Penyahwarnaan Enzimatik Melanin Oleh Lignin Peroksidase Daripada Phanerochaete Chrysosporium

Kulit menjadi gelap akibat daripada pengumpulan melanin pigmen kulit. Untuk memerangi ini, amplitud agen pencerah kulit boleh didapati secara komersil, kebanyakannya menghalang sintesis melanin. Penyahwarnaan melanin adalah kaedah alternatif pencerahan kulit. Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa lignin peroksidase (LiP), enzim ekstraselular yang disucikan daripada Phanerochaete chrysosporium NK-1 yang diasingkan daripada tanah hutan secara berkesan boleh merendahkan dan menyahwarnakan melanin secara in vitro. Keadaan penyahwarnaan termasuk pH, suhu, masa inkubasi, kepekatan enzim, dan penambahan mediator telah disiasat untuk mengoptimumkan keadaan tindak balas. Keputusan menunjukkan bahawa pH 3, 40 darjah, 15 IU/ml, dan 10 jam pengeraman adalah keadaan optimum untuk penyahwarnaan melanin. Penggunaan mediator, veraryl alkohol juga didapati berkesan untuk meningkatkan keberkesanan penyahkolonan melanin, dengan sehingga 92 peratus penyahwarnaan. Keputusan mikroskop elektron pengimbasan menunjukkan ruang kosong pada butiran melanin yang dirawat berbanding dengan sampel yang tidak dirawat, menunjukkan kemerosotan melanin. Perubahan dalam kawasan cap jari melanin diperhatikan. Antara nombor gelombang 1500–500 cm−1, sebagai contoh, kehadiran puncak baru dalam melanin yang dirawat pada 1513, 1464, dan 1139 cm−1 CH2, lenturan CH3, dan regangan C–O–C mewakili perubahan struktur. Puncak baru pada 2144 cm−1 (regangan alkynyl C≡C) juga dikesan dalam melanin yang tidak berwarna. Kajian sitotoksisiti telah menunjukkan bahawa melanin dan LiP yang dirawat mempunyai kesan sitotoksik yang rendah; bagaimanapun, pengantara alkohol veraryl boleh mengakibatkan kematian yang tinggi yang menunjukkan bahawa penggunaannya harus diuji dengan teliti dalam merumuskan produk kesihatan dan penjagaan kulit. Dapatan kajian menunjukkan bahawa LiP yang dihasilkan oleh Phanerochaete chrysosporium berpotensi untuk digunakan dalam industri perubatan dan kosmetik, khususnya untuk pembangunan agen pemutih kosmetik berasaskan bio.

Menurut kajian yang berkaitan, cistanche adalah herba biasa yang dikenali sebagai "herba ajaib yang memanjangkan hayat". Komponen utamanya ialah cistanoside, yang mempunyai pelbagai kesan seperti antioksidan, anti-radang, dan promosi fungsi imun. Mekanisme antara cistanche dan pemutihan kulit terletak pada kesan antioksidan glikosida cistanche. Melanin dalam kulit manusia dihasilkan oleh pengoksidaan tirosin yang dimangkin oleh tyrosinase, dan tindak balas pengoksidaan memerlukan penyertaan oksigen, jadi radikal bebas oksigen dalam badan menjadi faktor penting yang mempengaruhi pengeluaran melanin. Cistanche mengandungi cistanoside, yang merupakan antioksidan dan boleh mengurangkan penjanaan radikal bebas dalam badan, sekali gus menghalang pengeluaran melanin.

where can i buy cistanche

Klik pada Cistanches Herba Untuk Pemutihan

Untuk maklumat lanjut:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Melanin ialah sekumpulan pigmen kulit bio-polimer polisiklik yang kompleks, keras hati dan meresap yang dihasilkan oleh sel kulit khusus yang dipanggil melanosit 1,2. Fungsi utamanya adalah untuk melindungi kulit daripada sinaran UV berbahaya cahaya matahari dengan membentuk topi supranuklear di sekeliling DNA sel kulit 3. Selain itu, ia bertanggungjawab untuk warna kulit yang berbeza dengan menyerap pelbagai radikal bebas dalam sitoplasma. Kebanyakan agen pencerah kulit ini diperoleh daripada sumber semula jadi menghalang pengeluaran melanin dalam sel kulit dengan menghalang enzim tyrosinase, penindasan biosintesis pigmen, dan melalui beberapa laluan alternatif. Pelbagai sebatian seperti hidrokuinon, mono-benzil eter hidrokuinon, merkuri, kortikosteroid, dan arbutin sedang digunakan dalam formulasi komersial untuk kosmetik pemutihan kulit, walau bagaimanapun, penggunaannya telah dikaitkan dengan kesan sampingan yang serius. Sebagai contoh, merkuri dilaporkan menyebabkan kerosakan pada buah pinggang, dan plumbum telah dilaporkan menyebabkan kebimbangan, kemurungan, dan psikosis 4,5. Penggunaan kortikosteroid boleh menyebabkan sindrom Cushing, diabetes, hipertensi, kekurangan adrenal, imunosupresi, penipisan kulit, jerawat, dermatitis, dan hipertrikosis 6. Tain et al. (2009) melaporkan bahawa penggunaan arbutin dalam kosmetik pemutihan kulit berkesan untuk kepekatan sehingga 3 peratus tetapi peningkatan selanjutnya dalam kepekatan menyebabkan kesan sitotoksik. Memandangkan batasan ini, penggunaan perencat ini dalam kosmetik pemutihan kulit telah dikritik secara meluas oleh pihak berkuasa kesihatan dan keselamatan. Telah dicadangkan bahawa kosmetik pemutih kulit boleh mencecah sehingga AS$ 155.44 bilion menjelang tahun 2021 dengan kadar pertumbuhan tahunan sebanyak 4.9 peratus . Disebabkan oleh peningkatan permintaan untuk agen pemutih kulit yang selamat dan semula jadi di seluruh dunia, penyahkolonan melanin enzimatik telah mendapat minat yang besar 7–9.

