Penilaian Pengangkutan Usus Ekstrak Kaya Phenylethanoid Glycoside Daripada Cistanche Deserticola Merentasi Model Monolayer Sel Caco-2

pengenalan

Barisan sel Caco-2, yang berasal daripada adenokarsinoma kolon manusia, mempamerkan ciri-ciri seperti enterosit. Dalam keadaan biasa, sel Caco-2 secara spontan membezakan daripada sel matang dan membentuk satu lapisan utuh. Sel-sel bersebelahan melekat melalui persimpangan ketat yang terbentuk di bahagian apikal lapisan tunggal, yang boleh mendiskriminasikan secara pasif.dan mengangkut dadah secara aktif merentasi lapisan epitelium. Disebabkan persamaan morfologi dan biokimia dengan enterosit biasa, monolayer sel Caco-2 berfungsi sebagai model in vitro yang diterima baik untuk mengkaji potensi penyerapan usus dan ciri pengangkutan dadah.

Berbeza dengan bahan kimia, ekstrak tumbuhan (PE) adalah campuran yang aktiviti biologi dan konstituen aktifnya sering tidak dikenal pasti dengan baik. Selain itu, sifat pengangkutan usus PE, berbanding dengan sifat konstituennya, berkait rapat dengan penggunaan klinikal. Pengukuran fluks untuk sampel ujian merentas monolayer sel Caco{0}} biasanya melibatkan kaedah kimia, seperti HPLC, LC/MS, dsb. Walaupun kaedah ini merupakan alat yang berkuasa, kaedah ini kompleks, memakan masa, mahal dan kadangkala memerlukan peralatan yang canggih. Lebih penting lagi, tidak satu pun komponen minoriti boleh mencerminkan PE secara keseluruhan. Oleh itu, pendekatan baru yang bebas daripada penentuan juzuk perlu diwujudkan untuk mengenal pasti dan menilai ciri pengangkutan PE.

Cistanche deserticola YC Ma (CD), tumbuhan holoparasit, ialah ubat tradisional Cina yang biasa digunakan terutamanya untuk merawat kekurangan buah pinggang, kelemahan badan, dan sembelit, dan kegunaan ini telah direkodkan secara rasmi dalam Farmakope Cina.Phenylethanoid glycosides (PhGs), termasuk echinacoside (EC), acteoside (AC), dan isoacteoside (IS), dsb., ialah kelas sebatian polifenol. Mereka dianggap sebagai salah satu juzuk bioaktif utama spesies Cistanche. Kajian farmakologi telah menunjukkan bahawa bioaktiviti PhG adalah pelbagai dan termasuk kesan anti-oksidatif, anti-keletihan, hepatoprotektif, imunomodulator, anti-radang dan neuroprotektif. Walau bagaimanapun, ciri pengangkutan usus PhGs belum disiasat. Dalam kajian ini, kami meneroka kebolehtelapan usus ekstrak kaya PhG (PRE) daripada CD sebagai sistem bersepadu dan kebolehtelapan tiga PhG utama (AC, IS dan EC) dalam sel Caco-2 yang dibezakan. Keputusan kami menunjukkan bahawa PRE terutamanya diangkut melalui resapan pasif yang tidak diserap ke bawah kecerunan kepekatan tanpa efluks, yang menyediakan asas farmakokinetik untuk aplikasi klinikal PhGs dalam CD.

Cistanche tubulosa extract

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Bahan dan Kaedah

Bahan

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98%) telah dibeli daripada Must Biotechnology Co. (Chengdu, China). Medium Eagle's modified Dulbecco (DMEM), serum lembu janin (FBS), dan asid amino bukan penting (NEAA) dihasilkan oleh Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). 6-plat TranswellTM telaga (masukkan kawasan pertumbuhan membran 4.67 cm2 ) diperoleh daripada Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA). Kolagen ekor tikus diperolehi daripada Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Semua reagen dan bahan kimia untuk analisis HPLC adalah gred analitik.

Penyediaan PRE daripada CD

Bahan CD yang dikeringkan di udara telah diserbukkan dan diekstrak dengan meresap dengan 70% etanol. Pecahan kaya PhG telah disediakan seperti yang diterangkan sebelum ini dan diekstrak dengan alkohol n-butil tepu air. Ekstrak minuman keras telah dipekatkan dan dikeringkan di bawah tekanan yang dikurangkan. Spektrofotometri resin-UV makroporous mengukur kandungan PhG sebanyak 78.4%. Sampel akhir mewakili 1.75% hasil bahan mentah mengikut berat kering. Sampel yang diperoleh disimpan pada suhu -20 darjah sehingga digunakan selanjutnya.

