Pembezaan, Buah Pinggang, Nefrogenesis, Nefron Progenitor,

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

ABSTRAK

Endowmen nefron, yang ditakrifkan semasa tempoh janin, menentukan kesihatan buah pinggang dan kardiovaskular yang berkaitan sepanjang hayat. Kami menunjukkan di sini bahawa, walaupun kesan negatifnya terhadappertumbuhan buah pinggang, peningkatan genetik GDNF memanjangkan program nefrogenik melebihi pemberhentian biasa. Analisis mekanistik pelbagai peringkat mendedahkan bahawa GDNF yang berlebihan mengekalkan progenitor nefron dan nefrogenesis melalui peningkatan ekspresi sasaran yang dirembeskan dan isyarat WNT yang ditambah, yang membawa kepada kesan dua bahagian pada penyelenggaraan progenitor nefron. GDNF luar biasa tinggi in buah pinggang embrio mengawal seliasasarannya yang diketahui tetapi juga Wnt9b dan Axin2, dengan nyahpecutan serentak percambahan progenitor nefron. Penurunan tahap GDNF dalam postnatalbuah pinggang menjadi normaltunas ureter dan mewujudkan persekitaran permisif untuk penerusan program nefrogenik, seperti yang ditunjukkan oleh pembaharuan dan pembezaan diri nefron postnatal normal secara morfologi dan molekul. Keputusan ini membuktikan bahawa GDNF yang berlebihan mempunyai kesan bifasik pada nenek moyang nefron pada tikus, yang boleh bertindak balas dengan setia kepada manipulasi dos GDNF semasa tempoh janin dan selepas bersalin. Keputusan kami mencadangkan bahawa pengesanan tahap aktiviti isyarat adalah mekanisme penting yang melaluinya GDNF dan molekul lain menyumbang kepada spesifikasi jangka hayat nefron progenitor.

suplemen cistanche tubulosa vs deserticolauntukkhasiat buah pinggang

PENGENALAN

Buah pinggang mamalia ialah organ penapisan darah yang tidak menjana semula dengan fungsi detoksifikasi dan pengimbangan elektrolit yang penting.

Nefron yang melaksanakan fungsi ini dilahirkan semasa tempoh janin, kerana buah pinggang dewasa hanya menunjukkan kapasiti pembaikan terhad atau pembesaran glomerular pampasan (hipertrofi) (Chawla dan Kimmel, 2012; Rinkevich et al., 2014; Romagnani et al., 2013). Jisim nefron rendah kongenital adalah faktor risiko yang diterima secara meluas untuk hipertensi, proteinuria, glomerulosklerosis dan penyakit buah pinggang peringkat akhir (Bertram et al., 2011; Hoy et al., 2008) dan dengan itu sangat mempengaruhi kesihatan buah pinggang sepanjang hayat. Program nefrogenik berakhir antara minggu kehamilan 35-37 pada manusia dan hari selepas bersalin (P) 3 dalam tetikus (Hartman et al., 2007; Hinchliffe et al., 1991; Ryan et al., 2018), tetapi mekanisme menyumbang kepada pemberhentian kurang difahami. Telah didalilkan bahawa perubahan khusus peringkat dalam corak pertumbuhan (Cebrián et al., 2004) dan mekanisme penderiaan umur intrinsik sel (Chen et al., 2015a) terlibat. Secara molekul, isyarat SMAD yang disebabkan oleh protein morfogenetik tulang (BMP) (Brown et al., 2015), hamartin (Tsc1) (Volovelsky et al., 2018) dan peraturan mikroRNA (Yermalovich et al., 2019) mengambil bahagian dalam penentuan nefrogenik. tempoh program. Walau bagaimanapun, keplastikan program nefrogenik belum diterokai sepenuhnya. Nefron membezakan daripada kumpulan nefron progenitor (NP), juga dikenali sebagai metanephric atau mesenchyme cap. NP yang menyatakan repertoir unik penanda termasuk ENAM, glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) dan CITED1, hanya terdapat dalam buah pinggang embrio di mana ia mengelilingi setiap hujung ureteric bud (UB) dari penubuhannya (Boyle et al., 2008; Diri et al., 2006). Proses nefrogenesis disegerakkan dengan cawangan UB, yang pada masa yang sama mengekalkan pembaharuan diri dalam populasi NP yang tidak dibezakan dan mendorong subset NP untuk menjalani peralihan mesenchyme-to-epitelium secara beransur-ansur melalui peringkat prekursor yang jelas (agregat pretubular, PA; vesikel buah pinggang. , RV; badan berbentuk koma, CSB; badan berbentuk S, SSB), yang akhirnya membezakan kepada nefron berfungsi (Kobayashi et al., 2008; Lindström et al., 2018). Keseimbangan dalam pembaharuan diri berbanding pembezaan dalam populasi NP bergantung pada isyarat yang mengantara interaksi tisu induktif timbal balik yang berlaku antara UB dan mesenkim jiran. Mesenchyme metanephric dan isyarat yang diperolehi NP, seperti GDNF dan faktor pertumbuhan fibroblast (FGFs), mengawal morfogenesis UB, di mana buah pinggang embrio membesar dalam saiz, mencapai bentuknya dan mewujudkan sistem saluran pengumpul (Costantini dan Kopan, 2010). Isyarat RET yang diaktifkan GDNF dalam petua UB mengawal profil transkrip yang bertanggungjawab untuk kawalan mengumpul progenitor saluran dan morfogenesis UB (Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019; Lu et al., 2009; Ola et al. , 2011; Riccio et al., 2016). Transkrip terkawal GDNF juga terdiri daripada protein yang dirembeskan, seperti WNT11 dan CRLF1, dengan potensi yang ditunjukkan untuk mengawal program nefrogenik (O'Brien et al., 2018; Schmidt-Ott et al., 2005). Pengawal selia nefrogenesis lain yang berasal dari UB ialah WNT9b dan FGF-ligan yang mempengaruhi penyelenggaraan dan pembezaan NP (Barak et al., 2012; Carroll et al., 2005; Kiefer et al., 2012). Kami sebelum ini telah melaporkan bahawa gangguan genetik bagi rantau Gdnf 3′ yang tidak diterjemahkan menyebabkan 3- hingga 6-kali ganda peningkatan ekspresi GDNF endogen dan mengakibatkan hipoplasia buah pinggang disebabkan oleh kecacatan cawangan UB (Kumar et al., 2015). Tidak seperti kematian bayi baru lahir dalam kalah mati Gdnf, tikus Gdnfhyper/hyper bertahan sehingga 3 minggu dan telah mendedahkan peranan penting GDNF dalam mengumpul pembaharuan diri progenitor saluran (Costantini, 2012; Kumar et al., 2015; Li et al., 2019). Di sini, kami menunjukkan bahawa GDNF yang berlebihan, walaupun kesan negatifnya terhadap pertumbuhan buah pinggang keseluruhan, boleh mengembangkan jangka hayat NP, sekali gus mengukuhkan lagi keplastikan yang baru diiktiraf bagi buah pinggang mamalia.

KATA KUNCI:Pembezaan, Buah Pinggang, Nefrogenesis, Nefron progenitor, Tikus

KEPUTUSAN

Program nefrogenik embrio bergantung kepada GDNF

Susunan ruang ENAM2-NP positif dalam embrio dan awal selepas bersalinbuah pinggangmengikuti corak stereotaip, diterangkan dengan baik, di mana tisu berbilang sel awal menipis dari masa ke masa tanpa banyak menjejaskan organisasi khusus keseluruhan (Short et al., 2014). NP dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper telah diedarkan di sekeliling UB yang luar biasa lebar sebagai lapisan yang lebih nipis (Rajah 1A-F; Rajah S1A, B). Kuantifikasi NP pada E11.5 menunjukkan peningkatan awal, yang secara sementara dinormalisasi pada E12.5 tetapi menurun dengan teruk pada E14.5 dalam Gdnfhyper/hiper buah pinggang (Rajah 1E-G; Rajah S1C-F). Analisis mitosis menunjukkan bahawa kedua-dua GDNF meningkat secara endogen dan ditambah secara eksogen menyebabkan pengurangan ketara dalam pHH3 ditambah NPC (Rajah 1H; Rajah S1G). Secara kolektif, data menunjukkan bahawa GDNF yang berlebihan, yang berfungsi terutamanya dalam UB, di mana reseptornya dinyatakan (Pachnis et al., 1993), mendorong penurunan pesat dalam percambahan sel NP semasa perkembangan buah pinggang awal.