cistanche sold near me

Enzim ekstrasel mikrob seperti laccase, manganese peroxidase, dan lignin peroxidase (LiP) telah diuji sebelum ini untuk penyahwarnaan melanin dan dianggap sebagai alternatif mesra alam yang berpotensi untuk bahan kimia toksik 1. Antaranya, LiP didapati sangat berkesan untuk penyahwarnaan. melanin kerana potensi redoksnya yang tinggi untuk mengoksidakan veraryl alkohol (VA) berbanding enzim lain yang berkaitan. Walaupun potensi pengoksidaan tinggi dan pemangkinan melanin yang cekap, pengeluaran volumetrik dan kesukaran dalam penulenan adalah had utama untuk aplikasi komersial LiP dalam agen pemutihan kulit. Di samping itu, LiP kehilangan aktiviti enzimatiknya untuk penyahkolonan melanin di bawah hidrogen peroksida yang berlebihan, yang dianggap kritikal untuk pengoksidaan melanin. Selain peranannya yang penting, H2O2 menyahaktifkan LiP sekali gus mengurangkan prestasi pemangkin enzim.

Kulat reput putih, Phanerochaete chrysosporium telah dilaporkan sebagai sumber biologi yang cekap untuk penghasilan LiP. Walau bagaimanapun, pada masa ini, halangan utama dalam aplikasi enzim ini termasuk pembangunan proses penapaian kos efektif, pengasingan kotoran produktif, dan penulenan enzim kerana kulat menghasilkan campuran 17 isoenzim. Untuk menangani isu-isu produktiviti dan kepekaan enzim yang rendah, kajian ini telah dijalankan untuk membangunkan proses yang kos efektif dan cekap untuk pengeluaran LiP daripada pengasingan asli Phanerochaete chrysosporium. Kulat menghasilkan kepekatan LiP yang agak tinggi dengan kecekapan pemangkin yang lebih baik pada kepekatan enzim yang agak rendah daripada yang dilaporkan sebelum ini. Pengeluaran dijalankan dalam penapaian terendam menggunakan VA sebagai mediator. Keadaan tindak balas optimum untuk penyahkolonan melanin telah disiasat dengan LiP yang telah disucikan bersama-sama dengan penentuan kesan sitotoksisiti enzim yang telah disucikan.

Keputusan

Penyahwarnaan melanin oleh Phanerochaete chrysosporium NK‑1.Strain kulat telah diuji untuk penyahwarnaan melanin. Kulat telah diinokulasi pada medium pepejal yang mengandungi melanin dan VA sebagai inducer LiP. Selepas tujuh hari pengeraman, Phanerochaete chrysosporium NK-1 menunjukkan keupayaan menyahwarna melanin, seperti ditunjukkan dalam Rajah 1.

cistanche flaccid

Syarat untuk penyahwarnaan melanin yang optimum.pH. Enzim yang telah disucikan digunakan untuk penyahwarnaan melanin sintetik secara in vitro. Kesan keadaan berbeza pada penyahwarnaan melanin telah diperhatikan 10. Kesan pH pada penyahwarnaan melanin oleh LiP telah diperiksa terlebih dahulu. Untuk ini, penyahwarnaan melanin dilakukan pada keadaan pH berbeza yang berbeza daripada 2.0 hingga 6.0 pada suhu 30 darjah kedua-duanya dalam kehadiran dan ketiadaan VA untuk tempoh pengeraman selama 6 jam. Keputusan dalam Rajah 2 menunjukkan bahawa secara amnya, penyahwarnaan melanin dengan kehadiran VA adalah lebih tinggi dalam semua keadaan pH. Terutamanya, ia lebih menonjol dalam keadaan pH yang lebih tinggi. VA boleh membantu dalam pembentukan radikal kation 11. Radikal ini mempunyai potensi redoks yang lebih tinggi untuk menyerang ikatan C–C secara tidak khusus dalam melanin dan mengakibatkan penyahwarnaan 12. Dengan kehadiran VA, penyahwarnaan melanin tertinggi sebanyak 88 peratus telah dicapai pada pH 3 diikuti oleh 71 peratus pada pH 2, manakala penyahwarnaan melanin terendah sebanyak 39 peratus diperhatikan pada pH 6. Jika tiada VA, penyahwarnaan melanin tertinggi sebanyak 86 peratus diperhatikan pada pH 3 manakala yang terendah Penyahwarnaan melanin sebanyak 35 peratus dan 36 peratus diperhatikan pada pH 5 dan 6, masing-masing. Penyahwarnaan melanin oleh LiP dalam kajian ini sangat cekap pada keadaan pH yang lebih rendah, iaitu, 2 dan 3 (Rajah 2), walaupun kajian lain menunjukkan keadaan pH optimum pada 4 1.