Penentuan AC, IS dan EC oleh HPLC

Sistem HPLC Shimadzu yang dilengkapi dengan perisian penyelesaian LC telah digunakan untuk menguji kandungan AC, IS dan EC dalam PRE. Lajur Intersil C18 fasa terbalik (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) telah digunakan dan dikekalkan pada suhu bilik. Fasa mudah alih ialah asetonitril dan air yang mengandungi 0.1% asid fosforik (v/v) dengan elusi kecerunan (Jadual 1) pada kadar alir 1.0 ml/min. Pengesan spektrofotometer UV ditetapkan kepada 334 nm. Untuk menentukan fluks AC dan IS dengan tepat, kami membangunkan kaedah pengesanan pendarfluor HPLC (HPLC-FLD) novel. Selepas analisis struktur dan pengimbasan panjang gelombang pendarfluor (data tidak ditunjukkan), kami memperoleh keadaan pengesanan pendarfluor optimum untuk AC (Cth: 338 nm, Em: 448 nm) dan IS (Cth: 320 nm, Em: 434 nm).

Kaedah analisis HPLC telah disahkan menggunakan ciri prestasi berikut: kestabilan, kelinearan, kepekaan, ketepatan (kebolehubahan intra dan antara hari), dan ketepatan. Analit dalam penimbal pengangkutan disimpan pada 25 darjah dalam gelap selama 24 jam, dan kestabilannya diukur. Analit adalah sangat stabil dengan kehadiran vitamin C (0.4%) kerana nilai sisihan piawai relatif (RSD) di kawasan puncak adalah < 3.5%. Persamaan regresi linear, pekali korelasi, julat lineariti, LOD dan LOQ untuk AC, IS dan EC ditunjukkan dalam Jadual 2. LOD (18–30} nM) dan LOQ (60–100 nM) nilai menggambarkan bahawa kaedah HPLC-FLD dan HPLC-UV adalah sangat sensitif. Nilai RSD yang menyatakan ketepatan kaedah adalah kesemuanya < 2% untuk kebolehubahan intra dan antara hari, menunjukkan ketepatan yang baik. Untuk penilaian pemulihan, AC, IS, dan EC telah ditambahkan pada penimbal pengangkutan untuk menghasilkan tiga tahap kepekatan (tinggi, sederhana dan rendah). Nilai pemulihan kaedah untuk analit diringkaskan dalam Jadual 3. Purata pemulihan adalah antara 90.0% hingga 96.4%, menunjukkan ketepatan yang baik. Kesimpulannya, kaedah HPLC yang telah ditetapkan adalah memuaskan mengenai kelinearan, kepekaan, ketepatan, dan ketepatan untuk kuantifikasi AC, IS dan EC dalam penimbal pengangkutan.

Penentuan PRE oleh sistem bioassay

Bioassay (jumlah kapasiti anti-oksidatif) adalah berdasarkan ujian FRAP (kuasa pengurang ferik/antioksidan) yang kami huraikan sebelum ini [16] dan disahkan dari segi lineariti dan ketepatan (kebolehubahan intra dan antara hari). Kelinearan kaedah bioassay ditentukan berdasarkan lengkung penentukuran. Julat kepekatan lineariti ialah 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). Ketepatan kaedah bioassay yang ditetapkan telah ditentukan dari segi kebolehubahan intra dan antara hari untuk analisis PRE (10.0 ug/ml). Kebolehulangan intra-hari kaedah ditentukan berdasarkan lima penentuan berturut-turut pada hari yang sama. Kebolehulangan antara hari diukur berdasarkan lima penentuan berturut-turut pada tiga hari berbeza. Nilai RSD untuk ketepatan kaedah masing-masing ialah 1.014% dan 4.72% untuk kebolehubahan intra dan antara hari, menunjukkan ketepatan yang baik. Oleh itu, kaedah bioassay yang telah ditetapkan adalah memuaskan mengenai kelinearan, ketepatan dan ketepatan untuk kuantifikasi PRE dalam penimbal pengangkutan.

