Analisis trajektori mengenal pasti perkembangan keturunan CD8 ditambah sel T dan populasi peralihan yang berbeza. Berdasarkan fakta bahawa kluster 1 berada di tengah-tengah kluster TEX, TRM, dan TEM yang boleh dibezakan, dan kluster 1 itu memaparkan ekspresi perantaraan beberapa tandatangan gen (TRM, TEX, Tperiph) dan TF (Crem, Tcf7, Tox, Klf2 , dan Klf6) (Rajah 6, D–F, dan Rajah 7B), kami membuat hipotesis bahawa kelompok 1 mewakili populasi peralihan yang sedang dalam proses membezakan daripada fenotip persisian kepada mana-mana satu daripada 3 destinasi terminal yang lebih berbeza. Menariknya, sel peralihan yang berpotensi serupa telah dikenal pasti dalam model tumor di mana sel juga mempamerkan fenotip yang letih atau effector (34). Untuk menilai hipotesis ini, kami melakukan analisis perkembangan keturunan pengiraan (Rajah 7, C, dan D). Analisis ini menggambarkan perkembangan daripada sel naif kepada sel ingatan, diikuti dengan pencerobohan tisu buah pinggang, di mana sel pada mulanya menunjukkan fenotip "peralihan". Dari situ, algoritma meramalkan sel berkembang menjadi fenotip TEM (kluster 6), TEX (kluster 2), atau TRM (kluster 3).

Klik pada Faedah Cistanche Tubulosa

【Untuk maklumat lanjut: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Menurut kajian yang berkaitan, cistanche adalah herba tradisional Cina yang telah digunakan selama berabad-abad untuk merawat pelbagai penyakit. Ia telah terbukti secara saintifik mempunyai ciri anti-radang, anti-penuaan, dan antioksidan. Kajian telah menunjukkan bahawa cistanche bermanfaat untuk pesakit yang menghidap penyakit buah pinggang. Bahan aktif cistanche diketahui dapat mengurangkan keradangan, meningkatkan fungsi buah pinggang dan memulihkan sel-sel buah pinggang yang rosak. Oleh itu, menyepadukan cistanche dalam pelan rawatan penyakit buah pinggang boleh menawarkan manfaat yang besar kepada pesakit dalam menguruskan keadaan mereka. Cistanche membantu mengurangkan proteinuria, merendahkan paras BUN dan kreatinin, dan mengurangkan risiko kerosakan buah pinggang selanjutnya. Selain itu, cistanche juga membantu mengurangkan paras kolesterol dan trigliserida yang boleh merbahaya kepada pesakit yang menghidap penyakit buah pinggang.

Pengembangan dan percambahan klon dikaitkan dengan fenotip yang letih dalam KIT. Jika model bahawa sel T autoreaktif memasuki buah pinggang dan kemudian menjadi letih sebagai sebahagian daripada mekanisme pemeliharaan diri adalah betul, kami menjangkakan gugusan peralihan dan letih untuk menampung sel T berkembang secara klon, dengan beberapa klon merangkumi kedua-dua kelompok, mencadangkan perkembangan dinamik. Untuk menguji ini, kami melakukan TCR-Seq sel tunggal, yang membenarkan pengesanan keturunan klon di kalangan kelompok dalam kedua-dua model genetik murine LN (MRL-TCR-Seq dan Yaa-TCR-Seq, masing-masing).

