Penilaian Airgel Kalsium Alginat yang Ditadbir Secara Lisan Pada Perubahan Mikrobiota Usus Dan Fungsi Hepatik Dan Buah Pinggang Tikus Wistar

Kenalan:ali.ma@wecistanche.com

Mohammad AA Al-Najjar et al

Abstrak

Kajian ini menilai kesan aerogel kalsium alginat sebagai pembawa ubat yang berpotensi, pada hati danfungsi buah pinggang, dan pada mikrobiota usus tikus Wistar. Kajian aerogel alginat telah disediakan dalam bentuk nanopartikel menggunakan teknik pemotongan jet, dan ia dicirikan dari segi kawasan permukaan tertentu, morfologi luar, dan taburan saiz zarah. Untuk kajian in vivo, aerogel kalsium alginat diberikan secara lisan, dan hati danfungsi buah pinggangtelah diuji selama satu minggu dan selama empat minggu dalam dua kajian yang berbeza. Semasa kajian jangka pendek in vivo, sampel najis dikumpul untuk pengekstrakan DNA bakteria diikuti oleh analisis penjujukan gen rRNA 16S untuk mengesan perubahan dalam mikrobiota usus. Keputusan menunjukkan bahawa aerogel alginat yang disediakan mempunyai purata luas permukaan khusus BET sekitar 540 m2/g, dengan isipadu liang 7.4 cc/g, dan lebar liang 30–50 nm. Kajian in vivo mendedahkan bahawa tahap yang dikajibuah pinggangdan enzim hati tidak melebihi paras tertinggi dalam julat normal. Kajian mikrobiota usus menunjukkan corak yang berbeza; kumpulan bakteria tertentu, seperti Clostridia dan Bacteriodia, meningkat semasaaerogelrejim dan terus meningkat selepas aerogel dihentikan. Manakala kumpulan lain seperti Erysipelotrichia, dan bakteria Candidatus Sacha meningkat semasaaerogelrawatan dan kemudian menurun semula selepas satu bulan. Ahli kelas Bacilli menunjukkan aliran yang unik, iaitu, selepas menjadi kumpulan paling banyak (63 peratus ) pada masa 0, kelimpahan relatif mereka menurun secara mendadak sehingga mencapai < 5="" peratus="" ;="" yang="" berlaku="" walaupun="" selepas="" menghentikan="" rawatan="">

Cistanchetubulosa menghalangbuah pinggangpenyakit, kesan sampingan cistanche, klik.

pengenalan

AerogelTerminologi telah muncul buat pertama kali pada tahun 1931 oleh Samuel Kistler, yang mendefinisikannya sebagai bahan yang mengekalkan struktur liang dan rangkaiannya secara utuh apabila menukar cecair liang mereka dengan gas [1]. Selepas 60 tahun penemuan mereka, organikaerogeltelah dicadangkan untuk aplikasi penghantaran bioperubatan dan ubat kerana kawasan permukaan dalaman yang besar dan struktur liang terbuka [2]. Ciri-ciri cemerlang kelas bahan ini membolehkan bukan sahaja untuk meningkatkan kecekapan pemuatan, tetapi juga untuk meningkatkan bioavailabiliti, kestabilan, dan kinetik pelepasan molekul yang dimuatkan.

Penyelidikan tentangaerogeluntuk pentadbiran ubat oral pada mulanya tertumpu kepada penggunaan silikaaerogelkerana kimia sol-gelnya yang fleksibel dan terkenal, serta kemungkinan derivatisasi [3]. Namun begitu, penggunaan aerogel silika dalam formulasi farmaseutikal yang direka untuk pentadbiran oral masih menimbulkan kebimbangan tertentu kerana kebolehbiodegradasiannya yang terhad. Oleh itu, keperluan selanjutnya timbul untuk membangunkan pembawa airgel yang kedua-dua biokompatibel dan boleh terbiodegradasi. Ini mungkin boleh dilakukan dengan menggunakan bahan organik semula jadi atau polimer terbiodegradasi, seperti alginat [4] asid hyaluronik [5], kitosan, selulosa [6], dan protein [7].