Kultur sel

Sel Caco{{0}} telah dikultur pada 37 darjah dan 95% kelembapan relatif dalam atmosfera yang mengandungi 5% CO2 dan medium yang terdiri daripada DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-glutamin, penisilin (100 U/ml), dan streptomycin (100 ug/ml). Medium ditukar setiap hari semasa pertumbuhan dan pembezaan sel. Sel-sel telah ditanam dalam 75-cm2 kelalang plastik dan dituai setiap 3–5 hari dengan 0.05% EDTA-trypsin. Untuk eksperimen pengangkutan, sel telah disemai pada ketumpatan 1×105 sel/cm2 pada sisipan Transwell yang disalut dengan kolagen. Kira-kira 21 hari selepas pembenihan, lapisan tunggal digunakan untuk eksperimen pengangkutan. Integriti mereka ditentukan dengan mengukur rintangan elektrik trans-epithelial (TEER) merentasi lapisan tunggal dengan EVOM yang dilengkapi dengan ENDOHM-SNAP (Instrumen Ketepatan Dunia, Inc., Amerika Syarikat). Nilai TEER bagi monolayer sel Caco{24}} perlu melebihi 500 O∙cm2.

cistanche tubulosa extract

CISTANCHE TUBULOSA SEMULAJADI UNTUK MENENANGKAN DAN JARUH PHGS75% ECH 30% BERTINDAK 12%

Eksperimen pengangkutan

Monolayer telah dibasuh dengan penimbal pengangkutan (P-buffer yang mengandungi 10 mM HEPES, 1 mM natrium piruvat, 10 mM glukosa, 3 mM CaCl2 dan 145 mM NaCl, pH 7.4) dan kemudian pra-inkubasi selama 20 minit pada 37 darjah. Selepas mengeluarkan penimbal pengangkutan, penimbal pengangkutan segar yang mengandungi sampel ujian telah ditambah ke ruang apikal (AP) (1.5 ml) dalam kajian berarah AP ke basolateral (BL) atau ruang BL (2.5 ml) dalam kajian berarah BL ke AP. Untuk ujian AC, IS, dan EC menggunakan HPLC, aliquot (300 ul) telah dikeluarkan dari setiap ruang penerima pada selang masa yang berbeza (30, 60, 90, dan 120 min). Ruang penerima telah diisi semula dengan jumlah yang sama penimbal pengangkutan segar yang dipanaskan (37 darjah) selepas setiap pensampelan. Sampel yang dikumpul disimpan pada suhu -20 darjah untuk kegunaan selanjutnya. Untuk penentuan PRE menggunakan bioassay, hanya sampel pada 120 minit diambil. Disebabkan oleh ketidakstabilan PRE, AC, IS dan EC, 0.4% (b/v) vitamin C telah ditambah untuk menstabilkan sampel untuk menentukan kandungan AC, IS dan EC oleh HPLC, dan sampel untuk bioassay PRE adalah diuji serta-merta selepas diambil sampel. Nilai pekali kebolehtelapan jelas (Papp atau 'Papp) bagi setiap sampel telah dikira.

Analisis data

Nilai Papp dalam arah AP BL atau BLAP AC, IS dan EC dikira berdasarkan persamaan berikut: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), di mana Papp ialah pekali kebolehtelapan ketara (cm/s) yang ditentukan oleh HPLC. (4Q/4t) ialah kadar kemunculan sebatian ujian (AC, IS, atau EC) pada bahagian penerima (μmol/s); A ialah luas permukaan sisipan (cm2 ); C0 ialah kepekatan sebatian ujian awal pada bahagian penderma (μmol/ml). Khususnya, unit jisim "ug" digunakan dan bukannya "μmol" apabila 'nilai Papp dikira. Data dinyatakan sebagai min ± SD.

Keputusan

Komposisi AC, IS dan EC dalam PRE daripada CD

Kerana AC, IS, dan EC dianggap sebagai bioaktif utamaPhGs spesies Cistanche, kami menganalisis kandungannya dalam PRE melalui HPLC-UV. Kromatogram perwakilan ditunjukkan dalam Rajah 1. Pengenalpastian juzuk ini adalah berdasarkan perbandingan masa pengekalan dan spektrum UV dengan piawaian tulen pada panjang gelombang 334 nm. Kandungan AC, IS dan EC dalam PRE masing-masing adalah 26.60%, 1.84% dan 32.83%. Oleh itu, ketiga-tiga sebatian ini menyumbang 61.27% PRE; Tambahan pula, keputusan di atas menunjukkan bahawa kandungan PhG dalam PRE ialah 78.4%. Oleh itu, AC, IS dan EC menyumbang kira-kira 80% daripada PhG dalam PRE.

