LNK Farnesyltransferase Inhibitor-754 Melemahkan Distrofi Akson Dan Mengurangkan Patologi Amiloid dalam Tikus Bahagian 1

Abstrak

latar belakang:

Pemendapan plak amyloid dan degenerasi aksonal adalah peristiwa awal dalam patogenesis AD. A mengganggu mikrotubulus dalam neurit distrofi presinaptik, mengakibatkan pengumpulan organel endolisosomal dan autofagik terjejas yang mengangkut enzim pemisah protein prekursor amiloid tapak (BACE1). Akibatnya, neurit distrofik menjana A 42 dan menyumbang dengan ketara kepada pemendapan plak.

Degenerasi axonal adalah gangguan neurologi yang menyebabkan kerosakan pada akson neuron, dengan itu menjejaskan pengaliran saraf. Kekebalan adalah garis pertahanan penting bagi tubuh manusia untuk menentang pencerobohan kuman dan virus asing. Jadi, adakah terdapat hubungan antara degenerasi axonal dan imuniti?

Pertama, degenerasi axonal bukanlah penyakit yang disebabkan oleh sistem imun, jadi tidak perlu risau tentang imuniti yang menjejaskannya secara negatif. Walaupun punca khusus degenerasi aksonal tidak diketahui, beberapa kajian mencadangkan bahawa degenerasi axonal mungkin berkaitan dengan tindak balas keradangan dalam sistem imun. Tindak balas keradangan adalah mekanisme perlindungan sistem imun terhadap pencerobohan patogen asing. Walau bagaimanapun, jika ia terlalu aktif, ia akan menyebabkan kerosakan radang pada neuron dan menggalakkan degenerasi aksonal.

Kedua, sistem imun yang kuat boleh meningkatkan daya tahan badan dan mengurangkan risiko jangkitan dan penyakit, yang amat penting bagi pesakit yang mengalami degenerasi axonal. Kerana sistem saraf pesakit dengan degenerasi axonal telah rosak, keupayaan pembaikan diri badan agak lemah. Sekiranya mereka menghidap penyakit lain, keadaannya akan menjadi lebih teruk dan seterusnya menjejaskan kualiti hidup mereka. Oleh itu, mengekalkan diet dan tabiat hidup yang sihat serta meningkatkan imuniti boleh membantu mengurangkan risiko penyakit lain. Pada masa yang sama, ia boleh meningkatkan tindak balas imun badan dan menggalakkan pembaikan akson dan pemulihan pengaliran saraf.

Ringkasnya, walaupun tidak ada hubungan yang diperlukan antara degenerasi aksonal dan imuniti, sistem imun yang sihat boleh memberikan perlindungan dan sokongan yang diperlukan untuk pesakit yang mengalami degenerasi aksonal. Oleh itu, kita harus memberi perhatian kepada kepentingan mengekalkan sistem imun, bermula dari aspek seperti pemakanan dan tabiat hidup, dan secara aktif meningkatkan tahap imun badan untuk meletakkan asas yang kukuh untuk kesihatan dan awet muda. Ia boleh dilihat bahawa kita perlu meningkatkan daya ingatan, dan Cistanche deserticola boleh meningkatkan daya ingatan dengan ketara kerana Cistanche deserticola adalah bahan perubatan tradisional Cina yang mempunyai banyak kesan unik, salah satunya adalah untuk meningkatkan daya ingatan. Keberkesanan daging cincang berasal dari pelbagai bahan aktif yang terkandung di dalamnya, termasuk asid, polisakarida, flavonoid, dll. Bahan-bahan ini boleh menggalakkan kesihatan otak dalam pelbagai cara.

Klik tahu 10 cara untuk meningkatkan ingatan

Inhibitor Farnesyltransferase (FTI) baru-baru ini telah disiasat untuk mengubah kedudukan ke arah rawatan gangguan neurodegeneratif dan menyekat tindakan farnesyltransferase (FTase) untuk memangkinkan farnesylation, pengubahsuaian pasca terjemahan yang mengawal protein yang terlibat dalam fungsi lisosom dan kestabilan mikrotubule. Dalam otak AD postmortem, FTase dan isyarat hilirannya dikawal selia. Walau bagaimanapun, kesan FTI terhadap patologi amiloid dan neurit distrofik tidak diketahui.