Data transkrip dari semua 3 kohort telah digabungkan menjadi UMAP tunggal menggunakan Harmony (Rajah 8A). Menggunakan GSEA dan pemetaan kluster kohort Main-Seq, kami mengenal pasti, dalam plot UMAP gabungan, kluster dengan memori letih, effector, residen dan fenotip peralihan (Rajah 8, B, dan C). Walaupun meneliti 2 model nefritis spontan yang unik dengan tahap penyakit histologi yang berubah-ubah (Tambahan Rajah 4 dan Jadual Tambahan 2), komposisi kelompok sel T KIT adalah agak serupa (Tambahan Rajah 5 dan Tambahan Rajah 6, A dan B), Apabila menilai kelompok mengikut model, hanya kelompok IFNhi diwakili secara berbeza, ditambah antara Fc R2B–/–.Yaa KIT. Ini mewakili salah satu kelompok kecil, dan peningkatan dalam sel IFNhi dijangka berdasarkan data terdahulu (35). Untuk menilai sama ada kebolehubahan tetikus-ke-tikus dalam pengedaran kluster, terutamanya mengenai populasi yang letih, dikaitkan dengan status histologi, kami melakukan analisis regresi linear glomerulonephritis serta skor nefritis interstisial berbanding peratusan sel dalam kelompok yang letih. dan tidak menemui perkaitan yang ketara (Tambahan Rajah 6C). Dengan analisis histologi (Tambahan Rajah 4 dan Jadual Tambahan 2) MRL/lpr tikus 5 mempunyai penyakit yang paling teruk dan skor keletihan terminal tertinggi; Walau bagaimanapun, baki tikus dengan tahap penyakit yang berubah-ubah tidak menawarkan sebarang korelasi tambahan antara skor penyakit histologi dan fenotip sel T CD8 ditambah. Secara keseluruhannya, 2 model murine lupus yang berbeza secara genetik ini mempunyai perwakilan kelompok yang sangat serupa di antara KIT mereka, menunjukkan pada tahap sel tunggal bahawa proses yang mendasari nefritis interstisial tidak khusus model (Rajah Tambahan 5 dan 6).

We identified expanded T cell clones in each of the mice evaluated, consistent with previous reports in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) (36–38). High-frequency CD8 clones (top quartile)   were defined as a TCR shared between ≥13 T cells (or a frequency of ~1%) in MRL-TCR–Seq and between ≥40 T cells (or a frequency of ~3%) in Yaa-TCR–Seq (Figure 8D). In the combined UMAP, 2   distinct clusters of exhausted cells were observed. The rightmost cluster (Figure 8E) exhibited a significantly (P < 0.0001) higher exhaustion gene signature, which we denote as a terminally exhausted cluster  (Figure 8F). In the MRL/lpr model the great majority of the high-frequency clones mapped to the exhausted clusters (comprising about 79% of all high-frequency clones), which is a significant enrichment compared with T cells expressing unique TCRs (P < 0.0001, Figure 8, D and G). There was a less robust expansion of clonal T cells in the FcγR2B–/–.Yaa model, with 34.4% of high-frequency clones mapping to the 2 exhausted clusters, compared with an expected 23.1% of all T cells (P < 0.0001).  Notably, there was significant clonal expansion observed in the terminal exhaustion cluster: among T   cells expressing unique TCRs, the terminal exhaustion cluster comprised only 3.12%; whereas among high-frequency clones, the terminal exhaustion cluster comprised 17.3% of cells (P < 0.0001). The 2   other clusters displayed expansion of the high-frequency clones in the FcγR2B–/–.Yaa mice were  TRM cells and the transitional group. The transitional cluster represented 17.1% of cells with unique  TCRs compared with 23.9% of the high-frequency clones (P < 0.05, Figure 8G). Importantly, and consistent with TIL data (39), higher clonal abundance was progressively correlated with higher exhaustion scores as measured for high-frequency, moderate-frequency (>4 sel T berkongsi TCR), dikongsi (2–4 sel), dan klon unik (Rajah 8F).

Dijangkakan, terdapat sedikit pertindihan antara TCR antara tikus. Tiada satu pun daripada klon teratas menunjukkan pertindihan antara model MRL/lpr dan Fc R2B–/–.Yaa. Apabila memeriksa 10 klon teratas daripada setiap model, hanya klon teratas menunjukkan sebarang pertindihan. Dalam setiap kes, hampir semua TCR yang berkongsi kawasan CDR3 yang sama timbul daripada satu tetikus, dengan 1 klon timbul daripada tetikus kedua dalam kohort MRL/lpr. Walaupun 3 tikus dalam kohort Fc R2B–/–.Yaa menyatakan jujukan klon teratas, 168 sel T timbul daripada 1 tetikus manakala hanya 1 masing-masing timbul daripada 2 tikus lain (data tidak ditunjukkan). Kami tidak pasti sama ada ini benar, kejadian bebas bagi jujukan TCR yang sama atau hasil daripada ralat penyahmultipleksan yang jarang berlaku yang timbul daripada penggandaan tidak ditapis.