Jumlah kapasiti anti-oksidatif PRE, AC, IS dan EC

Kajian tentangaktiviti anti-oksidatif PhGsdaripada CD telah dilaporkan, dan AC, IS dan EC menyumbang kira-kira 80% daripada PhG dalam PRE. Oleh itu, jumlah kapasiti anti-oksidatif PRE, AC, IS, dan EC telah diuji dan dinyatakan menggunakan nilai FRAP (× 10-6 mmol). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2, apabila nilai FRAP ialah 8 × 10–6 mmol, kepekatan akhir PRE, AC, IS dan EC ialah 6.20 ug/ml, 3.14 ug/ml, 22.92 ug/ml, dan 4.89 ug /ml, masing-masing, menunjukkan bahawa jumlah kapasiti anti-oksidatif bagi empat sampel ini disenaraikan seperti berikut: AC > EC > PRE > IS. Bioaktiviti PRE dikaitkan dengan kumpulan bahan aktifnya (AIG). Untuk kira-kira 60% PRE, AC dan EC menunjukkan jumlah aktiviti anti-oksidatif yang lebih kuat daripada PRE dan IS. Oleh kerana IS (1.84%) merupakan sebahagian kecil PRE, komponen lain, seperti IS antioksidatif yang lemah, juga jelas aktif dalam PRE. Yang menghairankan, jumlah aktiviti anti-oksidatif berbeza hampir 7-kali ganda antara AC dan IS isomernya, menunjukkan bahawa bukan sahaja bilangan kumpulan hidroksil fenolik tetapi juga kedudukan kumpulan hidroksil fenolik dalam molekul mempengaruhi kesan anti-oksidatif. .

Pengesahan lapisan tunggal Caco-2.

Untuk mengesahkan sistem monolayer sel Caco-2, nilai Papp propranolol (penanda yang diangkut dengan baik) dan kuning Lucifer (penanda yang diangkut dengan buruk) daripada AP ke BL merentasi lapisan tunggal Caco-2 adalah ditentukan sebagai 1.51 × 10–5 cm/s dan 2.8 × 10–7 cm/s, masing-masing, dan nilai ini bersetuju dengan yang diterbitkan dalam laporan terdahulu. Ujian aktiviti alkali fosfatase juga mengesahkan bahawa lapisan tunggal sel Caco{11}} adalah setanding secara kualitatif dengan epitelium usus kecil.

Kebolehtelapan AC, IS dan EC

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 sm/s), manakala ubat yang kurang diserap adalah rendah (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion.

Kebolehtelapan PRE

Keputusan di atas menunjukkan bahawa jumlah kapasiti anti-oksidatif PRE adalah sekurang-kurangnya disebabkan oleh 61.27% AIG daripada PRE. Oleh itu, kami menilai TR PRE berdasarkan lengkung kesan kepekatan jumlah kapasiti anti-oksidatif dan mengira 'nilai Papp untuk mencerminkan ciri pengangkutan PRE. Nilai 'Papp PRE untuk AP!BL dan BL!AP ialah (2.16 ± 0.26) × 10–7 sm/s dan (3.13 ± 0.29) × 10–7 sm/ s, masing-masing, menunjukkan bahawa sebatian ini kurang telap. Tambahan pula, efluks atau pengangkutan aktif tidak jelas kerana nisbah 'Papp BL kepada AP / 'Papp AP kepada BL untuk PRE ialah 1.45. Selain itu, TR dwiarah PRE meningkat secara linear antara kira-kira 300 dan 900 ug/ml (Rajah 5). Kekurangan keutamaan arah keputusan menunjukkan bahawa penyebaran pasif adalah mekanisme pengangkutan utama PRE.

cistanche tubulosa extract

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN IMUNITI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Perbincangan

Berbanding dengan produk ubat yang sangat dimurnikan, PE biasanya merupakan campuran yang terdiri daripada beratus-ratus juzuk dengan sifat fisiokimia yang berbeza secara meluas. Oleh itu, PE melaksanakan tindakan sinergi yang sistematik, berbilang sasaran, dan berbilang saluran kerana AIG yang kompleks [21] mereka, yang menghalang analisis ciri pengangkutan PE. Untuk menilai sifat pengangkutan PE secara lebih saintifik, sesetengah penyelidik telah mengenal pasti pelbagai komponen, bukannya satu komponen, dalam PE [22-24]. Namun begitu, bilangan juzuk yang terhad tidak dapat menggambarkan PE secara keseluruhan. Walau bagaimanapun, menentukan semua komponen dalam PE adalah mustahil. Lebih-lebih lagi, jika pelbagai komponen dalam PE memaparkan ciri pengangkutan yang sama sekali berbeza, ciri pengangkutan holistik PE akan sukar dikenal pasti.