Adalah diketahui bahawa pembezaan NP pramatang atau dipercepatkan boleh menyebabkan penurunan sel NP dalam niche mereka (Kobayashi et al., 2008; O'Brien, 2018). Untuk menilai ini, nefrogenesis telah diperiksa dengan pewarnaan dengan LEF1 dan cyclin D1, yang melabelkan sel-sel yang melakukan pembezaan terawal dan nefron yang menjalani epitelialisasi penuh, masing-masing (Lindström et al., 2015). Ini menunjukkan penurunan umum dalam bilangan prekursor nefron awal dan menunjukkan pengurangan pembezaan nefron dalam Gdnfhyper/hiper embrio.buah pinggang(Gamb. 2). Penilaian ketumpatan glomerular seterusnya menyokong ini dan menunjukkan ketumpatan keseluruhan yang lebih rendah dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper hipodisplastik berbanding buah pinggang jenis liar (WT) (Rajah S1G). Menariknya, analisis glomeruli kortikal dalam jumlah kawasan yang diukur, dan terutamanya nisbah kortikal-ke-jumlah glomeruli, mendedahkan sedikit lebih tinggi daripada nisbah WT dalam Gdnfhyper/hyper (Jadual 1; 17 peratus dalam Gdnfhyper/hyper, 12 peratus dalam WT). Ini menunjukkan bahawa walaupun nyahpecutan awal pembaharuan diri dan pembezaan NP, buah pinggang yang menghadapi GDNF berlebihan semasa organogenesis mempunyai nefrogenesis selepas bersalin yang berterusan dengan peningkatan kecil dalam nefron yang dilahirkan terkini, yang terletak paling kortikal (Rumballe et al., 2011; Pendek. et al., 2014).

GDNF yang berlebihan memanjangkan jangka hayat kolam NP selepas bersalinBanyak model tetikus dengan kekurangan dalampertumbuhan buah pinggang, sama ada disebabkan oleh morfogenesis UB dan/atau pembezaan nefron, mati serta-merta selepas kelahiran (Kuure dan Sariola, 2020). Walaupun terdapat hipoplasia yang ketara, keabnormalan dalam morfologi UB dan nefrogenesis embrionik yang sangat terganggu (Rajah 2), tikus Gdnfhyper/hyper bertahan sehingga 3 minggu selepas kelahiran (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019), memberikan kemungkinan untuk memeriksa nefrogenesis selepas bersalin.

Seperti yang telah ditetapkan (O'Brien, 2018), analisis kami terhadap populasi NP di P1-P10 mendedahkan kehilangan dramatik dalam buah pinggang WT pada P3, di mana ENAM2-positif dikesan terutamanya dalam

membezakan prekursor nefron, dan hanya 10 peratus daripada petua UB yang dianalisis (niche) dihadkan dengan sel progenitor nefron (NPC) (Rajah 3A, n =2 buah pinggang). Walau bagaimanapun, ENAM2-NP positif telah dikesan dalam 59 peratus relung Gdnfhyper/hiper pada P3 (Rajah 3B, n=2 buah pinggang). Begitu juga, PAX2-NP positif telah dikesan dalam niche NP Gdnfhyper/ginjal hiper pada P3, tetapi PAX2-sel positif disetempat secara eksklusif dalam pembezaan prekursor nefron dalam WTbuah pinggang(Gamb. 3C, D).

Nefrogenesis dalam Gdnfhyper/hiper selepas bersalinbuah pinggangmenunjukkan peningkatan ketara daripada buah pinggang embrio, seperti yang ditunjukkan oleh corak prekursor nefron yang serupa dalam WT dan Gdnfhyper/buah pinggang hiper (Rajah 3E-H; bandingkan dengan Rajah 2). Akhirnya,

kami mendapati bahawa ~18 peratus daripada niche NP mengekalkan ENAM2-NPC positif pada P4 dan NPC yang komited hadir dalam Gdnfhyper/hyperbuah pinggangsehingga P6, manakala NPC yang komited dikesan dalam WT

buah pingganghanya sehingga P4 (Rajah 4; Rajah S1H). Ini menunjukkan bahawa jangka hayat NP dalam vivo tidak ditetapkan terlebih dahulu, dan mencadangkan bahawa modulasi tahap faktor pertumbuhan, khususnya GDNF, menyumbang kepada pemasaan gelombang pembezaan nefron akhir.

Kami membuat hipotesis bahawa NPC yang berterusan dalam Gdnfhyper / buah pinggang hiper selepas bersalin boleh disebabkan oleh mekanisme pampasan umum yang dicetuskan oleh kecacatan cawangan UB yang membawa kepada hipoplasia buah pinggang (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019) atau secara alternatif diperoleh daripada GDNF-specific. kesan kepada populasi NP. Untuk mendiskriminasi antara pilihan, NP selepas bersalin dianalisis dalam model lain hipoplasia buah pinggang. Fgf9;20-kekuranganbuah pinggangmenunjukkan penipisan lapisan sel NP embrio yang serupa (Barak et al., 2012) seperti yang dikesan dalam Gdnfhyper/hyperbuah pinggang, tetapi kami gagal mengesan ENAM2- dan/atau PAX2-sel positif dalam niche NP selepas bersalin mereka (Rajah S2). Untuk menghuraikan lebih lanjut mengenai perkara ini, kami seterusnya menganalisis Hoxb7Cre; Mek1fl/fl; Mek2 plus /− buah pinggang (Ihermann-Hella et al., 2014) di mana, sama dengan Gdnfhyper/hyper tikus, hipoplasia buah pinggang disebabkan oleh cawangan UB yang terjejas. Model ini juga tidak mempunyai tanda-tanda nefrogenesis yang berpanjangan, seperti yang dikesan oleh kehadiran ENAM2- dan/atau PAX2-sel positif dalam niche NP selepas bersalin mereka (Rajah S3), menyokong pandangan bahawa hipoplasia buah pinggang sebagai itu tidak mencukupi untuk mengekalkan nefrogenesis selepas bersalin.

Data yang diterbitkan juga menunjukkan bahawa hipoplasia buah pinggang sahaja tidak dapat menyokong penyelenggaraan NP selepas bersalin (Kuure dan Sariola, 2020), yang seterusnya mencadangkan peranan aktif untuk GDNF. Walau bagaimanapun, kami tidak boleh mengecualikan sepenuhnya kemungkinan bahawa faktor pertumbuhan berlebihan selain GDNF akan mempunyai kesan yang sama.

NP selepas bersalin yang berterusan mengekalkan program nefrogenik melebihi pemberhentian biasa

NP selepas bersalin yang berterusan mengekalkan program nefrogenik melebihi pemberhentian biasa

Seterusnya, potensi pembezaan NP yang berterusan dalam Gdnfhyper/hyper postnatalbuah pinggangtelah diperiksa. Analisis Ki67 mendedahkan corak percambahan selepas bersalin yang setanding dalam buah pinggang WT dan Gdnfhyper/hiper sehingga P4 (Rajah 5A, B). Dari P5 dan seterusnya, sel Ki67-positif berkurangan dalam zon pembezaan kortikal buah pinggang WT (Rajah 5C,E,G). Penurunan percambahan kortikal sedemikian tidak dikesan dalam Gdnfhyper/ginjal hiper, yang menunjukkan sel berbasikal secara aktif dalam struktur seperti prekursor nefron pada P7 (Rajah 5D, F,

H) tetapi tidak lagi pada P12 (Rajah S4A,B).

Analisis pembezaan nefron selepas bersalin menunjukkan kuantiti prekursor nefron yang berlebihan dalam Gdnfhyper/hiperbuah pinggangsehingga P7, sedangkan ini dikesan dalam buah pinggang WT hanya sehingga P4 (Rajah 6; Rajah S4C-F). Walau bagaimanapun, nefrogenesis selepas bersalin yang berterusan itu gagal meningkatkan ketumpatan glomerular daripada pada peringkat akhir embrio (Rajah S5A-C; 6.4±2.1 berbanding 10.2±1.2, masing-masing; min ± sem). Perkadaran glomeruli kortikal dalam Gdnfhyper/ginjal hiper pada P7 (59 peratus ) adalah 1.5× lebih tinggi

Rajah 1. Nefron progenitor semakin berkurangan dalam embrio Gdnf hiper/hiperbuah pinggang. (A,B) Penanda nefron progenitor (NP) SIX2 (merah) menyetempat ke hujung tunas ureter (UB) penutup mesenkim (calbindin, hijau) dalam WT (A; n=4 buah pinggang) dan Gdnfhyper/hyper (B; n=5 buah pinggang) buah pinggang pada E11.5. (C,D) E12.5 WT (C) dan Gdnfhyper/hyper (D) buah pinggang yang dikultur secara in vitro selama 24 jam dan diwarnakan selama ENAM2 (merah) untuk menggambarkan populasi NP dan calbindin (hijau) untuk UB (n{{9} } buah pinggang/ rawatan, tiga eksperimen bebas). (E, F) NPs banyak terdapat dalam E14.5 WT buah pinggang (E; 42.6/tip), manakala dalam Gdnfhyper/hyper NP buah pinggang jelas berkurangan (F; anak panah, 29.8/tip) (n=207 untuk WT dan 431 untuk petua Gdnfhyper/hiper dianalisis dalam sembilan buah pinggang/genotip).