Suhu. Penyahwarnaan melanin oleh LiP dikaji pada suhu yang berbeza antara 20-60 darjah kedua-duanya dengan kehadiran dan ketiadaan VA pada tempoh inkubasi selama 6 jam. Dengan ketiadaan VA, peratusan yang sama (19 peratus) penyahwarnaan melanin diperhatikan pada suhu 20 dan 30 darjah (Rajah 3). Penyahwarnaan melanin tertinggi dan terendah jika tiada VA diperhatikan pada 40 dan 50 darjah, masing-masing. Walau bagaimanapun, dengan VA dalam larutan, penyahwarnaan melanin meningkat daripada 20 hingga 40 darjah dan menurun sehingga 60 darjah . Dengan kehadiran VA, penyahwarnaan melanin tertinggi adalah kira-kira 60 peratus pada 40 darjah . Penyahwarnaan biasanya lebih rendah kerana eksperimen dijalankan dalam keadaan pH yang lebih ringan.

cong rong cistanche

Kepekatan LiP. Penyahwarnaan melanin juga telah diperiksa dengan variasi dalam kepekatan enzim. Lima kepekatan berbeza, iaitu, 5, 10, 15, 20, dan 25 IU/mL LiP telah diperiksa untuk penyahwarnaan melanin dalam kehadiran dan ketiadaan VA, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4. Yang menghairankan, kepekatan enzim yang paling berkesan ialah 15 IU/ml untuk kedua-dua larutan dengan dan tanpa VA. Selepas tempoh inkubasi selama 6 jam, penyahwarnaan melanin tertinggi ialah 92 peratus dengan kehadiran VA dan 70 peratus jika tiada mediator menggunakan kepekatan enzim 15 IU/mL, manakala penyahwarnaan melanin terendah sebanyak 23 peratus diperhatikan dalam ketiadaan VA menggunakan 5 IU/mL LiP. Tidak jelas bahawa penyahwarnaan kurang berkesan dengan kepekatan enzim yang tinggi, iaitu, 20 dan 25 IU/ml (Rajah 4).

Masa pengeraman. Eksperimen penyahwarnaan dijalankan pada 2, 4, 6, 8, dan 10 jam pengeraman. Reaksi ini juga dilakukan dengan kehadiran dan ketiadaan VA. Keputusan menunjukkan bahawa keberkesanan penyahwarnaan berkorelasi positif dengan masa pengeraman, seperti yang dijangkakan (Rajah 5). Peningkatan tahap penyahtempatan adalah lebih ketara dalam pengeraman awal. Penyahwarnaan melanin tertinggi (68 peratus) diperhatikan selepas tempoh inkubasi selama 10 jam dengan kehadiran VA dan 59 peratus jika tiada VA. Penyahwarnaan melanin adalah serendah 15 peratus selepas 2 jam pengeraman tanpa VA. Oleh itu, berdasarkan keputusan ujian, kami telah membuat kesimpulan bahawa keadaan optimum ialah pH 3, 40 darjah, 15 IU/ml, dan 10 jam pengeraman.

maca ginseng cistanche sea horse

Analisis SEM (Mikroskop elektron pengimbasan) dan FTIR (Fourier‑transform infrared spectroscopy).Perubahan morfologi dan struktur dalam melanin dicirikan oleh SEM dan FTIR, masing-masing. Melanin yang tidak berwarna telah dianalisis oleh SEM untuk melihat sebarang perubahan permukaan secara morfologi. Melanin sintetik tanpa sebarang rawatan enzim digunakan sebagai kawalan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6, terdapat ruang kosong pada butiran melanin yang dirawat berbanding dengan sampel yang tidak dirawat, menunjukkan zarah melanin telah diserang oleh enzim.

cistanche tubulosa adalah

Melanin yang tidak berwarna juga dianalisis oleh FTIR dengan melanin yang tidak dirawat sebagai kawalan (Rajah 7). Cap jari molekul kedua-dua melanin yang dinyahwarna dan tidak dirawat telah diperolehi dan dibandingkan untuk mengesahkan sebarang perubahan struktur dalam melanin yang dirawat 13. Spektrum FTIR melanin (C18H10N2O4) menunjukkan spektrum penyerapan yang luas pada 3272 cm−1 yang boleh dikaitkan dengan ciri O –Getaran regangan H atau regangan N–H asid karboksilik, dan kumpulan fenolik. Perubahan dalam spektrum FTIR melanin yang dirawat adalah ketara. Jalur lebar pada nombor gelombang 3000–3500 cm−1 menunjukkan kehadiran kumpulan -NH dan -OH dalam kedua-dua sampel kawalan dan dirawat. Walau bagaimanapun, keamatan sampel yang dirawat adalah lebih tinggi daripada sampel kawalan, menunjukkan bahawa rawatan mempunyai penambahan kumpulan berfungsi ini kepada struktur oleh serangan enzimatik. Puncak pada 2884.4 cm−1 dan 2822 cm−1 menunjukkan kehadiran kumpulan alkil dalam kawalan manakala dalam melanin yang dinyahwarna, puncak pada nombor gelombang 2884.4 cm−1 tidak hadir. Puncak pada 2822 cm−1 menyimpang kepada panjang gelombang 2835.92 cm−1 yang mewakili perubahan struktur dalam melanin yang dirawat di rantau ini juga. Puncak pada nombor gelombang 1710 cm−1 dalam kawalan dikaitkan dengan kehadiran asid karboksilik. Kemuncak ini juga tidak hadir atau dikurangkan pada tahap yang besar dalam melanin yang tidak berwarna, sekali lagi mengesahkan perubahan struktur dalam melanin yang dirawat. Terdapat juga beberapa perubahan dalam kawasan cap jari. Antara nombor gelombang 1500–500 cm−1, sebagai contoh, kehadiran puncak baru dalam melanin yang dirawat pada 1513, 1464, dan 1139 cm−1 mewakili perubahan struktur. Puncak baru pada 2144 cm−1 juga dikesan dalam melanin yang tidak berwarna.