Alginat (Alg), yang diekstrak daripada alga perang, ialah kopolimer linear yang terdiri daripada ß-1,4-monomer asid D-mannuronic dan -L-guluronic asid, yang berselang-seli corak seperti blok homogen atau heterogen. . Alginat telah digunakan dalam industri makanan dan farmaseutik kerana ia tidak toksik, murah, terbiodegradasi, dan biokompatibel [8, 9]. Kation polivalen, seperti Ca2 tambah , Ba2 tambah , atau Sr2 tambah , boleh mendorong ikatan silang ion Alg, mengubahnya daripada bentuk larut kepada bentuk tidak larut (gel).

Alg telah digunakan secara meluas dalam produk makanan dan sebagai bahan tambahan farmaseutikal, seperti agen pembentuk gel dan penghancur tablet [10, 11]. Ia juga telah digunakan dalam aplikasi bioperubatan, termasuk penghantaran ubat dan kejuruteraan tisu [12]. Seperti serat makanan lain yang boleh dimakan, Alg dan derivatif oligomernya tahan terhadap pencernaan oleh enzim endogen manusia. Walau bagaimanapun, ia boleh dicerna dengan ketara oleh mikrobiota usus manusia [13]. Walaupun kepentingannya, sedikit yang diketahui tentang mikrobiota usus yang bertanggungjawab untuk degradasi Alg.

Pihak Berkuasa Keselamatan Makanan Eropah (EFSA) telah mengisytiharkan keselamatan asid alginik dan garamnya, serta produk penapaian mereka. Ujian in vivo untuk penyerapan dan perkumuhan larutan akueus dan penggantungan asid alginik dan garamnya dalam haiwan menunjukkan ketidakupayaan mereka untuk diserap atau dimetabolismekan oleh enzim yang terdapat dalam saluran gastrousus tanpa mengira bentuk yang digunakan semasa pentadbiran. Walau bagaimanapun, mereka akan terdegradasi sebahagiannya melalui penapaian semasa laluan mereka melalui usus besar oleh tindakan mikrobiota usus anaerobik, menyebabkan pembesaran caecal yang dianggap oleh EFSA sebagai proses penyesuaian yang berkaitan dengan dos tinggi yang diuji sebagai bahan tambahan makanan [14] . Namun begitu, tiada kajian in vivo sebelum ini telah mengkaji kesan kalsium alginat (Ca-Alg) dalam bentuk aerogel padahati, buah pinggang,atau komuniti bakteria dalam usus.

Mikrobiota usus adalah komponen penting dalam sistem pencernaan manusia, kerana ia membantu dalam degradasi makanan yang ditelan, terutamanya yang badan manusia tidak mempunyai enzim yang diperlukan [15, 16]. Mikrobiota usus juga boleh menghalang pembungaan mikroorganisma patogen dengan bersaing dengan mereka dalam sumber nutrien, atau dengan menghasilkan bahan kimia untuk menghalang pertumbuhannya. Walau bagaimanapun, telah ditunjukkan bahawa degradasi serat tercerna yang dicerna, seperti Alg, berlaku terutamanya oleh bakteria yang ditapai dalam kolon [17]. Produk dari proses ini adalah asid lemak rantai pendek (SCFA), yang bermanfaat untuk keradangan kolon dan bertindak sebagai antikanser. Brownlee et al. melaporkan bahawa pengeraman Alg dan mikroflora najis manusia menunjukkan bahawa kebanyakan degradasi Alg disertai dengan perubahan dalam mikrobiota usus. Juga, inkubasi sedemikian membawa kepada pengeluaran SCFA dan gas selepas 24 jam [17].

Bahan dan kaedah

Bahan

Garam natrium asid alginik dibekalkan oleh BASF, Jerman. Kalsium klorida (CaCl2) dibeli daripada Th. Geyer GmbH & Co. KG, Jerman. Karbon dioksida (ketulenan 99.5 peratus ) dibekalkan oleh Praxair (Jerman), etanol 99.8 peratus diperoleh daripada Carl Roth (Jerman). Semua bahan kimia digunakan seperti yang diterima. Kit diagnostik komersial digunakan untuk mengukur ALP, dan kit kreatinin dibeli dari Biostsystems SA, Sepanyol. Kit Pengasingan PowerMax SoilDNA MO BIO telah dibeli daripada MO BIO Laboratories, Amerika Syarikat. Air ternyahion digunakan sepanjang kajian.

