL yang disebabkan oleh L. tropica dan L. major berlaku di negeri barat laut India, Punjab dan Rajasthan menjadi tumpuan (https://www.who.int/leishmaniasis/ burden/Leishmaniasis_India/en/ ). Tambahan pula, dengan peningkatan kejadian wabak human immunodeficiency virus (HIV) di seluruh dunia, leishmaniasis telah muncul sebagai patogen oportunistik yang muncul semula dalam pesakit AIDS menjadikan keadaan itu lebih mengerikan [22, 38]. Dalam kajian semasa, kami berhasrat untuk mereka bentuk vaksin am polyvalent novel untuk leishmaniasis yang mungkin memberikan perlindungan heterolog daripada spesies parasit patogen biasa. Kami memilih dua belas protein khusus Leishmania yang merangkumi lima strain patogenik parasit yang menyebabkan jangkitan VL dan CL pada manusia. Protein ini telah pun dinilai untuk peranannya dalam virulensi dan imunogenisiti dan potensinya sebagai calon vaksin dalam pelbagai kajian imunologi[1, 8–10, 75]. Oleh itu, binaan vaksin yang direka bentuk dalam silico dengan menggabungkan protein imunogenik yang dicirikan dengan baik dan sangat dipelihara daripada spesies patogenik Leishmania yang berbeza mungkin memberikan imuniti silang terhadap semua bentuk leishmaniasis manusia (terutamanya VL dan CL) dan, oleh itu, boleh digunakan untuk program vaksinasi am untuk mencegah jangkitan Leishmania pada manusia. Protein yang dipilih terutamanya disaring untuk kehadiran epitop CTL dan HTL yang berpotensi. Pengesanan epitop sel T adalah penting kerana sel T hanya boleh mengenali antigen apabila diproses sama ada melalui laluan endogen atau eksogen, dikomplekskan dengan molekul MHC kelas I atau MHC kelas II, dan kemudiannya dibentangkan kepada reseptor sel T oleh sel pembentang antigen ( APC). MHC-I adalah khusus untuk CD{14}}CTL, manakala MHC-II mengikat khusus kepada CD{16}}reseptor HTL. Pengenalpastian untuk epitope CTL dilakukan dengan ketat dengan menggunakan dua pelayan bebas secara serentak. Hanya epitop yang diramalkan oleh kedua-dua pelayan dengan pertalian mengikat MHC yang jauh lebih tinggi akhirnya dimasukkan ke dalam peptida vaksin. Epitop HTL yang dikenal pasti dinilai selanjutnya untuk kebolehan mendorong sitokin mereka dengan mengeksploitasi tiga pelayan web. Yang boleh merangsang pengeluaran pelbagai jenis sitokin, iaitu, IFN-, IL{{20}} dan IL-10, telah dipilih untuk mereka bentuk vaksin peptida chimeric untuk memastikan bahawa ia akan mencetuskan penghasilan semua sitokin khusus parasit ini dalam perumah. Ini amat penting memandangkan Kedzierski dan rakan sekerja telah mencadangkan bahawa rembesan IL-10 adalah sama pentingnya dengan rembesan IFN- untuk menentukan sama ada vaksin boleh menimbulkan tindak balas imun pelindung dan imuniti yang betul tidak didorong jika IL Tahap -10 tidak dinaikkan secara berkadar [8, 75]. Epitop CTL dan HTL eksklusif seterusnya digabungkan dengan menggunakan penyambung AAY dan GPGPG untuk membina peptida chimeric. Penyambung AAY dan GPGPG sebelum ini dilaporkan berguna untuk reka bentuk vaksin berbilang epitope kerana ia membenarkan imunogenisiti persimpangan yang minimum dan memudahkan pemprosesan dan pembentangan epitop terpilih oleh MHC-II [6, 28, 71]. Rantaian alfa adjuvant IL manusia-12 telah dipautkan ke terminal N peptida terhasil melalui pemaut EAAK. IL-12 dipilih sebagai adjuvant kerana ia merupakan salah satu adjuvant yang paling berkesan untuk vaksin Leishmania dalam model haiwan, seperti yang didokumenkan dalam kajian imunogenik sebelumnya [3, 37, 71]. Memandangkan vaksin bertujuan untuk pentadbiran manusia, menggabungkan IL manusia-12 sebagai adjuvant semulajadi dan bukannya sebarang agonis TLR sintetik dijangka meningkatkan imuniti tanpa menyebabkan kesan sampingan yang buruk. Peranan IL-12 sebagai pembantu umum untuk vaksin juga ditekankan kerana potensinya dalam meningkatkan kedua-dua protein dan tindak balas antibodi vaksin polisakarida dan mendorong keradangan tempatan yang mencukupi yang