Cap Jari HPLC Dan Hubungan Kesan Spektrum-antitumor Untuk Diskriminasi Antara Mylabris Phalerata Pallas Dan Mylabris Cichorii Linnaeus

Kenalan: emily.li@wecistanche.com

Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li

1 Pusat Pengajian Farmasi, Universiti Perubatan Zunyi, Zunyi, China,

2 Makmal Utama Farmakologi Asas Kementerian Pendidikan dan Makmal Penyelidikan Antarabangsa Bersama Etnoperubatan Kementerian Pendidikan, Universiti Perubatan Zunyi, Zunyi, Guizhou, China.

3 Pusat Pengajian Sains Perubatan Asas, Universiti Perubatan Zunyi, Zunyi, China, Makmal Utama untuk Pencegahan dan Rawatan Tumor Berpusat di Kolej Wilayah 4Guizhou dengan Ubat-Ubat Khas, Universiti Perubatan Zunyi, Zunyi, China.

Klik di sini untuk mendapatkan maklumat lanjut tentang anti-tumor Cistanche

Sorotan

Kajian ini menyediakan kaedah HPLC yang boleh digunakan, boleh dipercayai dan lebih cekap untuk mendiskriminasi dua spesies Mylabris. Dan, cap jari HPLC dan spektrum-kesan antitumortelah disepadukan dan tiga penanda pembezaan penting ditemui untuk penanda baru Mylabris.

Abstrak

Objektif: Penilaian diskriminasi antara dua Spesies Mylabris berdasarkan cap jari HPLC dan spektrum-kesan antitumorperhubungan. Kaedah: Dalam kajian ini, kaedah kromatografi cecair (HPLC) berprestasi tinggi yang mudah dan cekap menyepadukan dengan analisis kemometrik dan spektrum-kesan antitumorhubungan dibangunkan untuk diskriminasi antara dua spesies Mylabris: Mylabris phalerata Pallas (MP) dan Mylabris cichorii Linnaeus (MC). Keputusan: Dalam analisis cap jari, 14 puncak ciri telah dipilih untuk menilai perbezaan antara MP dan MC menggunakan analisis persamaan dan pengecaman corak menggunakan PCA dan OPLS-DA. Kromatogram HPLC sampel dari 10 wilayah China menunjukkan perbezaan antara MP dan MC, dan 7 penanda kimia ciri ditemui. Dalam spektrum-kesan antitumoranalisis hubungan, 4 penanda aktiviti memainkan peranan penting dalam mengurangkan IC50 dan mungkin komponen antitumor Mylabris oleh analisis hubungan kelabu dan analisis regresi linear multivariate. Analisis kemometrik dalam kombinasi dengan keputusan hubungan kesan spektrum menunjukkan bahawa puncak 2 (sitosin), 4 (tidak diketahui), dan 14 (tidak diketahui) adalah penanda pembezaan penting untuk membezakan kedua-dua spesies Mylabris.

Kesimpulan: Kaedah ini boleh digunakan, boleh dipercayai, dan lebih cekap untuk mendiskriminasi MP dan MC, dan akan menawarkan cara baharu untuk memudahkan kawalan kualiti ubat serangga.

Kata kunci: HPLC, Cap Jari, Spektrum-kesan antitumor, Mylabris, Diskriminasi

Latar belakang

Mylabris, dipanggil ban mao di China, telah digunakan sebagai perubatan tradisional Cina (TCM) untuk merawat furuncle, ulser berakar dalam, jisim perut, dan merupakan ubat penting.antitumorejen. Di samping itu, ia digunakan secara meluas di Eropah sebagai perubatan rakyat [1]. Konstituen aktif utama Mylabris ialah cantharidin, yang berkesananti tumorsebatian [2]. Kajian farmakologi moden telah menunjukkan bahawa Mylabris mempunyai pelbagai aktiviti, dan sangat dihargai untuk rawatan tumor kerana duaanti kansersifat dan keupayaan untuk meningkatkan bilangan leukosit [3-4]. Pada masa ini, Mylabris telah digunakan secara meluas dalam beberapa preskripsi TCM anti-karsinoma klinikal di China, seperti suntikan Aidi dan kapsul mao larangan Kompaun.