Kaedah:

Kami menguji kesan FTIR LNK-754 dan lonafarnib dalam model tetikus 5XFAD patologi amiloid.

Keputusan:

Dalam 2-tikus 5XFAD sebulan yang dirawat secara kronik selama 3 bulan, LNK-754 mengurangkan beban plak amiloid dan hiperfosforilasi tau serta melemahkan pengumpulan BACE1 dan LAMP1 dalam neurit distrofik. Dalam 5-tikus 5XFAD sebulan yang dirawat secara akut selama 3 minggu, LNK{11}} mengurangkan saiz neurit distrofik dan pengumpulan LysoTracker-Green tanpa kesan pada deposit A. Rawatan akut dengan LNK{13}} meningkatkan defisit ingatan dan pembelajaran dalam tikus amiloid hAPP/PS1.

Berbeza dengan LNK-754, rawatan lonafarnib kurang berkesan dalam mengurangkan plak, tau hiperfosforilasi dan neurit distrofik, yang mungkin berpunca daripada pengurangan potensi terhadap FTase berbanding LNK-754. Kami menyiasat kesan FTI pada pemerdagangan akson organel endolisosomal dan mendapati lonafarnib dan LNK-754 meningkatkan pengangkutan akson retrogred dalam neuron primer, menunjukkan FTI boleh menyokong pematangan endosom lewat akson kepada lisosom. Tambahan pula, rawatan FTI meningkatkan tahap LAMP1 dalam neuron utama tetikus dan otak tikus 5XFAD, menunjukkan bahawa FTI merangsang biogenesis organel endolisosomal.

Kesimpulan:

Kami menunjukkan data baharu untuk mencadangkan bahawa LNK-754 menggalakkan pemerdagangan akson dan fungsi petak endolisosomal, yang kami hipotesiskan mengurangkan distrofi akson, mengurangkan pengumpulan BACE1 dan menghalang pemendapan amiloid dalam tikus 5XFAD. Keputusan kami bersetuju dengan kerja sebelumnya yang mengenal pasti FTase sebagai sasaran terapeutik untuk merawat proteinopati dan boleh mempunyai implikasi terapeutik yang penting dalam merawat AD.

Kata kunci:

Penyakit Alzheimer, neurit Dystrophic, perencat Farnesyltransferase.

Latar belakang

Penyakit Alzheimer (AD) adalah penyakit neurodegeneratif progresif yang merupakan penyebab paling biasa demensia dalam populasi yang semakin tua dan dicirikan oleh kemerosotan yang ketara dalam pembelajaran dan ingatan. Pada peringkat molekul, ciri ciri otak AD ialah pembentukan plak amiloid- (A) dan kehadiran rangkuman tau hiperfosforilasi.

Pada peringkat awal AD tanpa gejala, A terkumpul di dalam otak selama lebih dua dekad atau lebih lama sebelum bermulanya gangguan ingatan [1-3]. Akibatnya, mengurangkan tahap otak A telah menjadi tumpuan utama strategi rawatan untuk AD [4]. Pada masa ini, satu-satunya terapi pengubahsuaian penyakit yang diluluskan secara bersyarat oleh FDA ialah antibodi anti-A yang membersihkan bentuk agregat A dari otak [5], mengesahkan bahawa menyasarkan A dalam otak adalah pendekatan yang menjanjikan untuk rawatan AD.

Walau bagaimanapun, kebanyakan ujian klinikal yang tertumpu pada A telah gagal kerana kebimbangan keselamatan atau keberkesanan, dan penekanan kini telah diletakkan pada sasaran berdasarkan hipotesis AD yang berbeza, termasuk penyebaran tau, keradangan, dishomeostasis kalsium, dan faktor neurovaskular [4, 6, 7]. ]. Di samping itu, terdapat minat yang semakin meningkat dalam potensi terapeutik untuk mengaktifkan laluan degradasi lisosom sebagai kaedah untuk mengurangkan protein patogen, ciri yang biasa merentasi penyakit neurodegeneratif [8-12].

Disfungsi meluas laluan endolisosomal dan autofagik didokumentasikan dengan baik sebagai peristiwa awal patogenesis AD. Banyak lokus genetik kerentanan AD dikaitkan dengan pengangkutan endolisosomal subselular dan fungsi lisosom [13], dan organel endolisosomal dan autofagik yang tidak berfungsi yang diperbesarkan terkumpul di otak AD dalam neurit distrofik [14, 15].