Kaedah

Penyediaan zarah airgel.

Langkah pertama dalam penyediaan zarah aerogel ialah menyediakan larutan stok; untuk itu serbuk natrium alginat (Alg) telah ditambah ke dalam air suling dalam kepekatan 1 peratus b/b dan disimpan di bawah kacau magnet semalaman pada suhu bilik. Untuk menyediakan zarah hidrogel, pendekatan yang diterangkan oleh Preibisch et al. [18] diikuti, menggunakan Jet Cutter Type S dari genia Lab, Braunschweig (Jerman). Dalam proses jet-cut ting ting, larutan alginat dikeluarkan melalui muncung (diameter 350 μm) oleh udara termampat (1–3 bar) untuk membentuk pancutan (kadar aliran jisim 1 g/s). Pancutan dipotong dalam zarah berasingan dengan cakera berputar (40 wayar dengan diameter wayar 100 μm cakera pemotongan, nisbah silinder 5). Selepas melepasi cakera, larutan polimer jatuh ke bawah ke dalam tab gelasi dengan larutan CaCl2 5 g/L. Untuk mengelakkan penggumpalan zarah-zarah gel, isipadu mandian gel adalah sekurang-kurangnya empat kali ganda jumlah isipadu larutan biopolimer yang diproses, dan kandungan mandian dikacau dengan bar magnetik (60 rpm). Jarak pemisahan antara muncung dan mandian gelasi dikekalkan pada 50-70 cm. Selepas mengumpul zarah-zarah gel, pengadukan diteruskan selama 60 minit untuk memastikan pengelasan lengkap dan untuk mengelakkan penggumpalan. Zarah-zarah bergel kemudian diasingkan daripada mandian gel melalui penapisan dan diteruskan untuk pertukaran pelarut.

Pertukaran pelarut (air kepada etanol) dilakukan pada zarah terkumpul secara berperingkat (30,60, 90, 100 peratus v/v etanol). Untuk memastikan pertukaran lengkap, ketumpatan cecair rendaman selepas langkah pertukaran pelarut terakhir diukur menggunakan meter ketumpatan (DMA4500, Anton PaarCompany, Austria). Ketumpatan kemudiannya dikira semula ke dalam kandungan etanol. Zarah alkogel yang terhasil akhirnya dibungkus ke dalam kertas turas, dan dikeringkan dengan CO2 superkritikal dalam autoklaf pada suhu malar 50˚C dan tekanan 120 bar. Aliran berterusan CO2 (20–80 g/min) ditetapkan sehingga pengekstrakan lengkap etanol dilakukan (2–4 jam). Selepas itu, penyahtekanan perlahan autoklaf (1–3 bar/min) dilakukan. Setelah tekanan ambien dicapai, autoklaf dibuka dan mikrosfera aerogel kalsium alginat (ditandakan sebagai Ca-Alg selepas ini) dikumpul dan disimpan dalam bekas yang tertutup rapat di bawah keadaan kering.

Pencirian zarah airgel

kawasan permukaan khusus zarah aerogel diukur melalui penjerapan/desorpsi nitrogen suhu rendah (BET) (Quantachrome Nova 3000e, Odelzhausen, Jerman dan Micromeritics TriStar II 3020, Jerman). Sebelum pengukuran, sampel telah dikeringkan selama 20 di bawah vakum (< 1="" mpa)="" at="">

Penyiasatan morfologi luar zarah aerogel yang disediakan telah dilakukan melalui analisis mikroskop elektron pengimbasan (SEM) (Zeiss Supra VP55, Jena, Jerman) pada voltan pecutan 3 kV dan jarak kerja 9.0– 9.4 mm. Sampel dipercikkan emas (ketebalan 10nm) sebelum pengimejan untuk meminimumkan pengecasan dan meningkatkan kontras imej.