Menurut Pharmacopoeia of the People's Republic of China (versi 2015), Mylabris ditakrifkan sebagai badan kering Mylabris phalerata Pallas (MP) dan Mylabris cichorii Linnaeus (MC), yang berbeza dalam ciri botani, dinamik populasi dan ekologi mereka [ 5-6]. Mylabris juga merupakan ubat yang sangat toksik. Oleh kerana ubat-ubatan yang terdapat di China biasanya merupakan campuran MP dan MC, adalah perlu untuk mengenal pasti perbezaan kimia dan aktiviti antara kedua-dua spesies.

Memandangkan TCM mengandungi banyak ramuan yang diketahui dan tidak diketahui, analisis profil kuantitatif bagi juzuk kimianya menimbulkan cabaran yang ketara. Cap jari kromatografi cecair (HPLC) berprestasi tinggi memainkan peranan penting dalam kawalan kualiti (QC) TCM kerana ciri profil keseluruhannya bagi kebanyakan sebatian dalam sistem yang kompleks. Tambahan pula, analisis cap jari TCM mempunyai kebolehulangan dan kestabilan yang baik untuk pengesahan spesies dan penilaian kualiti, dan diterima oleh Pertubuhan Kesihatan Sedunia, Pentadbiran Makanan dan Dadah Negeri China (SFDA), dan Agensi Penilaian Ubat Eropah (EMEA). Baru-baru ini, analisis chemometric yang menggabungkan cap jari HPLC telah dibangunkan untuk QC dan mendiskriminasi sumber semula jadi kompleks yang berbeza [7]. Walau bagaimanapun, adalah tidak berkesan untuk mendiskriminasi perbezaan dalam TCM kerana ia tidak dapat mencerminkan perbezaan konstituen aktif, yang lebih penting untuk kegunaan klinikal. Setakat ini, spektrum-antitumor kesanpendekatan perhubungan telah digunakan untuk berjaya mengenal pasti juzuk bioaktif TCM [8]. Cap jari HPLC digabungkan dengan analisis kemometrik dan hubungan kesan spektrum-antitumor akan lebih menjelaskan perbezaan pelbagai sumber TCM.

Baru-baru ini beberapa kaedah telah dilaporkan untuk menentukan kandungan cantharidin, yang boleh digunakan untuk menentukan kualiti Mylabris [9]. Beberapa cetakan jari kromatografi turut digunakan untuk QC [10-11]. Hanya satu kajian yang menggunakan kaedah yang melibatkan elusi kecerunan bagi sebatian larut air Mylabris berdasarkan HPLC. Sementara itu, hanya sepuluh sampel digunakan, dan tiada sampel MC [12]. Sepanjang pengetahuan kami, mendiskriminasi MP dan MC berdasarkan komposisi dan aktiviti kimia belum pernah dikaji sebelum ini.

Kajian ini bertujuan untuk membangunkan kaedah yang mudah dan cekap untuk mendiskriminasi dua spesies Mylabris menggunakan cap jari HPLC digabungkan dengan analisis kemometrik dan spektrum-antitumorkesanperhubungan, yang akan menyediakan asas untuk QC Mylabris. Kaedah ini juga boleh digunakan untuk mengenal pasti penanda QC bagi TCM lain.

Bahan dan kaedah

Secara keseluruhan, 20 kelompok Mylabris phalerata Pallas (MP) dan Mylabris cichorii Linnaeus (MC) telah dikumpulkan dari wilayah China yang berlainan (Jadual 1) dan dikenal pasti oleh prof Xiao-Fei Li kami. Spesimen baucar telah disimpan di makmal kami.

