Graham-2023-Pembelajaran Mendorong Transkrip Unik

Abstrak:
Pembelajaran boleh mendorong keplastikan neurofisiologi dalam korteks pendengaran pada skala berbilang masa. Perubahan berkekalan kepada fungsi kortikal pendengaran yang berterusan selama beberapa hari, minggu, atau seumur hidup, memerlukan ekspresi gen yang disebabkan oleh pembelajaran. Sesungguhnya, transkripsi de novo ialah penentu molekul untuk sama ada pengalaman sementara berubah menjadi kenangan jangka panjang dengan kesan yang berkekalan terhadap tingkah laku.

Dengan perkembangan sains dan teknologi yang berterusan, banyak fenomena kehidupan ajaib telah muncul dalam perjalanan kehidupan manusia, antaranya yang paling berharga untuk penyelidikan adalah ingatan. Memori adalah bahagian penting dalam aktiviti saraf lanjutan manusia, dan ia juga merupakan rekod dan pengumpulan pelbagai peristiwa yang telah berlaku sejak evolusi manusia. Jadi, adakah terdapat hubungan antara ekspresi gen dan ingatan? Jawapannya ya.

Pertama, pengaruh gen pada ingatan adalah jelas. Ia boleh mengawal selia ekspresi pelbagai molekul dan protein berkaitan memori melalui polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) dan kaedah lain. Ini boleh menjejaskan kecekapan komunikasi antara neuron, dengan itu menjejaskan ciri kognitif, konseptual, emosi dan lain-lain seseorang, yang menunjukkan kualiti ingatan.

Kedua, ingatan juga boleh memberi kesan tertentu pada ekspresi gen. Dalam proses pembelajaran, ingatan, dan pemikiran kita, bukan sahaja perubahan dalam aktiviti saraf otak tetapi juga peraturan dan campur tangan banyak gen dan molekul. Peraturan gen dan molekul ini akan merekodkan jejak yang sepadan dengan perasaan dan pengalaman yang wujud dalam ingatan jangka panjang kita, dan akhirnya akan disimpan dalam gen.

Akhirnya, terdapat saling bergantung antara sikap positif dan keupayaan ingatan jangka panjang. Suasana yang gembira dapat membantu kita lebih fokus dan menumpukan perhatian semasa proses pembelajaran dan pemikiran, seterusnya membantu meningkatkan keupayaan ingatan. Memori yang disengajakan jangka panjang juga boleh menggalakkan pembentukan sambungan saraf dan struktur baru di dalam otak, yang juga sangat membantu untuk pembelajaran dan ingatan masa depan.

Oleh itu, kita boleh membuat kesimpulan bahawa terdapat korelasi antara ekspresi gen dan ingatan. Kita boleh menggalakkan dan meningkatkan keupayaan ingatan kita melalui ingatan yang disengajakan, keyakinan dan pemikiran positif, yang juga boleh membantu kita mencapai kesihatan fizikal dan mental yang lebih baik. Hanya dengan cara ini kita boleh berkhidmat dengan lebih baik kepada masyarakat dan pembangunan manusia. Ia dapat dilihat bahawa kita perlu meningkatkan daya ingatan, dan Cistanche deserticola boleh meningkatkan daya ingatan dengan ketara kerana Cistanche deserticola adalah bahan perubatan tradisional Cina yang mempunyai banyak kesan unik, salah satunya adalah untuk meningkatkan daya ingatan. Keberkesanan daging cincang berasal dari pelbagai bahan aktif yang terkandung di dalamnya, termasuk asid, polisakarida, flavonoid, dll. Bahan-bahan ini boleh menggalakkan kesihatan otak dalam pelbagai cara.

Klik tahu suplemen untuk meningkatkan ingatan

Walau bagaimanapun, gen kortikal pendengaran yang menyokong pembelajaran auditori, ingatan dan tingkah laku khusus bunyi yang diperoleh sebahagian besarnya tidak diketahui. Laporan ini adalah yang pertama untuk mengenal pasti perubahan luas genom dalam ekspresi gen yang disebabkan oleh pembelajaran dalam korteks auditori yang dianggap mendasari pembentukan memori pendengaran. Analisis bioinformatik pada profil pengayaan gen daripada penjujukan RNA mengenal pasti laluan biologi yang merangkumi sinapsis kolinergik dan interaksi reseptor neuroaktif.

Penemuan ini mencirikan calon utama yang mempengaruhi perubahan dalam fungsi kortikal yang menyokong pembentukan memori auditori jangka panjang dalam otak dewasa. Molekul dan mekanisme yang dikenal pasti adalah sasaran terapeutik yang berpotensi untuk memudahkan perubahan jangka panjang dan khusus bunyi kepada fungsi pendengaran pada masa dewasa dan kini menjadi keutamaan untuk penyiasatan sasaran gen masa depan.

Manuskrip:

Konsep yang diterima baik dalam bidang pembelajaran dan ingatan ialah ingatan disimpan di mana ia diproses (Nadel & Hardt, 2011). Peristiwa biologi yang dikenali sebagai penyatuan ingatan boleh menstabilkan perwakilan neural sementara yang ditimbulkan oleh pengalaman deria (Lechner, Squire, & Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). Mekanisme asas dan evolusi yang dipelihara yang memulakan penyatuan ingatan ialah transkripsi dan terjemahan, masing-masing ditakrifkan sebagai ekspresi aktif gen dan produk protein seterusnya (Alberini & Kandel, 2014; Costa-Mattioli et al., 2009).

