Bagaimana Ekstrak Cistanche Mengurangkan Hiperplasia Radang

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Pengurangan Hiperplasia Inflamasi dalam Usus dalam Tikus yang terdedah kepada Kanser Kolon dengan Ekstrak Air Cistanche deserticola

Yamin Jia,1,2 et al

Cistanchedeserticola lazimnya digunakan dalam perubatan tradisional Cina untuk merawat banyak masalah kesihatan termasuk sindrom iritasi usus atau sembelit. Kajian ini direka untuk menguji keberkesanan ekstrak air C. deserticola dalam pencegahan kanser kolorektal dalam model tikus. Ekstrak air yang kaya dengan polisakarida C. deserticola telah disediakan dengan merebus serbuk batangnya dalam air suling. Tikus null Tgfb1Rag2 digunakan sebagai model eksperimen. Di sini kami menunjukkan bahawa pemberian ekstrak air C. deserticola dengan ketara mengurangkan bilangan mukosahiperplasiadan jangkitan Helicobacter usus pada tikus. Kesan berfaedah ini dikaitkan dengan rangsangan ketara sistem imun, dibuktikan oleh pembesaran limpa dengan peningkatan bilangan makrofaj limpa dan sel pembunuh semulajadi, dan dengan sitotoksisiti splenosit yang lebih kuat. Ekstrak air in vitro C. deserticola meningkatkan sitotoksisiti splenosit naif terhadap barisan sel kanser kolon manusia, dan dalam kultur makrofaj mengawal selia ekspresi sintase nitrik oksida II dan merangsang fagositosis. Kesimpulannya, data kami menunjukkan bahawa pemberian oral ekstrak C. deserticola berkuranganradanghiperplastikjangkitan polip dan helicobacter pada tikus melalui aktiviti rangsangan imunnya, menunjukkan bahawa ekstrak C. deserticola mungkin mempunyai potensi dalam mencegah gangguan keradangan usus termasuk kanser kolorektal. Hak Cipta © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.

Kata kunci: imunomodulasi herba;Cistancheekstrak; polisakarida; helicobacter;radanghiperplasia; kanser kolorektal.

Cistancheekstrakboleh mengurangkanMeradanghiperplasia

PENGENALAN

Kanser kolorektal adalah kanser ketiga paling biasa pada lelaki dan yang kedua pada wanita di seluruh dunia dan menduduki tempat keempat paling biasa kematian akibat kanser (8 peratus daripada semua kematian kanser; Ferlay et al., 2010). Kajian epidemiologi mencadangkan bahawa banyak faktor risiko yang berkaitan dengan penyakit ini, termasuk genetik (cth sejarah keluarga kanser kolon) (Strate dan Syngal, 2005) dan faktor pemakanan (cth daging merah dan rendah serat; Chao et al., 2005; Park et al., 2005), danradangpenyakit usus (IBD; Eaden et al., 2001; von Roon et al., 2007; Lukas, 2010). Sehingga kini, walaupun terdapat banyak ubat sitotoksik baru dan teknik pembedahan dan radioterapeutik yang lebih baik yang digunakan untuk rawatan penyakit ini (Cunningham et al., 2010), sebahagian besar pesakit dengan kanser kolorektal masih tidak dapat diubati; kira-kira 608000 kematian akibat penyakit ini dianggarkan di seluruh dunia pada tahun 2008 (Ferlay et al., 2010). Oleh itu, terapi baru diperlukan, dan satu calon adalah imunoterapi. Pelbagai pendekatan imunoterapeutik telah dinilai untuk rawatan kanser kolorektal, dan keputusan setakat ini adalah menggalakkan (Burgdorf et al., 2009). Polisakarida herba telah ditunjukkan mempunyai aktiviti imunoregulasi khusus (Jiang et al., 2010), menunjukkan bahawa produk herba ini boleh digunakan sebagai adjuvant imunostimulasi khusus terhadap kanser kolorektal.

Cistanchedeserticola Ma, dikenali sebagai Rou Cong Rong dalam perubatan herba Cina, telah dimasukkan ke dalam formula herba untuk banyak masalah kesihatan, termasuk mati pucuk, keputihan morbid, dan sindrom usus/sembelit (Jiang dan Tu, 2009). Kajian eksperimen telah mendedahkan aktiviti biologi yang berbeza oleh ekstrak berbeza C. deserticola; ekstrak phenylethanoid glycosides herba ini mempunyai aktiviti antikeletihan pada tikus (Cai et al., 2010), dan analgesik dan anti-radangkesan dalam tikus (Lin et al., 2002), manakala polisakaridanya merangsang percambahan T- dan B-limfosit dalam kultur limfosit (Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Walau bagaimanapun, keberkesanan ekstrak polisakarida C. deserticola dalam rangsangan tindak balas imun dalam vivo masih belum diteliti.

Rag2^-/-tikus tidak mempunyai limfosit T- dan B yang matang, dan pada latar belakang bercampur (~97 peratus 129 S6 dan ~3 peratus CF-1) berkembang secara spontan yang berkaitan dengan keradanganhiperplasiadalam usus (Engle et al., 1999). Pengenalan genetik gen Tgfb1 (transforming growth factor b1 (TGF-b1) alel nol kepada strain tikus ini menghasilkan perkembangan selanjutnyahiperplasiakepada adenoma dan karsinoma (Engle et al., 2002), dan kolitis yang bergantung kepada mikroflora patogenik diperlukan untuk perkembangan kanser kolon (Engle et al., 2002), menunjukkan bahawa strain tikus ini menyediakan model yang ideal untuk pemeriksaan terapi yang berpotensi dalam rawatan keradangan/kanser kolorektal yang disebabkan oleh IBD. Dalam kajian ini, kami menunjukkan buat pertama kalinya keberkesanan ekstrak air kaya polisakarida C. deserticola dalam penguranganradanghiperplasiadalam model ini.