Sitosin standard rujukan, uridin, guanosin dan adenosin telah dibeli daripada ChengduPush Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, China). Acetonitril gred HPLC dan metanol telah dibeli daripada Thermofisher Scientific (Fairlawn, NJ, USA). Air tulen Watson digunakan sepanjang kajian. Bahan kimia dan pelarut lain adalah gred analitik dan diperoleh daripada Reagen Aladdin (Shanghai, China), Reagen Chengdu Kelong (Chengdu, China) dan Reagen Kimia Sinopharm (Beijing, China)

Keadaan radas dan kromatografi

Analisis HPLC telah dijalankan menggunakan sistem Agilent 1260 Infinity HPLC pada 30 darjah pada Phenomenex Synergy Polar-RP80 (4.6 mm ×250 mm, 5 μm) untuk cap jari. Elusi kecerunan linear dengan eluen A (air/asid asetik glasier, 100:1, v/v) dan B (metanol) telah digunakan untuk pengasingan. Program kecerunan telah dibangunkan seperti berikut: 0-1 min, 3.0-4.6 peratus B; 1-9 min, 4.6-6.8 peratus B; 9-25 min, 6.8-51.0 peratus B; 25-30 min, 51.0-100 peratus . Kadar alir fasa mudah alih ialah 1.0 mL/min. Kromatogram dipantau pada 254 nm. Selepas tempoh penyamaan 15 minit, 10 μL sampel digunakan untuk suntikan.

Penyediaan sampel

Sampel kering dihancurkan menjadi serbuk dan 2.5 g setiap sampel serbuk diekstrak dua kali dengan 5{14}} mL etanol 75 peratus secara refluks selama 1.5 jam setiap kali. Sampel yang diekstrak dicampur dan dipekatkan di bawah tekanan yang dikurangkan kepada 20 mL. Campuran tersebut kemudiannya dimendakkan dengan 80 mL air selama 24 jam di bawah 4 darjah . Selepas itu, ekstrak telah disentrifugasi pada 3000 g min-1 selama 10 minit untuk memisahkan supernatan. Supernatan telah tertumpu di bawah tekanan yang dikurangkan kepada 25 mL. Akhirnya, supernatan itu ditapis melalui filem Millipore 0.22 μm sebelum analisis HPLC.

Pengesahan metodologi

Kaedah HPLC telah disahkan untuk ketepatan, kebolehulangan dan kestabilan (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h) . Pengesahan dianggarkan berdasarkan masa pengekalan (RT) dan kawasan puncak (PA). Akhirnya, cap jari kimia 20 kelompok Mylabris telah ditubuhkan untuk mengenal pasti ciri-ciri kimia bersepadu pelbagai sebatian. Beberapa teknik kemometrik telah diperkenalkan pada cap jari kimia untuk analisis.

Analisis pengecaman corak

Perbezaan antara dua spesies kawasan puncak telah dinilai untuk kepentingan statistik menggunakan ujian-t Pelajar tidak berpasangan. Nilai-p kurang daripada 0.05 dianggap signifikan secara statistik. Sebagai kaedah klasik tanpa pengawasan, analisis komponen utama (PCA) digunakan secara meluas untuk analisis data statistik. Daripada menggunakan banyak pembolehubah, PCA mengambil sebilangan kecil PC tanpa kehilangan banyak maklumat, dan plot skor kemudian divisualisasikan untuk pengasingan pemerhatian percuma. Dalam kajian ini, PCA telah dijalankan pada kawasan puncak ternormal setiap komponen dalam cap jari HPLC menggunakan perisian SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics, Umea, Sweden) untuk mencari diskriminasi antara kedua-dua spesies Mylabris.