cistanche powder bulk

Kesan sitotoksisiti.Sitotoksisiti melanin terdegradasi dan LiP telah disiasat menggunakan kaedah sitotoksisiti udang air garam 14,15. Dalam kajian ini, kesan sitotoksik melanin dan LiP yang dirawat adalah rendah dengan kadar berdaya maju larva udang melebihi atau sama dengan 90 peratus (Jadual 1). Peningkatan kepekatan LiP tidak memberi kesan ke atas daya maju larva udang sehingga 80 ul/mL (~80 IU/ml), menunjukkan aktiviti sitotoksiknya yang rendah. Dalam kawalan positif dengan VA, kadar kematian adalah 100 peratus , menunjukkan bahawa berhati-hati harus diambil semasa penggunaan LiP dengan kehadiran VA sebagai pengantara dalam bidang perubatan dan kosmetik.

cistanche nutrilite

Perbincangan

Ketoksikan bahan tambahan kimia yang digunakan dalam formulasi pemutihan kulit telah menimbulkan kebimbangan serius dan menuntut pendekatan alternatif yang menawarkan manfaat kesihatan dan keselamatan. Dalam kajian ini, pendekatan enzimatik telah dinilai dengan kemungkinan untuk menggantikan bahan kimia yang keras dengan produk semula jadi yang mesra alam. Penggunaan enzim sebagai bahan aktif formulasi pemutihan kulit boleh menjadi sangat berfaedah kerana kekhususan substratnya yang tinggi dan tiada kesan sitotoksik 16. Pengasingan asli Phanerochaete chrysosporium digunakan untuk menghasilkan LiP di bawah keadaan penapaian terendam. Sebelum ini, P. chrysosporium telah dilaporkan merembeskan enzim ekstraselular, yang mampu merendahkan melanin 17. Proses untuk penghasilan optimum LiP telah dikaji menggunakan reka bentuk Placket-Burman. Selain tahap optimum komponen sederhana (data tambahan), pH dan suhu memainkan peranan penting baik dari segi penghasilan enzim dan aktiviti pemangkinnya. pH optimum untuk penghasilan maksimum LiP daripada P. chrysosporium didapati berasid (pH 3). Telah dilaporkan bahawa semasa pertumbuhan kulat, ia merembeskan asid organik yang membawa kepada kejatuhan pH serendah 2 yang menggalakkan hidrolisis biopolimer kompleks bermangkin asid yang disebabkan oleh pH. Selain itu, P. chrysosporium menghasilkan LiP yang stabil asid yang menyebabkan penyahwarnaan melanin. Sebab yang mungkin untuk pemangkinan melanin yang lebih baik oleh LiP boleh dikaitkan dengan peranan interaksi supramolekul yang membantu mengekalkan konformasi protein yang sesuai pada kepekatan proton yang lebih tinggi 1.

how to use cistanche

Dalam kes suhu, pertumbuhan kulat dan pengeluaran enzim tertinggi dicapai pada 40 darjah, yang sepadan dengan habitat semula jadi P. chrysosporium. Keupayaan LiP untuk merendahkan melanin adalah berdasarkan persamaan struktur antara melanin dan lignin 18. Keberkesanan degradasi melanin oleh LiP secara in vitro telah dikaitkan dengan beberapa faktor seperti pH, suhu, kepekatan enzim, dan masa inkubasi juga. sebagai kewujudan VA. Lip boleh mengoksidakan VA kepada radikal kationnya (VA∙ tambah ) dan berfungsi sebagai pengantara redoks yang menyahwarnakan lagi melanin, seperti ditunjukkan dalam Rajah 8.

H2O2 ialah substrat penting sebagai penerima elektron terakhir semasa penyahwarnaan melanin. LiP mudah dinyahaktifkan dalam kepekatan berlebihannya yang mendorong pecahnya struktur heme atau pembentukan sebatian tidak aktif III. Dilaporkan bahawa kesan perencatan ini boleh dikurangkan dengan pengoksidaan VA kepada radikal kation VA 1 . LiP mengoksidakan VA kepada radikal kation VA, yang bertindak sebagai mediator redoks untuk menyahwarna melanin. VA adalah sebatian semula jadi yang dihasilkan daripada kulat reput putih yang dijangka mempunyai kesan sampingan yang lebih sedikit. Walau bagaimanapun, kehadiran pengantara VA telah mengakibatkan kematian yang tinggi bagi organisma yang diuji, berbanding dengan kesan sitotoksik rendah melanin dan LiP yang dirawat. Ia harus diuji dengan teliti dalam formulasi produk kesihatan dan penjagaan kulit.

rou cong rong benefits

Kami mendapati 88 peratus penyahkolonan lignin pada pH 3 yang menunjukkan bahawa pH rendah memihak kepada sentuhan langsung enzim dengan VA. Penemuan yang sama juga dilaporkan oleh Sung et al. (2019), yang mendapati bahawa pH rendah mesti dikekalkan untuk kecekapan pemangkin yang optimum. Penyahwarnaan meningkat secara perlahan dalam bahagian bawah suhu yang diuji (20–40 darjah ) dan berkurangan dengan cepat apabila suhu pengeraman terus meningkat, menunjukkan denaturasi mungkin berlaku pada suhu yang lebih tinggi. Secara amnya dijangkakan bahawa kadar degradasi melanin meningkat dengan peningkatan kepekatan enzim. Yang menghairankan, keputusan kami menunjukkan penurunan dalam keberkesanan penyahwarnaan dengan peningkatan kepekatan enzim. Pada kepekatan tinggi, aktiviti rendah mungkin dikaitkan dengan keadaan tindak balas lain, seperti suhu dan pH. Perubahan dalam keadaan ini boleh menyebabkan perubahan dalam seni bina supramolekul protein untuk menjejaskan kecekapan mengikat enzim-substrat dan membawa kepada penurunan kadar tindak balas 1. Walau bagaimanapun, aspek khusus ini memerlukan penyiasatan lanjut. Sebaliknya, degradasi melanin meningkat dengan pertambahan masa inkubasi menunjukkan enzim stabil semasa tempoh rawatan. Dalam semua keadaan eksperimen, penyahwarnaan didapati lebih berkesan dengan kehadiran VA kerana ia memudahkan pembentukan radikal dengan potensi redoks tinggi yang boleh menyerang ikatan karbon-karbon secara tidak spesifik. Analisis SEM dan FTIR juga mengesahkan bahawa rawatan enzimatik telah menyebabkan perubahan morfologi dan struktur dalam melanin.