Pengukuran taburan saiz zarah dilakukan tiga kali untuk setiap sampel yang terdiri daripada kira-kira 10,000 zarah. Analisis imej dinamik dilakukan menggunakan aCamsizer XT dengan modul X-Jet (Retsch GmbH, Jerman) dengan udara bertekanan pada 50 kPa.

Fungsi hepatik dan buah pinggang, dan kajian mikrobiota usus

Kajian rintis telah dilakukan ke atas sebilangan kecil haiwan yang dibahagikan kepada kumpulan yang berbeza untuk meliputi empat tahap dos bahan rawatan. Ia dijalankan untuk tempoh masa yang singkat (1 minggu) untuk melihat dos maksimum yang mungkin bagi aerogel Ca-Alg yang tidak mempunyai kesan besar pada fungsi buah pinggang atau hati, dan yang tidak menunjukkan tanda-tanda morbiditi atau kematian. Dos telah dipilih dengan teliti memandangkan LD50 oral alginat yang dilaporkan (lebih daripada 5,000 mg/kg berat badan) [19]. Namun, dos maksimum yang boleh dicapai yang dicapai dengan pengadukan haiwan yang minimum ialah 2,000mg/Kg berat badan.

Dalam bahagian kedua kajian, haiwan itu terdedah kepada tahap dos tetap selama dua minggu. Mengenai variasi umur dan berat serta keadaan penternakan semasa kajian ini, garis panduan Organisasi untuk Kerjasama dan Pembangunan Ekonomi (OECD) telah diikuti (kod No. 206). Semua protokol percubaan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika (IRB, Nombor Kelulusan: 2019-PHA-12, dilampirkan dalam Fail S1) Universiti Swasta Sains Gunaan (ASU), Jordan. Semua kakitangan di rumah haiwan di ASU dilatih dengan baik untuk memantau sebarang perubahan yang mungkin berlaku kepada haiwan itu akibat daripada campur tangan. Secara khusus, mereka memantau parameter seperti perubahan berat badan, tingkah laku tidak normal, bulu kusut, mobiliti berkurangan, postur badan atau ekspresi penanda cecair badan tertentu. Sekiranya berlaku sebarang perubahan tidak normal yang serius dalam status haiwan, mereka dibenarkan menggunakan protokol titik akhir yang berperikemanusiaan yang diluluskan oleh jawatankuasa Etika di ASU. Pada penghujung eksperimen, tikus telah dieutanasi dengan exsanguination di bawah bius am menggunakan 2.5 peratus natrium tiopental (Abbott Laboratories, North Point, Hong Kong) pada 20 mg/kg secara intravena.

Haiwan

Dalam kedua-dua kajian in vivo jangka pendek dan jangka panjang, Tikus Wistar berumur sepuluh minggu yang sihat dengan berat purata 240 ± 37 g ditempatkan pada suhu 21–23 ˚C dan kelembapan 35 peratus –70 peratus dalam bilik terkawal, dengan kitaran gelap 12 jam–12 jam. Tikus telah dikenal pasti dan diletakkan secara individu di dalam sangkar bersisi jelas untuk memudahkan pemerhatian tanpa mengganggu tingkah laku mereka. Pencukur kayu digunakan sebagai tempat tidur. Tikus diberi makan makanan yang tersedia secara komersial (player Bekalan Tempatan, Jordan) dan air tawar ditawarkan secara percuma.

Bilangan tikus setiap kumpulan dalam eksperimen yang berbeza telah dipilih mengikut karya yang diterbitkan sebelum ini (contoh; [20–22]), dan bergantung pada peraturan ketat tentang "penjagaan dan penggunaan haiwan" di peringkat kebangsaan dan antarabangsa, yang menekankan pada meminimumkan bilangan haiwan yang digunakan dalam kajian penyelidikan. Ini termasuk tetapi tidak terhad kepada, "Program Penjagaan dan Penggunaan Haiwan" di University of California, Berkeley (https://acuc.berkeley.edu/about.html), dan garis panduan Norway untuk kegunaan haiwan (https:// www.forskningsetikk.no/en/guidelines/science-and-technology/ethical-guidelines-for-the-use-of-animals-in-research/).