Kami membuat hipotesis bahawa pembelajaran diskriminasi yang baik mendorong ekspresi gen de novo dalam korteks pendengaran. Perwakilan isyarat bunyi yang sangat spesifik boleh bertahan lebih lama daripada pengalaman sementara (saat dan minit) dengan menyatukan ke dalam ingatan jangka panjang (jam hingga hari) yang kemudiannya membimbing tingkah laku isyarat bunyi. Walaupun profil transkriptik serantau yang tersendiri dianggap bertanggungjawab untuk penyatuan ingatan (Katzman, et al., 2021), peristiwa transkripsi yang disebabkan oleh pembelajaran yang menyokong pembentukan memori dalam sistem pendengaran pusat adalah kurang diterangkan.

Sebaliknya, korteks pendengaran telah diterangkan dengan sangat baik dalam kajian pembelajaran pendengaran dan ingatan pada tahap perubahan neurofisiologi terutamanya dalam bidang penerimaan dan peta tonotopik (Schreiner & Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pienkowski & Eggermont, 2011), cortico- sambungan kortikal dan kortiko-fugal (Souffi et al., 2021; Lesicko & Geffen, 2022; Schreiner & Polley, 2014; Liu et al., 2011; Xiong, Znamenskiy, & Zador, 2015), termasuk pada skala masa berbilang (Froemke& Martins , 2011; Froemke & Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David, & Shamma, 2007; Tchernichovski & Margoliash, 2013). Selain itu, perubahan neurofisiologi dikaitkan dengan tingkah laku, contohnya, untuk tindakan terarah isyarat (Letzkus, Wolff, & Lüthi, 2015), perhatian (Fritz et al., 2007; Elhilali et al., 2007) dan ingatan untuk isyarat bunyi (Bieszczad & Weinberger 2010; Grosso et al., 2015; Aschauer & Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso, & Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff, &Lüthi, 2015; Ghosh & Zador, 2021).

Bukti beberapa dekad untuk keplastikan neurofisiologi yang disebabkan oleh pembelajaran dalam korteks pendengaran telah menunjukkan ciri-ciri tingkah laku yang dikongsi memori pendengaran (Weinberger 2007a; 2007b), menjadikannya kawasan calon teratas untuk penyatuan memori auditori. Dengan menyiasat korteks auditori secara bioinformatik, kami juga memanfaatkan peluang yang tidak berat sebelah untuk mendedahkan penjaga pintu biologi yang sama atau berbeza di seluruh otak tentang neuroplastisitas yang mendasari fungsi pendengaran penyesuaian. Dari perspektif yang lebih luas, pemprofilan transkriptomik serantau boleh membawa kepada pemahaman yang lebih lengkap tentang cara sistem deria diubah suai oleh pengalaman dalam perkhidmatan ingatan.

Profil transkriptom akibat pembelajaran yang dikenal pasti dalam korteks pendengaran boleh mengesahkan, melanjutkan atau membawa kepada model proses biologi baharu yang menyokong atau menjejaskan pemprosesan auditori adaptif. Penyatuan ingatan auditori berkemungkinan merupakan hasil daripada perubahan yang bergantung kepada pengalaman dalam ekspresi gen yang mempengaruhi fungsi selular dalam korteks pendengaran, yang seterusnya menggalakkan perubahan yang berkekalan kepada respontiviti neurofisiologi yang ditimbulkan bunyi yang mengubah tingkah laku isyarat bunyi.

Untuk mengenal pasti transkrip yang disebabkan oleh pembelajaran, analisis pemprofilan ekspresi, menggunakan RNAsequencing (RNAseq) telah dilakukan pada sampel korteks pendengaran yang ditakrifkan secara anatomi (Bregma -3.10 mm, Interaural 6.90 mm; Paxinos & Watson, 2007 ) daripada tikus dewasa terhad air yang dilatih untuk menekan bar kepada nada tulen untuk ganjaran air. Respons kepada frekuensi nada tulen sasaran (5.0 kHz; 65 dB SPL) menghasilkan ganjaran, manakala respons kepada bukan sasaran (11.5 kHz; 65 dB SPL) tidak diberi ganjaran dan memulakan tempoh tamat masa yang memanjangkan masa ke percubaan seterusnya.

Tugas diskriminasi dua nada (2TD) ini tidak sukar dari segi persepsi; frekuensi akustik adalah lebih dari satu oktaf dan mudah dibezakan oleh tikus (Talwar & Gerstein,1998). Sebaliknya, cabaran tingkah laku adalah bersekutu: prestasi 2TD menuntut ingatan untuk nada yang dikaitkan dengan ganjaran (vs. tiada ganjaran). Tikus terlatih (N=8) telah dikorbankan selepas tiga hari berturut-turut 45-minit sesi latihan 2TD dan dibandingkan dengan sekumpulan tikus naif bunyi (N=4). Ini adalah titik masa awal dalam latihan apabila haiwan masih memperoleh tugas 2TD. Pemerolehan tugas awal disasarkan untuk menangkap peristiwa transkrip yang disebabkan pembelajaran awal yang menetapkan peringkat untuk peningkatan kemudian dalam prestasi 2TD yang diperhatikan dalam tingkah laku selama beberapa minggu latihan.