membenarkan eksudasi IgG yang membawa kepada tindak balas imun yang meningkat [72]. Penyambung EAAK telah ditambah untuk mencapai kadar ekspresi yang lebih tinggi dan untuk mempromosikan fungsi biologi peptida gabungan dengan menyekat interaksi antara domain vaksin [76, 77]. Analisis imunoinformatik menunjukkan bahawa binaan vaksin kami mempunyai banyak epitop sel B linear yang sangat diingini untuk vaksin yang dibuat untuk kegunaan imunoprophylactic. Sekali lagi, kami menggunakan dua alat berbeza untuk ramalan yang lebih tepat. Kedua-dua pelayan meramalkan epitop sel B yang mencukupi dalam urutan vaksin. Vaksin yang direka telah diramalkan bukan alergen, tidak toksik, dan cukup imunogenik untuk mencetuskan tindak balas imun yang betul. Analisis fizikokimia seterusnya mendedahkan peptida vaksin adalah sedikit berasid (pI 5.98) dengan indeks alifatik yang jauh lebih tinggi (78.34), menunjukkan sifatnya yang tidak stabil. Nilai GRAVY negatif (-0.14) menunjukkan peptida adalah hidrofilik, yang seterusnya menyumbang kepada potensinya sebagai vaksin. Unsur struktur sekunder vaksin ditentukan oleh pelayan PSIPRED v 4.0, yang merupakan salah satu kaedah pengiraan yang paling tepat dan digunakan secara meluas untuk ramalan struktur sekunder protein. Selain itu, struktur 3D untuk peptida yang direka juga telah diramalkan menggunakan pelayan I-TASSER yang memberikan maklumat terperinci tentang koordinat sisa penting protein, yang sangat penting untuk mengkaji dinamik, bioaktiviti dan interaksi vaksin. dengan ligan lain. Struktur tertiari awal telah diperhalusi dan disahkan dengan menggunakan alat pengesahan struktur protein untuk mencari dan membetulkan kemungkinan ralat dalam rantai sisi atau tulang belakang model yang diramalkan. Analisis plot Ramachandran menunjukkan bahawa lebih daripada 90% sisa model yang ditapis berada dalam kawasan yang dibenarkan dengan peratusan outlier yang kecil, manakala pelayan ERRAT menunjukkan faktor kualiti 43.542 yang kesemuanya implikasi kepada kualiti model yang memuaskan. Model 3D yang disahkan didapati mempunyai bilangan epitop sel B konformasi yang mencukupi oleh pelayan ElliPro, yang membayangkan bahawa ia mungkin menjana tindak balas sel B yang diingini dan merangsang pengeluaran antibodi khusus dalam hos. Pengaktifan sel B juga penting dalam ingatan imunologi dan bertanggungjawab untuk imuniti tahan lama dalam individu yang divaksin. Interaksi vaksin dengan reseptor imun (TLR) juga dinilai dengan melakukan analisis dok. Peptida vaksin didapati mempunyai pertalian tertinggi untuk TLR-2, diikuti oleh TLR-5, walaupun ia dapat mengikat dengan TLR lain pada tahap yang lebih rendah. Interaksi dengan TLR adalah penting untuk menimbulkan imuniti perlindungan kerana kajian terdahulu yang melibatkan model haiwan mendokumenkan bahawa spesies Leishmania yang berbeza atau komponen antigennya berinteraksi dengan pelbagai TLR yang membawa kepada tindak balas imun yang sengit dalam perumah yang dicabar. Untuk memenuhi keperluan untuk ekspresi memuaskan protein vaksin rekombinan dalam sistem hos E. coli (K12), pengoptimuman kodon dilakukan dengan menggunakan alat JCat yang melaraskan CAI dan kandungan GC bagi jujukan, menjadikannya sesuai untuk ekspresi dalam E coli. Pengklonan dalam siliko juga dilakukan menggunakan vektor ekspresi berasaskan plasmid pET28a(+) untuk menunjukkan kebolehlaksanaan urutan untuk pengklonan dan ekspresi berlebihan untuk mencapai peningkatan pengeluaran protein vaksin rekombinan. Ramalan struktur sekunder mRNA yang dikodkan oleh jujukan gen chimeric dibuat untuk menunjukkan kestabilan konformasi lipatan mRNA yang akan mempengaruhi proses terjemahan yang cekap dalam perumah bakteria. Mutasi penstabilan telah dicipta dengan menambahkan kaitan disulfida baru dalam protein vaksin kerana ia akan menyumbang kepada kekuatan protein asli, menjadikannya sesuai untuk penerokaan biokimia, imunologi dan bioteknologi tambahan.

