CRISPRi-mediated Kawalan Melaras Tahap Ekspresi Gen Dengan RNA Panduan Tunggal Kejuruteraan dalam Escherichia Coli
Oct 20, 2023
ABSTRAK
Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-lipat). SgRNA ini juga membolehkan peraturan modular dengan pelbagai urutan DNA sasaran. Kami menggunakan sistem ini untuk mengagihkan semula fluks metabolik untuk menghasilkan derivatif violacein dalam nisbah yang boleh diramal dan mengoptimumkan pengeluaran likopena. Sistem ini akan membantu mempercepatkan proses pengoptimuman fluks dalam kejuruteraan metabolik dan biologi sintetik.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity
【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
PENGENALAN
Sistem jenis II Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) ialah sistem belahan DNA berpandukan RNA yang terdiri daripada CRISPR RNA (crRNA), trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) dan protein Cas9 (1). ,2). Cas9 daripada Streptococcus pyogenes telah digunakan secara meluas dalam kejuruteraan genom kerana sifatnya yang dicirikan dengan baik (3,4). Kompleks protein spCas9, tracrRNA dan crRNA mengikat dan membelah protospacer DNA sasaran sebagai pelengkap kepada 20 nukleotida (nt) jujukan spacer crRNA dengan kehadiran 5'-NGG-3' protospacer motif bersebelahan (PAM). ) urutan (5,6). Untuk memudahkan sistem, RNA panduan tunggal chimeric (sgRNA) di mana crRNA dan tracrRNA dicantumkan oleh penyambung buatan yang dipanggil tetraloop boleh digunakan (5). Ia membolehkan untuk menggantikan dua RNA berasingan dengan molekul RNA tunggal, menjadikan sistem lebih mudah diurus. Salah satu sistem berasaskan CRISPR, gangguan CRISPR (CRISPRi), menggunakan Cas9 (dCas9) yang tidak aktif secara pemangkin dengan menggantikan asid amino tertentu daripada setiap domain endonuclease (7). Pengubahsuaian ini menjadikan kompleks ribonukleoprotein (RNP) yang boleh mengarahkan dan mengikat DNA sasaran dan mengganggu RNA polimerase (RNAP) untuk menghalang permulaan transkripsi atau pemanjangan (7). Berbeza dengan kalah mati oleh sistem CRISPR/Cas9, CRISPR membenarkan ketukan gen yang boleh diterbalikkan dengan mengekspresikan dCas9 atau sgRNA di bawah promoter yang boleh diinduksi, membolehkan lebih banyak fleksibiliti dalam peraturan gen (7). Sistem CRISPRi telah menyenyapkan gen sasaran secara berkesan ratusan kali ganda (7,8). Penindasan gen khusus sasaran membolehkan fenotaip pemprosesan tinggi menggunakan kumpulan sgRNA seluruh genom (9) atau mengubah hala fluks karbon dalam bakteria kejuruteraan ke arah bahan kimia sasaran (10–12). Di samping itu, CRISPRi multipleks telah ditunjukkan dalam pelbagai hos menggunakan pelbagai kaedah untuk mengekspresikan berbilang sgRNA secara stabil, termasuk tatasusunan crRNA panjang, penyepaduan suis pegangan kaki, dan tatasusunan sgRNA ekstra panjang yang tidak berulang (13-16). Teknik menghalang berbilang gen ini secara serentak telah digunakan untuk melaksanakan tugas yang lebih kompleks, seperti mengurangkan perantaraan toksik atau menyekat laluan bersaing dalam penapaian bakteria (13,16-19). Walau bagaimanapun, penindasan sepenuhnya tidak selalu diingini untuk kejuruteraan metabolik. Tahap ekspresi gen harus dikawal dengan tepat untuk mencapai aktiviti enzim optimum antara laluan pertumbuhan dan pengeluaran, mengimbangi kepekatan prekursor intraselular dan mengelakkan pengumpulan perantara toksik (20-22). Pelbagai teknik telah dibangunkan untuk merekayasa kecekapan penindasan CRISPRi. Beberapa faktor telah dimanipulasi, seperti jumlah sgRNA dan protein dCas9 atau pilihan sgRNA. Mengawal ungkapan dCas9 atau kedua-dua ekspresi dCas9 dan sgRNA menggunakan ekspresi gen sasaran dikawal oleh promoter boleh didorong masing-masing lebih daripada 30-kali ganda atau 300-kali ganda (23,24). Walau bagaimanapun, telah diperhatikan bahawa memodulasi kepekatan dCas9 boleh membawa kepada kecekapan penindasan yang tidak konsisten pada protospacer yang berbeza (23). Bilangan terhad promoter boleh didorong yang tersedia juga membuat cabaran reka bentuk walaupun banyak usaha (25). Strategi lain ialah memasukkan aptamer RNA khusus ligan ke dalam sgRNA, di mana molekul serumpun kecil boleh mendedahkan spacer, dengan itu membolehkan kawalan CRISPRi yang bergantung kepada dos (26). SgRNA khusus ligan berguna jika pasangan ligan dan aptamer yang sesuai tersedia. Jarak dari tapak permulaan transkripsi dan orientasi pengikatan dCas9 juga mempengaruhi kecekapan CRISPRi (7). Melaraskan jarak antara tapak pengikatan sgRNA dan tapak permulaan transkripsi boleh mengoptimumkan laluan dalam kejuruteraan metabolik (17,27,28). Kecekapan penghibridan antara jujukan spacer dan protospacer juga mengubah kecekapan pengikatan kompleks RNP (29–31). Oleh itu, ketidakpadanan yang direka di luar kawasan benih untuk mengubah tenaga bebas telah diperkenalkan untuk mempelbagaikan kecekapan CRISPRi (31,32). Walau bagaimanapun, mereka bentuk sgRNA diperlukan untuk setiap jujukan sasaran baharu, dan mencapai perbezaan ketara dalam tenaga bebas melalui hanya ketidakpadanan boleh mencabar. Selain itu, terdapat kemungkinan peningkatan pengikatan luar sasaran (33). Walau bagaimanapun, ia masih terhad untuk menindas pelbagai ekspresi gen dengan tepat secara modular tanpa mengira urutan sasaran. Dalam kajian ini, kami membangunkan sistem CRISPRi boleh tala yang mengawal ekspresi gen dengan ketepatan tinggi dan kebolehramalan. Dengan pengisihan sel berasaskan pendarfluor berulang bagi perpustakaan sgRNA yang menyasarkan tetraloop dan kawasan mengapitnya, kami mencapai kecekapan penindasan transkrip sehingga 45-kali ganda walaupun DNA sasaran diubah. Sistem ini membolehkan pengagihan semula fluks metabolik yang boleh diramal tanpa memanipulasi genom perumah atau laluan sintetik, menyediakan alat yang menjanjikan untuk mengoptimumkan laluan metabolik.
BAHAN DAN KAEDAH
Strain bakteria, plasmid, dan reagen
Strain dan plasmid Escherichia coli yang digunakan dalam kajian ini disenaraikan dalam Jadual Tambahan S1. Primer yang digunakan dalam kajian ini disenaraikan dalam Jadual Tambahan S2. Prosedur pengklonan diterangkan dalam kaedah tambahan. Gen sasaran dan urutan DNA sasaran mereka untuk sistem CRISPR ditunjukkan dalam Jadual Tambahan S3. Mach1-T1R telah digunakan untuk pengklonan umum. Pustaka telah dibina menggunakan NEB 5-alpha Electrocompetent E. coli (NEB). Kultur rutin untuk membina plasmid dan strain dilakukan pada suhu 37◦C dalam sup Luria-Bertani (LB) atau pada plat agar LB yang mengandungi antibiotik yang sesuai (34 g/ml chloramphenicol, 50 g/ml spectinomycin). PCR dilakukan menggunakan Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Plasmid dan produk PCR telah disucikan menggunakan Kit SV Plasmid GeneAll® Exprep™ dan Kit SV Gel (GeneAll Biotechnology). Kecekapan penindasan mutan sgRNA Media kultur semalaman telah dimuat semula kepada OD600 daripada 0.05 dan diinkubasi sehingga mencapai nilai antara 0.6 dan 0.8. Media kultur kemudiannya dicairkan kepada OD600 sebanyak 0.05 dengan 20 ng/ml aTc dan diinkubasi selama 4 jam. Pendarfluor koloni tunggal diukur pada 575 nm/616 nm menggunakan pembaca plat mikro Hidex Sense (Hidex), dan nilai OD600 ditentukan menggunakan spektrofotometer Jenway 7300 (Jenway). Pendarfluor relatif dikira sebagai unit pendarfluor bagi setiap nilai OD600, dengan nilai untuk PC ditetapkan sebagai 100%.