Sebagai contoh, prestasi purata melebihi peluang, tetapi hanya 66±7.81% selepas 3 hari, berbanding Lebih daripada atau sama dengan 90% selepas latihan lanjutan (Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019). Untuk memanfaatkan peluang untuk mengenal pasti ekspresi gen yang relevan untuk ingatan bersekutu khusus bunyi yang berjaya, kami memanfaatkan perencat HDAC yang mensasarkan peraturan sepigenetik ekspresi gen yang bergantung kepada aktiviti dalam pembelajaran dan pembentukan ingatan (McQuown, et al., 2011; Kwapis, et al. al., 2017; Malvaez, et al., 2012). Yang penting, sedekad kerja telah menunjukkan bahawa perencatan HDAC boleh memudahkan keplastikan neurofisiologi yang disebabkan oleh pembelajaran dalam tindak balas kortikal auditori yang ditimbulkan bunyi (berbanding dengan kenderaan) dan meningkatkan tingkah laku diskriminasi pendengaran (Bieszczad et al., 2015; Phan et al., 2017; Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019; Rotondo & Bieszczad, 2020; Rotondo & Bieszczad 2021a; 2021b) termasuk manusia (Gervain, et al., 2013).

Separuh daripada haiwan terlatih telah dirawat dengan HDAC-inhibitor, RGFP966 (N=4; 10 mg/kg, ApexBio, cat#A880}3; sub. cu. suntikan) , manakala separuh lagi adalah penyelesaian kenderaan terlatih tetapi ditadbir secara sama (N=4; volum sepadan, sub. cu. suntikan;Gamb. 1a). Tiada perbezaan dalam prestasi 2TD antara kumpulan pada masa pengumpulan otak (RGFP966: 61±5.0% lwn. Kenderaan: 71±7.0%; t(5.9166)=-1.21, p=0.272 ; Ujian-t Welch).Otak dikumpulkan dengan segera dan dibekukan kilat pada titik masa yang konsisten dengan kepekatan puncak perencat dalam korteks pendengaran, satu jam selepas suntikan selepas sesi sama ada perencat HDAC atau kenderaan (Bieszczad et al., 2015).

Penemuan di sini adalah yang pertama untuk mengenal pasti profil transkriptik pembelajaran bersekutu dalam korteks pendengaran. Pembelajaran dalam perubahan yang disebabkan oleh tugas diskriminasi dua nada dalam tahap transkripsi ratusan gen (berbanding dengan bunyi-naif) (Rajah 1b). Algoritma pengelompokan hierarki menunjukkan bahawa gen dikawal atau dikurangkan secara unik, mendedahkan rangkaian kompleks peristiwa ekspresi gen kortikal yang disebabkan oleh pembelajaran pendengaran (Rajah 2a).

Analisis pengayaan (iPathwayGuideTM; kaedah Analisis Impak) mengenal pasti sinaps kolinergik (gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) / semua gen (SEMUA): 22/101; p=0.004, Bonferronicorrection) sebagai laluan biologi teratas (Jadual 1) . Keputusan ini konsisten dengan penyelidikan sejak tahun 1990-an yang menonjolkan kecukupan isyarat kolinergik dalam korteks pendengaran untuk keplastikan neurofisiologi dan tingkah laku pendengaran yang berkaitan (Froemke & Martins, 2011; Weinberger, 2003; Bakin & Weinberger, 1996; Kilgard & Merzenich, 1998). Tahap transkrip yang disebabkan oleh pembelajaran di bawah perencatan HDAC sama ada dikuatkan dalam arah yang sama (dengan peningkatan atau penurunan lagi dalam tahap transkrip gen yang unik) (Rajah 2b) atau tumpul berbanding dengan pembelajaran sahaja (Rajah 2c). Satu laluan biologi teratas dalam keadaan ini ialah interaksi reseptor ligan Neuroaktif (DEG/ALL: 30/194; p=0.016; Jadual 1) yang melibatkan pengesan yang penting untuk pengaktifan saraf.

Satu lagi laluan teratas ialah interaksi reseptor matriks ekstraselular (reseptor ECM) (DEG/ALL: 14/69; p=0.04; Jadual 1). Komponen theECM adalah penting untuk keplastikan kortikal dan penyatuan ingatan (Happel, et al., 2014; Banerjee, et al., 2017; El-Tabbal, et al., 2021; Sonntag, et al., 2015). Laluan ini menawarkan alternatif yang berpotensi, mungkin pelengkap, kepada isyarat kolinergik yang boleh memudahkan perubahan yang bergantung kepada pengalaman yang berkekalan dalam fungsi pendengaran (Ji, Gao, & Suga, 2001; Luo & Yan, 2013; Metherate, 2011). Gen lain yang ekspresinya berubah dengan pembelajaran pendengaran tetapi tidak lagi dengan perencatan HDAC berkemungkinan berkaitan dengan keadaan prosedur tugas, dan bukannya ingatan bersekutu khusus bunyi. Sebagai contoh, laluan isyarat apelin telah dikenal pasti (DEG/ALL: 20/116; p=0.0005), yang penting dalam otak untuk pengawalan homeostatik pengambilan air (Hu, et al., 2021). Perbandingan langsung tahap transkrip antara dua kumpulan tikus terlatih (pembelajaran dengan atau tanpa perencatan HDAC) menunjukkan sangat sedikit gen yang dinyatakan secara berbeza secara unik (DEG).

Ambang digunakan dengan ketara untuk mengenal pasti DEG yang paling berkemungkinan (p =0.05) mendapati hanya Adamts13, U6, Rexo4 dan Cabin1 dinyatakan secara berbeza (Rajah 2d). Oleh itu, kesan utama perencatan HDAC nampaknya memodulasi ekspresi gen yang disebabkan oleh pembelajaran pendengaran di bawah keadaan biasa, dan bukannya merekrut gen unik yang baru untuk mengekalkan memori khusus bunyi. Bersama-sama, penemuan ini menunjukkan perubahan transkriptomi berskala besar berlaku dalam korteks pendengaran pada awal latihan apabila haiwan dewasa belajar untuk mendiskriminasikan hubungan asosiatif antara isyarat bunyi. Bersama-sama dengan laporan neurofisiologi dan tingkah laku yang ditetapkan mengenai perencatan HDAC untuk menggalakkan fungsi pendengaran, penemuan ini menyokong taktik menggunakan perencat HDAC untuk membezakan gen yang ekspresinya menentukan kejayaan pembentukan memori pendengaran.