Untuk lebih banyak diskriminasi pilihan antara kedua-dua spesies Mylabris, kaedah penyeliaan analisis diskriminasi kuasa dua terkecil separa ortogon (OPLS-DA) telah digunakan untuk menganalisis perbezaan dalam kawasan puncak ternormal setiap komponen dalam cap jari HPLC. Nilai VIP ialah jumlah wajaran kuasa dua bagi pemberat OPLS, mencerminkan sumbangan relatif setiap pembolehubah X kepada model. Pembolehubah dengan VIP > 1, bersama-sama dengan S-plot dianggap berpengaruh untuk pemisahan sampel dalam plot skor yang dijana daripada analisis OPLS-DA. Kemudian, penanda kimia ciri untuk diskriminasi diperolehi.

Analisis hubungan kesan spektrum-antitumor

Untuk menerokaanti tumorkesan kawasan puncak untuk sampel Mylabris disepadukan dengan data cap jari, dan bandingkan perbezaan antara kedua-dua spesies, korelasi antara puncak cap jari dananti-ketumbuhankesan telah dikaji. Dua kaedah yang menggabungkan analisis relasi kelabu dan analisis regresi linear multivariate (MLRA) telah digunakan oleh SPSS19.0 (IBM, USA) dan GM6.0 lembut (Grey Systems Theory Institution, NUAA, China). Theanti-ketumbuhanujian telah dijalankan oleh kaedah kami yang diterbitkan [12], sel karsinoma hepatoselular manusia sel HepG2 dikekalkan dalam medium RPMI1640 ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin. Sel-sel itu ditanam dalam suasana lembap yang mengandungi 5 peratus CO2 pada suhu 37 C. Kaedah SRB digunakan untuk menilai percambahan untukanti-ketumbuhanaktiviti, kemudian IC50 sel HepG2 dikira, akhirnya, IC50 dan kawasan puncak ternormal digunakan untuk analisis chemometric. Kemudian, penanda aktiviti ciri Mylabris telah diperolehi.

Keputusan dan perbincangan

Pengoptimuman keadaan ekstrak

Untuk pengekstrakan sebatian larut air yang mencukupi daripada Mylabris, sistem pengekstrakan telah dioptimumkan. Ultrasonik dan refluks menunjukkan bahawa sebatian ini boleh diekstrak secara optimum dengan refluks.

Pengoptimuman kaedah HPLC

Untuk mendapatkan puncak kromatografi maksimum untuk menerangkan ciri keseluruhan herba, komposisi lajur kromatografi, fasa bergerak, dan panjang gelombang pengesanan (200, 254, 265, dan 278 nm) telah disiasat. Keputusan menunjukkan bahawa lajur Phenimenex Synergy Polar-RP80, air (mengandungi 1 peratus asid asetik glasier) dan metanol, dan 254 nm adalah keadaan terbaik untuk analisis Mylabris HPLC (Rajah 1), struktur 4 bahan piawai ditunjukkan dalam Rajah 2 .

Pengesahan kaedah

Dalam kajian ini, 14 puncak telah diasingkan dengan baik dan digunakan sebagai "puncak biasa". Ketepatan, kebolehulangan dan kestabilan adalah berdasarkan masa pengekalan (RT) dan kawasan puncak (PA). Nilai RSD RT dan PA untuk ketepatan (n=6) masing-masing tidak melebihi 0.2 dan 4 peratus ; Nilai RSD RA dan PA untuk kebolehulangan (n=6) adalah di bawah 0.2 dan 4 peratus , masing-masing dan nilai RSD untuk kestabilan (0-24 h) adalah kurang daripada { {10}}.4 dan 5 peratus , masing-masing, yang menunjukkan bahawa sampel adalah stabil dalam masa 24 jam. Keputusan ini menggambarkan bahawa kualiti sampel yang dikaji dan kaedah HPLC adalah stabil dan terkawal dengan baik.

Penilaian persamaan cap jari

The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}}.921 kecuali sampel MC (dari Guizhou2 dan Guizhou4), yang persamaannya ialah 0.888 dan 0.887, masing-masing. Data ini menunjukkan bahawa kualiti Mylabris dalam satu spesies adalah stabil. Walau bagaimanapun, persamaan hanya tiga sampel MP berbanding cap jari HPLC rujukan ialah > 0.930; dan persamaan hanya dua sampel MC berbanding cap jari HPLC rujukan ialah > 0.921. Keputusan ini menunjukkan bahawa kedua-dua spesies Mylabris adalah variasi yang besar di beberapa kawasan puncak.