Anak panah putih menunjuk ke sel NP (merah).

(G) Analisis ENAM2-jumlah NP positif dalam WT dan Gdnfhyper/hyperbuah pinggangmenunjukkan kumpulan NP awal yang setanding pada E12.5. Data dibentangkan sebagai kuantiti purata ENAM2-NP positif±sem berbanding dengan rakan sampah WT, yang ditetapkan kepada 100 peratus dan mencerminkan keputusan yang diperoleh daripada empat sampah bebas (WT: 100±15.61 peratus , n{{ 7}}; Gdnfhyper/hyper: 124.74±33.89 peratus , n=5; P=0.533, ujian-t dua ekor dalam SPSS). (H) Kadar pembiakan ENAM{17}}NP positif dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper pada E12.5 menunjukkan penurunan yang ketara jika dibandingkan dengan buah pinggang WT. Data dibentangkan sebagai nisbah min bagi ENAM2-NP positif±sem yang membiak berbanding dengan rakan sampah WT yang ditetapkan kepada 100 peratus dan mencerminkan keputusan yang diperoleh daripada tiga sampah bebas (WT: 100±9.04 peratus , n{{ 25}};Gdnfhyper/hyper: 56.94±12.67 peratus , n=5;

*P=0.024, ujian-t dua hujung dalam SPSS). Bar skala: 100 µm.

daripada di WTbuah pinggang(39 peratus ) (Jadual 1) menyokong pandangan bahawa kumpulan NP postnatal yang berterusan dalam Gdnfhyper/hiper buah pinggang mendorong nefron baru selepas pemberhentian nefrogenesis normal.

Tikus Gdnfhyper/hyper dengan nefrogenesis yang berpanjangan dalam buah pinggang yang teruk hipodisplastik tidak menunjukkan tanda-tanda neoplasia atau tumorigenesis semasa jangka hayat mereka yang pendek (Kumar et al., 2015; Turconi et al., 2020).

Gdnfwt/ginjal hiper menunjukkan penurunan embrionik NPC yang lebih ringan daripada Gdnfhyper/hiperbuah pinggang. Tikus ini menjalani jangka hayat yang normal dan tidak menunjukkan tumorbuah pinggangs dan organ lain (Turconi et al., 2020) (Rajah S6A-D, n=62). Peningkatan GDNF dua kali ganda semasa embriogenesis, bagaimanapun, gagal mengekalkan populasi NP dalam Gdnfwt / buah pinggang hiper selepas bersalin (Rajah S6E, F), mencadangkan ketat

Rajah 2. Kesan GDNF berlebihan pada nefrogenesis embrio. (A) LEF1 (merah), penanda agregat pretubular, vesikel renal distal dan badan berbentuk S, dalam buah pinggang WT E14.5. (B) E14.5 Gdnfhyper/hiper buah pinggang menunjukkan sangat sedikit LEF1-prekursor nefron pembezaan positif dan kelimpahan tipikal epitelium tunas ureter (UB) seperti yang dikesan oleh pewarnaan calbindin (hijau).

(C) Cyclin D1 (merah) mengotorkan semua prekursor nefron yang membezakan (asteris menandakan agregat pretubular dan badan berbentuk koma, anak panah menghala ke badan berbentuk S), yang boleh diperhatikan dengan banyaknya di sebelah epitelium UB (hijau) dalam E14.5 WTbuah pinggang.

(D) Prekursor nefron pembezaan yang lebih sedikit dikesan dalam E14.5 Gdnfhyper/hiperbuah pinggang. (E, F) Penyetempatan Cyclin D1 (merah) dalam E16.5 WT (E) dan

Gdnfhyper/hyper (F) buah pinggang. Calbindin (hijau)

pewarnaan menggambarkan epitelium UB dalam semua imej. Untuk setiap pewarnaan pada peringkat n=3 buah pinggang/genotip tertentu. Bar skala: 100 µm.

Jadual 1. Kuantifikasi ketumpatan glomerular dalam Gdnfhyper/ginjal hiper pada E18.5 dan P7

Data ialah kuantiti min nefron per padu mm±sem (n=4 buah pinggang/ genotip, purata lapan slaid dianalisis untuk setiap buah pinggang dengan selang 125 µm untuk mengelakkan kiraan lelaran glomeruli yang sama). Perkadaran glomeruli kortikal dalam buah pinggang WT pada E18.5 ialah 12 peratus, manakala dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper ialah 17 peratus. Pada P7, bahagian glomeruli dalam korteks meningkat lagi dalam Gdnfhyper/hyperbuah pinggang,menunjukkan bahawa nefron masih aktif membezakan.

had ambang untuk keupayaan GDNF memodulasi program nefrogenik.

Nefrogenesis selepas bersalin yang berterusan bergantung kepada perubahan dalam isyarat yang disebabkan oleh GDNF

Ekspresi Gdnf hilang daripada buah pinggang WT oleh P2 (www.gudmap.org), manakala mRNA dan proteinnya masih terdapat dalam Gdnfhyper/hyper

Nefrogenesis selepas bersalin yang berterusan bergantung kepada perubahan dalam isyarat yang disebabkan oleh GDNF

Ekspresi Gdnf hilang daripada WTbuah pinggangoleh P2 (www.gudmap.org), manakala mRNA dan proteinnya masih terdapat dalam Gdnfhyper/hyper

buah pinggangselewat P7 (Gamb. 7A-D). Kompleks reseptor GDNF konservatif hanya dinyatakan dalam petua UB epitelium (Costantini, 2012;

Golden et al., 1999). Disebabkan penyetempatan reseptor dalam tisu bersebelahan dengan populasi NPC, kami mengesyaki bahawa kesan peningkatan GDNF endogen pada nefrogenesis mesti menjadi pengantara.

melalui molekul(s) yang bergantung kepada GDNF yang berasal dari UB (http://www.signalpeptide.de/index.php) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011; Schmidt-Ott et al., 2005) (Jadual 2), atau molekul lain, ekspresinya boleh berubah disebabkan oleh UB yang terlalu besar.

Analisis ekspresi sasaran GDNF yang dirembeskan yang berasal dari UB menunjukkan peningkatan yang ketara bagi Crlf1, Srgn dan Wnt11 dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper pada E14.5 (Rajah 7E). Juga, ungkapan Wnt9b meningkat dengan ketara (Rajah 7E). Analisis lanjut sasaran isyarat WNT/ - catenin (Clevers dan Nusse, 2012) dalam kawalan E14.5 dan Gdnfhyper/buah pinggang hiper menunjukkan peningkatan yang ketara bagi sasaran kanonik Axin2 (P=0.003371), manakala WNT yang dinyatakan NP sasaran (Karner et al., 2011) menunjukkan trend penurunan peraturan, mungkin mencerminkan pengurangan bilangan keseluruhan NPC (Rajah S7A). Bersama-sama, ini menunjukkan bahawa bukan sahaja isyarat teraruh GDNF ditambah tetapi juga meningkatkan isyarat teraruh Wnt9- dan Wnt11-dengan fungsi yang diketahui dalam peraturan NPC mengambil bahagian dalam pengantaraan komunikasi timbal balik daripada UB mutan ke kumpulan NP bersebelahan di E14.5 (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018).

Rajah 3. Pembezaan nefron pada pemberhentian morfogenesis buah pinggang. (A) Buah pinggang P3 WT telah kehilangan kortikal ENAM2-progenitor nefron positif (NP) seperti yang ditunjukkan oleh kehilangan sel dalam mesenkim penutup (anak panah). Sebaliknya, ENAM2 menyetempatkan ke mesenkim sisi dan prekursor nefron awal (anak panah).