Beberapa gen yang diminati (GOI) telah dipilih daripada analisis pengayaan laluan inbiologi untuk mengesahkan penjujukan seluruh genom dengan pendekatan yang disasarkan gen. Sampel dikumpulkan daripada kohort berasingan yang mereplikasi dua kumpulan haiwan terlatih dan dirawat pada peringkat awal yang sama. titik masa latihan (iaitu, satu jam selepas sesi latihan 2TD ketiga) untuk digunakan dalam analisis ekspresi gen menggunakan tindak balas rantai polimerase masa nyata kuantitatif (qRT-PCR). Tiada perbezaan prestasi 2TD dalam kohort replika(RGFP9661: 61±5.0% lwn. RGFP9662: 67±6.0%; t(8.441)=-0.834, p {{20}}.4274; dan Kenderaan1:71±6.0% lwn Kenderaan2: 74±3.0%;t(4.0809)=-0.444, p {{ 34}}.6796; ujian-t Welch).

GOI yang pertama ialahEgr1, "gen awal segera" yang dikaji dengan baik dan bergantung kepada aktiviti yang diketahui memuncak dalam jam pertama pembelajaran dan kritikal untuk pembentukan ingatan (Duclot & Kabbaj, 2017). Ia adalah gen yang disebabkan oleh pembelajaran dengan peningkatan ekspresi yang disahkan yang juga dikuatkan dengan perencatan HDAC dalam kohort haiwan yang berasingan dalam kajian sasaran gen (Rajah 3). Perkara yang sama berlaku untuk Per2, gen yang terlibat dalam pengawalan irama sirkadian dan laluan serotoninergik di otak (Bae, et al., 2001; Albrecht, et al., 2001; Cuesta, et al., 2009; Reh, et al. ,2020). Per2 adalah sebahagian daripada keluarga "gen jam" yang telah dikaitkan dengan modulasi HDAC di kawasan otak lain (Kwapis, et al., 2018) dan mungkin mempunyai peranan dalam fungsi pendengaran juga (Reh et al., 2020). Sebaliknya, beberapa GOI yang dikenal pasti di seluruh genom hanya disahkan sebahagiannya.

Chrna7 mengekod subunit reseptor asetilkolin nikotinik dinamik (nAChR) yang didapati kurang dikawal dengan pembelajaran pendengaran, selaras dengan bukti neurofisiologi (Takesian, etal., 2018; Kuchibhotla, et al., 2017). Oleh itu, kami menjangkakan kajian yang disasarkan gen untuk mengesahkan Chrna7 down-regulasi dalam semua haiwan terlatih 2TD, tetapi down-regulation adalah jelas hanya haiwan yang dirawat dengan kenderaan yang mempelajari 2TD tanpa perencatan HDAC. GOIs terpilih tambahan adalah daripada keluarga reseptor nuklear anak yatim Nr4a, Nr4a1 dan Nr4a2, yang merupakan gen awal yang dilaporkan diperlukan untuk menyebarkan kesan hiliran sasaran HDAC terpilih RGFP966 di kawasan otak lain (McQuown et al., 2011; Kwapis, et al. ., 2019).

Selaras dengan laporan terdahulu mengenai perbezaan serantau yang bergantung kepada tugas dalam ekspresi gen keluarga Nr4a (McNulty, et al., 2012), Nr4a1 tetapi tidak Nr4a2 dikawal selia dalam korteks pendengaran selepas pembelajaran auditori. DEG lain, Htr1a atau Adamts13, tidak disahkan oleh kajian sasaran gen yang berkemungkinan disebabkan oleh perbezaan dalam varian transkrip yang diketahui yang tidak dikesan oleh probe sasaran gen yang direka khas kami, atau disebabkan ralat jenis I, atau perbezaan tingkah laku yang halus antara kohort haiwan terlatih yang tidak dapat dikesan dalam ukuran prestasi 2TD. Kami juga menyiasat Lynx1, gen dengan sejarah panjang fungsi untuk membuka semula keplastikan seperti "tempoh kritikal" dalam korteks deria (Morishita et al., 2010), mungkin melalui tindakannya pada modulasi kolinergik dan serotonergik (Takesian, et al. , 2018). Walau bagaimanapun konsisten dengan laporan seluruh genom sebelum ini yang gagal pengesanannya (Kalish, et al., 2020), ia tidak dikesan dalam dataset RNAseq kami mahupun kajian yang disasarkan gen.

Walaupun masih menjadi cabaran untuk menentukan sama ada percanggahan boleh dijelaskan oleh kebolehubahan biologi atau individu sebenar antara haiwan, atau disebabkan oleh kebolehubahan teknikal dengan kelimpahan rendah atau transkrip ekspresi khusus jenis sel, kami melaporkan keputusan yang sangat konsisten untuk sesetengah GOI. Memandangkan ungkapan Chrna7, Egr1, dan Per2 yang disebabkan oleh pembelajaran adalah konsisten antara pendekatan yang disasarkan gen dan genom yang luas, dan antara kohort haiwan terlatih yang berbeza, adalah wajar bahawa gen ini mungkin merupakan pemain paling asas untuk perubahan yang berkekalan kepada fungsi pendengaran dan ingatan dan kini menjadi keutamaan untuk penyiasatan masa hadapan.