Kesan Cistanche tubulosa-merawat sembelit
pemeriksaan perpustakaan sgRNA
Kaedah budaya yang sama seperti yang diterangkan di atas telah digunakan. Media kultur telah dicairkan kepada [sel]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.
Pengekstrakan RNA
Jumlah RNA diekstrak menggunakan RNeasy Mini Kit (Qiagen) hanya apabila miRNeasy Mini Kit (Qiagen) untuk kuantifikasi sgRNA, berikutan rawatan dengan RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) dan penyimpanan pada –80◦C. Pencernaan DNA pada lajur menggunakan Set DNase Bebas RNase (Qiagen) telah dijalankan semasa proses pengekstrakan. Pencemaran DNA telah disahkan melalui PCR tanpa transkripsi terbalik. Kepekatan dan ketulenan setiap sampel ditentukan menggunakan NanoDrop One (Thermo Scientific), dan kualiti dinilai menggunakan DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) pada LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer).
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Analisis RT-qPCR
Primer untuk RT-qPCR sama ada diperoleh daripada stok makmal atau direka menggunakan alat Primer3Plus (34) dan disenaraikan dalam Jadual Tambahan S4. Gen CysG digunakan sebagai gen rujukan (35) untuk semua eksperimen RT-qPCR. Lengkung standard dijana dengan 10-lipatan mencairkan templat daripada 107 salinan/ l kepada 10−1 salinan/ l. Had kuantifikasi ditentukan dengan memasang nombor salinan dan kadar penguatan positif kepada fungsi sigmoid dan mengira 95% nilai nombor salinan positif. Julat dinamik linear ditakrifkan sebagai nombor salinan terendah di mana variasi Cq yang dikira belakang adalah kurang daripada 35%. Nilai Cq melebihi 30 atau yang tidak dikuatkan dalam kawalan bukan templat telah disahkan. Data lengkung standard tersedia dalam Jadual Tambahan S5 dan Rajah Tambahan S1. Sebanyak 2.5 ng jumlah RNA telah digunakan dalam tindak balas 10 l RT-qPCR dengan Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB). RT-PCR dilakukan dalam tiga kali ganda pada Sistem PCR Masa Nyata StepOnePlus™ (Applied Biosystems) dengan langkah berikut: (i) transkripsi terbalik pada 55◦C selama 10 minit, diikuti dengan denaturasi pada 95◦C selama 1 minit; (ii) 40 kitaran haba pada 95◦C selama 10 saat dan 60◦C selama 1 minit; (iii) analisis lengkung cair pada 95◦C selama 15 s dan 60◦C selama 1 minit, diikuti dengan tanjakan dari 60◦C hingga 95◦C pada kadar kadar 0.3◦C/min. Kuantifikasi relatif RNA ditentukan menggunakan kaedah delta-deltaCt (36) dan dianalisis dengan StepOnePlus™ Software (Applied Biosystems).
RNA-sequencing (RNA-seq) dan analisis data
1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 berdasarkan FPKM (Fragmen Per Kilobase transkrip setiap Juta bacaan dipetakan). Gen yang dinyatakan secara berbeza diperolehi daripada ambang 1.5 (berasaskan log2-) dan 0.01 (nilai q).
Pengeluaran dan pensampelan proviolacein dan prodeoxyviolacein
Untuk penghasilan violacein dan prodeoxyviolacein, komposisi medium berikut telah digunakan: 10.7 g/l K2HPO4, 5.2 g/l KH2PO4,1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}}.2 g/l ekstrak yis dan 1{{20}} g/l glukosa. Media budaya semalaman telah dimuat semula kepada OD600 sebanyak 0.1 dan dikultur sehingga OD600 mencapai antara 0.6 dan 0.8. Media kultur kemudiannya dicairkan kepada OD600 sebanyak 0.1 dan ditambah dengan 500 ng/ml aTc, 0.05 mM IPTG, dan 0.1 g/l L-tryptophan kepada isipadu akhir 5 ml. 300 l media kultur telah disampel dan disentrifugasi pada 14 000 rpm selama 5 minit untuk mendapatkan pelet sel untuk analisis HPLC, dan 300 l media kultur telah disampel untuk pengekstrakan RNA.
Analisis HPLC
Untuk analisis laluan biosintetik violacein, pelet sel telah digantung semula dalam {{0}}volume metanol, disonikasi selama 5 minit, disentrifugasi dan ditapis melalui 0.22-m penapis nilon. Analisis HPLC mengikut kaedah (42) dengan Poroshell 120 EC-C18, 4.6 × 150 mm, lajur 4 m (Agilent). Dua fasa mudah alih, A dengan 0.1% asid formik dalam DDW dan B dengan 0.1% asid formik dalam asetonitril, digunakan pada kadar aliran 0.6 ml/min dengan profil kecerunan berikut: 95% A selama 1.5 minit, ramping A daripada 95 % hingga 2% selama 4 minit, mengekalkan 2% A selama 2 minit, meningkatkan A daripada 2% kepada 95% selama 30 saat, dan mengekalkan 95% A selama 10 minit. Sampel dikesan menggunakan pengesan PDA, dan kawasan HPLC ditentukan pada 600 nm untuk violacein dan 610 nm untuk prodeoxyviolacein.
Pengeluaran dan persampelan likopena
Untuk pengeluaran likopena, komposisi medium berikut digunakan: 13.56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1 g NaCl, 2 ml 1 M MgSO4, 0.1 ml 1 M CaCl2 dan 4 g/l glukosa (22). 27 g/ml kloramfenikol dan 50 g/ml spectinomycin telah digunakan. Media kultur semalaman telah dimuat semula kepada OD600 daripada 0.1 kepada volum akhir 5 ml. Apabila OD600 mencapai antara 0.5 dan 0.6, aTc telah ditambahkan pada kepekatan akhir 500 ng/ml dan apabila OD600 mencapai antara 0.9 dan 1, IPTG telah ditambah kepada kepekatan akhir 0.02 mM. Lycopene diekstrak menggunakan aseton, seperti yang diterangkan dalam rujukan (22). Kepekatan likopena diperoleh daripada penyerapan pada 475 nm menggunakan spektrofotometer Jenway 7300 menggunakan lengkung piawai. 300 l media kultur telah diambil sampel untuk pengekstrakan RNA.