Merancang pengedaran 20 klon frekuensi tertinggi teratas (Tambahan Rajah 7) membolehkan kami menilai sejauh mana klon besar menjangkau kelompok, yang seterusnya menghubungkan secara langsung evolusi klon ini ke atas fenotip kelompok. Dalam setiap klon MRL/lpr frekuensi tinggi, ahli ditemui dalam kelompok TEX peralihan, TEX dan terminal. Dalam model Yaa, majoriti klon frekuensi tertinggi juga diwakili dalam gugusan peralihan serta yang lebih dibezakan secara terminal, termasuk kedua-dua kelompok TEX dan TRM. Klon ini memberikan bukti langsung bahawa keturunan peralihan sel yang sama antara keadaan berbeza dalam buah pinggang. Diambil bersama, data ini menyokong analisis trajektori (Rajah 7D), dengan pengembangan klon dalam petak peralihan diikuti dengan pembezaan terminal.

Percambahan dalam kelompok yang habis. Klon yang diperkembangkan dalam gugusan habis boleh terhasil daripada percambahan berterusan selepas pembezaan ke dalam gugusan tersebut atau boleh menjadi produk pembezaan terminal yang tidak membahagikan prekursor peralihan pembahagi mereka. Untuk membezakan kemungkinan ini, kami mengukur keadaan kitaran sel setiap kelompok menggunakan skor untuk ekspresi set gen yang menunjukkan fasa kitaran sel. Seperti yang dijangkakan, kelompok proliferatif (Rajah 8B) diperkaya dalam fasa S dan pada tahap yang lebih rendah gen G2 / M. Kelompok keletihan KIT mempunyai fasa S yang tinggi dan ketara dan skor G2/M dalam kedua-dua strain tikus (Rajah 8H). Sebaliknya, kelompok naif, TRM, dan TCM mempamerkan ekspresi gen fasa G1 yang diperkaya dengan ketara, menunjukkan populasi yang stabil dan berehat. Ini menyokong konsep bahawa sel-sel letih terus membiak dan pengembangan klon boleh berlaku sekurang-kurangnya sebahagiannya selepas pembezaan letih, menunjukkan bahawa sel-sel letih sedang merasakan isyarat TCR dan boleh menyumbang secara langsung kepada patogenesis.

Perbincangan

Kami sebelum ini melaporkan bahawa KIT dalam 3 model lupus murine yang berbeza mempamerkan "keletihan" yang berfungsi dan transkrip, dengan ciri-ciri yang selari dengan TIL dalam tumor yang sedang berkembang (6, 14, 40). Namun, nefritis dalam kedua-dua tikus yang terdedah kepada lupus dan pesakit dengan SLE mengakibatkan kemusnahan muktamad tisu dan kehilangan fungsi organ. Proses dinamik yang mendamaikan 2 penemuan ini, dan yang menerangkan bagaimana pemusnahan buah pinggang autoimun berlaku dan pada masa yang sama boleh dihalang melalui keletihan dan mekanisme lain, belum dijelaskan. Di sini, kami telah menggunakan scRNA-Seq dan TCR-Seq untuk mendedahkan heterogeniti yang ketara di kalangan KIT dan kemungkinan laluan progresif yang menghubungkan klon CD4 plus dan CD8 plus T yang mula diaktifkan dan berpotensi merosakkan kepada populasi sel yang letih. Bersama-sama, kajian ini memberikan pandangan tentang patogenesis LN dan maklumat yang berpotensi boleh diambil tindakan untuk strategi rawatan baru.