Berdasarkan keputusan kami, adalah dicadangkan bahawa P. chrysosporium boleh digunakan sebagai sumber biologi yang kuat untuk pengeluaran komersial LiP untuk aplikasinya dalam industri perubatan dan kosmetik, terutamanya untuk pembangunan agen pemutihan kosmetik baharu.

Bahan dan kaedah

Pengasingan dan pengenalpastian strain kulat.Pengasingan kulat dilakukan dari tapak tercemar yang digunakan sebagai tapak pembuangan bahan kayu untuk jangka masa yang lama. Sampel diambil dalam botol steril dan dipindahkan ke makmal untuk penulenan. Pemurnian dilakukan pada medium agar dextrose pinggir laut. Empat koloni kulat berbeza telah diasingkan dan disucikan daripada sampel. Saringan untuk strain terbaik dilakukan berdasarkan penyahwarnaan melanin dan penghasilan biojisim dengan kehadiran melanin sebagai satu-satunya sumber karbon dalam medium garam mineral (MSM). Berdasarkan saringan, organisma yang dipilih telah dikenal pasti dengan menjujukan DNA 5.8S rRNA dan 18S rRNA menggunakan primer universal ITS-1 dan ITS-4 10. DNA genomik mereka diekstrak mengikut kaedah Anderson et al. 19. Selepas penulenan, penjujukan produk PCR telah dilakukan. Urutan itu diselaraskan menggunakan alat BLAST di NCBI dan homolog dianalisis untuk filogeni menggunakan Analisis Genetik Evolusi Molekul (MEGA). Berdasarkan kemungkinan maksimum, pokok penyambung jiran telah dibina untuk mengenal pasti strain kulat terpencil. Urutan telah diserahkan kepada NCBI GenBank dengan nombor penyertaan KX064682.1. Analisis filogenetik mendedahkan bahawa terpencil KX064682.1 ialah strain Phanerochaete chrysosporium NK-1.

Ujian plat untuk penyahwarnaan melanin.Kulat reput putih, Phanerochaete chrysosporium NK-1, digunakan untuk penyahwarnaan melanin. Phanerochaete chrysosporium diketahui menghasilkan LiP. Melanin sintetik (B049-97–6) digunakan sebagai model melanin dalam semua eksperimen penyahwarnaan melanin. Medium yang diubah suai dengan VA 2 sebagai inducer LiP digunakan untuk menguji keupayaan penyahwarnaan melanin kulat. Piring petri digunakan untuk mengkultur Phanerochaete chrysosporium NK-1. Medium disediakan dengan melarutkan 10 g glukosa, 2 g ekstrak malt, 4 g MgSO4·7H2O, 1 g KH2PO4, 0.01 g FeSO4, 0.005 g ZnSO4, 0.2 g melanin sintetik dan 15 g agar dalam 1-L air suling. Plat Petri yang diinokulasi diinkubasi pada suhu bilik dalam kegelapan. Sejauh mana melanin hilang warna di bawah dan di sekeliling koloni kulat diperhatikan. Didapati bahawa kulat mampu menyahwarna melanin dan seterusnya digunakan untuk menyediakan larutan enzimatik.

Penyediaan enzim untuk penyahwarnaan melanin.Medium cecair kultur mengandungi 10 g glukosa, 0.2 g ekstrak yis, 0.07 g VA, 3.{{13 }} g asid tartarik, 1 g antara 80, 0.2 g KH2PO4, 0.146 g CaCl2·2H2O, 0.157 g daripada K2HPO4, 0.05 g MgSO4·7H2O, 42.5 mg ZnSO4·7H2O, 7.0 mg CoCl2·6H2O, 7.0 mg daripada CuCl2·2H2O, 0.54 mg FeCl3, 0.9 mg NaCl dan 0.2 mg melanin sintetik setiap liter air suling 20. pH medium telah dilaraskan kepada 4.0 dengan larutan NaOH dan HCl. 250 ml kelalang yang mengandungi aliquot 100 ml medium kultur telah diautoklaf dan diinokulasi dengan inokulum 5 ml. Kelalang kemudian diinkubasi pada penggoncang berputar pada suhu 30 darjah selama 15 hari. Sampel pendua dikumpul untuk ujian aktiviti LiP pada selang 24 jam.

Ujian enzim.Reagen untuk ujian LiP termasuk penimbal natrium tartrat 25{9}} mM pH 5.5, 10 mM VA dan 4 mM H2O2 (30 peratus). Ujian enzim telah dijalankan dalam kuvet silika, dan penyerapan diukur pada 310 nm oleh spektrofotometer yang boleh dilihat UV (Shimadzu, Kyoto, Jepun). Penyerapan dipantau pada masa 0-30 s di bawah keadaan ambien. Aktiviti enzim dikira mengikut Hukum Beer, Pers. (1) 21.

c = A/εd （1）

di mana c, ialah kepekatan spesies pengecilan; A ialah penyerapan optik; ε ialah pekali pengecilan molar; d ialah panjang laluan optik. Mengukur aktiviti enzim melibatkan penentuan perubahan kepekatan dari semasa ke semasa, Pers. (2).