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN
Kesan mutasi dalam sgRNA pada kecekapan penindasan sistem CRISPR
Sistem CRISPRi boleh menindas ekspresi gen apabila kompleks ternary dCas9-sgRNA-DNA mengikat dengan kuat. Kami membuat hipotesis bahawa kecekapan penindasan sistem CRISPRi boleh diubah ke tahap tertentu dengan memodulasi pembentukan kompleks RNP. Untuk mengukur kecekapan penindasan sistem CRISPR, kami mereka bentuk sistem pelaporan pendarfluor berdasarkan litar genetik di mana dCas9 daripada S. pyogenes diinduksi oleh anhydrotetracycline (aTc), dan kedua-dua gen reporter (mCherry) dan varian sgRNA dinyatakan secara konstitutif (Rajah 1A). Sebaik sahaja aTc ditambahkan ke dalam medium, kompleks terner dCas9-sgRNA- DNA menyekat transkripsi gen reporter, dan tahap pendarfluor secara songsang menunjukkan kecekapan penindasan sistem CRISPR. sgRNA mengandungi 96 nukleotida (nts) secara keseluruhan. Rantau spacer (20 nts pertama) mengikat urutan DNA sasaran, dan 76 nts yang lain menyumbang kepada pembentukan dan kestabilan kompleks. Memandangkan ketidakpadanan di rantau spacer mungkin kehilangan kekhususan dan meningkatkan kesan luar sasaran dalam sistem berasaskan CRISPR (33,43), panjang maksimum sgRNA yang boleh direkayasa ialah 76 nts. Dalam kes ini, saiz perpustakaan 476 (kira-kira 1045) harus diperoleh, tetapi ia terlalu besar untuk dibina. Oleh itu, ia diperlukan untuk mengecilkan saiz perpustakaan dengan menentukan kedudukan tertentu pada sgRNA. Kami mula-mula menyiasat bagaimana mutasi dalam sgRNA di setiap rantau mempengaruhi penindasan dalam sistem CRISPR. Kajian terdahulu melaporkan bahawa mutasi dalam gelung batang 1 (sg mut01 dan sg mut02) menyebabkan penurunan ketara dalam aktiviti nuklease Cas9, manakala mutasi dalam gelung batang 2 (sg mut03) atau gelung batang 3 (sg mut04) tidak menjejaskan aktivitinya (44). SgRNA yang dibina semula (sg mut05) yang mengandungi mutasi di rantau stem-gelung 1 dan kawasan ulangan, tetraloop, anti-ulang, dan stem-gelung 2 juga mengurangkan aktiviti nuklease (44). Walau bagaimanapun, dalam sistem CRISPRi, kesemua lima varian sgRNA mempunyai sedikit kesan ke atas kecekapan penindasan berbanding sgRNA jenis liar (sg WT), dengan setiap varian mempamerkan tahap pendarfluor 2-4% berbanding kawalan positif tanpa kawasan spacer ( sg PC) (Rajah 1B). Keputusan ini menunjukkan bahawa pembentukan kompleks dCas9-sgRNA kurang sensitif terhadap pengubahsuaian jujukan dalam rantau gelung batang 1 dalam sistem CRISPRi, berbeza dengan sistem CRISPR/Cas9. Kami membuat hipotesis bahawa mengalih keluar kawasan yang berkaitan dengan kestabilan kompleks boleh menjadi titik permulaan untuk mengawal ekspresi pada pelbagai peringkat lebih jauh. Untuk tujuan ini, kami membina sgRNA terpenggal (sg trcSL1) yang tidak mempunyai penghubung, gelung batang 2 dan gelung batang 3. sgRNA terpenggal ini mempunyai bilangan komponen yang minimum dan telah ditunjukkan dapat mengurangkan aktiviti nuklease dengan ketara dalam CRISPR/ Sistem Cas9 (5,44). Apabila diuji dalam sistem CRISPRi, mutan yang rosak ini menunjukkan tahap pendarfluor 8% berbanding sg PC, menunjukkan bahawa ia masih boleh mengikat dCas9 dan menindas gen yang diminati pada tahap tertentu walaupun dengan penurunan kestabilan kompleks ternary (Rajah 1B). Analisis struktur kompleks RNP menunjukkan bahawa kawasan penghubung, gelung batang 2, dan gelung batang 3 sgRNA bertanggungjawab untuk menstabilkan kompleks melalui interaksi mereka dengan domain nuklease dCas9, yang membawa kepada penurunan ketara dalam indel. kecekapan dalam sistem CRISPR/Cas9 (44). Sebaliknya, ulangan: kawasan anti ulangan dan gelung batang 1 sgRNA terutamanya berinteraksi dengan domain pengecaman dan domain berinteraksi PAM dCas9 dan tidak menjejaskan kecekapan indel dalam sistem CRISPR/Cas9 (44). Keputusan ini menyokong pemerhatian bahawa sg trcSL1 mempamerkan pengurangan ketara dalam aktiviti nuklease dalam sistem CRISPR/Cas9 manakala hanya sedikit mempengaruhi pertalian pengikatan dalam sistem CRISPRi.
Rajah 1. Pembinaan sistem dan kesan ke atas kecekapan penindasan oleh mutasi sgRNA. (A) Dua sistem plasmid untuk kuantifikasi kecekapan penindasan. Satu plasmid dengan asal p15A mengandungi gen dCas9 di bawah promoter aTc-inducible dan gen mCherry di bawah promoter konstitutif. Plasmid lain dengan asal cloDF13 mengandungi sgRNA jenis liar atau mutan di bawah promoter konstitutif. (B) Pendarfluor relatif setiap mutan sgRNA (sg mut01 ~ sg mut05 dan sg trcSL1) dan sg WT berbanding dengan sg PC. +1 hingga + 20 ialah jujukan spacer yang mengikat gen mCherry. sg PC: sgRNA tanpa spacer sebagai kawalan positif, sg WT: sgRNA jenis liar. Bar ralat menunjukkan sisihan piawai (n=3). Nilai-P ditentukan oleh ujian-t tidak berpasangan. ns: tidak penting, **P< 0.01
Mengubah kecekapan pembentukan kompleks untuk kawalan ekspresi pelbagai peringkat
Tetraloop ialah penyambung buatan yang menghubungkan crRNA dan tracrRNA dalam sistem CRISPR-Cas9 (5). Struktur kristal kompleks ternary, yang terdiri daripada dCas9, crRNA, dan tracrRNA, telah menunjukkan bahawa tetraloop dan kawasan mengapit 5 dan 3 mempunyai sedikit sentuhan dengan dCas9 (44). Pada masa yang sama, kawasan ulang:anti-ulang dan gelung batang 1 adalah kritikal untuk kompleks berfungsi (44). Oleh kerana ia tidak berinteraksi secara langsung dengan dCas9, tetraloop, dan kawasan mengapitnya telah diterokai sebagai tapak berpotensi untuk sgRNA kejuruteraan dengan komponen tambahan, seperti menggabungkan urutan aptamer untuk merekrut protein tambahan kepada sgRNA (45, 46). Adalah munasabah bahawa mutasi di rantau ini boleh mempelbagaikan pertalian mengikat antara sgRNA dan dCas9 tanpa mengganggu sepenuhnya kompleks. Satu 12- pustaka rawak mer (masing-masing 4 nt rantau tetraloop dan 4 nt daripada 5 dan 3 kawasan mengapit) telah dibina menggunakan sg trcSL1 sebagai templat untuk mengurangkan lagi kecekapan pembentukan kompleks antara sgRNA dan dCas9 (Rajah 2A ). Kami menggunakan strategi pengisihan dua langkah untuk mendapatkan pelbagai mutan sgRNA yang meliputi kecekapan penindasan antara sg WT (keadaan penindasan sepenuhnya) dan sg PC (keadaan tidak penindasan). Kami membahagikan perpustakaan asal kepada perpustakaan yang lebih kecil dengan julat keamatan pendarfluor yang berbeza, dan kemudian secara individu mengenal pasti pendarfluor setiap varian sgRNA daripada perpustakaan yang lebih kecil. Taburan pendarfluor perpustakaan asal yang diperolehi oleh sitometri aliran adalah hampir sama dengan sg PC (Rajah 2B). Walau bagaimanapun, selepas tiga langkah pengisihan berturut-turut, setiap perpustakaan (tinggi, pertengahan dan rendah) masing-masing mempunyai 63%, 24%, dan 14% tahap pendarfluor median berbanding sg PC (Rajah 2B). Lapan puluh dua koloni telah diasingkan daripada perpustakaan yang lebih kecil ini, dengan tahap pendarfluor antara 8% hingga 104% (Rajah 2C). Keputusan ini menunjukkan bahawa tetraloop yang bermutasi dan kawasan mengapitnya sgRNA boleh memodulasi pertalian mengikat antara dCas9 dan sgRNA untuk pelbagai kecekapan penindasan. Analisis PCR (RT-qPCR) kuantitatif transkripsi terbalik bagi 10 mutan sgRNA (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10, Jadual Tambahan S6) dengan pelbagai isyarat pendarfluor antara sg WT dan sg PC antara 82 koloni sgRNA menunjukkan bahawa tahap pendarfluor mCherry meningkat secara linear dengan peningkatan transkripsi secara linear. , menunjukkan bahawa sistem CRISPRi kami mengawal ekspresi gen pada tahap transkrip (Tambahan Rajah S2). Sistem CRISPRi yang boleh dilaras kami menggunakan sgRNA yang direka bentuk, yang boleh mencapai kawalan penindasan sehingga 45-lipat ganda, membolehkan penalaan halus kecekapan penindasan tanpa mengubah jumlah dCas9 atau sgRNA. Kelebihan ketara sistem kami ialah ia boleh memperhalusi kecekapan penindasan melalui varian sgRNA tertentu tanpa potensi akibat yang tidak diingini, walaupun pengklonan tambahan diperlukan. Selain itu, keluk pertumbuhan mencadangkan sistem kami tidak mengenakan beban selular yang ketara (Tambahan Rajah S3). Tambahan pula, RNA-Seq pada tiga varian sg trcSL1 dengan pelbagai tahap kecekapan penindasan menunjukkan bahawa ungkapan 51 hingga 83 gen telah diubah, berbeza dengan 262 gen yang diubah dalam sg WT (Tambahan Rajah S4). Keputusan ini menunjukkan bahawa varian sg trcSL1 mempunyai kesan luar sasaran yang lebih rendah daripada sistem CRISPRi konvensional. Ia amat relevan dalam aplikasi kejuruteraan metabolik, di mana mengoptimumkan laluan metabolik sering melibatkan manipulasi pelbagai gen. Keupayaan untuk memperhalusi ekspresi gen tanpa menyebabkan kesan sampingan negatif boleh mempercepatkan proses pengoptimuman dengan ketara dan meningkatkan kecekapan dan produktiviti keseluruhan sistem.