Kuantifikasi 48 niche NP (nombor tip yang dianalisis) mendedahkan hanya lima niche dengan NP. (B) Cap mesenchyme positif untuk SIX2 masih terdapat dalam Gdnfhyper/hyper kidney pada P3 (anak panah). Kuantifikasi 107 niche NP (nombor tip yang dianalisis) mendedahkan 63 niche dengan sel NP. (C, D) pewarnaan PAX2 (merah) dan calbindin (hijau) dalam WT (C) dan Gdnfhyper/hiper

(D) buah pinggang pada P3. Anak panah menunjuk ke kedudukan di mana sel NP dikekalkan dalam Gdnfhyper/hyperbuah pinggang.

(E,F) Jumlah setanding prekursor nefron siklik D1-positif (merah) dalam P3 WT (E) dan Gdnfhyper/hiper

(F) buah pinggang. (G,H) Visualisasi LEF1-prekursor nefron positif (merah) dan epitelium ureterik (hijau) mendedahkan nefrogenesis berterusan yang serupa dalam WT

(G) dan Gdnfhyper/hyper (H) buah pinggang. Untuk setiap pewarnaan

n=3 buah pinggang/genotip. Bar skala: 100 µm.

Pencirian molekul P5 Gdnfhyper/hiperbuah pinggangmenunjukkan peningkatan berterusan Crlf1, Etv4, Etv5, Cited1 dan Uncx4.1 (juga dikenali sebagai Uncx), tetapi juga mendedahkan peningkatan ekspresi potensi faktor khusus Lama1 (Rayagiri et al., 2018), inducer pembezaan nefron Wnt4 (Stark et al. , 1994) dan agonis isyarat WNT R-spondin 1 (Rspo1) (Rajah 7F; Rajah S7B). Profil transkrip seperti itu mencadangkan kesan tambahan yang diperolehi UB pada NP, yang nampaknya mengalami gelombang pembezaan berdasarkan ekspresi Fgf9 dan Fgf20 yang menurun dan penyetempatan SIX2 ditambah sel (Rajah 4C, D dan 7F). Kami secara fungsional menguji sama ada ungkapan Crfl1, Wnt11 dan Wnt9b yang paling ketara meningkat mungkin menjejaskan program nefrogenik dalam tetikus. CRLF1, dalam kompleks dengan sitokin seperti kardiotropin ligan fisiologinya, mendorong pembezaan dalam kultur mesenkim buah pinggang terpencil (Schmidt-Ott et al., 2005). Pencirian Crfl1-buah pinggang kalah mati mendedahkan saiz buah pinggang yang setanding dan nefrogenesis dengan buah pinggang WT (Rajah S6C-F), mencadangkan fungsi CRLF1 boleh dibuang dalam vivo. Sumbangan peningkatan isyarat WNT kanonik kepada fenotip yang disebabkan oleh GDNF yang berlebihan telah diuji seterusnya. IWR1 menghalang tankyrases 1 dan 2, yang diperlukan untuk perkembangan buah pinggang yang normal (Chen et al., 2009; Huang et al., 2009; Karner et al., 2010). Rawatan IWR1 mengurangkan nombor tip dan morfologi UB dengan kehadiran GDNF yang berlebihan (Rajah S8). Akhirnya, kami bertanya sama ada ekspresi Wnt11 yang meningkat dengan ketara dalam Gdnfhyper/buah pinggang hiper menyumbang kepada program nefrogenik yang berpanjangan dalam tikus Gdnfhyper/hiper dengan menyeberangi Wnt11 kalah mati-alel ke latar belakang Gdnfhyper. Ini gagal menghasilkan homozigot berganda

Rajah 4. Nefron progenitor berterusan dikekalkan dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper selepas bersalin. (A, B) Penyetempatan penanda nefron progenitor (NP) SIX2 (merah) dalam WT pada P4 (A) dan P6 (B) menunjukkan kehilangan NP dalam buah pinggang WT di mana ENAM hanya terdapat dalam vesikel buah pinggang positif lemah (asteris). . (C) Dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper pada P4 SIX2 juga disetempatkan kepada NP yang mengehadkan petua tunas ureter (hijau) (anak panah) (n=315 petua dalam WT dan 245 dalam Gdnfhyper/hiper dianalisis dalam empat buah pinggang/genotip). (D) Penyetempatan ENAM (merah) dan calbindin (hijau) dalam P6 Gdnfhyper/buah pinggang hiper mendedahkan kegigihan sel NP yang komited (13; * menunjukkan pembezaan nefron) dalam buah pinggang mutan (n=3 buah pinggang/genotip) . Kuantifikasi relung sel NP menunjukkan sangat sedikit petua, yang tidak mempunyai ENAM2-NP positif dalam buah pinggang WT, manakala 81 peratus relung dalam ginjal Gdnfhyper/hiper (n=2, 16 niche) telah disertakan dengan ENAM{17}}positif dalam prekursor nefron yang komited dan membezakan. Bar skala: 100 µm.

Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− anak (Jadual 3; n=95; P=0.005 Gdnfwt//hyper;Wnt11 plus /− pembiakan). Keputusan ini menunjukkan kematian embrio untuk Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− mutan dan memaksa kami untuk memfokuskan analisis pada Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plus /− buah pinggang. Penyingkiran satu alel Wnt11 dalam latar belakang Gdnfhyper/hiper meningkatkan sedikit morfologi UB dan mengurangkan saiz buah pinggang lebih jauh daripada itu dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper, berkemungkinan mencerminkan pengurangan pembentukan sista saluran pengumpul apabila pengurangan dos Wnt11 (Rajah S9A-C). Walau bagaimanapun, ENAM{12}}populasi NP positif telah dipertingkatkan (29.8 NPC/tip berbanding 40.7 NPC/tip pada E14.5 dan 20.3 NPC/tip berbanding 30.9 pada P0) dan nefrogenesis telah dipertingkatkan dalam zon pembezaan kortikal Gdnfhyper/hiper ;Wnt1 tambah /− buah pinggang (Rajah 8; Rajah S9D-F; bandingkan juga dengan Rajah 1F). Oleh itu, keputusan ini menunjukkan bahawa peningkatan tahap GDNF menambah beberapa sasaran GDNF/Ret yang diperolehi tunas, yang, bukan sahaja tetapi digabungkan antara satu sama lain dan bersama-sama dengan peningkatan isyarat WNT kanonik, mengawal NPC dalam buah pinggang embrio.

PERBINCANGAN Kiraan nefron ditakrifkan semasa hayat janin dan boleh berbeza-beza antara individu. Pengembangan dan jangka hayat NP sangat mempengaruhi endowmen nefron akhir, dan oleh itu pengenalpastian mekanisme pengawalseliaan yang mengawal pembaharuan diri NP adalah penting. Di sini, kami menunjukkan bahawa faktor neurotropik GDNF, yang dikenali untuk memulakan pembangunan buah pinggang dan mengawal morfogenesis UB (Costantini, 2010; Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019), adalah, walaupun kesan negatifnya terhadap pertumbuhan buah pinggang, mampu memanjangkan program nefrogenik melebihi pemberhentian biasa. Keputusan kami menunjukkan bahawa lebihan GDNF mempunyai kesan dwi-fasa pada pembaharuan dan penyelenggaraan diri NP. Berdasarkan analisis kami, kami mencadangkan model bagaimana GDNF berlebihan dalam Gdnfhyper/buah pinggang hiper berfungsi