Diskriminasi MP dan MC dengan analisis pengecaman corak

For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>1, puncak 1, 2, 4, 7, 9, 12, dan 14 mungkin pembolehubah paling ketara dalam mendiskriminasi antara kedua-dua spesies (Rajah 6). Kumpulan puncak (1, 2, 4, 7, 9, 12, dan 14) mungkin memainkan peranan penting dalam membezakan antara MP dan MC sebagai penanda kimia ciri.

Hubungan spektrum-kesan oleh analisis hubungan kelabu

To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.

Hubungan kesan spektrum oleh MLRA

Model MLRA ialah kaedah pemodelan yang paling biasa untuk menyimpulkan kerumitan hubungan antara dua atau lebih pembolehubah dan tindak balas yang dibina oleh formula berikut

Di mana Y ialah nilai anggaran dan mewakili tindak balas; Xn ialah pembolehubah bebas, b{{0}} ialah pintasan, dan bn ialah pekali regresi untuk Xn. Dalam kajian ini, MLRA telah digunakan untuk mewujudkan hubungan keberkesanan cap jari antara nilai kawasan puncak dalam cap jari HPLC dan IC50 anti-HepG2, dan kemudian mencari komponen antitumor yang mungkin. Penyatuan data ditemui oleh model MLRA biasa, yang tidak sesuai untuk meneroka korelasi antara Y (IC50) dan X (PA). Model PCA MLRA digunakan untuk mengkaji hubungan kesan cap jari, dan enam PC pertama dengan kadar sumbangan varians kumulatif: 91.068 peratus telah dipilih untuk analisis. Akhir sekali, persamaan berikut telah diwujudkan mengikut output SPSS dan PC: IC50=1.115864 tambah （ 1.87268PA1- 699.722PA2 tambah 25.7138PA3 - 24.1528PA4 tambah 7.22878PA{{ 23}}.2114PA6 tambah 2.95283PA7- 15.5305PA8 tambah 13.0297PA9 tambah 22.5683PA10 - 10.3462PA11 tambah 123.762PA12 tambah 31.0428PA13 - 10).70}. (R ialah 0.682, P <>

Mengintegrasikan Analisis Dua Spesies Mylabris

Eksperimen menunjukkan bahawa cap jari HPLC boleh digunakan untuk mencerminkan ciri-ciri kimia Mylabris. Algoritma persamaan, PCA, dan OPLS-DA digunakan untuk mencari perbezaan antara MC dan MP. Kumpulan puncak (1, 2, 4, 7, 9, 12, dan 14) ditakrifkan sebagai penanda kimia ciri.

Di samping itu, kedua-dua GRA dan MLRA terbukti sebagai kaedah yang memuaskan untuk mendiskriminasikan lagi. Mengintegrasikan keputusan analisis GRA dan MLRA, puncak 2, 4, dan 14 sebagai penanda aktiviti Mylabris harus bertanggungjawab untuk kesan anti-tumor, yang mungkin merupakan asas bahan farmakodinamik Mylabris.

Penanda pembezaan penting telah ditakrifkan untuk puncak dengan ciri kimia dan ciri penanda aktiviti. Jadi, antara MC dan MP pada cap jari HPLC selepas analisis hubungan kesan spektrum, puncak 2 (sitosin), 4 (tidak diketahui), dan 14 (tidak diketahui) adalah penanda pembezaan penting untuk perbezaan antara MP dan MC seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 7.