BAHAN DAN KAEDAH

Ekstrak air yang kaya dengan polisakarida daripada penyediaan C. deserticola.

Herba C. deserticola dituai oleh Dr. Y. Guo (Universiti Pertanian China) di wilayah autonomi Mongolia Dalam, China. Serbuk seluruh batang kering (300 g) direbus dalam air suling dua kali dua kali: pertama selama 1 jam dalam 500 mL air, diikuti dengan pengumpulan supernatan, kemudian selama 45 minit dalam 400 mL air. Supernatan ditapis melalui kertas penapis Whatman (sederhana cepat) selepas setiap kali mendidih, dan dikumpulkan bersama. Larutan ekstrak telah dikeringkan secara liofilisasi dan disimpan pada suhu 80 C. Hasil akhir adalah kira-kira 10 g (hasil: ~3 peratus ).

Tikus dan kultur sel. Tikus kekurangan TGF-b1 (Tgfb1 plus /- Rag2^-/-) pada latar belakang bercampur (~97 peratus 129 S6 dan ~3 peratus CF-1) diterima daripada koloni pembiakan yang dikekalkan di bawah keadaan bebas patogen dalam kemudahan haiwan di Pusat Penyelidikan Jack Bell (Vancouver, BC). Tikus ini berasal dari Repositori Model Tetikus Konsortium Kanser Manusia (MMHCC) (Institut Kanser Kebangsaan di Frederick, MD, Amerika Syarikat). Tikus C57BL / 6 J (B6) (jantan, 8-10 minggu) telah dibeli dari Makmal Jackson (Bar Harbor, ME, Amerika Syarikat). Semua haiwan untuk eksperimen telah disimpan di bawah perumahan dan diet konvensional (5001 Rodent Diet, LabDiet) selepas bercerai susu pada usia 4 minggu, dan rawatan herba dan pengumpulan sampel telah dilakukan mengikut garis panduan Canadian Council on Animal Care di bawah
protokol yang diluluskan oleh Jawatankuasa Kecil Penggunaan Haiwan di Universiti British Columbia.

Kedua-dua barisan sel adenokarsinoma kolon manusia SW480 dan barisan sel makrofaj leukemia tikus RAW 246.7 telah ditanam dalam Medium Eagle's Modified Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) yang mengandungi 10 peratus lembu janin serum (FBS) (medium DMEM lengkap) pada 37-C dalam inkubator udara 5 peratus CO2/95 peratus lembap. Splenosit diasingkan dengan menghancurkan serpihan limpa secara perlahan-lahan dalam garam penimbal fosfat (PBS), diikuti dengan penyingkiran eritrosit menggunakan penimbal lisis (0.15 M NH4Cl, 1.0 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 6.8). Selepas mencuci dengan PBS sekali lagi, splenocytes digantung dalam medium RPMI 1640 ditambah dengan 10 peratus FBS (medium RPMI lengkap).

Cistancheekstrakboleh mengurangkanMeradanghiperplasia

Rawatan ekstrak.

Ekstrak herba, dipanggilCistancheekstrakdalam kajian ini, akhirnya disediakan dengan penyusunan semula serbuk kering dengan air suling dua kali yang disterilkan dan mengandungi 2–3 peratus (b/b) feniletanoid, 65–70 peratus (b/b) polisakarida, dan 0.6–1 peratus (b/b) berasaskan protein pada ujian berikut: bilangan feniletanoid ditentukan oleh penyerapan pada 332 nm menggunakan spektrofotometri yang diterangkan sebelum ini (Ouyang et al., 2005); kandungan polisakarida diukur menggunakan kaedah asid sulfurik fenol standard (Dubois et al., 1956) selepas pemendakan etanol; dan protein ditentukan oleh ujian protein Bio-Rad mengikut protokol pengeluar (Bio-Rad Lab, Hercules, CA, Amerika Syarikat). Dos ekstrak Cistanche ialah 0.4 g/kg/hari berdasarkan kajian rintis kami. Purata pengambilan air bagi setiap tikus dewasa sehari adalah lebih kurang 4 mL, dan jika 1 mL air minuman mengandungi 3 mgCistancheekstrak, setiap tetikus menerima pemberian oral sebanyak 12 mg ekstrak setiap hari. Berdasarkan fakta bahawa purata berat badan seekor tikus dewasa ialah 30 g, air minuman yang mengandungi 3 mg/mLCistancheekstrakmemberikan dos sebanyak 0.4 g/kg/hari kepada tikus. Tikus dirawat dengan memberi air minuman ad labium yang mengandungi 3 mg/mLCistancheekstrakyang telah diisi semula sekurang-kurangnya sekali setiap dua hari, dari umur dua bulan selama tiga bulan di dalam bilik konvensional kemudahan penjagaan haiwan.

Penggredan histologi kanser kolorektal.

Pada penghujung rawatan selama tiga bulan, kedua-dua tisu usus kecil dan besar telah dituai dan dibuka secara membujur, diikuti dengan perlahan-lahan membuang kandungannya dengan PBS. Sebanyak enam keping (setiap 2 cm panjang) tisu usus dari setiap tetikus telah dikumpulkan: tiga dari usus kecil di lokasi proksimal, tengah dan distal; dua dari usus besar di lokasi proksimal dan distal, dan satu dari sekum. Semua tisu telah ditetapkan dalam 10 peratus formalin dan tertanam dalam parafin. Setiap bahagian telah diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (HE) untuk penggredan histologi kanser kolorektal. Penggredan penyakit dilakukan mengikut watak patologihiperplasia, adenoma, atau karsinoma dalam setiap sampel, seperti yang diterangkan sebelum ini (Engle et al., 1999) dalam fesyen ujian buta. Jumlah bilangan setiap perubahan patologi (hiperplasia, adenoma, dan karsinoma) dikira dalam dua bahagian tisu usus untuk setiap tetikus.