Rajah 2. Struktur perpustakaan sgRNA dan saringan perpustakaan. (A) perancah sgRNA yang digunakan dalam kajian ini. 12-mer yang mengandungi tetraloop dan jujukan mengapitnya dimutasi secara rawak daripada sg trcSL1 untuk mendapatkan pustaka sgRNA. (B) Taburan pendarfluor yang diperoleh daripada sitometri aliran sebelum (kiri) dan selepas (kanan) pengisihan. Setiap pengedaran mengandungi 100,000 sel. (C) Pendarfluor koloni tunggal yang diperoleh daripada (B). Bar ralat menunjukkan sisihan piawai (n=2).
Kesan kuantiti dCas9 dan sgRNA pada kecekapan penindasan
Oleh kerana memodulasi jumlah sama ada dCas9 atau sgRNA boleh mengubah kecekapan penindasan sistem CRISPRi (23,24), adalah penting untuk mengkaji kesan kuantiti dCas9 dan sgRNA terhadap kecekapan penindasan. Kami menguji prestasi sistem kami di bawah keadaan yang berbeza dengan menukar jumlah dCas9 dan sgRNA menggunakan sepuluh mutan sgRNA (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10). Tiga kepekatan berbeza (20, 100, dan 500 ng/ml) induktor digunakan untuk ekspresi dCas9. Berbanding dengan paras mRNA dCas9 apabila 20 ng/ml inducer digunakan, ia ditingkatkan lagi sebanyak 15-kali ganda (100 ng/ml) dan 22-kali ganda (500 ng/ml) (Tambahan Rajah S5A ). Terdapat kebimbangan tentang mengekspresikan dCas9 secara berlebihan kerana tahap dCas9 yang tinggi boleh menjadi toksik kepada sel (47,48) atau kadangkala tidak (49). Walau bagaimanapun, kadar pertumbuhan dikurangkan kurang daripada 10% apabila sehingga 500 ng/ml aTc digunakan, mengikut lengkung pertumbuhan pada pelbagai kepekatan induser (Tambahan Rajah S6). Ini menunjukkan bahawa jumlah dCas9 tidak mempunyai kesan toksik pada E. coli di bawah keadaan yang diuji. Kecekapan penindasan berubah sedikit apabila jumlah dCas9 yang berbeza dinyatakan (Rajah 3A). Ia konsisten dengan kajian terdahulu bahawa sistem CRISPRi mencapai kecekapan penindasan maksimum pada [aTc]< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.
Rajah 3. Pencirian dan modulariti sistem CRISPRi boleh tala. (A) Pendarfluor relatif di bawah kepekatan aTc yang berbeza (20, 100, dan 500 ng/ml). (B) Pendarfluor relatif di bawah promoter yang berbeza (J23100 dan UPJ23119). (C) Pendarfluor relatif di bawah protospacers berbeza. Paksi-x menunjukkan pendarfluor relatif mCherry, dan paksi-y menunjukkan pendarfluor relatif lacI33-mCherry (merah) dan araC33-mCherry (biru). 33 bp jujukan tambahan daripada lacI dan araC telah ditambahkan pada 5-hujung mCherry (56). (D) Tenaga bebas 12-mer dan pendarfluor relatif. Garis putus-putus menunjukkan selang ramalan 95% dan garis pepejal menunjukkan garis regresi. Nilai dG sg trcSL1c2 tidak dapat diperoleh menggunakan mFold dan dengan itu dikecualikan daripada analisis. (A–D) Semua bar ralat menunjukkan sisihan piawai (n=3).