cistanche root supplement

Pengoptimuman untuk meningkatkan pengeluaran LiP dan penyahwarnaan melanin secara in vitro.Pengoptimuman untuk pengeluaran LiP yang dipertingkatkan daripada Phanerochaete chrysosporium NK-1 menggunakan melanin sebagai substrat telah dijalankan menggunakan reka bentuk Placket Burman. Placket penuh adalah berdasarkan fakta bahawa ia menjejaskan kesan interaktif antara pembolehubah yang berbeza manakala ia hanya menganggap arah aliran linear, Pers. (3) 22.

di mana Y mewakili tindak balas dan simbol menunjukkan pekali regresi dan k ialah bilangan faktor yang dikaji. Sebanyak 9 faktor telah dikaji untuk mencapai kepekatan tertinggi LiP daripada Phanerochaete chrysosporium NK-1 untuk penyahwarnaan melanin yang terdapat dalam medium. Reka bentuk Placket-Burman telah dibina dengan 12 jumlah larian eksperimen, seperti ditunjukkan dalam Jadual 2. Eksperimen telah dijalankan selama 35 hari dan tindak balas diukur (aktiviti LiP IU/mL). Data eksperimen dianalisis menggunakan perisian statistik 'Design Expert 9'. Medium yang dioptimumkan digunakan untuk meningkatkan pengeluaran LiP dan disucikan oleh pemendakan ammonium.

cistanche lost empire

Pengoptimuman pengeluaran dan penulenan enzim.Medium terendam digunakan untuk menentukan masa inkubasi yang optimum dari segi aktiviti LiP. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 1, larutan kultur mempunyai aktiviti enzimatik maksimum pada hari ke-8, iaitu 140 IU/ml. Oleh itu, masa pengeraman selama 8 hari digunakan untuk menghasilkan larutan enzim.

Sebanyak 12 larian eksperimen telah dijalankan untuk menentukan faktor (9) yang memberi kesan kepada aktiviti LiP. Antara ujian, nilai tindak balas aktiviti LiP berjulat dari 171 IU/ml hingga 576 IU/ml, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 2. Larian dengan aktiviti LiP tertinggi dijalankan 3 (576 IU/ml) diikuti dengan larian 1{16}} (547 IU/ ml). Menurut analisis regresi, suhu, masa, kepekatan glukosa, kepekatan substrat, dan mediator mempunyai kesan positif terhadap aktiviti LiP. Kesan ekstrak yis didapati boleh diabaikan. Faktor lain mempunyai kesan negatif. Keadaan optimum untuk pengeluaran LiP ialah masa: 35 hari, suhu: 40 darjah , glukosa (setiap liter): 20 g, fruktosa: 10 g, ekstrak yis: 2 g, pepton: 2 g, inokulum: 10 ml, mediator substrat: 0.1 ml. Keadaan ini kemudiannya digunakan untuk pengeluaran LiP yang dipertingkatkan yang ditulenkan oleh kaedah pemendakan ammonium dan kromatografi gel (Sephadex G-75).

Pengekstrakan enzim pada pH optimum, suhu, dan masa pengeraman telah dijalankan. Lajur penapisan gel Sephadex G75 digunakan untuk memisahkan pecahan kandungan protein daripada lisat sel berkenaan kecerunan ketumpatan mengikut arahan pengilang. Kelimpahan protein dalam ekstrak mentah juga ditunjukkan melalui bilangan jalur yang muncul pada analisis gel polyacrylamide natrium dodecyl (SDS-PAGE). Berat molekul enzim tulen ialah 46.0 kDa seperti yang dikira daripada analisis SDS-PAGE (Tambahan Rajah 3). Aktiviti enzimatik selepas pemendakan ammonium dan penulenan oleh kromatografi gel ialah 684.0 dan 957.6 IU/ml, masing-masing.

Enzim yang telah disucikan digunakan untuk penyahwarnaan melanin pada keadaan fisiokimia yang berbeza, termasuk pH, suhu, masa inkubasi, dan kepekatan enzim. Melanin sintetik (B049-97-6) telah digunakan sebagai model melanin dalam semua eksperimen penyahwarnaan melanin mengikut 23.

Eksperimen penyahwarnaan.Kesan pH pada penyahwarnaan melanin. Untuk melihat kesan pH ke atas penyahwarnaan melanin oleh LiP, tindak balas penyahwarnaan melanin telah dijalankan pada pH yang berlanjutan daripada 2.0– 6.0. Campuran tindak balas mengandungi 10 µl enzim mentah yang dilarutkan dalam penimbal TE dan 1990 µl 0.02 peratus b/v melanin. Reaksi ini dilakukan dengan kehadiran dan ketiadaan VA. Campuran tindak balas telah diinkubasi pada suhu 30 darjah selama 6 jam. Eksperimen kawalan dijalankan secara selari dengan menggantikan LiP aktif dengan enzim ternyah natur yang telah direbus pada 95 darjah . Campuran tindak balas telah dipantau untuk penyahwarnaan melanin menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm sebelum dan selepas pengeraman. Kecekapan penyahwarnaan enzim dinyatakan dalam peratus ( peratus ). Penyahwarnaan melanin dikira dengan Pers. (4) 11.

di mana peratus DC mewakili peratusan penyahwarnaan; A0 dan Af mewakili penyerapan sebelum dan selepas rawatan enzim.

Kesan suhu pada penyahwarnaan melanin. Tindak balas penyahwarnaan melanin telah dijalankan pada suhu dari 20–60 darjah . Campuran tindak balas mengandungi 10 µl enzim mentah yang dilarutkan dalam penimbal dan 1990 µl 0.02 peratus b/v melanin pada pH 4 kedua-duanya dengan kehadiran dan ketiadaan VA. Campuran tindak balas telah diinkubasi selama 6 jam dan peratusan penyahwarnaan melanin diperolehi.