Cistancheekstrakboleh mengurangkanMeradanghiperplasia

Pengesanan Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) dalam najis tikus.

Untuk mengkaji kesan daripadaCistancheekstrakpada pertumbuhan mikroflora patologi dalam usus, H. hepaticus dalam najis ditentukan oleh tindak balas rantai polimerase (PCR) dengan primer 16S rDNA khusus spesies seperti yang diterangkan sebelum ini (Shames et al., 1995). Kira-kira 200 mg najis segar telah dilarutkan dalam 1 μL PBS dan diinkubasi pada 5{18}} darjah selama 30 minit, diikuti dengan sentrifugasi pada 8000 rpm selama 10 minit. Supernatan (200 mL) dikumpul dan dicampur dengan jumlah larutan proteinase K yang sama yang mengandungi 5 peratus (v/v) 18.7 mg/mL larutan proteinase K (Fermentas Canada, Burlington, ON, Kanada) dalam penimbal pencernaan (50). μM Tris–HCl, pH 8.0, 0.1 M EDTA, 0.5 peratus Sodium dodecyl sulfate), dan diinkubasi pada 70 C selama 30 minit. DNA dalam larutan terhasil telah diekstrak menggunakan kit Miniprep QIAprep mengikut protokol pengeluar (QIAGEN, Mississauga, ON, Kanada).
Penguatan tindak balas rantai polimerase DNA bakteria dilakukan dalam campuran yang mengandungi {{0}}.75 μL 10 penimbal PCR, 0.5μL daripada 50 mM MgCl2, 0.5 μL setiap primer (deria: 5'-GCA TTT GAA ACT GTT ACT CTG; anti-deria: 5'-GGG GAGCUUGAAAACAG, 100 mM setiap satu), 0.5 μL Taq polimerase, 18.75 μL H2O bebas nuklease dan 1μL larutan DNA najis tanpa kuantiti. Campuran PCR dipanaskan pada 94 darjah selama 5 minit, diikuti dengan 40 kitaran denaturasi pada 94 darjah selama 1 minit, penyepuhlindapan pada 55 darjah selama 1.25 minit, dan lanjutan pada 72 darjah selama 1.5 minit. PCR telah ditamatkan dengan langkah pemanjangan selama 10 minit pada 72 darjah . Produk PCR yang terhasil (25 μL) tertakluk kepada elektroforesis pada gel agarose 1 peratus dalam penimbal Tris-acetate-EDTA (TAE) yang mengandungi 0.5 mg/mL etidium bromida dan divisualisasikan di bawah cahaya UV.

Penentuan makrofaj dan sel pembunuh semulajadi (NK).

Peratusan makrofaj dan sel NK dalam penggantungan splenosit ditentukan oleh analisis pengisihan sel diaktifkan pendarfluor (FACS). Satu juta splenocytes dalam penimbal FACS telah diinkubasi dengan kombinasi antibodi yang sesuai untuk fenotip sel yang berbeza dalam ais: anti-CD3-fluorescein isothiocyanate (FITC) dan anti-CD49b-phycoerythrin (PE) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Kanada) untuk CD3 CD49b plus sel NK, dan anti-tikus F4/80 plus sebagai antibodi utama dan anti-tikus IgG-FITC sebagai antibodi sekunder (eBioscience, San Diego, CA, USA) untuk F4/80 plus makrofaj. Keamatan pendarfluor untuk setiap jenis sel diukur menggunakan sitometri aliran dan dianalisis dengan perbandingan dengan kawalan latar belakang menggunakan perisian CELLQUEST (BD Biosciences).

Ujian sitotoksisiti Calcein-acetoxymethyl (calcein-AM).

Aktiviti litik splenosit effector terhadap sel sasaran SW480 dinilai oleh ujian sitotoksisiti calcein-AM menggunakan sistem kultur bersama seperti yang diterangkan sebelum ini (Neri et al., 2001). Secara ringkasnya, sel SW480 dilabelkan dengan pewarna pendarfluor calcein-AM seperti berikut: 1 x10⁶sel/mL sel SW480 dalam medium DMEM lengkap diinkubasi dengan 15 μM calcein-AM pada 37 darjah dengan goncangan sekali-sekala. Selepas 30 minit pengeraman, sel-sel telah dibasuh secara meluas dengan medium DMEM lengkap untuk mengeluarkan pewarna ekstraselular. Sel SW480 berlabel pewarna pendarfluor dalam medium DMEM lengkap (0.2 x 10⁶sel/{{0}}.25 mL/perigi) telah disemai dalam 24-plat perigi. Berdasarkan nisbah berbeza (12:1, 6:1, 3:1 dan 1.5:1) E (pengaruh): T (sasaran), splenosit dalam 0.25 mL medium RPMI lengkap setiap telaga telah ditambahkan ke telaga dengan sel sasaran dalam tiga kali ganda. Kultur bersama diinkubasi pada 37 darjah dalam 5 peratus CO2 selama 24 jam. Supernatan dikumpul selepas plat dipusing pada 2000 rpm selama 5 minit. Pelepasan Calcein-AM kepada supernatan ditentukan dengan menggunakan spektrofluorimeter mikroplat (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems) pada pelepasan 527 nm di bawah pengujaan pada 485 nm. Sel sasaran, diinkubasi dengan campuran 0.25 mL medium DMEM lengkap dan 0.25 mL medium RPMI lengkap, digunakan sebagai latar belakang atau kawalan pelepasan spontan, dan dengan kehadiran 2 peratus , Triton X-100 digunakan sebagai kawalan pelepasan maksimum. Sitotoksisiti splenosit dikira seperti berikut:

Pengukuran nitrik oksida (NO). Nitrik oksida yang dirembeskan daripada sel telah teroksida dengan cepat kepada nitrit dalam medium kultur. Oleh itu, kepekatan nitrat dalam medium ditentukan menggunakan kaedah Griess sebagai ukuran penghasilan NO. RAW264.7 sel (0.25 x 10⁶

sel/telaga dalam 0.5 mL medium DMEM lengkap) dalam 24-plat telaga telah dirangsang denganCistancheekstrak(50–200 mg/mL) dan lipopolisakarida (LPS) (10 ng/mL) sebagai kawalan positif. Selepas 24 jam rawatan, 50 mL supernatan kultur pertama kali dicampur dengan 50 mL 1 peratus
sulfanilamide dalam 5 peratus asid fosforik dalam 96-plat perigi dalam tiga kali ganda, dan diinkubasi selama 10 min, kemudian 50 mL 0.1 peratus naphthyl ethylene diamine dihydrochloride dalam air suling ditambah setiap telaga. Penyerapan dibaca pada 550 nm selepas pengeraman selama 10 minit, dan tahap NO / nitrit dikira menggunakan lengkung piawai dengan kepekatan natrium nitrit yang diketahui.

Cistancheekstrakboleh mengurangkanMeradanghiperplasia

Penghapusan Barat.

Tahap selular nitric oxide synthase II (NOS 2 atau iNOS) telah diperiksa oleh Western blot seperti yang diterangkan sebelum ini (Du et al., 2006). Secara ringkas, sampel protein (kira-kira 100 mg/sampel) telah difraksinasi oleh 7 peratus SDS-PAGE dan telah dipindahkan ke membran nitroselulosa. Jalur protein NOS II telah dikenal pasti dengan antibodi anti-NOS II poliklonal arnab primer (N-20) (pencairan 1:500; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, Amerika Syarikat) dan antibodi IgG anti-arnab kambing sekunder ( 1:10000 pencairan; Makmal Vektor, Burlingame, CA, Amerika Syarikat). Kompleks protein-antibodi NOS II telah divisualisasikan oleh ujian chemiluminescence yang dipertingkatkan (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England). Blots telah direprobed menggunakan IgG anti-b-actin (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON, Kanada) untuk pengesahan protein dimuatkan dalam setiap sampel.

Ujian fagositosis. Fagositosis diukur dengan jumlah manik lateks berlabel pendarfluor (SigmaAldrich Canada, L-3030, diubah suai karboksilat, saiz purata 2 mm) yang ditelan oleh sel RAW264.7 seperti yang diterangkan sebelum ini (Wu et al., 2{{ 9}}07). Secara ringkasnya, sel RAW264.7 (0.1 106 sel/0.5 mL/telaga) dalam medium DMEM lengkap telah disemai dalam 24-plat perigi dan dirangsang dengan 100 mg/mLCistancheekstrakatau melengkapkan medium DMEM sahaja sebagai kawalan. Selepas rangsangan semalaman, 2.5 mL manik lateks pendarfluor setiap telaga ditambah kepada kultur makrofaj dan diinkubasi selama 2 jam. Untuk analisis sitometri aliran, sel-sel telah dipisahkan dengan pemipetan selepas mencuci dalam PBS, dan keamatan pendarfluor sel fagositik diukur oleh sitometer aliran dan dianalisis dengan perbandingan dengan kawalan latar belakang (tiada manik) menggunakan perisian CELLQUEST (BD Biosciences).

Analisis statistik.

Data telah dibentangkan sebagai min tambah - sisihan piawai (SD). Analisis varians (ANOVA) atau ujian-t Pelajar dilakukan mengikut kesesuaian untuk membandingkan data antara kumpulan. Nilai p < 0.05="" dianggap="">

KEPUTUSAN

Rawatan denganCistancheekstrakmengurangkan kekerapanhiperplasiadan jangkitan H. hepaticus pada usus Dalam tempoh rawatan (3 bulan), berat badan dan pengambilan air minuman dipantau sekali setiap 2 hari pada tikus kumpulan yang dirawat ekstrak berbanding kumpulan yang dirawat kenderaan, tiada perbezaan yang ketara adalah. dicatatkan (data tidak ditunjukkan). Analisis histologi, bagaimanapun, menunjukkan bahawa pentadbiran oralCistancheekstrakmengurangkan dengan ketara bilanganradanghiperplasiadalam usus (Rajah 1), dibuktikan oleh fakta bahawa tikus yang menerima air dengan ekstrak mempunyai lebih sedikithiperplasia(5.00 tambah -2.83/tikus, n=15) daripada mereka yang minum air kosong atau kenderaan (7.53 tambah -3.09/tikus, n {{9 }}) (ekstrak lwn. kenderaan: p=0.0133, ujian-t). Perbezaan dalam bilangan adenoma dan karsinoma antara tikus yang dirawat ekstrak dan kenderaan tidak signifikan secara statistik kerana hanya beberapa tikus yang mengalami tahap perubahan patologi ini (data tidak ditunjukkan).

Rajah 1. Pengurangan kejadian hiperplasia dengan rawatan dengan ekstrak air C. deserticola (Cistancheekstrak). Tgfb1 plus /-Rag2-/- tikus diberi makanCistancheekstrakdalam air minuman (Kumpulan Ekstrak) berbanding dengan air minuman biasa sahaja (Kumpulan kenderaan). Lesi kanser dalam usus telah diperiksa oleh histologi dengan pewarnaan H&E. (A) Imej tipikal bahagian tisu yang sihat. (B) Imej tipikal hiperplasia dalam bahagian, ditunjukkan oleh anak panah. (C) Bilangan hiperplasia dalam usus setiap haiwan dikira oleh histologi (p=0.0133, ekstrak berbanding kenderaan, n=15). Angka ini boleh didapati dalam warna dalam talian di wileyonlinelibrary.com/journal/ptr