Matlamat utama kerja ini adalah untuk menentukan populasi mana yang mungkin menyumbang kepada kerosakan di LN. Walaupun banyak populasi sel telah terlibat dalam patogenesis LN, termasuk sel dendritik, makrofaj, sel B, dan neutrofil (41), dalam kerja terdahulu kami, kami menentukan bahawa sel T mempamerkan pengembangan terbesar dalam tikus nefritik berbanding dengan tikus bukan nephritik. (6). Mereka juga mempamerkan ciri fungsi yang unik, dan oleh itu kami memilih populasi ini untuk analisis lanjut. Walau bagaimanapun, kemungkinan besar banyak populasi sel lain mungkin menyumbang kepada penyakit yang diperhatikan pada kedua-dua tikus dan manusia. Dalam petak CD4 tambah, pengelompokan berdasarkan ekspresi gen tidak mendedahkan keadaan pembezaan sel CD4 ditambah T klasik, termasuk sel Th1, Th2, atau Th17; sebaliknya, beberapa kluster dikaitkan dengan ciri transkrip hibrid kedua-dua sel Th1 dan Th2 (Rajah 2). Ini akan berhujah bahawa paradigma Th klasik tidak semestinya memegang dalam sistem pengaktifan imun kompleks dalam tisu, seperti yang telah diperhatikan oleh orang lain (11, 42). Sel T hibrid Th1/Th2 boleh menimbulkan tindak balas terhad sendiri yang berfungsi untuk mengehadkan imunopatologi yang berlebihan (43, 44).

Analisis trajektori dan pemetaan ekspresi gen mencadangkan model berikut untuk evolusi CD4 ditambah KIT: sel T CD4 campur T reaktif diri sitotoksik yang timbul di pinggir menyusup ke dalam buah pinggang, dan selepas permulaan keradangan dan kerosakan organ sementara, menimbulkan lebih banyak hipoksik dan populasi sel T yang letih/tidak berfungsi, mengakibatkan keradangan yang membara. Penindasan akibat hipoksia dan status tidak berfungsi sel T tersebut telah didokumenkan dengan baik, menyokong model ini (3, 45); kerja baru-baru ini menunjukkan bahawa hipoksia secara langsung mendorong keletihan sel T (46) selaras dengan penemuan kami dalam kerja ini. Pengaktifan awal yang dicadangkan di pinggir meramalkan bahawa beberapa antigen yang diiktiraf oleh sel CD4 ditambah T di pinggir mungkin juga dibentangkan dalam buah pinggang dan/atau antigen khusus buah pinggang dibentangkan di pinggir selepas kerosakan dan pembebasan buah pinggang awal.

Antara KIT CD8 tambah, kami mengenal pasti beberapa populasi, termasuk TCM, TEM, TRM, IFNhi dan TEX, serta populasi peralihan. Tumpuan khusus, memandangkan penemuan terdahulu kami dan kesusasteraan TIL (2, 6, 14), adalah kelompok sel yang letih. Sel TEX dikaitkan dengan TFs Tox dan Eomes, pengantara keletihan yang didokumenkan (31–33). Tambahan pula, reseptor glukokortikoid NR3C1, yang baru-baru ini dikenal pasti sebagai mekanisme menggalakkan disfungsi sel T dalam tumor (47), adalah pemacu transkrip yang berpotensi bagi fenotip TEX dalam sistem ini. Peranan penduduk peralihan, yang kami jelaskan di sini buat kali pertama untuk pengetahuan kami, mungkin menjadi kunci dalam memahami proses dinamik yang berlaku dalam buah pinggang apabila penyakit itu ditubuhkan. Pemetaan trajektori meletakkan sel-sel ini di persimpangan sel T periferal autoreaktif dan KIT yang dibezakan secara terminal, yang akan menyusup ke buah pinggang dalam konteks masa pseudo.