melalui mekanisme yang melibatkan perubahan dalam perkembangan kitaran sel dan kapasiti untuk mengesan tahap faktor pertumbuhan. Pada mulanya dalam buah pinggang embrio, tahap GDNF yang tinggi menyebabkan penurunan pesat dalam nombor NP setiap niche, yang tipikal untuk banyak model tetikus dengan kekurangan utama dalam UB (Carroll dan Das, 2013; Chen et al., 2015b; Costantini dan Kopan, 2010; Liu et al., 2018). Penurunan NP pramatang yang dilihat dalam model yang diterbitkan sebelum ini biasanya disebabkan oleh pembezaan yang tidak tepat pada masanya, yang tidak berlaku dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper. Sebaliknya, GDNF yang berlebihan mampu mengekalkan kitaran sel aktif dalam korteks buah pinggang selepas bersalin dengan ketara lebih lama daripada yang dilihat pada buah pinggang WT. Proliferasi berlaku dalam sel NP, yang dikekalkan lebih lama daripada buah pinggang WT, dan mereka terus menghasilkan nefron baru. Pada masa hadapan, ia akan menjadi menarik untuk melihat sama ada mungkin untuk mentadbir GDNF yang berlebihan dengan cara yang baik untuk nefrogenesis selepas bersalin yang berterusan tanpa menjejaskan morfogenesis UB dengan teruk untuk memesongkan pertumbuhan organ keseluruhan. Data kami menunjukkan bahawa penurunan awal dalam NP embrionik Gdnfhyper / ginjal hiper adalah disebabkan oleh penurunan percambahan sel dan bukannya peningkatan pembezaan pramatang. Mekanisme selular ini disokong oleh perubahan molekul yang dikesan dalam sasaran GDNF yang diketahui (Crlf1, Wnt11 dan Srgn) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011) dan dalam pengawal selia penting bagi isyarat penyelenggaraan sel NP (Wnt9b, Wnt11 dan mereka sasaran transkrip) (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; O'Brien et al., 2018). Pemeriksaan sebelumnya terhadap umur panjang dan daya tahan sel NP dengan menghilangkan populasi NP dengan toksin difteria A, atau dengan mengganggu pengaktifan MAPK / ERK, yang kedua-duanya mengakibatkan penurunan pesat dalam sel NP tanpa kesan positif terhadap jangka hayat mereka (Cebrián et al., 2014). ; Ihermann-Hella et al., 2018), bersama-sama dengan keputusan kami menunjukkan bahawa percambahan sel NP sememangnya memainkan peranan utama dalam menentukan jumlah hayat mereka. Dalam persetujuan, sel NP dalam buah pinggang embrio lewat menunjukkan kadar percambahan yang berkurangan dan pembezaan yang dipercepatkan, manakala pemindahan sel NP lama ke dalam buah pinggang peringkat awal memanjangkan jangka hayatnya (Chen et al., 2015a). Berdasarkan keputusan kami, kami mencadangkan bahawa GDNF menyumbang kepada mekanisme di mana sel NP merasakan usia perkembangan mereka dan akhirnya jangka hayat mereka. Dalam buah pinggang yang normal, ekspresi GDNF adalah tinggi pada permulaan morfogenesis buah pinggang dan semasa fasa pertumbuhan aktif, manakala penurunan tahap GDNF yang jelas berlaku pada buah pinggang embrio lewat, mengakibatkan kehilangan ekspresi pada peringkat awal selepas bersalin (Rajah 7 dan 9) . Tahap GDNF pada awal Gdnfhyper/buah pinggang hiper adalah luar biasa tinggi, yang nampaknya menghalang percambahan sel NP, mungkin disebabkan oleh perubahan selular dan molekul yang dikesan dalam UB mutan seperti laluan WNT yang diubah.

(Rajah 7E, F; Rajah S7A, B), yang mempunyai kesan yang diketahui terhadap biologi NPC (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). Sama seperti buah pinggang WT, paras protein Gdnf mRNA dan GDNF berkurangan dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper selepas bersalin di mana Gdnf dimanipulasi pada tahap pasca transkrip yang membenarkan peraturan temporal endogen bagi ekspresi (Kumar et al., 2015). Berkemungkinan, ini mengurangkan ekspresi GDNF ke tahap yang mengizinkan untuk pembaharuan diri dan pembezaan sel NP, yang dikesan sebagai program nefrogenik yang berterusan dalam buah pinggang selepas bersalin (Rajah 9). Keplastikan bergantung kepada faktor pertumbuhan yang baru diiktiraf dalam pembezaan buah pinggang memberi harapan untuk kegunaannya dalam tujuan penjanaan semula pada masa hadapan. Petunjuk pertama untuk kemungkinan memanjangkan tempoh pembezaan nefron datang daripada eksperimen yang menghalang BMP/

Rajah 5. Pembiakan kortikal yang berterusan dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper selepas bersalin. (A, B) Pewarnaan Ki67 dalam buah pinggang P4 WT (A) dan Gdnfhyper/hyper (B) menunjukkan corak sel proliferatif yang sama dalam buah pinggang kortikal (anak panah merah) kedua-dua genotip. (C, D) Dalam buah pinggang P5 WT (C) Ki67-positif dikurangkan dengan ketara dalam korteks (anak panah merah), manakala Gdnfhyper/ginjal hiper (D) masih mempamerkan proliferasi yang sangat tinggi secara fokus (anak panah merah). (E, F) Percambahan dalam buah pinggang kortikal WT (E) semakin berkurangan pada P6, manakala ia kekal sangat aktif dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper (F). (G,H) Ki67-sel proliferatif positif menyetempat ke tubul renal medullar (anak panah hitam) dalam buah pinggang P7 WT (G) tetapi percambahan aktif masih dikesan dalam struktur nefron pembezaan kortikal (anak panah merah) buah pinggang Gdnfhyper/hiper (H). Bagi setiap peringkat selepas bersalin, n=3 buah pinggang/genotip. Bar skala: 1 mm.

P7 hanya dalam Gdnfhyper/hiper buah pinggang. (A, B) Penanda prekursor nefron LEF1 (merah) dalam buah pinggang WT (A) dan Gdnfhyper/hyper (B) pada P4 menunjukkan nefrogenesis yang berterusan dalam kedua-dua genotip (anak panah) (n=2 buah pinggang/genotip). (C,D) Buah pinggang P5 WT (C) menunjukkan sangat sedikit sel LEF1-positif dalam korteks, manakala nefrogenesis yang mencukupi dikesan dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper (D; anak panah; n=4 buah pinggang/ genotip) . (E,F) LEF1 tidak lagi terdapat dalam korteks buah pinggang WT pada P6 (E), manakala prekursor nefron yang banyak masih dikesan dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper (F) (n=3 buah pinggang/genotip). (G) Siklin D1 (putih) dan JAG1 (merah) menyetempat ke tubul distal nefron yang berbeza (anak panah kuning dan kepala anak panah) dalam buah pinggang P7 WT (n=3 buah pinggang). (H) Dalam P7 Gdnfhyper/ginjal hiper cyclin D1 dan JAG1 menyetempat kepada badan berbentuk koma (anak panah) dan berbentuk S (anak panah) bagi prekursor nefron dalam zon pembezaan kortikal, dengan itu menunjukkan nefrogenesis yang berterusan pada peringkat selepas bersalin lewat ini (n{ {19}} buah pinggang). Bar skala: 100 µm.

Isyarat SMAD1/5, yang membawa kepada buah pinggang yang lebih besar sedikit dengan lebih banyak nefron berbanding buah pinggang yang dirawat dengan kenderaan (Brown et al., 2015). Pengurangan dos Tsc1, pengekodan perencat mTOR, mengekalkan sel NP untuk hari tambahan, tanpa kesan yang dilaporkan pada nombor sel NP embrio (Volovelsky et al., 2018). Nefrogenesis yang berpanjangan juga diperhatikan pada tikus dengan ekspresi berlebihan Lin28, Lin28b atau Let-7 yang tidak diaktifkan (Let-7a1; Let-7d; Let-7f1) (Urbach et al ., 2014; Yermalovich et al., 2019), yang juga sama ada menunjukkan tumorigenesis langsung atau pengaktifan lokus Igf2 atau H19h yang dikaitkan dengan kanser buah pinggang kanak-kanak tumor Wilms (Chen et al., 2018; Ogawa et al., 1993). Sebagai nota, tiada perubahan dalam penyetempatan atau tahap pSMAD1/5 dikesan dalam Gdnfhyper/hiper buah pinggang, yang hypodysplastic dan serasi dengan kehidupan selama tiga minggu.