Kesan masa inkubasi pada penyahwarnaan melanin. Untuk pengoptimuman masa pengeraman, tindak balas penyahwarnaan melanin telah dijalankan pada masa pengeraman yang berlangsung dari 2–10 jam. Campuran tindak balas mengandungi 10 µl enzim mentah yang dilarutkan dalam penimbal dan 1990 µl 0.02 peratus b/v melanin pada pH 4 dengan kehadiran dan ketiadaan VA. Campuran tindak balas kemudiannya diinkubasi pada suhu 30 darjah dan peratusan penyahwarnaan melanin diperolehi.

Kesan kepekatan enzim pada penyahwarnaan melanin. Untuk mengoptimumkan kepekatan enzim, tindak balas penyahwarnaan melanin telah dijalankan pada kepekatan enzim yang berbeza dari 5–25 IU/ml dalam campuran tindak balas. 2 ml campuran tindak balas yang mengandungi 5, 10, 15, 20, dan 25 IU/ml enzim kasar dan 0.02 peratus b/v melanin telah disediakan dengan kehadiran dan ketiadaan VA. Campuran tindak balas kemudiannya diinkubasi pada suhu 30 darjah selama 6 jam dan penyahwarnaan melanin diukur.

Analisis SEM melanin terdegradasi. Perubahan morfologi permukaan melanin telah dianalisis dengan mengimbas mikroskop elektron (JEOL JSM-5910, Peabody, MA, USA) 24. Melanin yang tidak dirawat telah digunakan sebagai kawalan. Sampel telah dikeringkan dan diikat pada stub kuprum (10×10mm2 ) dengan pita karbon dua sisi (melekit pada kedua-dua belah). Rintisan itu dibasuh dengan detergen dan dikeringkan dengan pengering pistol haba (KADA 85U/SMD) pada suhu 200 darjah selama 2 minit sebelum penetapan sampel. Pengaliran tampal perak (SPI-CHEM, West Chester, PA, USA) digunakan untuk memastikan pengaliran rasuk elektron. Emas didepositkan pada sampel dengan plasma yang dicipta dengan keadaan voltan tinggi (arus 25 mA selama 50 s) dan keadaan vakum (10−2 ATM). Morfologi permukaan sampel telah diperiksa pada 3000 kuasa pembesaran.

cistanche chemist warehouse

Analisis FTIR bagi melanin yang tidak berwarna.Tindak balas atau sampel yang menunjukkan penyahwarnaan melanin tertinggi dalam eksperimen pengoptimuman dianalisis dengan spektroskopi FTIR (Model No 56, Merlin, Jerman). Sampel telah disentrifugasi (10,000 rpm selama 1 minit) dan dikeringkan dengan udara sebagai langkah persediaan untuk analisis FTIR 20. Analisis kualitatif sampel melanin dilakukan menggunakan spektrometer inframerah-dekat UV-Vis (NIR) Alat Lambda 900/Perkin Elmer. Spektrum telah direkodkan dalam julat 1000 hingga 3500 cm−1. Sampel disediakan dalam pelet KBr dengan penyebaran serbuk. Melanin sintetik yang tidak dirawat digunakan sebagai kawalan dalam analisis ini.

Sitotoksisiti melanin dan LiP yang terdegradasi.Ujian kematian udang air garam telah dijalankan untuk memeriksa sitotoksisiti melanin terdegradasi 14,15. Telur udang air garam ditetaskan dalam hidangan segi empat tepat yang mempunyai air laut tiruan. Pinggan itu mengandungi pembahagi plastik dengan lubang kecil dan membahagikan hidangan itu kepada dua petak yang tidak sama rata. Telur-telur itu berbintik-bintik di dalam petak yang lebih besar dan ditutup untuk mengelakkan sebarang penembusan cahaya, manakala petak yang lebih kecil diterangi dengan lampu di atasnya. Larva yang menetas tertarik oleh cahaya ke arah petak kecil. Selepas 48 jam pengeraman, nauplii matang dikumpulkan dari petak yang menyala menggunakan pipet pasteur.

Lima pencairan berbeza (20, 40, 60, 80, dan 100 µL/ml) melanin dan LiP yang terdegradasi telah diuji untuk kesan sitotoksisiti. Melanin terdegradasi telah ditambah ke dalam tabung uji kecil yang masing-masing mempunyai 2 mL air laut dengan 10 larva udang air garam hidup. Kawalan negatif adalah penyelesaian air laut buatan dengan larva udang air garam. Kawalan positif pokok disediakan untuk mengandungi melanin yang tidak dirawat dalam air laut buatan dengan larva.

Analisis statistik.Data eksperimen dianalisis menggunakan perisian statistik 'Design Expert 9'. Imej grafik telah dilukis dengan menggunakan kaedah tiga percubaan eksperimen dengan sisihan piawai yang dikira. Kepentingan statistik larian eksperimen telah dikira oleh ANOVA.

Ketersediaan data

Penulis mengesahkan bahawa data yang menyokong penemuan kajian ini tersedia dalam artikel [dan/atau] bahan tambahannya.

Rujukan

1. Sung, HJ, Khan, MF & Kim, YH Penyahwarnaan melanin yang dimangkinkan oleh lignin peroksidase rekombinan menggunakan H2O2 terjana in-situ untuk aplikasi dalam kosmetik pemutihan. Int. J. Biol. Makromol. 136, 20–26 (2019).

2. d'Ischia, M. et al. Melanin dan melanogenesis: daripada sel pigmen kepada kesihatan manusia dan aplikasi teknologi. Sel Pigmen Melanoma Res. 28, 520–544 (2015).