Kemodulatan sistem CRISPRi boleh dilaras
Pendekatan kami menggunakan varian sgRNA khusus untuk mengekalkan tahap ekspresi tertentu untuk DNA sasaran mempunyai potensi untuk digunakan sebagai sistem modular. Untuk menunjukkan kebolehlaksanaan sistem CRISPRi boleh tala untuk menyasarkan protospacer yang berbeza, kami membina dua gen gabungan (lacI{{0}}mCherry dan araC33-mCherry) dengan menambahkan 33 bps jujukan daripada lacI dan araC ke hujung 5 -mCherry (56). Genom E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) mengandungi dua salinan jujukan protospacer untuk lacI33- mCherry dan satu salinan untuk araC33-mCherry. Walau bagaimanapun, jujukan kromosom ini tidak mempunyai jujukan PAM dan, oleh itu, tidak boleh disasarkan oleh kompleks dCas9-sgRNA (43). Apabila siRNA direka bentuk untuk menyasarkan setiap protospacer, kecekapan penindasan dikekalkan secara konsisten untuk semua protospacer daripada lacI33, araC33, dan mCherry (Rajah 3C). Penemuan ini mencadangkan bahawa sistem CRISPRi yang boleh disesuaikan kami boleh mengawal ekspresi gen secara berkesan pada tahap tertentu tanpa mengira jujukan protospacer. Satu penjelasan yang berpotensi untuk hubungan yang diperhatikan antara pembentukan kompleks RNP dan kecekapan penindasan ialah perubahan dalam tenaga bebas apabila kompleks itu terbentuk. Penghubung tetraloop tiruan dan kawasan mengapitnya mengandungi dua pasangan asas A: U dan G: C Watson-Crick dan pasangan asas A: G bukan Watson–Crick (44). Oleh kerana pengikatan crRNA dan tracrRNA adalah penting untuk pembentukan kompleks, mutasi yang menyasarkan tetraloop akan menjejaskan pertalian pengikatan antara dCas9 dan sgRNA. Perkaitan ini boleh dikira daripada perbezaan tenaga bebas antara keadaan bersempadan dan tidak bersempadan. Walau bagaimanapun, pengiraan tenaga bebas bagi keadaan sempadan adalah mencabar (57). Kami mengandaikan bahawa struktur dan kestabilan keseluruhan keadaan sempadan tidak berubah kerana sgRNA yang disusun daripada perpustakaan tidak sepenuhnya mengganggu fungsinya. Selain itu, tetraloop dan kawasan mengapitnya mempunyai sedikit hubungan dengan dCas9 (44). Oleh itu, pertalian pengikatan antara dCas9 dan sgRNA akan dipengaruhi terutamanya oleh kestabilan struktur sekunder tetraloop dan jujukan mengapitnya. Berdasarkan idea ini, kami mengira tenaga bebas tetraloop dan jujukan mengapitnya menggunakan acuan (58). Perbezaan tenaga bebas lipatan akibat mutasi ditakrifkan sebagai perbezaan antara tenaga bebas jujukan jenis bermutasi dan liar. Ia boleh dikira secara langsung daripada tenaga bebas lipatan mutan kerana tenaga lipatan jujukan jenis liar adalah malar pada –4.3 kcal/mol. Apabila tenaga bebas lipatan meningkat, isyarat pendarfluor meningkat (Rajah 3D). Kecekapan penindasan adalah tertinggi apabila tenaga lipatan kawasan yang mengandungi tetraloop adalah hampir atau di bawah 0 kcal/mol dan menurun secara linear apabila tenaga lipatan melebihi 0 kcal/mol. Pemerhatian ini menunjukkan bahawa kecekapan pembentukan kompleks antara dCas9 dan sgRNA ditentukan oleh struktur sekunder rantau tetraloop, yang membantu menjelaskan modulariti sistem kami. Kecekapan penindasan 85 sgRNA tambahan dengan jujukan 12-mer berbeza daripada pustaka telah diukur untuk mengesahkan lagi hubungan ini. Ia juga menunjukkan korelasi yang diperhatikan daripada varian sg trcSL1 (Rajah 3D dan Jadual Tambahan S7), menunjukkan bahawa penghubung tetraloop memainkan peranan penting dalam membentuk kompleks RNP dan mutasi di rantau ini boleh memberi kesan kepada kecekapan sistem CRISPR. Di samping itu, hubungan ini menunjukkan kemungkinan reka bentuk berasaskan komputer bagi varian sgRNA dengan kecekapan penindasan yang dikehendaki.
Menggunakan sistem CRISPRi yang boleh disesuaikan untuk pengagihan semula fluks dalam laluan biosintetik violacein dalam E. coli
Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-lipatan) berbanding dengan gen lain apabila dikira daripada lengkung piawai. Sebaliknya, ekspresi enzim tidak terkawal lain dalam laluan violacein (vioA, vioB, dan vioE) kekal tidak berubah. Keputusan ini menunjukkan bahawa sistem kami secara khusus boleh menyasarkan dan memodulasi ekspresi gen individu tanpa menjejaskan gen lain dalam laluan. Kuantifikasi langsung PV dan PDV tidak dapat dilakukan kerana kekurangan piawaian yang tersedia secara komersial untuk analisis HPLC. Oleh itu, kami mengukur titer dalam unit sewenang-wenang menggunakan kawasan puncak HPLC. Titer produk mencapai maksimum pada 8 jam selepas induksi dan kemudian secara beransur-ansur menurun (Tambahan Rajah S8), mungkin disebabkan oleh penukaran produk kepada produk sampingan lain, seperti chromoviridans, oleh mekanisme yang tidak diketahui (42, 64). Puncak kecil yang diperhatikan pada spektrum HPLC menunjukkan kehadiran produk sampingan kecil tambahan. Penyelidikan terdahulu telah menunjukkan bahawa logaritma titer setiap produk dalam unit sewenang-wenangnya boleh diramalkan oleh kombinasi linear kekuatan promoter setiap gen yang terlibat dalam laluan biosintetik violacein (42). Model regresi log-linear ini juga sah dalam sistem kami, dan peningkatan transkrip vioD dikaitkan dengan peningkatan pengeluaran PV (Rajah 4B). Adalah diketahui bahawa kejuruteraan penganjur atau 5 -UTR bagi setiap gen yang terlibat dalam laluan biosintetik violacein membolehkan pengagihan semula fluks dan pengoptimuman laluan (65,66). Sistem kami boleh berfungsi sebagai kaedah alternatif yang menggambarkan kawalan transkripsi tanpa memanipulasi promoter yang terlibat dalam laluan menggunakan sgRNA sintetik, yang pendek dan boleh dipasang dengan kaedah satu langkah. Penyaringan melalui sistem CRISPRi boleh laras memungkinkan untuk mengubah hala laluan dengan fluks yang boleh diramalkan sebelum memanipulasi terus strain perumah atau kaset gen, yang berpotensi mempercepatkan proses.
Menggunakan sistem CRISPRi yang boleh dilaras untuk mengimbangi fluks karbon dalam E. coli penghasil likopena
Pengeluaran sebatian berharga yang cekap dalam kejuruteraan metabolik memerlukan keseimbangan fluks karbon. Laluan methylerythritol 4-fosfat (MEP) ialah laluan metabolik yang menggunakan prekursor ringkas seperti piruvat dan gliseraldehid 3-fosfat (GAP) untuk menghasilkan blok binaan isoprenoid, dimethylallyl pyrophosphate dan isopentenyl pyrophosphate (67,68) . Molekul-molekul ini mensintesis geranil pirofosfat, yang ditukar kepada farnesyl pyrophosphate (FPP) (67,68). Lycopene, karotenoid bernilai tinggi dengan sifat antioksidan yang kuat dan aplikasi yang pelbagai dalam pelbagai industri (69), disintesis daripada FPP melalui satu siri tindak balas enzim daripada crtE, crtB, dan crtI (Rajah 4C) (22,70). Prekursor GAP adalah penting bukan sahaja untuk laluan MEP tetapi juga untuk laluan glikolisis (22). Ekspresi gen gapA yang berkurangan, yang mengekodkan gliseraldehid{11}}fosfat dehidrogenase (GAPDH) dalam laluan glikolisis, telah ditunjukkan dapat meningkatkan pengeluaran likopena dengan meningkatkan kumpulan GAP (22). Oleh itu, kami menyasarkan gapA dengan lima varian, termasuk tiga varian sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 dan sg trcSL1c6) yang menunjukkan pelbagai kecekapan penindasan, sg PC dan sg WT. Walau bagaimanapun, gapA adalah gen penting yang tidak boleh dirobohkan sepenuhnya (71,72). Percubaan untuk menindas gapA dengan CRISPRi konvensional menggunakan sg WT tidak berjaya walaupun dengan kebocoran rendah dcas9 di bawah promoter tet (73). Sebaliknya, penindasan berbilang peringkat ekspresi gen gapA menggunakan sistem CRISPRi yang boleh dilaras telah dicapai tanpa kecacatan pertumbuhan dan menghasilkan peningkatan 2.7-kali ganda dengan sg trcSL1c6 dalam pengeluaran likopena berbanding dengan gen gapA yang mengekspresikan sepenuhnya. selepas 15 jam penanaman (Rajah 4D dan Rajah Tambahan S9). Telah dilaporkan bahawa hanya 10% daripada ekspresi semula jadi gen gapA membawa kepada peningkatan kumpulan GAP tanpa perubahan ketara dalam metabolit hiliran dalam laluan glikolisis, seperti 2-fosfogliserat dan 3-fosfogliserat ( 22). Secara kolektif, keputusan ini menunjukkan bahawa CRISPRi yang boleh disesuaikan dengan tepat boleh menindas ekspresi gen pada pelbagai peringkat tanpa kejuruteraan kromosom.