Kajian ini memberi tumpuan kepada pencirian fungsi GDNF dalam nefrogenesis, yang telah diperiksa sebelum ini dengan mengurangkan dos Gdnf endogen dan mengakibatkan pengurangan endowmen nefron (Cullen-McEwen et al., 2001, 2003). Kompleks reseptor kanonik untuk GDNF dibentuk oleh RET tyrosine kinase dan reseptor bersama GFRa1, yang secara eksklusif dinyatakan bersama hanya dalam epitelium UB (Costantini, 2012; Golden et al., 1999; Pachnis et al., 1993) . GDNF ialah faktor niche utama untuk sel hujung UB (Chi et al., 2009; Riccio et al., 2016; Shakya et al., 2005). Kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa GDNF yang berlebihan mengembang kumpulan progenitor saluran pengumpulan dengan mengorbankan pemanjangan batang ureter, mengakibatkan hujung berkembang dan fenotip batang pendek disebabkan oleh kecacatan dalam motilitas progenitor dan panjang kitaran sel yang dipendekkan (Li et al., 2019). Semasa peringkat embrio, kesan gabungan yang tidak normal

Rajah 7. Analisis ekspresi pengawal selia perkembangan buah pinggang yang penting. (A) Ujian hibridisasi in situ Gdnf pada P4 tidak dapat mengesan sebarang transkrip dalam buah pinggang WT (n=3 buah pinggang). (B) Ekspresi Gdnf dikekalkan dalam P4 Gdnfhyper/buah pinggang hiper dan menyetempatkan ke zon pembezaan kortikal di mana progenitor nefron dikekalkan (anak panah merah) disebabkan oleh lebihan GDNF (n=3 buah pinggang). (C) analisis qRT-PCR bagi transkrip Gdnf dalam Gdnfwt/ko, WT, Gdnfwt/hyper dan Gdnfhyper/hiper buah pinggang pada P7 (n=3 buah pinggang/genotip). Ekspresi Gdnf dalam Gdnfhyper/buah pinggang hiper adalah jauh lebih tinggi daripada WT (P=0.036) dan Gdnfwt/ko (P=0.038) (min±sem, ujian-t dua ekor dalam SPSS ). (D) Analisis ELISA tahap protein GDNF dalam buah pinggang P7 (n=5 buah pinggang/ genotip) (min±sem). (E,F) kuantifikasi berasaskan qRT-PCR bagi tahap ekspresi relatif gen yang dipilih pada E14 (E) dan pada P5 (F) (n=3 buah pinggang/genotip pada peringkat tertentu). Sasaran GDNF yang dirembeskan dari UB disenaraikan di atas garis putus-putus, manakala pengawal selia nefrogenesis lain yang diketahui dibentangkan di bawah garisan. Gdnfhyper/ hyper kidney menunjukkan peningkatan yang ketara bagi Crlf1 (*P=0.019), Srgn (*P=0.021), Wnt11 (**P=0.001) dan Wnt9b ( **P=0.01) pada E14, manakala pada P5, ekspresi gen meningkat dengan ketara termasuk Crlf1 (**P=0.009), Etv4 (**P=0.{{ 39}}), Etv5 (*P=0.03), Lama1 (*P=0.014) dan Wnt4 (*P=0.026). Sebaliknya, transkripsi Sostdc1 (**P=0.000), Fgf9 (**P=0.001) dan Fgf20 (**P=0.001 ) menurun dengan ketara dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper pada P5. Bar skala: 100 µm.

GDNF yang tinggi, perubahan biofizik yang disebabkan oleh morfologi hujung UB yang tidak normal dan perubahan molekul yang berkaitan dalam sasaran GDNF dan laluan WNT kelihatan bersama-sama menolak sel NP ke arah percambahan yang berkurangan. Kami menunjukkan di sini bahawa morfologi hujung UB yang berkembang bertambah baik dari semasa ke semasa tetapi berterusan pada bentuk ringan sehingga P4 dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper selepas bersalin (Rajah 5). Sel-sel hujung UB secara molekul masih terdapat dalam P5 Gdnfhyper/buah pinggang hiper, yang menyatakan tahap tinggi penanda hujung terkawal GDNF Crlf1, Etv4, Etv5 dan Lama1, sasaran WNT kanonik dinyatakan NPC Cited1 dan Uncx4.1, serta agonis WNT R -spondin1 (Rajah 7E, F; Rajah S7A, B) (Karner et al., 2011; Lu et al., 2009; Vidal et al., 2020). Perubahan molekul sedemikian dalam UB selepas bersalin mungkin menyediakan persekitaran yang menggalakkan untuk pembaharuan diri NP yang berterusan melebihi P2/P3. Kami mengenal pasti CRLF1 dan WNT11 yang dirembeskan dari UB sebagai sasaran GDNF yang, bersama-sama dengan WNT kanonik tambahan

isyarat, selain dirangsang oleh peningkatan ekspresi Wnt9b, mengantara kesannya pada peraturan NP. Data kami juga menunjukkan bahawa fungsi CRLF1 adalah berlebihan dengan sitokin lain kerana ketidakaktifannya tidak menjejaskan pembezaan buah pinggang. Kedua-dua WNT9b dan WNT11 mengawal banyak aspek NPC dan nefrogenesis (Carroll et al., 2005; Karner et al., 2011; Majumdar et al., 2003; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). Upregulasi Wnt9b yang dinyatakan UB, yang diketahui mengawal banyak aspek nefrogenesis, dalam Gdnfhyper / buah pinggang hiper mungkin meniru ekspresi paksanya dalam NP, yang mengganggu penyelenggaraan berbanding keseimbangan pembezaan (Kiefer et al., 2012), dan dengan itu menyumbang secara mekanistik kepada pembaharuan diri NP yang tidak seimbang dalam Gdnfhyper/hyper nephrogenesis. Ini disokong oleh morfologi hujung yang lebih baik apabila perencatan WNT kanonik oleh IWR1 di seluruh buah pinggang yang menghadapi GDNF berlebihan.

Jadual 2. Gen sasaran GDNF yang dirembeskan dengan potensi untuk mempengaruhi program nefrogenik

Keputusan kami menunjukkan bahawa perencatan IWR1 itu sendiri mempunyai kesan besar pada NPC, yang tersebar dan dipatuhi secara longgar pada petua UB. Perencatan WNT kanonik dalam NPC sendiri mungkin menyumbang kepada kegagalan untuk menambah fenotip mereka dengan kehadiran GDNF yang berlebihan. Ini disokong oleh eksperimen genetik kami di mana menurunkan ekspresi Wnt11 yang dinyatakan UB dalam latar belakang Gdnfhyper/hyper meningkatkan penyelenggaraan dan pembezaan NP, tetapi gagal menyelamatkan sepenuhnya hipoplasia buah pinggang yang disebabkan oleh GDNF yang berlebihan. Ini mungkin sekurang-kurangnya sebahagiannya disebabkan oleh kegagalan untuk menyahaktifkan kedua-dua alel Wnt11 dalam latar belakang Gdnfhyper/hyper disebabkan oleh kematian embrio Wnt11−/− (Nagy et al., 2016). Oleh itu, satu alel Wnt11 yang tinggal mungkin juga menambah lata GDNF seperti yang dicadangkan sebelum ini (Majumdar et al., 2003) dan dengan itu sebahagiannya melarang penyelamatan nefrogenesis sepenuhnya. Kajian semasa kami tidak dapat menolak kemungkinan bahawa beberapa kesan GDNF pada NP adalah disebabkan oleh isyarat GDNF bukan kanonik, kerana reseptor isyarat alternatif yang berpotensi dinyatakan oleh NP (Brodbeck et al., 2004; Enomoto et al., 2004; Keefe Davis et al., 2013; Paratcha et al., 2003). Walau bagaimanapun, kedua-dua pemadaman NCAM atau ekspresi Gfra1 dalam UB sahaja (dengan meletakkannya di bawah kawalan promoter Ret) mengekalkan fenotip buah pinggang yang normal (Cremer et al., 1994; Heuckeroth et al., 1999; Keefe Davis et al., 2013; Rossi et al., 1999; Sariola dan Saarma, 2003). Ini menunjukkan bahawa, sekurang-kurangnya sendiri, NCAM atau GFRa1, adalah penting untuk program nefrogenik. Ringkasnya, eksperimen kami mencadangkan bahawa GDNF, yang telah, dan kini, dalam ujian klinikal untuk penyakit Parkinson (Kirkeby dan Barker, 2019), mungkin berpotensi untuk berfungsi sebagai cara prospektif untuk meningkatkan endowmen nefron pada masa hadapan. Eksperimen tambahan diperlukan untuk mengenal pasti cara yang mungkin untuk mengaktifkan isyarat GDNF secara berlebihan tanpa kesan berbahaya pada pertumbuhan buah pinggang

BAHAN DAN KAEDAH

Haiwan

Protokol penjagaan dan penyelidikan haiwan dilakukan mengikut Kod Tingkah Laku Etika untuk Percubaan Haiwan serta arahan Kesatuan Eropah (Arahan 2010/EU/63), dan telah diluluskan oleh Lembaga Eksperimen Haiwan Kebangsaan Finland. Tikus ditempatkan dalam sangkar pengudaraan individu dengan makanan dan air secara ad libitum. Pelembapan dan pemanasan optimum disediakan secara berterusan di Pusat Haiwan Makmal Universiti Helsinki yang disahkan. Penjanaan dan genotaip model tetikus Gdnfhyper (Kumar et al., 2015) dan Fgf9;20 (Barak et al., 2012) telah diterangkan sebelum ini. Gdnfhyper;Wnt11− anak anjing adalah daripada persilangan C57BL6 Wnt11−