Kajian rintis dalam vivo (dos berulang 7 hari)

Dos oral berulang untuk tempoh satu minggu telah dilakukan untuk menentukan dos maksimum aerogel yang mungkin menunjukkan keselamatan dalam tikus Wistar. Airgel Ca-Alg ditadbir secara lisan pada empat tahap dos 50, 100, 250, dan 500 mg bersamaan dengan dos purata 200, 400,1000, dan 2000 mg/Kg (berat badan berat), masing-masing. Hasilnya dibandingkan dengan dua kumpulan kawalan positif yang diberi 50 dan 500 mg natrium alginat murni (Na-Alg) yang sepadan dengan tahap dos purata 200 dan 2000 mg/Kg berat badan, masing-masing. Akhirnya, semua kumpulan rawatan aerogel dan Na-Alg Ca-Alg sebelumnya telah dirujuk kepada kumpulan kawalan (plasebo). Kumpulan terakhir menerima penimbal fosfat dalam dos yang setara dengan dos maksimum apabila ia ditadbir sebagai sistem kenderaan untuk bahan ujian. Kumpulan kawalan dan rawatan untuk kajian rintis terdiri daripada 4 ekor tikus/kumpulan (dua betina dan dua jantan/kumpulan). Serbuk pepejal aerogel Ca-Alg dan Na-Alg masing-masing terampai dalam penimbal fosfat (pH 7.4) dan dicampur dengan baik secara langsung sebelum pemberian oral kerana tikus enggan memakannya dalam keadaan kering. Bagi semua kumpulan, pemberian kepada tikus dimulakan pada masa yang sama setiap hari menggunakan gavage oral.

Kajian pendedahan in vivo jangka panjang (kajian dos berulang 15 hari)

Berdasarkan keputusan dari bahagian sebelumnya, dos 250 mg aerogel Ca-Alg telah dipilih untuk dinilai selanjutnya untuk kajian pendedahan jangka panjang (15 hari) Tikus Wistar diperhatikan untuk sebarang kesan buruk buah pinggang dan/atau hepatik serta-merta atau tertunda. kesan yang mungkin berlaku apabila terdedah kepada aerogel Ca-Alg atau apabila terdedah kepada Na-Alg masing-masing. daripada. Bagi setiap bahan yang diuji, tiga kumpulan haiwan digunakan termasuk kawalan, rawatan dan kumpulan satelit. Kumpulan kawalan terdiri daripada 6 ekor tikus/kumpulan Wistar (3 jantan dan 3 betina), manakala kumpulan rawatan dan satelit terdiri daripada 10 ekor tikus/kumpulan Wistar (5 jantan dan 5 betina). Tikus Wistar dalam kumpulan rawatan menerima dos harian 250 mg bahan ujian (Ca-Alg airgel atau Na-Alg) selama 15 hari, dan mereka dikorbankan pada hari ke-16. Manakala kumpulan satelit dirawat untuk tempoh yang sama. seperti itu untuk kumpulan rawatan, tetapi disimpan di bawah pemerhatian selama 15 hari tambahan selepas rawatan, dan mereka dikorbankan pada hari ke-30.

Perlu dinyatakan bahawa tidak mungkin untuk menjalankan dua kajian aerogel Ca-Alg dan Na-Alg secara selari. Atas sebab ini, adalah tidak mudah untuk menggunakan satu kumpulan kawalan untuk kedua-duanya. Kumpulan kawalan ini menerima penimbal fosfat oral selama 15 hari sahaja dan seterusnya dipantau selama 14 hari lagi. Sebagai percubaan jangka pendek, serbuk pepejal aerogel Ca-Alg dan Na-Alg juga digantung dalam penimbal fosfat (pH 7.4) dan dicampur dengan baik secara langsung sebelum pemberian oral. Bagi semua kumpulan, pemberian kepada tikus dimulakan pada masa yang sama setiap hari menggunakan gavage oral.