Rajah 4. Aplikasi sistem CRISPRi boleh tala untuk laluan biosintetik violacein. (A) Laluan biosintetik Violacein dan pembinaan plasmid. Lima gen (vioA, vioB, vioC, vioD dan vioE) yang bertanggungjawab untuk menghasilkan violacein telah diklonkan ke dalam dCas9-mengekspresikan plasmid. Empat produk utama (violacein, proviolacein, deoxyviolacein, dan prodeoxyviolacein) dihasilkan. sg WT untuk vioC dan lima varian sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 dan sg trcSL1c9) untuk vioD, menunjukkan kecekapan penindasan yang berbeza, telah diklonkan ke dalam plasmid lain. Trp: L-tryptophan, V: violacein, PV: proviolacein, PDV: prodeoxyviolacein, DV: deoxyviolacein, PDVA: asid protodeoxyviolaceinic, PVA: asid protoviolaceinic. (B) Hubungan antara transkrip vioD, pendarfluor mCherry, dan titer PDV dan PV. Paksi-x menunjukkan RNA vioD relatif yang diperoleh daripada RT-qPCR, paksi-y di sebelah kiri menunjukkan pendarfluor mCherry relatif dari Rajah 3, dan paksi-y di sebelah kanan menunjukkan nisbah kawasan HPLC. Sampel dengan nilai RNA vioD tertinggi ditetapkan kepada 100% untuk normalisasi. (C) Laluan biosintetik likopena dan pembinaan plasmid. Tiga gen (crtE, crtB, crtI) yang bertanggungjawab untuk menghasilkan likopena telah diklonkan ke dalam dCas9-mengekspresikan plasmid. gapA disasarkan dengan varian sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) dan sg PC telah diklon ke dalam plasmid lain. Glc: Glukosa, GAP: glyceraldehyde 3-phosphate, 1,3-BPG: 1,3-biphosphoglycerate, DMAPP: dimethylallyl pyrophosphate, IPP: isopentenyl pyrophosphate, FPP: farnesyl pyrophosphate. (D) Hubungan antara transkrip gapA, pendarfluor mCherry, dan pengeluaran likopena. Paksi-x menunjukkan RNA jurang relatif yang diperoleh daripada RT-qPCR, paksi-y di sebelah kiri menunjukkan pendarfluor mCherry relatif dari Rajah 3, dan paksi-y di sebelah kanan menunjukkan titer likopena. (B, D) Semua bar ralat menunjukkan sisihan piawai (n=3).
KESIMPULAN
Kami mereka bentuk sistem CRISPRi boleh tala yang boleh mengawal ekspresi gen pada tahap yang dikehendaki dengan tepat. Dengan mengubah tetraloop dan kawasan mengapitnya, sgRNA sintetik yang menyasarkan pelbagai jujukan protospacer boleh mengawal gen pada tahap tertentu. Kami berjaya menggunakan sistem ini untuk mengalihkan fluks metabolik yang diminati dalam laluan biosintetik violacein untuk menghasilkan derivatif indole dalam nisbah yang boleh diramal. Selain itu, kami telah menunjukkan bahawa penggunaan CRISPRi boleh dilaras membawa kepada peningkatan 2.7-kali ganda dalam pengeluaran likopena, menyerlahkan kepelbagaian sistem kami untuk meningkatkan pengeluaran sebatian berharga yang lain. Sistem ini akan mempercepatkan proses pengoptimuman fluks sebelum memanipulasi maklumat genetik hos secara kekal, seperti menggantikan promoter atau 5-jujukan UTR.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
RUJUKAN
1. Sapranauskas,R., Gasiunas,G., Fremaux,C., Barrangou,R., Horvath,P. dan Siksnys, V. (2011) Sistem Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas memberikan imuniti dalam Escherichia coli. Asid Nukleik Res., 39, 9275–9282.
2. Gasiunas,G., Barrangou,R., Horvath,P. dan Siksnys, V. (2012) Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mengantara belahan DNA khusus untuk imuniti adaptif dalam bakteria. Proc. Natl. Acad. Sci. AS, 109, E2579–E2586.
3. Cong, L., Ran,FA, Cox, D., Lin,S., Barretto, R., Habib,N., Hsu, PD, Wu,X., Jiang, W., Marraffini, LA et al . (2013) Kejuruteraan genom berganda menggunakan sistem CRISPR/Cas. Sains, 339, 819–823.
4. Ran, FA, Hsu,PD, Wright,J., Agarwala,V., Scott,DA dan Zhang,F. (2013) Kejuruteraan genom menggunakan sistem CRISPR-Cas9. Nat. Protoc., 8, 2281–2308.
5. Jinek,M., Chylinski,K., Fonfara,I., Hauer,M., Doudna,JA dan Charpentier,E. (2012) Endonuklease DNA berpandukan dwi-RNA yang boleh diprogramkan dalam imuniti bakteria adaptif. Sains, 337, 816–821.
6. Anders,C., Niewoehner,O., Duerst,A. dan Jinek,M. (2014) Asas struktur pengecaman DNA sasaran yang bergantung kepada PAM oleh endonuclease Cas9. Alam, 513, 569–573.
7. Qi,LS, Larson, MH, Gilbert,LA, Doudna,JA, Weissman,JS, Arkin,AP and Lim,WA (2013) Mengguna semula CRISPR sebagai platform berpandukan RNA untuk kawalan ekspresi gen khusus jujukan. Sel, 152, 1173–1183.
8. Larson,MH, Gilbert,LA, Wang,X., Lim,WA, Weissman,JS and Qi,LS (2013) Gangguan CRISPR (CRISPRi) untuk kawalan khusus jujukan ekspresi gen. Nat. Protoc., 8, 2180–2196.
9. McGlincy,NJ, Meacham,ZA, Reynaud,KK, Muller,R., Baum,R. dan Ingolia,NT (2021) Pustaka panduan gangguan CRISPR skala genom membolehkan pemprofilan fenotip yang komprehensif dalam yis. BMC Genomics, 22, 205.
10. Yoon,J. dan Woo,HM (2018) Kejuruteraan metabolik pengantara gangguan CRISPR Corynebacterium glutamicum untuk pengeluaran homo-butyrate. Bioteknol. Bioeng., 115, 2067–2074.
11. Cleto,S., Jensen,JV, Wendisch,VF and Lu,TK (2016) Kejuruteraan metabolik Corynebacterium glutamicum dengan gangguan CRISPR (CRISPRi). ACS Synth. Biol., 5, 375–385.
12. Zhang,GQ, Ren,XN, Liang,XH, Wang,YQ, Feng,DX, Zhang,YJ, Xian,M. dan Zou,HB (2021) Meningkatkan penghasilan mikrob asid amino: daripada pendekatan konvensional kepada trend terkini. Bioteknol. Bioproc. E, 26, 708–727.
13. Kim,SK, Seong,W., Han,GH, Lee,DH and Lee,SG (2017) Penindasan multipleks dipandu gangguan CRISPR terhadap gen laluan bersaing endogen untuk mengalihkan fluks metabolik dalam Escherichia coli. Mikrob. Fakta Sel., 16, 188.
14. Ellis,NA, Kim,B., Tung,J. dan Machner,MP (2021) Alat gangguan CRISPR multipleks untuk soal siasat gen virulensi dalam Legionella pneumophila. Commun. Biol., 4, 157.
15. Siu,KH dan Chen,W. (2019) gRNA berpagar kaki terkawal selia untuk fungsi CRISPR-Cas9 yang boleh diprogramkan. Nat. Kimia. Biol., 15, 217–220.
16. Reis,AC, Halper,SM, Vezeau,GE, Cetnar,DP, Hossain,A., Clauer,PR and Salis,HM (2019) Penindasan serentak berbilang gen bakteria menggunakan tatasusunan sgRNA lebih panjang yang tidak berulang. Nat. Bioteknol., 37, 1294–1301.
17. Tian,T., Kang,JW, Kang,A. dan Lee, TS (2019) Mengubah hala fluks metabolik melalui multipleks gabungan CRISPRi-pengantara penindasan untuk pengeluaran isopentenol dalam Escherichia coli. ACS Synth. Biol., 8, 391–402.