3. Brenner, M. & Hearing, VJ Peranan perlindungan melanin terhadap kerosakan UV pada kulit manusia. Photochem. Photobiol. 84, 539–549 (2008).

4. Clarkson, TW, Magos, L. & Myers, GJ Te toksikologi merkuri—pendedahan semasa dan manifestasi klinikal. N. Inggeris. J. Med. 349, 1731–1737 (2003).

5. Lynde, C., Kraf, J. & Lynde, C. Rawatan topikal untuk melasma dan hiperpigmentasi selepas keradangan. Terapi Kulit Lett. 11, 1–6 (2006).

6. Hughes, J. & Rustin, M. Kortikosteroid. Clin. Dermatol. 15, 715–721 (1997).

7. Płonka, P. & Grabacka, M. Sintesis melanin dalam mikroorganisma: aspek bioteknologi dan perubatan. Acta Biochim. Pol. 53, 423–443 (2006).

8. Lim, Y.-J. et al. Kesan perencatan arbutin pada biosintesis melanin bagi hiperpigmentasi yang disebabkan oleh hormon perangsang melanosit dalam tisu kulit babi guinea berwarna perang. Gerbang. Farmal Res. 32, 367–373 (2009).

9. Petit, L. & Pierard, G. Produk pencerah kulit dilawati semula. Int. J. Kosmet. Sci. 25, 169–181 (2003).

10. Rättö, M., Chatani, M., Ritschkof, A.-C. & Viikari, L. Penyaringan mikroorganisma untuk penyahwarnaan melanin yang dihasilkan oleh kulat pewarna biru. Appl. mikrobiol. Bioteknol. 55, 210–213 (2001).

11. Nagasaki, K. et al. Pembersihan, pencirian, dan pengklonan gen Ceriporiopsis sp. terikan MD-1 peroksidase yang menyahwarnakan melanin rambut manusia. Appl. alam sekitar. mikrobiol. 74, 5106–5112 (2008).

12. Ruiz-Dueñas, FJ & Martínez, Á. T. Degradasi mikrob lignin: bagaimana polimer recalcitrant yang besar dikitar semula secara cekap dan bagaimana kita boleh memanfaatkannya. mikrob. Bioteknol. 2, 164–177 (2009).

13. Holmes, EW & Tompson, KD (Paten Google, 2014).

14. Baravalia, Y., Vaghasiya, Y. & Chanda, S. Sitotoksisiti udang air garam, sifat anti-radang dan analgesik Woodfordia fruticosa Kurz fowers. Iran. J. Pharm. Res.: IJPR 11, 851 (2012).

15. Milhem, MM, Al-Hiyasat, AS & Darmani, H. Ujian ketoksikan bahan pergigian restoratif menggunakan larva udang air garam (Artemia salina). J. Appl. Sains Lisan.

16, 297–301 (2008). 16. Falade, AO et al. Fungsi lignin peroksidase dan aplikasi prospektif. Mikrobiologibuka 6, e00394.

17. Dinyanyikan, HJ Penyahwarnaan melanin oleh lignin peroksidase dengan H2O2 terjana in-situ untuk aplikasi kosmetik pemutihan (2020).

18. Pérez, J., Munoz-Dorado, J., De la Rubia, T. & Martinez, J. Biodegradasi dan rawatan biologi selulosa, hemiselulosa, dan lignin: gambaran keseluruhan. Int. mikrobiol. 5, 53–63 (2002).

19. Anderson, MJ, Gull, K. & Denning, DW Penaipan molekul melalui penguatan rawak DNA polimorfik dan hibridisasi selatan M13 bagi pencilan berpasangan Aspergillus fumigatus yang berkaitan. J. Clin. mikrobiol. 34, 87–93 (1996).

20. Sabar, MA et al. Degradasi arang batu peringkat rendah oleh Rhizopus oryzae yang diasingkan daripada lombong arang batu Pakistan dan pelepasan bahan organik yang dipertingkatkan. Bahan api 253, 257–265 (2019).

21. Yadav, M., Singh, S. & Yadava, S. Penucian, pencirian dan aktiviti penyahpolimeran arang batu lignin peroksidase daripada Lenzitus betulina MTCC-1183. Appl. Biokim. mikrobiol. 48, 583–589 (2012).

22. Mohan, S., Viruthagiri, T. & Arunkumar, C. Aplikasi reka bentuk Plackett–Burman untuk menyaring komponen media untuk penghasilan tannase daripada sekam program menggunakan penapaian tenggelam. Int. J. Pharm. Res. Wahyu 2, 24–29 (2013).

23. Woo, SH, Cho, JS, Lee, BS & Kim, EK Penyahwarnaan melanin oleh lignin peroksidase daripada Phanerochaete chrysosporium. Bioteknol. Bioproses. En. 9, 256 (2004).

24. Karp, JM et al. Penanaman sel stem embrio manusia tanpa langkah badan embrioid meningkatkan osteogenesis secara in vitro. Sel Stem 24, 835–843 (2006).

Pengakuan

Penulis ingin menghargai Yayasan Sains Pakistan kerana menyediakan pembiayaan di bawah geran penyelidikan PSF/Biotech-99.

Sumbangan pengarang

BS, NK, AYM, AJ, UF, MIA, memikirkan idea eksperimen dan bertanggungjawab untuk reka bentuk kajian, tafsiran keputusan, dan penulisan manuskrip. BS, NK, ZH, dan QW menyediakan dan menyemak semula rajah dan jadual dalam manuskrip. ZH juga terlibat dalam penulisan manuskrip asal. HH, FJL, HG, dan MU membincangkan, menyemak dan mengulas draf manuskrip pada peringkat yang berbeza. Semua pengarang menyemak manuskrip.