Neurit distrofik nampaknya dimulakan apabila kecederaan neuron, dan dalam AD ini dicadangkan sebagai ketidakstabilan mikrotubul oleh A [16]. Ini mengakibatkan pembengkakan akson fokus yang mengganggu laluan pemerdagangan dan degradasi normal protein utama yang terlibat dalam pengeluaran A, termasuk BACE1 [16, 17]. Akibatnya, distrofi menjana A 42 dan menyumbang dengan ketara kepada pemendapan plak ekstraselular dan distrofi aksonal [18], memulakan laluan suapan ke hadapan yang mengakibatkan kehilangan sinaptik, neurodegenerasi, dan defisit kognitif [16].

Strategi terapeutik yang meningkatkan pengangkutan dan aktiviti organel endolisosomal dan autofagik boleh menghalang distrofi neuritik mengekalkan degradasi protein patogen, dan menjadi mekanisme kritikal untuk mengurangkan tahap BACE1 dan A dalam AD.

Apabila pencarian diteruskan untuk rawatan AD yang berkesan, bilangan ubat yang digunakan semula dalam ujian klinikal untuk AD telah berkembang dengan ketara kerana ubat yang dinilai secara klinikal telah mengetahui masalah keselamatan dan keberkesanan, sekali gus mempercepatkan proses pembangunan ubat [7, 19]. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, kajian telah mengenal pasti FTI sebagai kelas ubat yang berpotensi untuk digunakan semula untuk merawat penyakit neurodegeneratif.

FTI menghalang farnesylation, pengubahsuaian pasca translasi yang mengawal protein di mana farnesyl pyrophosphate diubah suai secara kovalen kepada residu sistein dalam protein yang mengandungi motif CAAX [20]. FTI pada mulanya direka untuk menyekat aktiviti Ras onkogenik dengan menghalang prenilasinya tetapi telah dihentikan dalam ujian klinikal untuk rawatan kanser berikutan penemuan laluan pranilasi Ras alternatif [21, 22].

Walau bagaimanapun, banyak substrat FTase wujud [23-25], yang membawa kepada penilaian FTI untuk pelbagai gangguan, termasuk penyakit kardiovaskular, hepatitis D, dan progeria [20, 26]. Selain itu, FTI telah menunjukkan janji terhadap penyakit neurodegeneratif yang dicirikan oleh pengumpulan agregat protein. Dalam model kultur tikus dan sel proteinopathies, FTI mendorong aktiviti lisosom dan proteolisis protein toksik khusus penyakit [8, 9, 27, 28].\

Sebelum ini, kami menunjukkan bahawa LNK-754, FTI yang diuji dalam ujian kanser, mempertingkatkan pemerdagangan hidrolase lisosom dan menurunkan agregat alfa-synuclein ( -synuclein) dalam neuron yang diturunkan pesakit dan model tetikus PD penyakit Parkinson (PD) [8 ].

Kajian lain telah melaporkan keputusan FTI yang sama ke arah mengurangkan agregat protein; merawat model kultur sel PD dengan FTI-277 pengurangan -synuclein [28] dan lonafarnib, FTI yang diluluskan FDA untuk rawatan progeria [29], meningkatkan aktiviti lisosom dan mengurangkan kemasukan tau dalam model tetikus tauopati [ 9]. Tambahan pula, kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa kalah mati genetik FTase neuron dalam model tetikus APP/PS1 AD menghalang generasi A [30]. Tumpuan kajian lepas yang menilai FTI untuk proteinopati adalah peranan substrat FTase dalam aktiviti lisosom dan autophagy.

Walau bagaimanapun, FTI juga dikenali untuk menggalakkan kestabilan mikrotubule (MT) dan bersinergi dengan ubat penstabil MT untuk meningkatkan asetilasi tubulin, melalui laluan bebas Ras [31-33]. Penstabilan MT menghalang patologi AD dalam tikus APP/PS1 [34], dan pada masa ini, beberapa agen penstabil MT sedang disiasat secara klinikal untuk rawatan AD [35]. Oleh itu, bukti besar menunjukkan bahawa FTI boleh memberi manfaat kepada penyakit yang dicirikan oleh mekanisme homeostasis protein yang tidak berfungsi seperti AD. Namun, sasaran dan laluan yang menghubungkan farnesilasi protein dengan penurunan agregat protein dalam penyakit neurodegeneratif tidak difahami sepenuhnya.