Pada tahun 1990-an, sistem bioassay digunakan untuk menilai TR ejen antimikrob [25]. Menjelang 2005, Eguchi dan rakan-rakannya [26] telah menilai aktiviti anti-oksidatif ekstrak lobak merah dengan menggunakan media BL daripada sel Caco-2 yang dibezakan; pendekatan ini lebih sesuai untuk mencerminkan dalam situasi vivo.

Berdasarkan laporan sebelumnya mengenai aktiviti PhG dan keputusan kami (Rajah 2), TR AIG dalam PRE boleh dinilai dengan menentukan jumlah kapasiti anti-oksidatif medium dalam ruang penerima. Selepas eksperimen pengangkutan, kami mendapati bahawa TR PRE adalah serupa dalam kedua-dua arah, dan pengangkutan ini tidak tepu dan kurang diserap ('Papp < 1.0 × 10–6 cm/s), dan ia tidak menunjukkan efflux, menunjukkan bahawa resapan pasif ke bawah kecerunan kepekatan adalah mekanisme pengangkutan utama PRE (Rajah 5). Tambahan pula, ciri pengangkutan PRE adalah konsisten dengan AC, IS dan EC, komponen berkesan yang memaparkan aktiviti anti-oksidatif dalam PRE (Rajah 4 dan Jadual 4). Keputusan ini dijangka dan menunjukkan bahawa sistem bioassay sekarang adalah sesuai dan boleh dipercayai untuk penilaian ciri pengangkutan AIG dalam PRE dalam sel Caco{10}} yang dibezakan.

Berbeza dengan nilai Papp kanonik, yang biasanya digunakan untuk mencerminkan pengangkutan sebatian tunggal, nilai 'Papp yang diperoleh daripada TR berdasarkan lengkung kesan kepekatan mungkin bukan sahaja mencerminkan komponen yang menembusi lapisan tunggal dengan struktur yang utuh tetapi turut melibatkan faktor lain yang berkaitan dengan aktiviti sasaran, seperti metabolit komponen, produk terdegradasi secara kimia dan juga beberapa sitokin yang dirembeskan daripada sel Caco-2 sebagai tindak balas kepada rangsangan yang boleh menjejaskan bioaktiviti sasaran. Oleh itu, multifaktor yang disebutkan di atas, bukannya hanya komponen utuh yang diangkut, menentukan 'nilai Papp. Oleh itu, 'Papp mungkin berkorelasi lebih kuat dengan situasi in vivo daripada nilai Papp kanonik. Dalam kajian ini, kami menjelaskan sifat PRE yang disebarkan secara pasif dan kurang diserap berdasarkan 'nilai Pappnya, dan sifat ini mungkin berkaitan dengan dos yang tinggi dan tempoh rawatan klinikal yang panjang bagi CD. Namun begitu, penemuan ini akan memberikan panduan yang lebih sistematik untuk doktor dalam penggunaan CD apabila hanya ciri-ciri pengangkutan kebanyakan AIG dalam CD, bukan sahaja PhG, telah dikenalpasti.

Walau bagaimanapun, item bioaktiviti yang dipilih mestilah cukup sensitif untuk dikesan dalam medium ruang penerima, yang memberikan cabaran kepada penubuhan sistem bioassay untuk menilai ciri pengangkutan PE. Tambahan pula, bioaktiviti juga harus bergantung kepada seberapa banyak komponen yang mungkin. Dalam kajian kami, jumlah ujian kapasiti anti-oksidatif adalah lebih sesuai daripada beberapa kaedah lain (S1 Rajah). Namun begitu, ujian kami hanya boleh mengesan TR PRE pada 120 min.

Secara kolektif, kajian ini mewujudkan sistem bioassay novel untuk menilai kebolehtelapan usus PRE dalam sel Caco-2 yang dibezakan. Keputusan yang diperolehi menunjukkan bahawa resapan pasif yang kurang diserap ke bawah kecerunan kepekatan tanpa efluks adalah mekanisme pengangkutan utama PRE (Rajah 5), yang menyediakan asas farmakokinetik untuk aplikasi klinikal PhG dalam CD. Penggunaan sistem bioassay novel untuk menilai TR dan dengan itu mengira 'nilai Papp untuk menilai sifat pengangkutan usus AIG dalam PE adalah boleh dilaksanakan. Pendekatan ini mungkin juga sesuai untuk PE lain yang diberi bioaktiviti yang sesuai.