Rajah 9 Simulasi imun berasaskan pelayan C-immsim. a Jumlah antigen dan penjanaan antibodi masing-masing, b profle pengeluaran sitokin, c dan d generasi sel T penolong dan jumlah bilangan limfosit T sitotoksik (aktif dan berehat), tindak balas sel e B selepas pemberian vaksin

Rajah 10 Simulasi dinamik molekul. a Kebolehubah bentuk rantai utama ditunjukkan oleh engsel, b NMA menjana B faktor menunjukkan kestabilan protein, c nilai eigen untuk mengubah bentuk struktur kompleks dok, d individu (ungu) % daripada varians dan kumulatif (hijau) struktur, e matriks kovarians berkorelasi (merah), tidak berkorelasi (putih) atau anti-korelasi (biru) antara pasangan atom, model rangkaian f anjal menunjukkan spring bersambung antara pasangan atom, kelabu gelap menunjukkan spring tegar dan sebaliknya

faedah tambahan cistanche-meningkatkan imuniti

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Kesimpulan

Dalam kerja ini, kami telah mengeksploitasi pendekatan vaksinologi terbalik untuk reka bentuk in silico bagi vaksin peptida berbilang subunit polivalen terhadap leishmaniasis manusia (kedua-dua visceral dan kutaneus) yang mungkin dapat memberikan perlindungan heterolog daripada parasit Leishmania biasa yang menjangkiti manusia dan, oleh itu, boleh dianggap sebagai spektrum luas dalam alam semula jadi. Perkara yang sama boleh digunakan untuk program vaksinasi am untuk mengawal dan membasmi penyakit sebagai strategi pelengkap bersama dengan agen kemoterapeutik yang ada sekarang. Selain itu, kami telah menggunakan IL-12 sebagai pembantu semula jadi dan bukannya sebarang peptida sintetik bukan manusia. Menggunakan IL-12 sebagai adjuvant akan meningkatkan imunogenisiti vaksin tanpa menyebabkan sebarang kesan sampingan yang buruk pada badan hos. Dengan syarat bahawa peptida vaksin terdiri daripada pelbagai peptida yang sangat konservatif dan berpotensi imunogenik yang diperoleh daripada lima spesies Leishmania patogenik, adalah berguna untuk menimbulkan imuniti silang pada individu yang divaksin, dengan itu juga mempunyai kelebihan terapeutik dan profilaksis. Pelbagai analisis imunoinformatik yang ketat menggunakan beberapa alat pengiraan telah menemui cadangan vaksin imunogenik, stabil dan boleh dihasilkan semula sebagai protein rekombinan dan selamat untuk ujian manusia. Walau bagaimanapun, pengesahan eksperimen masih perlu dilakukan untuk menjamin pelepasan imuniti pelindung dan tahan lama yang betul serta menolak ketoksikan.

Rujukan

1. De-Brito RCF, Cardoso JMO, Reis LES, Vieira JF, Mathias FAS, Roatt BM, Agiuar-Soares RDDO, Ruiz JC, Resende DM et al. (2018) Vaksin peptida untuk leishmaniasis. Immunol Depan 9:1043

2. Okwor I, Uzonna J (2016) Beban sosial dan ekonomi leishmaniasis manusia. Am J Trop Med Hyg 94(3):489–493. https://doi. org/10.4269/ajtmh.15-0408

3. Mutiso JM, Macharia JC, Gicheru MMJ (2010) Biomed Res 24(1):16–25. https://doi.org/10.1016/S1674-8301(10)60004-8

4. Gillespie PM, Beaumier CM, Strych U, Hayward T, Hotez PJ, Bottazzi ME (2016) Status penyelidikan vaksin dan pembangunan vaksin untuk leishmaniasis. Vaksin 34(26):2992–2995. https:// doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.12.071

5. Joshi S, Rawat K, Yadav NK, Kumar V (2014) Siddiqi MI dan Dube A (2014) Visceral leishmaniasis: kemajuan dalam pembangunan vaksin melalui pendekatan klasik dan molekul. Immunol Depan 5:380. https://doi.org/10.3389/fmmu.2014.00380

6. Khatoon N, Pandey RK, Prajapati VK (2017) Meneroka protein rembesan Leishmania untuk mereka bentuk vaksin subunit berbilang epitope sel B dan T menggunakan pendekatan imunoinformatik. Sci Rep 7:8285