Dipertimbangkan bersama, penemuan itu mendedahkan landskap transkripsi dinamik dalam korteks pendengaran dewasa yang boleh menyokong fungsi pendengaran yang muncul dalam neurofisiologi dan tingkah laku. Memandangkan bukti yang semakin meningkat tentang kawalan epigenetik pada fungsi sistem deria (rujuk, Shang &Bieszczad, 2022), adalah menarik untuk dipertimbangkan bagaimana mekanisme epigenetik memainkan peranan dalam mengimbangi kestabilan dengan keplastikan litar kortikal pendengaran yang bergantung kepada pengalaman. Sebagai contoh, dataset seluruh genom semasa juga mengenal pasti pengurangan yang disebabkan oleh pembelajaran dalam ekspresi deacetylase histon arepressive, Hdac9, yang tidak hadir dengan perencatan HDAC.

Ia menggoda untuk menyamakan kesan ekspresi HDAC9 yang dikurangkan dengan kesan menghalang HDAC secara farmakologi untuk mempromosikan transkripsi yang disebabkan oleh pembelajaran. Satu lagi kelas penting pengatur epigenetik mengubah DNA dan bukannya histon. Contohnya ialah Tet1 dan Gadd45b yang kedua-duanya memberi kesan metilasiDNA (Bayraktar & Kreutz, 2018) dan didapati masing-masing terkawal ke bawah dan terkawal dengan pembelajaran, di bawah perencatan HDAC. Selanjutnya, kelas mikroRNA muncul sebagai laluan biologi teratas yang disebabkan oleh pembelajaran dengan perencatan HDAC (lihat Jadual 1), yang telah mendapat daya tarikan dalam bidang sebagai pengawal selia epigenetik utama kawalan transkrip saraf (Saab & Mansuy, 2014). Interaksi molekul yang lebih tinggi antara pemain epigenetik dan produk protein gen yang dinyatakan juga berkemungkinan. Sebagai contoh, Egr1 yang dikawal selia yang dikenal pasti boleh merekrut Tet1 untuk menghilangkan tanda metilasi yang menindas untuk mengaktifkan gen hiliran (Sun, et al., 2019). Kajian molekul lanjut akan diperlukan untuk menghuraikan kepentingan interaksi antara pengawal selia epigenetik dalam sistem pendengaran semasa pembelajaran. Selain itu, laporan ini memberikan peluang segera untuk mewujudkan hubungan antara gen kortikal pendengaran terpilih dan pengesan hiliran mereka.

Merapatkan jurang antara gen dan molekul ini kepada peristiwa neurofisiologi yang ditimbulkan bunyi pengaruhnya adalah penting untuk memahami cara sistem pendengaran dewasa menyesuaikan diri dengan pengalaman untuk mengubah tingkah laku. Sesungguhnya, terjemahan transkripsis de novo diperlukan untuk perubahan jangka panjang kepada fungsi tingkah laku kerana ia menghasilkan perubahan yang berkekalan kepada fungsi selular. Sebagai contoh, kesan sasaran utama proses transkrip yang disebabkan oleh pembelajaran boleh mengubah ketersediaan saluran atau reseptor (Metherate, Intskirveli, & Kawai, 2012; Brown & Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao, & Tzounopoulos, 2023) dalam litar yang menentukan bunyi- membangkitkan ambang, responsif, dan seni bina medan penerimaan dalam sistem pendengaran. Adalah munasabah untuk mengandaikan bahawa tugas pendengaran yang berbeza akan merekrut rangkaian gen unik untuk laluan biologi yang berkaitan dengan fungsi selular tertentu yang akan menyokong pembelajaran untuk ciri bunyi atau struktur tugas yang berkaitan dengan tugas.

Secara keseluruhannya, laporan ini bertindak sebagai titik permulaan untuk menjadikan set data RNAseq daripada korteks pembelajaran, dewasa dan auditori tersedia (lihat Repositori Data). Usaha untuk mengecilkan jurang pengetahuan yang diburukkan lagi oleh kekurangan kajian yang memberi tumpuan kepada proses genetik molekul dalam korteks pendengaran dewasa kini dialu-alukan. Kami menggalakkan kajian melangkaui batasan spatio-temporari penjujukan RNA pukal yang sensitivitinya terhad secara teknikal juga oleh kedalaman bacaan (Li& Wang, 2021), terutamanya memandangkan teknologi Omics moden berkembang dengan pantas dan bertambah baik.