Dalam kajian ini, kami menilai sama ada rawatan farmakologi dengan FTI boleh memperbaiki patologi AD yang berkaitan dengan A. Kami menilai kesan LNK-754 dan lonafarnib, dua FTI yang diketahui dapat mengurangkan agregat protein dalam gangguan neurodegeneratif, pada beban plak dan neurit distrofik dalam model tetikus 5XFAD patologi amiloid. Keputusan kami memberikan pandangan tentang laluan yang terjejas oleh perencatan FTase dan sangat menyokong penyiasatan lanjut ke dalam penggunaan semula FTI sebagai terapeutik untuk AD dan penyakit neurodegeneratif lain yang dicirikan oleh pembentukan agregasi protein.

Bahan dan kaedah

Haiwan dan rawatan dadah

Semua kerja haiwan telah dilakukan oleh kelulusan Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Northwestern (IACUC). Tikus telah diberi diet chow tikus standard dan air ad libitum dan ditempatkan dengan kitaran standard 12-jam terang/gelap. Tikus 5XFAD pada latar belakang C57BL6 (Jackson Laboratories) dikekalkan dengan melintasi tikus C57BL6 jantan hemizygous transgene-positif dengan tikus C57BL6 betina transgene-negatif (Jackson Laboratories).

Dalam protokol rawatan kronik kami, rawatan ubat telah dimulakan pada usia 2 bulan, umur di mana pemendapan plak bermula [36, 37]. Dalam protokol rawatan akut, rawatan dadah dimulakan pada usia 5 bulan selepas pemendapan plak dan degenerasi aksonal meluas [38, 39].

LNK{{0}} telah disintesis oleh Link Medicine (Massachusetts USA) dan lonafarnib diperoleh daripada Cayman Chemical Company (Ann Harbor, MI). Untuk rawatan haiwan, LNK-745 dan lonafarnib telah disediakan dalam larutan yang dipanaskan sebanyak 0.5% carboxymethylcellulose (Sigma-Aldrich) sebagai kenderaan pada kepekatan 0.10mg/mL sehingga larut dan larutan itu jelas.

Aliquot untuk suntikan dibekukan pada -20 darjah dan kemudian dicairkan dan disimpan pada 4 darjah untuk setiap minggu rawatan. Tikus dirawat mengikut protokol yang telah ditetapkan yang diketahui meningkatkan aktiviti lisosom [8]. Dalam protokol rawatan kronik, 2-tikus 5XFAD berusia sebulan telah disuntik melalui suntikan intraperitoneal (ip) dengan sama ada kenderaan, LNK754 atau lonafarnib setiap hari menggunakan picagari insulin tolok 29-selama 12 minggu sehingga tikus berumur 5 tahun. berbulan-bulan. Dalam rejimen rawatan akut, 5-tikus 5XFAD berusia sebulan disuntik setiap hari selama 3 minggu.

Setelah selesai rawatan, tikus telah dibius dan diberi minyak, dan otak dikumpulkan untuk analisis lanjut (lihat bahagian bawah). Untuk eksperimen kultur sel, LNK-754 dan lonafarnib telah dilarutkan dalam DMSO dan ditambahkan pada kultur neuron primer tikus pada kepekatan 10nM selama 48 jam. Rawatan kenderaan adalah jumlah yang setara dengan DMSO. Sel telah dikumpulkan dan dianalisis seperti yang diterangkan di bawah.

Antibodi

Antibodi yang digunakan untuk eksperimen imunofluoresensi ialah anti-LAMP1 tikus (#1D4B, DSHB), arnab anti-A 42 (#700254, Invitrogen), arnab anti-BACE1 (#ab108394, Abcam), arnab anti- III tubulin (#ab18207, Abcam). Untuk immunoblotting, antibodi yang digunakan ialah anti-aktin arnab (#926–42,210, LI-COR), antip44/42 MAPK (pErk1/2) arnab (#CS9101, Teknologi Isyarat Sel), anti arnab-44/42 (Erk1/2) (#CS137F5, Teknologi Isyarat Sel), arnab anti-LAMP1 (#CS3234, Teknologi Isyarat Sel), anti-BACE tetikus (3D5; Zhao et al., 2007), anti-APP tetikus (6E10) ( #803001, BioLegend), arnab anti-p-tau (ser404) (#CS20194, Teknologi Isyarat Sel), tetikus anti-Tau1 (#MAB3420, Millipore Sigma), prelamin-A, (#MABPT858, Millipore Sigma) dan anti tetikus -HDJ-2 (#sc-59,554, Santa Cruz). Antibodi sekunder anti-arnab atau -tikus daripada Vector Laboratories telah digunakan untuk immunoblots.