Pemerhatian klinikal dan tingkah laku

Selaras dengan garis panduan OECD 407, haiwan dipantau setiap hari untuk sebarang tanda klinikal yang tidak normal atau perubahan dalam tingkah laku sepanjang tempoh kajian, dengan perhatian khusus pada empat jam pertama selepas pentadbiran bahan ujian. Haiwan dalam kumpulan satelit dan kawalan terus diperhatikan selama 15 hari tambahan tanpa pentadbiran rawatan. Kumpulan satelit membenarkan pengesanan sebarang tanda klinikal yang berlaku lewat yang menunjukkan kesan hepatik dan/atau buah pinggang melalui pengukuran tahap Alkali Fosfatase (ALP) dan kreatinin.

Analisis biokimia serum dan najis

Sepanyol. Sampel darah dikumpulkan dari vena sinus orbit tikus Wistar, yang kemudiannya digunakan untuk membelah serum. Serum yang dikumpul daripada sampel ini kemudiannya dipindahkan ke dalam tiub Eppendorf steril dan disimpan dalam pembekuan dalam untuk ujian lanjut parameter biokimia. Sampel najis juga dikumpul setiap hari kedua untuk menyiasat perubahan dalam struktur komuniti mikrob. Najis dikumpulkan dalam tiub bertutup skru steril15 ml bersih dan terus disimpan pada suhu -20˚C sehingga semua sampel dikumpulkan. Untuk 15-kajian dos berulang hari, hanya sampel darah dikumpul setiap minggu untuk mengukur tahap Alkali Fosfatase (ALP) dan kreatinin, iaitu pada hari 0, hari ke-7, hari ke-14, hari ke-21, dan hari ke-30 (hari ke-21 dan hari ke-30 digunakan untuk kumpulan kawalan dan satelit sahaja).

Analisis komuniti mikrob usus

Pengekstrakan DNA daripada sampel najis yang dikumpul telah dilakukan menggunakan Kit Pengasingan DNA PowerMaxSoil MO BIO (MO BIO Laboratories, USA), mengikut arahan pengilang. Pemurnian dan penjujukan Reaksi Rantaian Polimerase (PCR) DNA genomik (gDNA) kemudiannya dijalankan menggunakan Makmal En. DNA (Molecular Research LP, USA). Penguatan PCR gen 16S rRNA dan penjujukan seterusnya dilakukan menggunakan Illumina. Gen 16SrRNA V4 rantau pembolehubah PCR primer ill27F mod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG)/ill519R dan mod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) dengan kod bar pada primer hadapan digunakan dalam 30 kitaran menggunakan Kit Campuran Induk HotStarTaq Plus (Qiagen, Amerika Syarikat). Selepas amplifikasi, produk PCR telah diperiksa dalam 2 peratus gel agarose untuk menentukan kejayaan amplifikasi dan keamatan relatif jalur.

Kemudian produk PCR yang dikumpulkan dan disucikan digunakan untuk menyediakan perpustakaan DNA Illumina. Penjujukan dilakukan dengan DNA MR pada penjujukan mikrobiom (MiSeq) mengikut garis panduan pengilang. Data berjujukan telah diproses menggunakan saluran paip analisis DNA MR. Secara ringkasnya, jujukan telah dicantumkan, kemudian kod bar telah habis, selepas itu, jujukan < 150="" bpas="" serta="" jujukan="" dengan="" panggilan="" asas="" yang="" tidak="" jelas="" telah="" dialih="" keluar.="" jujukan="" telah="" dinafikan="" dan="" unit="" taksonomi="" operasi="" (out)="" dijana="" dan="" chimera="" dikeluarkan.="" otu="" ditakrifkan="" dengan="" mengelompokkan="" pada="" perbezaan="" 3="" peratus="" (97="" peratus="" persamaan).="" otu="" akhir="" telah="" dikelaskan="" secara="" taksonomi="" menggunakan="" blastn="" terhadap="" pangkalan="" data="" yang="" dipilih="" susun="" yang="" diperoleh="" daripada="" rdp-ii="" dan="" ncbi.="" pakej="" analisis="" statistik="" berbeza="" yang="" disertakan="" dalam="" perisian="" "r"="" telah="" digunakan="" untuk="" pengelompokan="" hierarki="" (versi="" 3.5.1,="" pakej="">