Walaupun penyelidikan dalam korteks pendengaran telah membuat beberapa langkah awal dalam genetik molekul yang telah mengenal pasti lata molekul penting (Schicknick, et al., 2008), profil IEG permisif (Mello, Velho, & Pinaud, 2006; de Hoz, et al., 2018). ; Peter, et al., 2011) dan juga kromatindinamik (Peter, et al., 2021), terdapat preseden di pinggir pendengaran di mana transkripsidinamik dikaji dengan indah (Kwan, 2016; Barta, et al., 2018; Li, et. al., 2020; Ebeid, et al., 2017). Alat molekul sedia ada seperti penjujukan RNA sel tunggal (RNA-Seq) dan penghibridan in situ molekul kecil pendarfluor (smFISH) akan berguna untuk memberikan cerapan tentang variasi sel-ke-sel yang bergantung kepada pengalaman dan interaksi molekul dalam sel dan litar kortikal pendengaran. Tidak seperti RNAseq pukal, kaedah ini menghormati kepelbagaian selular yang mendalam dan organisasi peringkat tinggi dalam korteks pendengaran, seperti litar mikro khusus lapisan dan topografi lemniskalnya.
Pendekatan bijak untuk menandai dan menyusun transkrip daripada hanya sel kortikal auditori yang aktif baru-baru ini (Cho, Huang, & Gray, 2016) boleh meningkatkan kepekaan yang cukup torobustly memperoleh set gen yang paling relevan dari segi fungsian daripada jenis dan populasi sel yang paling relevan. Pendekatan yang sama boleh digunakan juga secara subkortikal untuk menangkap dan membezakan profil transkriptik serantau yang bergantung kepada aktiviti dalam korteks yang menghormati integrasi luar biasa kortikal dengan fungsi subkortikal sistem pendengaran di bawah keadaan mendengar atau tuntutan tingkah laku yang berbeza. Mencirikan sepenuhnya pembezaan selular dan serantau dalam mekanisme genetik dan molekul yang mendasari pembelajaran auditori dalam otak dewasa adalah penting untuk membangunkan terapeutik ketepatan terpilih tapak dan sasaran molekul yang membolehkan perubahan fungsi yang mantap dan berterusan untuk menyokong pendengaran dan kebolehdengaran tertentu sepanjang jangka hayat.

Kaedah

Subjek: Sebanyak 24 ekor tikus Sprague-Dawley jantan dewasa (250 – 300 g semasa ketibaan; Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA) telah digunakan dalam eksperimen tingkah laku dan molekul. Semua haiwan ditempatkan secara individu di dalam bilik koloni yang dikawal suhu (24 ˚C) pada 12-kitaran cahaya/gelap jam. Subjek mempunyai akses ad libitum kepada makanan dan air sebelum latihan tingkah laku. Semua prosedur telah diluluskan dan dijalankan mengikut garis panduan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi (IACUC) di Rutgers, Universiti Negeri New Jersey (No. Protokol:999900026 (KMB)).

Radas gelagat dan rangsangan bunyi: Semua sesi gelagat dijalankan dalam dua ruang pelaziman instrumen yang sama (H{{0}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA) dalam kotak yang dilemahkan bunyi. Sesi latihan harian diimbangi untuk memastikan pendedahan yang sama kepada kedua-dua ruang. Setiap ruang (12" W x 10" D x 12" H; lantai dawai dipasang dengan tuil tindak balas (H21-03R), lampu rumah (H11-01R), pembesar suara (H{ {8}}R), dan sistem penghantaran air (H14-05R). Semasa fasa latihan, haiwan boleh menekan tuil tindak balas("barpress"), yang mencetuskan persembahan cawan air (~0.02cc) dalam port ganjaran (1.25"W x 1.625" H). Suis tangan (H21-01) telah digunakan semasa sesi awal untuk membentuk tindak balas akhbar bar haiwan untuk mencetuskan persembahan cawan air yang membenarkan akses kepada balasan kelakuan telah direkodkan menggunakan perisian Graphic State 4 (CoulbournInstruments, Holliston MA) untuk analisis luar talian.

Semua rangsangan pendengaran dijana menggunakan perisian Tucker-Davis Technologies (TDT, Alachua, FL) dan RPvdsEx, dan dipersembahkan melalui pembesar suara yang dipasang di dinding ruang pengendali. Whitenoise (semasa latihan prosedur; Rajah 1a) dipersembahkan selama 7 atau 9 s dalam tempoh (75 dB SPL). Nada tulen (semasa latihan diskriminasi dua nada; Rajah 1a) sentiasa dibentangkan selama 8 s (70dB SPL). Tahap bunyi telah ditentukur setiap hari menggunakan meter bunyi digital (Larson DavisSoundTrack LxT1).

Latihan tingkah laku dan perencatan farmakologi HDAC3: Selepas satu hari menyesuaikan diri dengan thevivarium, tikus dikendalikan setiap hari selama sekurang-kurangnya 3 hari. Sebelum permulaan latihan tingkah laku, tikus diletakkan pada jadual air terhad sehingga mereka mencapai 85% daripada berat tidak terhad haiwan kawalan dipadankan dengan umur. Tikus yang dihadkan air kemudiannya dibentuk dalam ruang yang dilemahkan bunyi untuk menekan untuk mendapatkan ganjaran air (Rajah 1a). Pembentukan barpress dan latihan bunyi seterusnya adalah seperti yang diterangkan sebelum ini (Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019). Secara ringkas, semua haiwan telah dibentuk untuk barpress selama 5 hari dan kemudian dilatih dalam tugas prosedur untuk belajar bar-press untuk berbunyi, yang dalam fasa ini ialah rangsangan hingar Gaussian jalur lebar(1-12.5 kHz band-pass tapis hingar putih; 75 dB SPL), untuk mendapatkan ganjaran air. Semua haiwan berjaya belajar mengaitkan bunyi ini dengan ganjaran sebelum meneruskan ke fasa latihan seterusnya. Latihan prosedur menunjukkan kebolehubahan individu tentang seberapa cepat haiwan itu dapat mempelajari tugas ke tahap prestasi yang tinggi. Namun begitu, semua haiwan dapat mencapai tahap prestasi Lebih daripada atau sama dengan 90% selama dua hari berturut-turut (min=92.85%, sem =0.01%) selepas purata 12.67 hari ( sd=2.85 hari). Prestasi dikira menggunakan 100%.