Ujian tingkah laku

Haiwan dan rawatan dadah

Analisis tingkah laku dilakukan oleh reMYND, Inc. menggunakan model tetikus hAPP/PS1 dengan ekspresi khusus neuron bagi mutan klinikal protein prekursor amiloid manusia bersama-sama dengan mutan klinikal presenilin manusia 1 [40]. Tikus transgenik berganda ini memaparkan pengumpulan A secara spontan dan progresif di dalam otak, akhirnya menghasilkan plak amiloid dalam subiculum, hippocampus, dan korteks pada usia 6 bulan. 48 tikus hAPP/PS1 betina dalam latar belakang FVB x C57Bl/6J berumur 6 bulan telah digunakan untuk kajian ini, dalam kombinasi dengan 12 kawalan jenis liar betina yang dipadankan dengan umur dalam latar belakang FVB x C57Bl/6J. Pentadbiran 0.9mg/kg/hari LNK-754 dilakukan setiap gavage oral, sekali sehari, selama 12 hari berturut-turut. Pengorbanan haiwan itu dilakukan 2 jam selepas dos akhir.

Semua tikus telah digenotipkan oleh tindak balas rantai polimerase (PCR) pada usia 3 minggu dan menerima nombor identiti unik, setelah keputusan PCR diketahui. Semua tikus telah diperiksa dua kali oleh PCR kedua sebelum bermulanya kajian. Semua tikus secara rawak buta dan dipadankan dengan umur. Tikus diberi nombor rawak oleh komputer dan diperuntukkan secara rawak untuk rawatan. Haiwan itu dikurung semula oleh kumpulan rawatan 15 hari sebelum bermulanya kajian untuk membolehkan mereka membiasakan diri dengan konteks sangkar baharu. Tikus mempunyai akses percuma kepada air pra-tapis dan steril serta makanan tetikus standard (Snif® Ms-H, Snif Spezialdiäten GmbH, Soest, Jerman). Makanan disimpan dalam keadaan kering dan sejuk di dalam bilik simpanan yang mempunyai pengudaraan yang baik. Jumlah air dan makanan diperiksa setiap hari, dibekalkan apabila perlu dan standard disegarkan sekali seminggu. Tikus pada mulanya ditempatkan di bawah irama siang-malam terbalik (14 jam terang/10 jam kegelapan) bermula jam 7 malam dalam sangkar logam standard jenis RVS T2 (luas 540 cm2 ).

Sangkar dilengkapi dengan lantai pepejal dan lapisan sampah tempat tidur. Bilangan tikus setiap sangkar dihadkan oleh undang-undang tempatan mengenai kebajikan haiwan. 15 hari sebelum permulaan rawatan, tikus dikurung semula dalam sangkar makrolon T2 berventilasi individu dan diangkut ke makmal untuk menyesuaikan diri dengan persekitaran makmal sebagai persediaan untuk rawatan. Di makmal, irama siang-malam ditukar kepada 12 jam terang/12 jam kegelapan, bermula jam 7 malam

labirin air Morris

Morris Water Maze telah dilakukan pada hari 8–12 rawatan, dan haiwan itu dikorbankan terus selepas ujian siasatan. Kolam renang (bekas bulat putih berdiameter 1m) mengandungi air pada 20 darjah dengan titanium dioksida sebagai bahan tambahan tidak berbau dan tidak toksik untuk menyembunyikan pelantar melarikan diri (1cm di bawah paras air). Renang setiap tetikus telah dirakam dan dianalisis (Ethovision, Teknologi Maklumat Noldus, Wageningen, Belanda). Sebelum latihan, setiap tetikus diletakkan di atas platform selama 15 saat. Untuk ujian navigasi tempat, tikus dilatih untuk mencari platform tersembunyi dalam tujuh blok tiga percubaan selama empat hari berturut-turut.