Jadual 3. Ringkasan genotip anak daripada Gdnfwt//hyper;Wnt11 tambah /− silang silang

(Nagy et al., 2016) dan garisan Gdnfhyper, dan telah digenotipkan seperti yang diterangkan sebelum ini (Kumar et al., 2015; Nagy et al., 2016 ). Semua garisan tetikus yang digunakan dalam kajian dikekalkan pada latar belakang campuran tiga kali ganda 129Ola/ICR/C57bl6. Penjanaan tikus kalah mati Crlf telah diterangkan sebelum ini (Alexander et al., 1999). Genotaip PCR dilakukan menggunakan set primer khusus Neo (5′-AGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′ dan 5′-CCTGATCGACAAGACCGGCTTC-3′) bersama set primer khusus gen untuk Crlf1 (5′-GCCTAATAGGTGCTGGGTGA{{ 18}}′ dan 5′-GACCCTATCTGCGTTTTCCA-3′). Pengumpulan tisu Embrio dipentaskan mengikut kriteria Theiler (1989) seperti yang diterangkan sebelum ini (Kuure et al., 2005) dan dikumpulkan selepas dislokasi serviks wanita hamil pada anestesia dalam dengan CO2. Anak anjing lewat embrio dan selepas bersalin telah dikorbankan melalui pemenggalan kepala. Tisu telah dibedah dalam medium Dulbecco ditambah dengan 0.2 peratus albumin serum lembu (BSA) diikuti dengan penetapan dengan 4 peratus paraformaldehid (PFA) atau kultur organ. Kultur organ Buah pinggang yang diasingkan daripada embrio tikus E11.5 dan E12.5 diletakkan pada antara muka cecair udara yang disokong oleh sistem membran poliester Transwell® (Costar) dan dikultur pada 37 darjah dalam suasana CO2 5 peratus yang lembap dengan medium kultur buah pinggang [F12 :DMEM (1:1) ditambah Glutamax (Gibco)] ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin dan penicillin-streptomycin (Ihermann-Hella dan Kuure, 2019). Untuk kultur in vitro dengan 100 ng/ml GDNF eksogen (ProSpec Ltd) (Sainio et al., 1997) bertujuan untuk pengiraan NPC, setiap blok urogenital yang mengandungi metanephros, asas buah pinggang definitif, dibelah dua sepanjang linea mediana ventralis. Separuh daripada setiap sampel dibiakkan dengan GDNF eksogen manakala separuh lagi berfungsi sebagai kawalan. Percubaan perencatan WNT pertama kali diuji dengan 50-100 ng/ml GDNF dan 50-100 µM IWR1 (I0131-25, Sigma-Aldrich). Berdasarkan eksperimen pergantungan dos ini, kepekatan optimum ialah 50 ng/ml GDNF dan 75 µM IWR1. Histologi dan imunostaining Untuk kajian yang menyiasat penanda minat pada bahagian parafin, buah pinggang telah dibedah daripada embrio atau anak anjing pada peringkat yang ditunjukkan, diikuti dengan pemprosesan dan keratan tisu seperti yang diterangkan sebelum ini (Li et al., 2019). Sekurang-kurangnya lima bahagian dari setiap buah pinggang dan tiga hingga lima buah pinggang berbeza setiap genotip digunakan dalam setiap analisis. Nombor sampel yang tepat disediakan dalam legenda angka. Hematoxylin dan Eosin (H&E) dan imunohistokimia yang dilakukan pada bahagian parafin telah disiapkan seperti yang diterangkan sebelum ini (Li et al., 2019). Secara ringkasnya, tisu yang dibedah telah ditetapkan semalaman dengan 4 peratus PFA (pH 7.4), diikuti oleh dehidrasi dan parafinisasi dengan pemproses tisu automatik (Leica ASP 200). Bahagian dengan ketebalan 5 µm telah disediakan dan didewax dalam Xylene diikuti dengan penghidratan semula sebelum diwarnakan dengan Harris H&E atau menjalani pengambilan antigen akibat haba dalam penimbal pengambilan antigen (10 mM Citrate; pH 6.0). Untuk imunostaining, 3 peratus BSA digunakan untuk menyekat (1 jam pada suhu bilik) diikuti dengan 30 minit 0.5 peratus rawatan hidrogen peroksida untuk pewarnaan kromogenik. Bahagian kemudiannya diinkubasi dengan antibodi primer semalaman pada ditambah 4 darjah diikuti oleh pengeraman antibodi sekunder khusus spesies selama 2 jam pada suhu bilik. Pengesanan kromogenik telah dilaksanakan dengan kit EnVision Detection System-HRP (DAB) (Dako).

Rajah 8. Penurunan genetik paras Wnt11 sebahagiannya menyelamatkan kehilangan progenitor nefron dalam buah pinggang Gdnfhyper/hiper. (A) ENAM2-progenitor nefron positif (NP, merah) adalah jarang dalam E14.5 Gdnfhyper/buah pinggang hiper (purata 29.8 NP/petua dalam 552 petua dianalisis dalam sembilan buah pinggang). (B) Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plus /− buah pinggang menunjukkan peningkatan kelimpahan umum NP setiap niche tanpa ketiadaan satu alel Wnt11 (purata 40.7 NP/tip dalam 107 petua yang dianalisis dalam empat buah pinggang ). (C,D) PAX2-sel positif dalam Gdnfhyper/hyper (C) dan Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plus /− (D) buah pinggang menunjukkan corak dan jumlah yang sama pada E14.5. (EH) Pada P0, pewarnaan SIX2 menunjukkan peningkatan dalam nombor NP dengan penyingkiran satu alel Wnt11 (purata 20.3 NPs/tip dalam 610 Gdnfhyper/hyper tip berbanding purata 30.9 NPs/tip dalam Gdnfhyper/−Wnt11 plus /− petua dianalisis dalam enam buah pinggang/genotip), yang disokong oleh pewarnaan PAX2. Taburan ENAM2-positif NP (A′,B′,E′,F′) dan PAX2- sel positif (C′,D′,G′,H′) ditunjukkan tanpa calbindin ( hijau) isyarat, yang menggambarkan epitelium UB dalam semua buah pinggang. Bar skala: 200 µm.

Buah pinggang E11.5 dan E12.5 yang tertakluk kepada pewarnaan imunofluoresensi pemasangan keseluruhan telah dibetulkan dan telap dengan 100 peratus metanol ais sejuk selama 10 minit sebelum pengeraman semalaman dengan antibodi primer. Pengeraman dengan antibodi sekunder khusus spesies yang sepadan telah dilaksanakan pada hari kedua berikutan pencucian yang kuat dengan PBST (0.1 peratus Tween 20 dalam PBS). Butiran tentang antibodi primer dan sekunder yang digunakan dalam kajian ini disenaraikan dalam Jadual S1. Hibridisasi in situ Hibridisasi in situ telah dijalankan seperti yang diterangkan sebelum ini (Ihermann Hella et al., 2014). Secara ringkasnya, siasatan RNA anti-deria terhadap ekson Gdnf telah ditranskripsi dan dihibridkan pada bahagian tebal yang diperoleh daripada buah pinggang P4 (10-15 bahagian/buah pinggang, n=3 buah pinggang/genotip) yang dibenamkan dalam 4 peratus agarose lebur rendah (NuSieve GTG, Lonza). BM Ungu digunakan untuk tindak balas kolorimetrik

Tahap protein ELISA GDNF dalam buah pinggang P7.5 diukur melalui ELISA seperti yang dilaporkan sebelum ini (Kumar et al., 2015). GDNF Emax® Immunoassay (Promega) telah digunakan dengan rawatan asid semasa menjalankan ELISA. Secara terperinci, bagi setiap genotip, tiga buah pinggang dilisiskan serta-merta selepas dibedah. Selepas mengukur kepekatan protein dengan Ujian protein DC (Bio-Rad), 25 µg jumlah protein telah dimuatkan ke dalam telaga pada plat ELISA. Setiap sampel dianalisis dalam pendua.