Fasa latihan seterusnya ialah tugas diskriminasi dua nada (2TD) (Rajah 1a), di mana tikus dilatih untuk mendiskriminasi antara dua frekuensi bunyi yang berbeza secara spektrum. Tekanan bar pada nada S+ (5.0 kHz; 70 dB SPL) akan menghasilkan persembahan ganjaran air, manakala bar menekan pada Batu (11.5 kHz; 70 dB SPL) menghasilkan isyarat ralat (rumah berkelip cahaya) dan "masa tamat" (tambahan 6 saat menunggu untuk permulaan percubaan seterusnya). Percubaan S+ dan S- S adalah secara rawak dan berlangsung selama 8 saat. Selang antara percubaan (ITI) adalah secara purata 15 saat (julat: 5-25 s, rawak). Barpresses semasa ITI senyap adalah tidak penting (tiada masa tamat, tiada isyarat ralat, mahupun ganjaran air). Sesi harian adalah selama 45 minit. Semua haiwan melakukan 2TDtask selama tiga hari berturut-turut. Tikus telah dipasangkan oleh pemerhati terlatih supaya haiwan dengan kadar yang sama untuk memperoleh tugas prosedur diberikan keadaan rawatan yang berbeza dalam fasa 2TD. Pasangan padanan prestasi menerima suntikan sistemik sama ada perencat HDAC3 kelas farmakologi RGFP966 (Abcam Inc., ab144819; 10 mg/kg;sc; N=12) atau larutan kenderaan (N=9) serta-merta selepas setiap sesi 2TD. Prestasi tugas 2TD telah dikira seperti yang diterangkan sebelum ini: 100% (Shang,Bylipudi, & Bieszczad, 20).

).Pengumpulan tisu dan pengasingan RNA: Satu jam selepas haiwan menerima suntikan ketiga dan terakhir RGFP966 selepas sesi ketiga 2TD, otak telah dibedah dengan cepat dan dibekukan dalam bikar 2-metilbutana yang diletakkan di atas ais kering. Otak beku kilat disimpan pada -80˚ C sehingga pemprosesan masa hadapan. Untuk menyediakan otak untuk cryosectioning, otak telah disarungkan sebatian suhu pemotongan tidak optimum (OCT) dan disimpan pada -20˚ C selama 12-24 jam untuk memastikan tisu otak mencapai -20˚ C untuk pemotongan. Otak yang terbungkus dalam OCT kemudiannya akan dihiris secara dhorizontal dalam cryostat (Leica CM 3050S) pada ketebalan 250 µm. Menggunakan penebuk mikro tisu bulat 1 mm, 2 mm3 tisu kortikal pendengaran dari setiap hemisfera (digabungkan menjadi satu sampel untuk sejumlah 4 mm3 setiap kawasan otak) telah diambil sampel untuk pengekstrakan RNA. Cortexlocation auditori telah dikenal pasti menggunakan Paxinos dan Watson's The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates(edisi ke-6) sebagai rujukan (kira-kira A/P=-3.6 hingga -5.8 mm, M/L {{20} } ±6.4 mm D/V=-4.2 hingga -5.8 mm; dan menggunakan hippocampus sebagai tanda tempat

Jumlah RNA daripada setiap sampel telah diasingkan menggunakan Kit Mini RNA PureLinkTM (ThermoFisher) menggunakan protokol pengeluar. Sampel RNA kemudiannya disucikan dengan Kit RNA Clean andConcentratorTM -25 (Zymo Research).

Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8), perpustakaan penjujukan telah dijana menggunakan Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prepkit mengikut protokol yang disyorkan pengeluar. Pustaka telah dikumpulkan dan penjujukan telah dilakukan pada Illumina NovaSeq 6000 yang menjalankan 100 bp berpasangan SBSchemistry. Bacaan telah diproses dengan saluran paip informatika sumber terbuka 'bcbio-nextgen.py' yang dibangunkan terutamanya di Harvard Chan Bioinformatics (v.1.2.4) yang dijalankan pada Argon HPCresource di University of Iowa. Saluran paip ini termasuk pendekatan 'amalan terbaik' untuk kawalan kualiti baca, penjajaran bacaan dan kuantiti. Talian paip 'bcbio-nextgen.py' telah dijalankan dalam mod "RNA-seq" dengan kekunci 'rn6' sebagai binaan genom yang dipilih (merujuk secara dalaman pemasanganEnsembl dan genebuild 'Rnor_6.0'). Jajaran saluran paip membaca kepada genom Rnor_6.0 menggunakan penjajar hisat2 (2.2.1) yang sedar sambatan, ultra-pantas dan secara serentak dikuantifikasikan membaca kepada transkrip menggunakan penjajar 'salmon' (1.4.0). Qualimap (2.2.2), alat pengiraan yang memeriksa fail penjajaran BAM hisat2, telah digunakan untuk memeriksa data bacaan untuk kawalan kualiti. Markah kualiti jujukan lulus semakan asas dan kadar pertindihan jujukan berada dalam parameter yang boleh diterima. Semua sampel lulus QC untuk penjajaran baca ke kawasan eksonik. Kuantifikasi transkrip terbitan Salmon (TPM atau "transkrip per juta") telah diimport dan diringkaskan kepada kiraan anggaran pada tahap gen menggunakan tximport (1.12.3) dalam Rstudio, seperti yang dinyatakan dalam yang terbaik- mengamalkan DESeq2 vignette(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).