Setiap percubaan terdiri daripada ujian renang paksa maksimum 120 saat, diikuti dengan rehat 10 minit. Masa yang diperlukan oleh setiap tetikus untuk mencari platform telah diukur. Tujuh blok berturut-turut menghasilkan keluk pembelajaran. 24 jam selepas latihan terakhir, setiap haiwan mempunyai percubaan siasatan dengan platform dialih keluar. Tikus dibenarkan mencari selama 60 saat, dan masa carian kuadran dan lintasan kedudukan platform asal diukur. Semasa ujian siasatan akhir, tikus dibenarkan mencari lokasi platform sebelumnya selama 60 saat selepas platform dialih keluar.

Budaya neuron utama

Otak depan dibedah dalam larutan Hanks' Balanced Salt (HBSS) (Thermo Fisher #14185–052) daripada tikus C57BL6 jenis liar hamil (Jackson) pada E15.5 untuk mendapatkan neuron primer. Otak depan yang dibedah telah dicernakan dalam 2.5% tripsin pada 37 darjah selama 20 minit. Pipet Pasteur yang digilap api digunakan untuk mengasingkan neuron dalam HBSS. Neuron itu kemudiannya disalut pada plat enam telaga bersalut poli-L-lisin, 2 × 106 neuron setiap telaga dalam medium neurobasal ditambah dengan 2% B-27, glutamin 500μM, 10% serum kuda, dan 2.5μM glutamat (semua dari Thermo Fisher).

Media ditukar 2 jam kemudian kepada Neurobasal dengan 2% B-27, 500μM glutamin dan 2.5μM glutamat. 24 jam kemudian, media ditukar kepada Neurobasal ditambah 2% B-27 dan 500μM glutamin. Perubahan separuh media dibuat setiap 2-3 hari. Neuron utama dibiakkan selama 7 hari dan dirawat dengan kenderaan (DMSO) atau kepekatan 10nM LNK-754, atau lonafarnib selama 48 jam. Neuron kemudiannya ditetapkan atau diimej secara langsung seperti yang diterangkan di bawah.

Untuk penetapan, neuron diinkubasi selama 20 minit dalam 4% paraformaldehid, 0.12M sukrosa dalam 1XPBS, telap dalam 0.5% Triton X-100 dan diinkubasi dengan antibodi primer semalaman diikuti dengan Antibodi sekunder konjugasi Alexafuor anti-tikus keldai (Molecular Probes, 1:1000) dan diwarnakan bersama dengan 300nM DAPI. Coverslips telah dipasang menggunakan Prolong Gold (Molecular Probes), dan imej diperoleh pada mikroskop confocal Nikon A1 dengan objektif 60X (NA 1.4) dan perisian NIS Elements.

Pengimejan langsung neuron

Untuk eksperimen pengimejan langsung, neuron telah disediakan seperti di atas dan disalut dalam piring bawah kaca 35mm (MatTek # P35G-1.5-14C) selama 7 hari dalam kultur. LNK 10nM-754 atau lonafarnib kemudiannya ditambahkan pada media berhawa dingin, kultur kawalan dirawat dengan DMSO sebagai kenderaan. Selepas 48 jam rawatan, media digantikan dengan media terkondisi daripada plat selari neuron yang tidak dirawat. 25nM LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) telah ditambahkan pada media terkondisi dan neuron diinkubasi selama 30 minit pada 37 darjah .

Pengimejan selang masa neuron dilakukan menggunakan mikroskop medan lebar Ti2. Pengimejan bermula serta-merta pada 30 minit dan berterusan selama tidak lebih daripada 30 minit. Pendedahan 1- diambil setiap minit dan 20–30 kawasan berasingan bagi setiap hidangan telah diimej dalam masa 30 minit. Kuantifikasi jarak dan halaju zarah LysoTracker dan analisis kymograph dilakukan menggunakan perisian NIS Elements dan diterangkan secara terperinci di bawah. Dalam percubaan berasingan, 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) telah ditambahkan pada media terkondisi dan imej tangkapan neuron hidup telah diambil selama tidak lebih daripada 15 minit menggunakan mikroskop confocal Nikon A1 dengan objektif 60X (NA 1.4) dan perisian NIS Elements.

For more information:1950477648nn@gmail.com