18. Gauttam,R., Seibold,GM, Mueller,P., Weil,T., Weiss,T., Handrick,R. dan Eikmanns,BJ (2019) Sistem gangguan CRISPR dwi-induksi mudah untuk penyasaran gen berbilang dalam Corynebacterium glutamicum. Plasmid, 103, 25–35.
19. Yao,L., Cengic,I., Anfelt,J. dan Hudson, EP (2016) Penindasan gen berbilang dalam cyanobacteria menggunakan CRISPRi. Acs Synth. Biol., 5, 207–212.
20. Lim,HG, Noh,MH, Jeong,JH, Park,S. dan Jung,GY (2016) Pengimbangan semula optimum 3-laluan pengeluaran asid hidroksipropionik daripada gliserol dalam Escherichia coli. ACS Synth. Biol., 5, 1247–1255.
21. Yang,Y., Lin,Y., Li,L., Linhardt,RJ dan Yan,Y. (2015) Mengawal metabolisme malonyl-CoA melalui RNA antisens sintetik untuk biosintesis produk semula jadi yang dipertingkatkan. Metab. Eng., 29, 217–226.
22. Jung,J., Lim,JH, Kim,SY, Im,DK, Seok,JY, Lee,SV, Oh,MK and Jung,GY (2016) Pengimbangan semula prekursor yang tepat untuk pengeluaran isoprenoid dengan kawalan halus ekspresi gapA dalam Escherichia coli. Metab. Eng., 38, 401–408.
23. Li,XT, Jun,Y., Erickstad,MJ, Brown,SD, Parks,A., Court,DL dan Jun,S. (2016) tCRISPRi: boleh dilaras dan boleh diterbalikkan, kawalan satu langkah ekspresi gen. Sci. Rep., 6, 39076.
24. Fontana,J., Dong,C., Ham,JY, Zalatan,JG and Carothers,JM (2018) Ekspresi terkawal lagu sgRNA CRISPRi dalam E. coli. Bioteknol. J., 13, e1800069.
25. Kim,NM, Sinnott,RW and Sandoval,NR (2020) Biosensor berasaskan faktor transkripsi dan sistem boleh teraruh dalam bakteria bukan model: kemajuan semasa dan arah masa hadapan. Curr. Pendapat. Bioteknol., 64, 39–46.
26. Kundert,K., Lucas,JE, Watters,KE, Fellmann,C., Ng,AH, Heineike,BM, Fitzsimmons,CM, Oakes,BL, Qu,J., Prasad,N. et al. (2019) Mengawal CRISPR-Cas9 dengan sgRNA yang diaktifkan ligan dan dinyahaktifkan ligan. Nat. Komuniti, 10, 2127.
27. Ferreira,R., Skrekas,C., Hedin,A., Sanchez,BJ, Siewers,V., Nielsen,J. dan David, F. (2019) Penalaan halus berbantukan model metabolisme karbon pusat dalam yis melalui peraturan9-dCas. ACS Synth. Biol., 8, 2457–2463.
28. Su,T., Guo,Q., Zheng,Y., Liang,Q., Wang,Q. dan Qi,Q. (2019) Penalaan halus hemB menggunakan CRISPRi untuk meningkatkan 5-pengeluaran asid aminolevulinik dalam Escherichia coli. Depan. Mikrobiol., 10, 1731.
29. Zheng,T., Hou,Y., Zhang,P., Zhang,Z., Xu,Y., Zhang,L., Niu,L., Yang,Y., Liang,D., Yi,F . et al. (2017) Pemprofilan kekhususan RNA panduan tunggal mendedahkan jujukan teras sensitif yang tidak sepadan. Sci. Rep., 7, 40638.
30. Jiang,W., Bikard,D., Cox,D., Zhang,F. dan Marraffini, LA (2013) pengeditan genom bakteria berpandukan RNA menggunakan sistem CRISPR-Cas. Nat. Bioteknol.,
31, 233–239. 31. van Gestel,J., Hawkins,JS, Todor,H. dan Gross,CA (2021) Saluran paip pengiraan untuk mereka bentuk RNA panduan untuk ketidakpadanan-CRISPRi. STAR Protoc, 2, 100521.
32. Hawkins,JS, Silvis,MR, Koo,BM, Peters,JM, Osadnik,H., Jost,M., Hearne,CC, Weissman,JS, Todor,H. dan Gross,CA (2020) Mismatch-CRISPRi mendedahkan hubungan ekspresi-kecergasan yang berbeza-beza bagi gen penting dalam Escherichia coli dan Bacillus subtilis. Sistem Sel., 11, 523–535.
33. Fortin,J.-P., Tan,J., Gascoigne,KE, Haverty,PM, Forrest,WF, Costa,MR and Martin,SE (2019) Penyasaran berbilang gen dan toleransi ketidakpadanan boleh mengelirukan analisis genom- skrin CRISPR terkumpul lebar. Genome Biol., 20, 21.
34. Rozen,S. dan Skaletsky, H. (2000) Primer3 di WWW untuk pengguna umum dan untuk pengaturcara biologi. Kaedah Mol. Biol., 132, 365–386.
35. Zhou,K., Zhou,L., Lim,Q., Zou,R., Stephanopoulos,G. dan Too,HP (2011) Gen rujukan novel untuk mengukur tindak balas transkrip Escherichia coli kepada ekspresi berlebihan protein oleh PCR kuantitatif. BMC Mol. Biol., 12, 18.
36. Livak,KJ and Schmittgen,TD (2001) Analisis data ekspresi gen relatif menggunakan PCR kuantitatif masa nyata dan Kaedah 2(-Delta Delta C(T)). Kaedah, 25, 402–408.
37. Andrews,S. (2010) FastQC: Alat Kawalan Kualiti untuk Data Jujukan Throughput Tinggi. v0.11.9 ed.
38. Langmead,B., Trapnell,C., Pop,M. dan Salzberg,SL (2009) Penjajaran jujukan DNA pendek yang sangat pantas dan cekap ingatan kepada genom manusia. Genome Biol., 10, R25.
39. Danecek,P., Bonfield,JK, Liddle,J., Marshall,J., Ohan,V., Pollard,MO, Whitwham,A., Keane,T., McCarthy,SA, Davies,RM et al. (2021) Dua belas tahun SAMtools dan BCFtools. Gigascience, 10, giab008.
40. Trapnell,C., Williams,BA, Pertea,G., Mortazavi,A., Kwan,G., van Baren,MJ, Salzberg,SL, Wold,BJ dan Pachter,L. (2010) Perhimpunan transkrip dan kuantifikasi oleh RNA-Seq mendedahkan transkrip tanpa nota dan penukaran isoform semasa pembezaan sel. Nat. Bioteknol., 28, 511–515.
41. Trapnell,C., Hendrickson,DG, Sauvageau,M., Goff,L., Rinn,JL dan Pachter,L. (2013) Analisis pembezaan peraturan gen pada resolusi transkrip dengan RNA-seq. Nat. Bioteknol., 31, 46–53.
42. Lee,ME, Aswani,A., Han,AS, Tomlin,CJ and Dueber,JE (2013) Pengoptimuman peringkat ekspresi laluan berbilang enzim tanpa ketiadaan ujian throughput tinggi. Asid Nukleik Res., 41, 10668–10678.
43. Hsu,PD, Scott,DA, Weinstein,JA, Ran,FA, Konermann,S., Agarwala,V., Li,Y., Fine,EJ, Wu,X., Shalem,O. et al. (2013) Kekhususan penyasaran DNA nuklease Cas9 yang dipandu RNA. Nat. Bioteknol., 31, 827–832.
44. Nishimasu,H., Ran,F., Hsu,P., Konermann,S., Shehata,S., Dohmae,N., Ishitani,R., Zhang,F. dan Nureki,O. (2014) Struktur kristal Cas9 dalam kompleks dengan RNA Panduan dan DNA sasaran. Sel, 156, 935–949.