7. Goto Y, Bhatia A, Raman VS, Liang H, Mohammad R, Picone AF, Vidal SEZ, Vedvick TS et al (2011) KSAC, calon vaksin poliprotein yang ditakrifkan pertama untuk leishmaniasis visceral. Clin Vaccine Immunol 18(7):1118–1124. https://doi.org/10.1128/CVI. 05024-11

8. Kedzierski L (2010) Vaksin Leishmaniasis: di manakah kita hari ini? J Glob Infect Dis 2(2):177–185. https://doi.org/10.4103/0974- 777X.62881

9. Nagill R, Kaur S (2011) Calon vaksin untuk leishmaniasis: kajian semula. Int Immunopharmacol 11(10):1464–1488. https://doi.org/ 10.1016/j.intimp.2011.05.008

10. Coler RN, Reed SG (2005) Vaksin generasi kedua terhadap leishmaniasis. Trend Parasitol 21(5):244–249

11. Fernández L, Carrillo E, Sánchez-Sampedro L, Sanchez C, Ibarra Meneses AV, Jimenez MA, Almeida VDA, Esteban M et al (2018) Antigenicity of Leishmania-activated c-kinase antigen (LACK) dalam mononuklear darah periferal manusia sel, dan kesan perlindungan pemvaksinan prime-boost dengan pCI-neo-LACK ditambah dengan virus vaccinia yang mengekspresikan LACK yang dilemahkan dalam hamster. Immunol Depan 9:843. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.00843

12. Kelly BL, Stetson DB, Locksley RM (2003) Antigen LACK utama Leishmania diperlukan untuk parasitisasi vertebrata yang cekap. J Exp Med 198(11):1689–1698. https://doi.org/10.1084/jem.20031 162

13. De Mendonça SC, Cysne-Finkelstein L, Matos DC (2015) Protein membran kinetoplastid-11 sebagai calon vaksin dan faktor virulensi dalam Leishmania. Immunol Depan 6:524. https://doi.org/ 10.3389/fmmu.2015.00524

14. Joshi PB, Kelly BL, Kamhawi S, Sacks DL, McMaster WR (2002) Penghapusan gen yang disasarkan dalam utama Leishmania mengenal pasti leishmanolysin (GP63) sebagai faktor virulensi. Mol Biochem Parasitol 120(1):33–40. https://doi.org/10.1016/s0166-6851(01)00432-7

15. McMahon-Pratt D, Rodriguez D, Rodriguez JR, Zhang Y, Manson K, Bergman C, Rivas L, Rodriguez JL et al (1993) Virus vaccinia rekombinan yang menyatakan GP46/M-2 melindungi daripada jangkitan Leishmania. Jangkitan Immun 61(8):3351–3359

16. Holakuyee M, Mahdavi M, Zuhair MH, Abolhasani M (2012) Promastigotes yang diperkaya protein kejutan haba daripada Leishmania utama mendorong tindak balas imun Th2 dalam tikus BALB/c. Iran Biomed J 16(4):209–217. https://doi.org/10.6091/ibj.1098.2012

17. MacLean L, Price H, O'Toole P (2016) Meneroka laluan eksport Leishmania hydrophilic acylated surface protein B (HASPB) melalui kaedah pengimejan sel hidup. Kaedah Mol Biol 1459:191–203. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3804-9_13

18. Maharana BR, Tewari AK, Singh V (2015) An overview on kinetoplastid parafagellar rod. J Parasit Dis 39(4):589–595. https:// doi.org/10.1007/s12639-014-0422-x

19. Mahmoudzadeh NH, McKerrow JH (2004) Leishmania tropica: protease sistein adalah penting untuk pertumbuhan dan patogenik. Exp Parasitol 106(3–4):158–163. https://doi.org/10.1016/j.exppara. 2004.03.005

20. Mundodi V, Kucknoor AS, Gedamu L (2005) Peranan Leishmania (Leishmania) chagasi amastigote cysteine ​​protease dalam dalam survival parasit travellular: kajian oleh gangguan gen dan perencatan mRNA antisense. BMC Mol Biol 6:3. https://doi.org/10.1186/ 1471-2199-6-3

21. Rogers ME (2012) Peranan leishmania proteo phosphoglycans dalam penghantaran lalat pasir dan jangkitan perumah Mamalia. Mikrobiol Depan 3:223. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00223

22. Bhowmick S, Ali N (2009) Pengenalpastian antigen Leishmania donovani novel yang membantu mentakrifkan korelasi perlindungan pengantaraan vaksin dalam leishmaniasis visceral. PLoS One 4(6):e5820. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0005820

23. Assis TM, Mancini DT, Ramalho TC, da Cunha EFF (2014) Dalam kajian silico Leishmania donovani - tubulin dan perencat. J Chem. https://doi.org/10.1155/2014/492579