Kandungan mikrob usus, terutamanya jangkitan H. hepaticus, telah ditunjukkan diperlukan untuk perkembangan semua peringkat kanser kolon termasuk hiperplasia dalam Rag2^-/- tikus (Engle et al., 2002; Erdman et al., 2003). Untuk memeriksa sama ada rawatan denganCistancheekstrakmengurangkan mikroflora patologi dalam usus, kehadiran H. hepaticus dalam najis daripada tikus yang dirawat denganCistancheekstraktelah ditentukan oleh PCR berbanding dengan kawalan kenderaan. Dalam setiap eksperimen, tiga tikus setiap sangkar dirawat dengan ekstrak Cistanche atau kenderaan. Sampel najis dikumpul pada penghujung 14-j tempoh semalaman selepas sangkar dibersihkan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2, H. hepaticus 16S rDNA dalam najis telah dikesan dengan cekap oleh teknik PCR. Dalam tiga eksperimen berasingan (Jadual 1), hanya 20–40 peratus daripada sampel daripadaCistanche-ekstrak-tikus yang dirawat dikesan sebagai PCR positif, manakala 60–80 peratus daripada kawalan kenderaan adalah positif (ekstrak vs. kenderaan: p=0.0189, ujian-t, n=3), mencadangkan bahawa rawatan dengan Ekstrak cistanche mengurangkan jangkitan H. hepaticus usus pada tikus.

Rawatan dengan ekstrak Cistanche meningkatkan bilangan makrofaj splenik dan sel NK

Tindak balas imun memainkan peranan penting dalam menghapuskan jangkitan helicobacter. Untuk memeriksa jikaCistanche ekstrakrawatan menjejaskan sistem imun pada tikus yang terdedah kepada kanser kolon ini, saiz limpa (12 tikus dalam setiap kumpulan), dan bilangan splenosit (enam tikus dipilih secara rawak daripada setiap kumpulan) ditentukan pada akhir rawatan. Limpa 12 tikus dalam setiap kumpulan ditimbang, tiga tikus lain dalam eksperimen awal tidak dimasukkan. Seperti yang digambarkan dalam Jadual 2,Cistanche-ekstrak-tikus yang dirawat (0.055 tambah -0.022 g/limpa) adalah lebih berat daripada dalam kumpulan kenderaan (0.038 tambah -0.01 g/limpa; ekstrak lwn. kenderaan: p=0.04, ujian-t). Data ini disokong lagi oleh peningkatan bilangan splenosit pada tikus yang dirawatCistancheekstrak, ditunjukkan dengan 7.095 tambah -1.353 (x10⁶ sel/limpa) berbanding dengan 2.941 tambah -1.492 (x10⁶sel/limpa) tikus kawalan dalam kenderaan (ekstrak vs. kenderaan: p=0.002, ujian-t).

Untuk menilai lagi sama adaCistancheekstrakrawatan menjejaskan subjenis splenosit tertentu pada tikus, bilangan sel NK splenik (CD3^-CD49b^{tambah lagi}sel) dan makrofaj (FT/80^{tambah lagi}sel) telah dikira oleh analisis FACS. Peratusan CD3^-CD49b^{tambah lagi}sel dalam splenosit daripadaCistanche-ekstrak-tikus yang dirawat (32.06 tambah -2.13 peratus ) tidak jauh berbeza daripada tikus yang dirawat kenderaan (28.47 tambah -2.74 peratus ; ekstrak lwn. kenderaan: p=0. 3741, ujian-t, n=6), tetapi jumlah bilangan sel NK dalam limpaCistanche-ekstrak-tikus yang dirawat (2.22 tambah - 0.44x10⁶/limpa) adalah lebih tinggi daripada kumpulan kawalan dalam kenderaan itu (0.83 ditambah -0.17x10⁶/limpa; ekstrak lwn. kenderaan: p=0.01, ujian-t, n=6; Rajah 3B). Keputusan yang sama dilihat dalam pemeriksaan sel splenik FT/80 plus; seperti dalam populasi sel NK splenik, perbezaan dalam peratusan sel FT/80 plus splenik antara tikus yang dirawat ekstrak (35.25 tambah -7.28 peratus ) dan tikus kawalan kenderaan (31.74 tambah -5. 07 peratus ) tidak signifikan (ekstrak lwn. kenderaan: p=0.407, n=6), tetapi jumlah bilangan makrofaj splenik dalam kumpulan yang dirawat ekstrak (2.439 tambah -0 .452x10⁶sel/limpa) adalah lebih tinggi daripada kumpulan kawalan (1.114 tambah -0.685x10⁶sel/limpa; ekstrak lwn. kenderaan: p=0.001, ujian-t, n=6; Rajah 3D). Diambil bersama, data ini mencadangkan bahawa rawatan denganCistancheekstrakboleh meningkatkan jumlah bilangan, tetapi bukan peratusan atau perkadaran, subjenis splenosit effector, sel NK dan makrofaj dalam limpa.

Rajah 3. Peningkatan bilangan sel NK splenik dan makrofaj dengan rawatan denganCistancheekstrak. Sel NK atau makrofaj dalam penggantungan splenocyte ditentukan oleh analisis FACS dengan pewarnaan gabungan antibodi FITC-anti-CD3e dan penanda sel APC-anti-CD49b/Pan-NK (untuk sel NK) atau dengan noda tunggal FITC-anti- FT/80 (untuk makrofaj). (A) Graf perwakilan peratusan sel NK splenik (CD3^-CD49b^{tambah lagi}) dalam splenosit tikus yang dirawat denganCistancheekstrakberbanding kenderaan. (B) Jumlah bilangan sel NK setiap limpa. Data dibentangkan sebagai min tambah -SD dalam setiap kumpulan (p= 0.01, n= 6). (C) Graf perwakilan peratusan makrofaj splenik (FT/80 plus) dalam splenosit tikus yang dirawat denganCistancheekstrakberbanding kenderaan. (D) Jumlah bilangan makrofaj setiap limpa. Data dibentangkan sebagai min tambah -SD dalam setiap kumpulan (p= 0.001, n=6).