Dalam model MRL/lpr, TCR yang berkembang secara klon merangkumi populasi peralihan dan TEX, menunjukkan pergerakan dinamik antara kelompok, seperti yang diramalkan oleh model trajektori. Dalam model Fc R2B–/–.Yaa, klon lebih diperluaskan; walaupun pengembangan yang ketara dilihat dalam kelompok peralihan dan habis tamat, klon besar merentangi beberapa petak, mencadangkan penyusupan diikuti oleh percambahan dan pembezaan ke dalam pelbagai fenotip terbeza terminal. Secara keseluruhannya, taburan kluster antara 2 model adalah agak serupa, mencadangkan tema biasa yang mungkin digunakan untuk LN manusia dan bentuk penyusupan tisu autoimun yang lain. Tahap pengembangan dan perkongsian klon yang lebih besar antara kelompok dilihat dalam model Fc R2B–/–.Yaa mungkin mewakili tahap atau kualiti penyakit yang berbeza, mencerminkan subtipe murine LN, serupa dengan jenis LN yang berbeza yang dilihat pada pesakit. Dalam model Fc R2B–/–.Yaa, kami mencatatkan peningkatan bilangan sel TRM yang dikembangkan secara klon; bagaimanapun, peranan TRM dalam menggalakkan penyakit tidak jelas. Walaupun fungsi sel-sel ini dalam tisu penghalang umumnya dirasakan memberikan tindak balas khusus antigen yang cepat pada pertemuan awal patogen, peranan dalam tisu bukan penghalang mungkin agak berbeza. Oleh kerana terdapat klon TCR yang dikongsi antara populasi memori yang letih dan bermastautin, ini menunjukkan bahawa ini mungkin laluan pembezaan alternatif untuk sel T, dan TRM mungkin menyumbang kepada beberapa tindak balas kerosakan kronik yang diperhatikan dalam LN. Penyelesaian soalan ini akan menunggu alat untuk menyasarkan sama ada TRM atau TEX secara khusus dalam tisu tikus yang terdedah kepada lupus.

Terutama, 2 kajian manusia baru-baru ini yang memeriksa sel T dalam persekitaran mikro tumor (34, 39) mendedahkan penyusupan yang selari dengan model LN. Li et al. (34) menggambarkan naif, ingatan, peralihan, dan sel T CD8 ditambah T yang tidak berfungsi dalam penyusupan tumor. Sama seperti yang kita perhatikan dalam KIT, mereka juga melihat pertindihan klon antara sel T peralihan dan tidak berfungsi tetapi pada tahap yang lebih rendah dalam populasi sitotoksik (34). Selanjutnya, dalam kedua-dua KIT (di sini) dan TIL (34), kapasiti proliferatif adalah lebih besar di kalangan sel T yang letih / tidak berfungsi, menunjukkan bahawa tingkah laku TIL mungkin mencerminkan peningkatan proses semula jadi yang berkembang untuk pemeliharaan organ dalam menghadapi autoimun.

Pada setiap peringkat perkembangan daripada pengaktifan dan kerosakan ke arah sama ada keletihan atau status ingatan pemastautin, mungkin terdapat peluang untuk campur tangan berdasarkan keadaan selular tertentu. Kajian lanjut untuk lebih memahami faktor yang mengekalkan sel atau yang boleh menghalang sel pada setiap peringkat diperlukan, begitu juga dengan cerapan tentang isyarat yang menggalakkan perkembangan di sepanjang laluan ini. Laluan progresif yang telah kami kenal pasti juga boleh menjadi rangka kerja untuk memahami lokus kerentanan genetik, beberapa daripadanya mungkin menjejaskan, sebagai contoh, kemungkinan KIT boleh didorong ke arah keletihan oleh persekitaran buah pinggang. Varian genetik sedemikian boleh dinyatakan dalam sama ada sel T atau tisu sasaran (48).