Kesimpulan

Secara kesimpulannya, dalam penyelidikan ini, kaedah HPLC telah dicadangkan untuk cap jari kimia MP dan MC. Dengan menggabungkan cap jari HPLC, PCA, dan analisis hubungan kesan spektrum seperti GAS dan MLRA, sifat kimia dan farmakologi dua spesies rapat Mylabris boleh didiskriminasi. Ini menunjukkan bahawa sebatian daripada puncak 2(sitosin), 4 (tidak diketahui), dan 14 (tidak diketahui) sebagai penanda pembezaan penting memainkan peranan dominan dalam membezakan antara MP dan MC. Struktur puncak 4 dan 14 harus dikenal pasti oleh teknologi lain. Kaedah cap jari HPLC digabungkan dengan statistik, analisis kemometrik, dan analisis hubungan kesan spektrum telah ditunjukkan sebagai cekap dalam menemui komponen penanda atau untuk promosi QC bagiubat-ubatan herba.

Rujukan

1 Wang GS. Penggunaan perubatan Mylabris di China purba dan kajian terkini. J Ethnopharmacol 1989, 26(2): 147-162.

2. Lin YS, Lia YH, Peng ZP, et al. Penentuan kandungan Cantharidin dan kesan perencatannya pada sel HepG2 hepatoma manusia. Biomed Res-India 2016, 27(2): 533-536.

3. Xu MZ, Lee WS, Kim MJ, et al. Acyl-CoA: aktiviti perencatan kolesterol asiltransferase amida asid lemak yang diasingkan daripada Mylabris phalerate Pallas. Bioorg Med Chem Lett 2004, 14(16): 4277-4280.

4. Hari RM, Harbord M, Forbes A, et al. Cantharidin blisters: teknik untuk menyiasat pemerdagangan leukosit dan pengeluaran sitokin di tapak keradangan pada manusia. Kaedah J Immunol 2001, 257(1-2): 213-220.

5. Mo RY, Sun NX, Peng R. Kajian tentang makanan pilihan Mylabris phalerata dewasa dalam populasi geografi yang berbeza. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2014, 39(22): 4293-4296.

6. Wang XM, Cheng XS, Li XF. Ciri Biologi Meloidae dan Pemakanan Tiruannya. Guizhou Agricultural Sciences (Chin) 2007, 35(2): 140-142.

7. Yang Y, Zhang J, Jin H, et al. Analisis Kuantitatif dalam Gabungan Teknologi Cap Jari dan Analisis Kemometrik Digunakan untuk Menilai Enam Spesies Paris Liar Menggunakan UHPLC-UV-MS. J Kaedah Dubur Chem 2016: e3182796.

8. Liu Y, Liu Z, Sun G, et al. Memantau dan menilai ketekalan kualiti tablet Compound Bismut Aluminate dengan kaedah cap jari nisbah terkuantiti mudah digabungkan dengan penentuan serentak lima sebatian dan dikaitkan dengan aktiviti antioksidan. Plos One 2015; 10: e0118223.

9. Mehdinia A, Asiabi M, Jabbari A, et al. Analisis cantharidin dalam kumbang lepuh palsu (Coleoptera: Oedemeridae) oleh pengekstrakan mikro fasa pepejal ruang kepala dan kromatografi gas-spektrometri jisim. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2011, 879(27): 2897-2901.

10. Li XM, Xiao JS. Kajian tentang cap jari GC Mylabris phalerata. China Journal of Hospital Pharmacy (Dagu) 2010; 30(2): 116-119.

11. Luo CX, Sun, GX dan Shi XF. Cap jari didigitalkan Mylabris oleh HPCE. Farmasi Selatan Tengah (Chin) 2008; 6(2): 230-235.

12. Sun GX, Luo CX, dan Wang, Z. Kajian tentang cap jari HPLC Digitized Mylabris. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis (Chin) 2008;28(7): 1031-1036.

13. Guo K, Li XF, Yan R, et al. Karsinoma hepatoselular anti-manusia HepG 2 aktiviti sel cantharidin yang diperolehi dari Wilayah Guizhou dan kawasan sekitarnya. Jurnal Perubatan Moden & Kesihatan (Dagu) 2016; 32(5): 648-650.