Gen dengan kurang daripada 5 anggaran kiraan merentas semua sampel telah ditapis terlebih dahulu daripada analisis hiliran, mengikut prosedur yang disyorkan. Analisis ekspresi gen pembezaan telah dijalankan dengan DESeq2 (v.1.24.0) pada anggaran kiraan peringkat gen. FDR sebanyak 5% dan X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

Pengesahan data RNA-seq dengan qRT-PCR: Data RNA-seq telah disahkan oleh qRT-PCR pada mRNA yang diekstrak daripada kohort tikus yang berbeza. Lima transkrip telah dipilih daripada senarai DEG novel yang diperkaya di setiap rantau pada garis dasar. Tiga daripada gen itu adalah berdasarkan kesusasteraan fisiologi dan tingkah laku kortikal yang didorong oleh hipotesis, manakala tiga lagi gen adalah novelgen yang dikenal pasti daripada tahap gen dan analisis DEG dalam perbandingan antara Kumpulan Dadah dan Kenderaan. Semua jujukan primer telah dipilih sama ada daripada kesusasteraan terdahulu mengenai tisu otak dalam tikus (jujukan yang disediakan dalam jadual di bawah) atau direka menggunakan NCBI Primer Blast dan disahkan untuk kekhususan sasaran dengan menilai lengkung cair dan penjujukan produk amplikon PCR. Analisis qRT-PCR dilakukan dalam QuantStudio 3 (Applied Biosystems) dengan SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Bagi setiap sampel, 500 ng cDNA telah dikuatkan menggunakan Kit Sintesis cDNA iScriptTM (Bio-Rad).

Ucapan terima kasih

Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Dr. Andrea Shang, Sean Tsaur, dan Sooraz Bylipudi atas bantuan mereka dalam prosedur dan analisis tingkah laku; Dr. Mimi L. Phan atas bantuannya dengan RNAextraction dan protokol pengumpulan sampel; Dr Troy A. Roepke, Ali Yasrebi, dan ChristopherO'Brien atas bantuan mereka dengan analisis penulenan sampel RNA; dan Alisa Ray untuk bantuan teknikal. Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada semua kakitangan Makmal CLEF semasa dan bekas atas bantuan dan sokongan mereka.

Kerja ini disokong oleh National Institutes of Health, National Institute of Deafness and Communication Disorders [R01-DC014753 to KMB]; Pusat Pengajian Seni dan Sains di Universiti Rutgers; Yayasan Aresty di Universiti Rutgers dengan pembiayaan geran kecil untuk penyelidikan siswazah; dan program SUPER Projek di Universiti Rutgers dengan dana geran kecil untuk penyelidikan sarjana muda.

Rujukan:

Alberini, CM, & Kandel, ER (2014). Peraturan Transkripsi dalam Penyatuan Memori. ColdSpring Harbour Perspectives in Biology, 7(1), a021741.doi:https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021741

Albrecht, U., Zheng, B., Larkin, D., Sun, Z., & Lee, C. (2001). MPer1 dan mper2 adalah penting untuk menetapkan semula normal jam sirkadian. J Biol Rhythms, 16, 100-104. doi:10.1177/074873001129001791.

Aschauer, D., & Rumpel, S. (2016). Neokorteks Sensori dan Memori Bersekutu. BehavioralNeuroscience of Learning and Memory, 37, 177-211.doi:https://doi.org/10.1007/7854_2016_453

Bae, K., Jin, X., Maywood, ES, Hastings, MH, Reppert, SM, & Weaver, DR (2001). Fungsi pembezaan mPer1, mPer2 dan mPer3 dalam jam sirkadian SCN. Neuron, 30, 525-536.doi:10.1016/S0896-6273(01)00302-6.

Bakin, JS, & Weinberger, NM (1996). Induksi ingatan fisiologi dalam korteks serebrum oleh rangsangan nukleus basalis. Prosiding Akademi Sains Kebangsaan Amerika Syarikat, 93(20), 11219-11224. doi:https://doi.org/10.1073/pnas.93.20.11219

Banerjee, SB, Gutzeit, VA, Baman, J., Aoued, HS, Doshi, NK, Liu, RC, & Ressler, KJ (2017). Jaring perineuron dalam korteks deria dewasa diperlukan untuk pembelajaran ketakutan. Neuron, 95(1), 169-179. doi:10.1016/j.neuron.2017.06.007

Barta, CL, Liu, H., Chen, L., Giffen, KP, Li, Y., Kramer, KL, . . . Beliau, DZ (2018). Transkripmikanalisis RNA-seq sel rambut telinga dalam ikan zebra dewasa. Data Saintifik, 5, 180005.doi:https://doi.org/10.1038/sdata.2018.5

Bayraktar, G., & Kreutz, MR (2018). Peranan Demetilasi DNA Bergantung kepada Aktiviti dalam Otak Dewasa dan Gangguan Neurologi. Sempadan dalam Neurosains Molekul, 11, 169.doi:10.3389/fnmol.2018.00169

Bieszczad, KM, Bechay, K., Rusche, JR, Jacques, V., Kudugunti, S., Miao, W., . . . Wood, MA (2015). Perencatan Histone Deacetylase melalui RGFP966 Melepaskan Brek pada Keplastikan Kortikal Deria dan Kekhususan Pembentukan Memori. J Neurosci, 35(38), 13124-13132.doi:https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0914-15.2015

Brown, MR, & Kaczmarek, LK (2011). Modulasi saluran kalium dan pemprosesan pendengaran. Penyelidikan Pendengaran, 279(1-2), 32-42. doi:https://doi.org/10.1016/j.heares.2011.03.004

Bychkov, ML, Vasilyeva, NA, Shulepko, MA, Balaban, PM, Kirpichnikov, MP & Lyukmanova, EN(2018). Lynx1 Menghalang Sekatan Potensi Jangka Panjang dan Pengurangan Ekspresi Neuromodulator Disebabkan oleh A 1-42 dan Pengaktifan JNK. Acta Naturae, 10(3), 57-61.

Reference:1950477648n@gmail.com