Rawatan dengan ekstrak Cistanche merangsang sitotoksisiti splenosit dalam vivo dan in vitro

Tindak balas imun bergantung bukan sahaja pada bilangan splenosit tetapi juga fungsinya, seperti sitotoksisiti. Kesan daripadaCistancheekstrakrawatan terhadap fungsi splenosit (iaitu sitotoksisiti) telah diperiksa dalam kultur bersama dengan sel SW480. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4A, sitotoksisiti splenosit daripada tikus yang dirawat denganCistancheekstrakadalah lebih tinggi daripada sel daripada tikus yang dirawat dengan kenderaan, ditunjukkan oleh 39.38 ditambah -2.64 peratus pembebasan calcein-AM dalam kultur bersama splenosit yang dirawat ekstrak dengan sel SW480 pada 6 nisbah :1, 51.11 tambah -2.6 peratus pada nisbah 3:1 dan 57.33 tambah -2.53 peratus pada nisbah 1.5:1, berbanding dengan 27.75- 0.18 peratus dalam kultur bersama splenosit yang dirawat kenderaan dengan sel SW480 pada nisbah 6:1, 40.97 =-2.85 peratus pada nisbah 3:1 dan 45.16 tambah -0.18 peratus pada Nisbah 1.5:1 (ekstrak vs. kenderaan: p < 0.0001,="" anova="" dua="" hala).="" untuk="" mengesahkan="" lagi="" kesan="" rangsangan="">Cistancheekstrakpada sitotoksisiti splenosit, sitotoksisitiCistanche-ekstraksplenosit naif yang dirawat daripada tikus B6, yang mengandungi sel T dan B berfungsi, telah diperiksa dalam kultur bersama dengan sel SW480. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4B, penambahanCistancheekstrak(100 mg/mL) dengan ketara meningkatkan pelepasan calcein-AM dalam kultur bersama dalam cara bergantung kepada splenocyte: 57.64 tambah -3.41 peratus pada nisbah 12:1, 52.25 tambah { {11}}.77 peratus pada nisbah 6:1 dan 45.72 tambah -2.43 peratus pada nisbah 3:1, berbanding dengan 14.36 tambah -0.05 peratus pada nisbah 12:1 , 20.67 campur -2.03 peratus pada nisbah 6:1 dan 23.1 tambah -3.73 peratus pada nisbah 3:1 dalam kultur bersama yang tidak dirangsang (ekstrak vs. kenderaan: p < 0.0001,="" dua="" -cara="" anova).="" keputusan="" ini="" menunjukkan="">Cistancheekstrakmerangsang aktiviti litik splenosit. Sebab mengapa kurang sitotoksisiti dilihat apabila lebih banyak splenosit effector ditambah tidak diketahui. Satu kemungkinan ialah tahap pelepasan calcein-AM dalam sistem kultur bersama ini mungkin tidak betul-betul mencerminkan kematian sel sasaran kerana calcein-AM boleh diserap semula oleh splenocytes effector selepas tempoh inkubasi yang panjang.

Ekstrak cistanche mengaktifkan makrofaj

Pengaktifan makrofaj adalah salah satu tindak balas imun yang kritikal terhadap jangkitan dan perkembangan tumor (Mantovani et al., 2002, 2008). Untuk mendedahkan lagi pandangan tentang mekanisme yang digunakanCistancheekstrakrawatan mengurangkan hiperplasia usus dan kandungan mikrob, kesan daripadaCistancheekstrakpada pengeluaran NO dan fagositosis makrofaj, sel RAW264.7, telah diperiksa. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5A, ekspresi protein NOS II dikawal selia dalam kultur selepas pengeraman denganCistancheekstrak. Keputusan ini disokong lagi oleh peningkatan dalam pengeluaran NO dalamEkstrak cistanche dirangsangkultur (Rajah 5B), dibuktikan dengan 3.88 ditambah -0.13 mM nitrit dalam 50 mg/mLCistancheekstrakmerangsang kultur sel RAW264.7 berbanding dengan 0.11 ditambah -0.12 mM nitrit dalam kultur kawalan tidak dirangsang (ANOVA sehala, p<>

Fagositosis ialah proses selular menelan zarah pepejal, seperti bakteria. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5C dan D, penambahan bagiCistancheekstrakmerangsang fagositosis makrofaj, seperti yang ditunjukkan oleh lebih banyak sel fagositik (9.8 tambah -0.1 peratus ) ditemui dalamCistanche-ekstrak-kultur makrofaj yang dirangsang berbanding dengan yang (5.2 tambah -0.4 peratus ) dalam kultur yang dirangsang kenderaan (ekstrak berbanding kenderaan: p=0.0007, ujian-t, n=3) selepas pengeraman 2 jam. Data ini mencadangkan bahawaCistancheekstrakboleh secara langsung mengaktifkan makrofaj dengan mengawal selia pengeluaran NO tempatan dan rangsangan fagositosis makrofaj dalam usus tikus.