Bersama-sama konsep ini menimbulkan persoalan bagaimana tisu memprogram semula mengaktifkan sel T yang menyusup dan apakah ciri-ciri pengaturcaraan semula tersebut. Dalam hal ini, TFs Crem, Id2, dan Klf6 telah dikenal pasti dalam kesemua 3 populasi KIT (CD4, CD8, Treg). Crem ialah penindas transkrip yang menyekat transkripsi IL-2 dan dikaitkan dengan sel T anergik (49). Klf6 dianggap menggalakkan ketenangan sel T, dan dalam kajian baru-baru ini, ekspresinya dikaitkan dengan ekspresi VISTA dan mengurangkan kerentanan SLE (50). Persatuan TF ini seterusnya menyokong konsep bahawa terdapat program tolerogenik menyeluruh yang disebabkan selepas penyusupan buah pinggang.

Walaupun kehadiran jelas populasi TEX dalam kedua-dua model murine lupus, populasi TEX tidak diperhatikan dalam LN manusia dalam laporan dari konsortium AMP (4). Terutama, disebabkan kesukaran mendapatkan tisu, kajian AMP memeriksa beberapa sel T (hanya lebih 1000 jumlah daripada semua pesakit), dan ini diperoleh daripada pesakit yang dirawat dengan terapi imunosupresif. Walaupun secara teorinya mungkin bahawa keletihan sel T tidak berlaku pada LN manusia dan khusus tetikus (6) dan khusus tumor manusia (51), nampaknya lebih berkemungkinan bahawa autoimun manusia akan menyerupai penyusupan tumor manusia; Oleh itu, kajian yang lebih mendalam mungkin mendedahkan KIT yang letih, sekurang-kurangnya pada sesetengah pesakit. Keletihan sel T secara nyata diperhatikan dalam darah periferal CD8 ditambah sel-sel pesakit lupus, dan kehadiran sel-sel letih tersebut dalam darah berkorelasi dengan kurang kecenderungan untuk perkembangan penyakit (11, 52). Jika penyakit yang teruk dikaitkan dengan kurang keupayaan untuk menyebabkan keletihan, ada kemungkinan pesakit yang cukup mendorong keletihan mungkin tidak diwakili dengan baik dalam data AMP yang memfokuskan pada pesakit yang memerlukan (semula) biopsi. Rawatan dengan prednison atau agen imunosupresif lain juga boleh mengurangkan populasi yang letih. Kortikosteroid boleh mendorong apoptosis sel T (53) dan mengurangkan keberkesanan terapi kematian sel anti-program 1 (anti-PD-1) (47, 53, 54). Selain itu, rawatan dengan siklofosfamid membawa kepada pengurangan besar dalam PD-1 ditambah Lag3 serta TEX dalam tumor dan oleh itu berkemungkinan akan melakukan perkara yang sama dalam buah pinggang nefritik manusia (55). Sesungguhnya, keberkesanan rawatan ini untuk nefritis membayangkan bahawa ia mesti memberi kesan kepada KIT dan persekitaran mikro buah pinggang.

Mengintegrasikan penemuan kami, kami mencadangkan beberapa mekanisme di mana kerosakan buah pinggang berlaku secara subakut, walaupun dalam menghadapi peraturan balas yang wujud dalam tisu. Sitotoksik seperti CD4 ditambah sel T boleh menyumbang kepada kerosakan (28, 29). Kemusnahan parenkim juga mungkin disebabkan oleh gabungan sel CD8 tambah yang menyusup/peralihan awal yang mengenali antigen diri dan mengembang sebelum ia menjadi letih sepenuhnya. Kemungkinan lain bahawa sel IFNhi dan TEM, yang terdapat dalam jumlah kecil, juga bersifat patogen. Secara kritikal, walaupun TEX tidak berfungsi, ia bukan tidak berfungsi (7, 51); Oleh itu, sel-sel ini juga boleh menyumbang kepada kerosakan kronik yang perlahan yang kita perhatikan dalam LN dan berkemungkinan terus bertindak balas terhadap rangsangan mitogenik, seperti yang disokong oleh tandatangan fasa S dan G2/M yang berterusan yang dilihat dalam TEX (Rajah 8H).

【Untuk maklumat lanjut: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】