45. Fu,Y., Rocha,PP, Luo,VM, Raviram,R., Deng,Y., Mazzoni,EO dan Skok,JA (2016) Perancah CRISPR-dCas9 dan sgRNA membolehkan pengimejan langsung dwi-warna bagi jujukan satelit dan lokus individu yang diperkaya berulang. Nat. Komuniti, 7, 11707.
46. Khosravi,S., Schindele,P., Gladilin,E., Dunemann,F., Rutten,T., Puchta,H. dan Houben, A. (2020) Aplikasi Aptamers Meningkatkan Pengimejan Langsung Berasaskan CRISPR bagi Telomer Tumbuhan. Depan. Plant Sci., 11, 1254.
47. Nielsen,AA dan Voigt,CA (2014) Litar genetik CRISPR/Cas berbilang input yang antara muka rangkaian pengawalseliaan hos. Mol. Syst. Biol., 10, 763.
48. Lee, YJ, Hoynes-O'Connor, A., Leong, MC dan Moon, TS (2016) Kawalan boleh atur cara ekspresi gen bakteria dengan 44, 2462–2473.
49. Vigouroux,A., Oldewurtel,E., Cui,L., Bikard,D. dan van Teeffelen,S. (2018) Penalaan keupayaan dCas9 untuk menyekat transkripsi membolehkan gen bakteria yang teguh dan tanpa bunyi. Mol. Syst. Biol., 14, e7899.
50. Zhang,Y., Shang,X., Lai,S., Zhang,G., Liang,Y. dan pergi. (2012) Pembangunan dan penggunaan sistem ekspresi boleh aruh arabinosa dengan memudahkan pengambilan induser dalam Corynebacterium glutamicum. Appl. alam sekitar. Mikrobiol., 78, 5831–5838.
51. Thompson,MG, Sedaghatian,N., Barajas,JF, Wehrs,M., Bailey,CB, Kaplan,N., Hillson,NJ, Mukhopadhyay,A. dan Keasling,JD (2018) Pengasingan dan pencirian mutasi novel dalam asal pSC101 yang meningkatkan bilangan salinan. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke,PM, Link,T., Gatgens,J., Sonntag,C., Otto,M., Bott,M. dan Polen, T. (2020) Plasmid ekspresi boleh digerakkan L-arabinose untuk bakteria asid asetik Gluconobacter oxydans. Appl. mikrobiol. Bioteknol., 104, 9267–9282.
53. Nguyen,TT, Nguyen,NH, Kim,Y., Kim,JR dan Park,S. (2021) Pencirian in vivo sistem penggalak teraruh 3-hydroxypropionic dehydrogenase dalam Pseudomonas denitrificans. Bioteknol Bioproc E, 26, 612–620.
54. McCarty,NS, Graham,AE, Studena,L. dan Ledesma-Amaro,R. (2020) Teknologi CRISPR berbilang ganda untuk penyuntingan gen dan peraturan transkrip. Nat. Komuniti, 11, 1281.
55. Yan,Q. dan Fong,SS (2017) Kajian kesan pengikatan transkrip in vitro dan bunyi menggunakan promoter konstitutif digabungkan dengan jujukan unsur UP dalam Escherichia coli. J. Biol. Eng., 11, 33.
56. Seo,SW, Yang,JS, Kim,I., Yang,J., Min,BE, Kim,S. dan Jung,GY (2013) Reka bentuk ramalan kawasan permulaan terjemahan mRNA untuk mengawal kecekapan terjemahan prokariotik. Metab. Eng., 15, 67–74. 57. Kappel,K., Jarmoskaite,I., Vaidyanathan,PP, Greenleaf,WJ, Herschlag,D. dan Das, R. (2019) Ujian buta ramalan pertalian mengikat protein RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. Amerika Syarikat, 116, 8336–8341.
58. Zuker,M. (2003) Pelayan web Mfold untuk ramalan lipatan dan hibridisasi asid nukleik. Asid Nukleik Res., 31, 3406–3415.
59. Xiong,B., Zhu,Y., Tian,D., Jiang,S., Fan,X., Ma,Q., Wu,H. dan Xie,X. (2021) Pengagihan semula fluks metabolisme karbon pusat untuk pengeluaran l-tryptophan yang cekap dalam Escherichia coli. Bioteknol. Bioeng., 118, 1393–1404.
60. Yao,R., Li,J., Feng,L., Zhang,X. dan Hu,H. (2019) (13) Kejuruteraan metabolik berpandukan analisis fluks metabolik C Escherichia coli untuk pengeluaran asetol yang lebih baik daripada gliserol. Bioteknol. Bahan api bio, 12, 29.
61. Duran,N. dan Menck,CF (2001) Chromobacterium violaceum: kajian semula perspektif farmakologi dan industri. Crit. Rev. Microbiol., 27, 201–222.
62. Balibar,CJ and Walsh,CT (2006) Biosintesis in vitro violacein daripada L-tryptophan oleh enzim VioA-E daripada Chromobacterium violaceum. Biokimia, 45, 15444–15457.
63. Gwon,DA, Seok,JY, Jung,GY and Lee,JW (2021) Evolusi makmal penyesuaian berbantukan biosensor untuk pengeluaran violacein. Int. J. Mol. Sains, 22, 6594.
64. Sanchez,C., Brana,AF, Mendez,C. dan Salas,JA (2006) Penilaian semula laluan biosintetik violacein dan hubungannya dengan biosintesis indolocarbazole. Kimia. Bio. Kimia, 7, 1231–1240.
65. Jones,JA, Vernacchio,VR, Lachance,DM, Lebovich,M., Fu,L., Shirke,AN, Schultz,VL, Cress,B., Linhardt,RJ dan Koffas,MA (2015) ePathOptimize: a pendekatan kombinatorial untuk pengimbangan transkrip laluan metabolik. Sci. Rep., 5, 11301.
66. Zhang,Y., Chen,H., Zhang,Y., Yin,H., Zhou,C. dan Wang, Y. (2021) Kejuruteraan RBS langsung gugusan gen biosintetik untuk produktiviti violacein yang cekap dalam E. coli. Mikrob. Fakta Sel., 20, 38.
67. Hunter,WN (2007) Laluan bukan mevalonat biosintesis prekursor isoprenoid. J. Biol. Chem., 282, 21573–21577.
68. Rohmer,M. (1999) Penemuan laluan bebas mevalonat untuk biosintesis isoprenoid dalam bakteria, alga dan tumbuhan yang lebih tinggi. Nat. Prod. Rep., 16, 565–574.
69. Muller,L., Caris-Veyrat,C., Lowe,G. dan Bohm, V. (2016) Lycopene dan peranan antioksidannya dalam pencegahan penyakit kardiovaskular––semakan kritikal. Crit. Rev. Sains Makanan. Nutr., 56, 1868–1879.
70. Miura,Y., Kondo,K., Saito,T., Shimada,H., Fraser,PD dan Misawa,N. (1998) Penghasilan karotenoid likopena, beta-karotena, dan astaxanthin dalam yis makanan Candida utilis. Appl. alam sekitar. Mikrobiol., 64, 1226–1229.
71. Goodall,ECA, Robinson,A., Johnston,IG, Jabbari,S., Turner,KA, Cunningham,AF, Lund,PA, Cole,JA and Henderson,IR (2018) Genom penting Escherichia coli K{ {2}}. Mbio, 9, e02096-17.
72. Baba,T., Ara,T., Hasegawa,M., Takai,Y., Okumura,Y., Baba,M., Datsenko,KA, Tomita,M., Wanner,BL dan Mori,H. (2006) Pembinaan Escherichia coli K-12 dalam bingkai, mutan kalah mati gen tunggal: koleksi Keio. Mol. Syst. Biol., 2, 2006.0008.
73. Bertram,R. dan Hillen, W. (2008) Aplikasi penindas Tet dalam peraturan dan ekspresi gen prokariotik. Mikrob. Bioteknol., 1, 2–16.