PERBINCANGAN

Kajian ini menunjukkan buat kali pertama bahawa pentadbiran lisanCistancheekstrakmengurangkan dengan ketara kekerapan hiperplasia dan jangkitan H. hepaticus dalam usus tikus yang terdedah kepada kanser kolon. Kesan berfaedah daripadaCistancheekstrakrawatan dikaitkan dengan peningkatan bilangan dan sitotoksisiti sel NK splenik dan makrofaj. Penambahan in vitro daripadaCistancheekstrakmerangsang pengeluaran NO dan fagositosis dalam makrofaj. Rag2 kekurangan TGF-b1^-/-tikus telah ditunjukkan untuk membina kanser kolon (hiperplasia, adenoma, atau adenokarsinoma) dari umur 3 hingga 6 bulan, dan telah ditunjukkan bahawaradangfokus sentiasa dikaitkan dengan lesi tumorigenik ini (Engle et al., 1999). Kajian lanjut telah menunjukkan bahawa dalam tikus ini perkembangan kanser kolon diperlukan untuk kehadiran jangkitan flora mikrob patogen kerana kanser kolon dihapuskan sepenuhnya oleh tikus perumahan dalam keadaan bebas kuman (Engle et al., 2002), dan H. hepaticus jangkitan juga mendorong kolitis dan karsinoma usus besar dalam Rag2-/-tikus (Erdman et al., 2003). Begitu juga, pada manusia, status mikrob dan imuniti perumah adalah faktor utama untuk perkembangan IBD (Fiocchi, 1998), dan karsinoma gastrik telah dilaporkan dikaitkan dengan jangkitan atau keradangan kronik yang disebabkan oleh H. pylori (Parsonnet et al., 1991; El-Omar dan Malfertheiner, 2001). Penemuan daripada kajian ini menunjukkan bahawa jangkitan gastrousus mungkin memainkan peranan penting dalam perkembangan kanser kolon. Oleh itu, menyasarkan jangkitan gastrousus boleh menjadi strategi terapeutik untuk pencegahan atau rawatan kanser kolon serta IBD. Kajian kami menunjukkan buat kali pertama bahawa pentadbiran lisanCistancheekstrakmengurangkan kekerapanradanghiperplasiadalam usus, dan bilangan H. hepaticus dalam najis dalam tikus kekurangan TGF-b1. Kesan berfaedah daripadaCistanche ekstrakmungkin disebabkan oleh pengaktifan makrofajnya, seperti yang dilihat oleh peningkatan dalam pengeluaran NO dan fagositosis selepas rawatan denganCistancheekstrak(Rajah 5), yang mungkin mengehadkan mikroflora patogenik usus termasuk helicobacter (Mantovani et al., 2002, 2008). Akibatnya, lesiradanghiperplasiatelah dikurangkan.

Pelbagai sebatian bioaktif telah dikenal pasti dalam ekstrak C. deserticola termasuk glikosida phenylethanoid dan polisakarida (Jiang dan Tu, 2009). Glikosida phenylethanoid adalah sitoprotektif, yang ditunjukkan oleh fakta bahawa sebatian ini menghalang kematian sel dalam hepatosit berbudaya dan neuron granul cerebellar (Xiong et al., 1998; Pu et al., 2003). Manakala polisakarida merangsang pembiakan T- dan B-limfosit yang disebabkan oleh mitogen (Wu dan Tu, 2005; Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Telah didokumentasikan dengan baik bahawa polisakarida herba memodulasi tindak balas imun (Jiang et al., 2010).Cistancheekstrakmengandungi 2–3 peratus feniletanoid dan 65–70 peratus polisakarida, menunjukkan bahawa kesan imunomodulasiCistancheekstrakrawatan mungkin disebabkan oleh aktiviti imunoregulasi polisakarida, majoriti bahan bioaktif dalam ekstrak Cistanche. Walau bagaimanapun, sel imun sasarannya (cth makrofaj atau sel NK, atau kedua-duanya) dan laluan molekul memerlukan penyiasatan lanjut. Di samping itu, kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa pentadbiran phenylethanoid acetonide herba, salah satu phenylethanoids bioaktif dalam ekstrak C. deserticola (Xiong et al., 1996; Jiang dan Tu, 2009), mempunyai kesan yang baik terhadap pengurangan dextran. kolitis yang disebabkan oleh sulfat-natrium pada tikus (Hausmann et al., 2007), membuktikan bahawa phenylethanoids (2-3 peratus) dalamCistancheekstrakboleh menyumbang sekurang-kurangnya sebahagiannya kepada keberkesanannya dalam penurunan dalamradanghiperplasia, yang juga memerlukan penilaian pada masa hadapan.
Kesimpulannya, kanser kolorektal adalah salah satu kanser yang paling lazim di seluruh dunia dan boleh dicegah dalam kebanyakan kes. Penggunaan ekstrak herba bukan toksik boleh menawarkan strategi yang berkesan untuk mencegah perkembangan kanser kolorektal, dan juga boleh digunakan sebagai kemo-pembantu, yang boleh memberi manfaat kepada peningkatan keberkesanan antikanser kemoterapi, dan/atau pengurangan kemoterapi. kesan sampingan. Data yang dibentangkan dalam kajian ini jelas menunjukkan bahawa rawatan dengan ekstrak air C. deserticola mengurangkan hiperplasia dan jangkitan H. hepaticus dalam usus tikus yang terdedah kepada kanser kolon. Jangkitan Helicobacter atau ususkeradanganhiperplasiaadalah faktor risiko untuk perkembangan kanser kolorektal. Kajian semasa kami menunjukkan bahawa penggunaan herba ini mungkin mempunyai potensi untuk pencegahan dan rawatan kanser kolorektal, terutamanya bagi individu yang mempunyai IBD.

Pengakuan

YM disokong oleh biasiswa pelajar siswazah daripada Majlis Biasiswa China.

Konflik Kepentingan

Pengarang tidak mempunyai konflik kepentingan.

Cistancheekstrakboleh mengurangkanMeradanghiperplasia

Daripada: 'PenguranganMeradangHiperplasiadalam Usus dalam Tikus yang terdedah kepada Kanser Kolon oleh Air-ekstrak daripadaCistanchedeserticola ' oleh Yamin Jia,1,2 et al

---Hak Cipta © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Phytother. Res. 26: 812–819 (2012) DOI: 10.1002/ptr.3637

RUJUKAN

Burgdorf SK, Nielsen HJ, Rosenberg J. 2009. Imunoterapi dalam kanser kolorektal. Scand J Gastroenterol 44: 261–268.
Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. 2010. Aktiviti antikeletihan ekstrak kaya phenylethanoid daripadaCistanchedeserticola. Phytother Res 24: 313–315.
Chao A, Thun MJ, Connell CJ, et al. 2005. Pengambilan daging dan risiko kanser kolorektal. JAMA 293: 172–182.
Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ, et al. 2010. Kanser kolorektal. Lancet 375: 1030–1047.
Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. 2007. Pencirian struktur dan aktiviti imunologi dua polisakarida yang boleh diekstrak air sejuk daripadaCistanchedeserticola YC. Mak. Karbohidrat Res 342: 1343–1349.
Du C, Guan Q, Diao H, Yin Z, Jevnikar AM. 2006. Nitrik oksida mendorong apoptosis dalam sel epitelium tiub buah pinggang melalui pengaktifan caspase-8. Am J Physiol Renal Physiol 290: F1044–1054.
Dubois M, Gilles KAJK, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Kaedah kolorimetrik untuk penentuan gula bahan berkaitan. Chem Dubur 28: 350–356.

Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. 2001. Risiko kanser kolorektal dalam kolitis ulseratif: meta-analisis. Usus 48: 526–535.
El-Omar EM, Malfertheiner P. 2001. Helicobacter pylori dan kanser gastrik. Curr Opin Gastroenterol 17(Bekalan 1): S24-S27.
Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, ​​Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999. Mengubah faktor pertumbuhan beta1 menindas kanser kolon bukan metastatik pada peringkat awal tumorigenesis. Kanser Res 59: 3379–3386.
Engle SJ, Ormsby I, Pawlowski S, et al. 2002. Penghapusan kanser kolon dalam tikus kekurangan faktor-beta 1-perubahan bebas kuman. Kanser Res 62: 6362–6366.
Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M, et al. 2003. CD4 campur CD25 serta limfosit T kawal selia menghalang kanser kolon yang disebabkan oleh mikrob dalam tikus yang kurang2-Rag. Am J Pathol 162: 691–702.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. 2010. Anggaran beban kanser di seluruh dunia pada tahun 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127: 2893–2917.
Fiocchi C. 1998.Meradangpenyakit usus: etiologi dan patogenesis. Gastroenterologi 115: 182–205.
Hausmann M, Obermeier F, Paper DH, et al. 2007. Rawatan in vivo dengan acteoside phenylethanoid herba memulihkan keradangan usus dalam kolitis akibat natrium dekstran sulfat. Clin Exp Immunol 148: 373–381.
Jiang MH, Zhu L, Jiang JG. 2010. Tindakan imunoregulasi polisakarida daripada ubat herba Cina. Pendapat Pakar Sasaran 14: 1367–1402.
Jiang Y, Tu PF. 2009. Analisis juzuk kimia dalamCistanchespesis. J Chromatogr A 1216: 1970–1979.
Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CR. 2002. Anti-nociceptive dan anti-radangaktiviti yang disebabkan olehCistanchedeserticola dalam tikus. J Ethnopharmacol 83: 177–182.
Lukas M. 2010.Meradangpenyakit usus sebagai faktor risiko kanser kolorektal. Gali Dis 28: 619–624.
Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. 2008. Keradangan berkaitan kanser. Alam 454: 436–444.
Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. 2002. Polarisasi makrofaj: makrofaj yang berkaitan dengan tumor sebagai paradigma untuk fagosit mononuklear M2 terpolarisasi. Trend Immunol 23: 549–555.
Neri S, Mariani E, Meneghetti A, Cattini L, Facchini A. 2001. Ujian sitotoksisiti Calcein-acetoxymethyl: penyeragaman kaedah yang membenarkan analisis tambahan pada sel dan supernatan effector yang dipulihkan. Clin Diagn Lab Immunol 8: 1131–1135.
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Wang YC. 2005. Peningkatan pengeluaran glikosida phenylethanoid olehCistanchesel deserticola dibiakkan dalam bioreaktor pengangkat udara gelung dalaman dengan penaik penapis. Enzim Mikrob Technol 36: 982–988.
Park Y, Hunter DJ, Spiegelman D, et al. 2005. Pengambilan serat pemakanan dan risiko kanser kolorektal: analisis terkumpul kajian kohort prospektif. JAMA 294: 2849–2857.
Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al. 1991. Jangkitan Helicobacter pylori dan risiko karsinoma gastrik. N Engl J Med 325: 1127–1131.
Pu X, Song Z, Li Y, Tu P, Li H. 2003. Acteoside fromCistanchesalsa menghalang apoptosis oleh 1-metil-4-ion phenylpyridinium dalam neuron granul cerebellar. Planta Med 69: 65–66.
Shames B, Fox JG, Dewhirst F, Yan L, Shen Z, Taylor NS. 1995. Pengenalpastian jangkitan Helicobacter hepaticus yang meluas dalam najis dalam koloni tikus komersial melalui kultur dan ujian PCR. J Clin Microbiol 33: 2968–2972.
Strate LL, Syngal S. 2005. Sindrom kanser kolorektal keturunan. Kawalan Punca Kanser 16: 201–213.
Von Roon AC, Reese G, Teare J, Constantinides V, Darzi AW, Tekkis PP. 2007. Risiko kanser pada pesakit dengan penyakit Crohn. Dis Colon Rectum 50: 839–855.
Wu TF, Hsu CY, Huang HS, Chou SP, Wu H. 2007. Analisis proteomik kesan pycnogenol dalam RAW 264.7 makrofaj mendedahkan induksi ekspresi cathepsin D dan peningkatan fagositosis. J Agric Food Chem 55: 9784–9791.
Wu XM, Gao XM, Tsim KW, Tu PF. 2005. Arabinogalactan diasingkan daripada batangCistanchedeserticola mendorong pembiakan limfosit berbudaya. Int J Biol Macromol 37: 278–282.
Wu XM, Tu PF. 2005. Isolation and characterization of alpha-(1-->6)-glukan daripadaCistanchedeserticola. J Asian Nat Prod Res 7: 823–828.
Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. 1998. Aktiviti hepatoprotektif feniletanoid daripadaCistanchedeserticola. Planta Med 64: 120–125.
Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. 1996. Kesan antioksidan phenylethanoids daripadaCistanchedeserticola. Biol Pharm Bull 19: 1580–1585.