Pengimejan Immunostaining dan hibridisasi in situ pada bahagian telah diimej menggunakan sama ada Zeiss AxioImager yang dilengkapi dengan sumber cahaya pendarfluor HXP 120V, Hamamatsu Orca Flash 4.0 Kamera LT B&W dan kamera warna Zeiss AxioCam 105 , atau dengan Leica DM5000B dilengkapi dengan sumber cahaya halida logam Leica EL 6000 dan kamera sCMOS Hamamatsu Orca-Flash4.0 V2. Pewarnaan imunofluoresensi pemasangan keseluruhan telah diimej menggunakan Zeiss AxioImager dengan aplikasi Zeiss ApoTome. Pengimejan pemasangan keseluruhan untuk ukuran saiz buah pinggang yang utuh dilakukan menggunakan Leica MZFLIII yang dilengkapi dengan kamera Leica DFC7000T. Analisis kuantitatif berdasarkan imunostaining dan pengimejan Kuantifikasi ketumpatan glomerular dikira daripada bahagian berjujukan buah pinggang E18.5 dan P7. Buah pinggang telah dipotong, dan bahagian untuk kuantifikasi glomerular dipilih setiap 125 µm untuk mengelakkan kiraan lelaran glomeruli. Bilangan glomeruli dalam setiap bahagian dikira secara manual dan luas setiap buah pinggang diukur dengan perisian Fiji ImageJ (V1.51) melalui menggariskan kontur secara manual. Untuk mengira ketumpatan glomerulus, jumlah bilangan glomeruli

Rajah 9. Skema kesan GDNF yang berlebihan pada perkembangan buah pinggang tikus. (A) Dalam buah pinggang embrio yang mengalami pertumbuhan aktif, sel-sel progenitor nefron (NPC, merah) menerima isyarat panduan yang dirembeskan (cth Wnt11 dan Wnt9b) daripada hujung tunas ureter (UBT, biru tua) untuk mengawal keseimbangan percambahan NP dan pembaharuan diri dan pembezaan mereka kepada agregat peritubular (PA, kelompok sel merah jambu). (B) Dalam buah pinggang selepas bersalin, identiti hujung UB (UB, biru muda) hilang, seperti yang dibuktikan secara molekul oleh penurunan dalam ungkapan cth Wnt9b, Wnt11, Crlf1, dan Etv4/5, yang ditunjukkan oleh huruf merah nipis. Kehilangan beransur-ansur faktor rembesan yang berasal dari UB (Wnt9b, Wnt11, dan Crlf1) menyumbang kepada pengurangan percambahan NP dan pembaharuan diri. Pada masa yang sama, tahap GDNF dan FGF berkurangan, yang bertepatan dengan pembezaan NP yang dipercepatkan. Ini bersama-sama menghabiskan kolam NP dengan cepat mengakibatkan pemberhentian nefrogenesis. (C) Lebihan GDNF dalam buah pinggang embrio mendorong morfologi UBT yang tidak normal dan menambah ekspresi molekul pengawalseliaan yang diperolehi tunas (Crlf1, Sign, Wnt11, dan Wnt9b). Ekspresi berlebihan molekul rembesan terbitan tunas mempunyai kesan perencatan pada kitaran sel NP yang mengakibatkan percambahan berkurangan dan pembaharuan diri. Nombor NP keseluruhan drop-in memperlahankan pembezaan PA, seperti yang dikesan oleh ungkapan Wnt4 yang berkurangan. (D) Dalam buah pinggang selepas bersalin, morfologi UBT, dan oleh itu niche yang disediakannya untuk NPS, menjadi normal walaupun lebih tinggi daripada ekspresi WT bagi sasaran rembesan yang diperolehi tunas (Crlf1, Etv4/5, dan Lama1). Bersama-sama dengan Wnt9b dan Wnt11 yang dinormalisasi (tidak ditunjukkan), perubahan molekul ini mensubsidi percambahan NP normal, pembaharuan diri dan pembezaan, seperti yang dibuktikan oleh pengekalan populasi NP yang besar, ekspresi Wnt4 yang lebih tinggi, dan jumlah prekursor nefron yang serupa (kelompok merah jambu). sel) seperti dalam buah pinggang embrio WT. Melalui mekanisme sedemikian, lebihan GDNF konstitutif di bawah penganjurnya sendiri membolehkan program nefrogenik diteruskan sehingga P7. Teks kelabu gelap, ungkapan tidak berubah; teks merah, ungkapan berkurangan; teks hijau, peningkatan ekspresi.

dan bilangan glomeruli dalam korteks dikira secara berasingan. Purata jumlah kawasan buah pinggang dan keseluruhan dan nombor glomeruli kortikal kemudiannya dikira untuk setiap sampel. Purata ketumpatan glomerular dikira dengan membahagikan purata nombor glomerular dengan purata kawasan yang diukur. Purata glomeruli kortikal dalam keseluruhan kawasan purata dikira dengan membahagikan purata nombor glomerulus kortikal dengan purata jumlah kawasan yang diukur. Hanya glomeruli dengan bentuk utuh direkodkan. Kuantifikasi jumlah ENAM2-NPS positif pada E11.5 (n=4 untuk WT, n=5 untuk Gdnfhyper/hiper) dan E12.5 (n=10 buah pinggang/ rawatan, tiga eksperimen bebas) adalah berdasarkan pewarnaan imunofluoresensi keseluruhan gunung. Imej-imej itu ditangkap dengan aplikasi Zeiss ApoTome dan kemudian diproses dengan Perisian Imaris (Bitplane) menggunakan pengesanan spot. Semua imej telah diproses dengan protokol analisis yang sama. Untuk menormalkan variasi antara sampah, kuantiti min ENAM2-NP positif dalam buah pinggang WT dalam setiap sampah ditetapkan kepada 100 peratus , dan kuantiti ENAM2- NP positif dalam Gdnfhyper /buah pinggang hiper dibandingkan dengan kuantiti min dalam buah pinggang WT dalam sampah. Indeks mitosis bagi ENAM2-NPS positif dalam buah pinggang E12.5 (n=10 buah pinggang/ rawatan, tiga eksperimen bebas) yang dikultur dengan GDNF eksogen dikira dengan cara yang sama untuk menormalkan variasi antara sampah.

Purata perkadaran ENAM{0}}positif NP yang membiak dalam buah pinggang WT dan buah pinggang yang dikultur tanpa GNDF eksogen dalam setiap sampah ditetapkan kepada 100 peratus dan perkadaran ENAM yang membiak{{2 }}NP positif dengan kehadiran lebihan GDNF (Gdnfhyper/ginjal hiper dan aplikasi eksogen) daripada sampah yang sama telah diplot dalam rajah selepas membandingkan dengan sampah WT. Indeks mitosis ENAM2-NPS positif dalam buah pinggang E11.5 yang dikultur dengan GDNF eksogen telah diplot sebagai data/nilai asal. Pengiraan purata ENAM2-NPS positif bagi setiap relung nefrogenik (E14.5 dan P0) dan relung nefrogenik dengan progenitor (P3-P6) telah dijalankan dengan pewarnaan imunofluoresensi dalam bahagian parafin. Bilangan ENAM2-NPS positif telah dikira dengan perisian Fiji ImageJ (V1.51) pada setiap bahagian yang dipilih untuk analisis menggunakan analisis zarah dan bilangan petua dikira secara manual pada bahagian yang sepadan. Bilangan sampel yang dianalisis pada E14.5 ialah tiga buah pinggang untuk WT dan Gdnfhyper/hiper buah pinggang dan dua buah pinggang untuk Gdnfhyper/hiper; Wnt11 tambah /−. Bilangan petua yang dianalisis pada E14.5 ialah 207 dalam WT, 431 dalam Gdnfhyper/hyper, dan 107 untuk Gdnfhyper/hyper; Wnt11 plus /− buah pinggang. Bilangan sampel yang dianalisis pada P0 ialah tiga buah pinggang setiap genotip, dan beberapa petua yang dianalisis, yang dibentangkan dalam angka yang sepadan, berbeza dari 10 hingga 315, paling rendah dalam buah pinggang WT P6, di mana petua jarang hadir. Pengukuran hujung UB telah dijalankan menggunakan program LAS X sistem pengendalian mikroskop Leica selepas kultur 48 jam dengan kehadiran bahan kimia tertentu dan visualisasi petua dengan antibodi E-cadherin (Jadual S1). Petua diukur daripada enam buah pinggang dalam setiap keadaan dua set eksperimen bebas di mana bilangan petua diukur ialah: 101 untuk GDNF, 131 untuk IWR1, dan 115 untuk 75 µM IWR1 ditambah 50 ng/ml GDNF. Pengukuran saiz buah pinggang dalam eksperimen menilai kesan pemadaman Wnt11 dalam latar belakang Gdnfhyper/hyper telah dijalankan dengan perisian Fiji ImageJ (V1.51) pada imej pemasangan keseluruhan melalui pengesanan manual kontur buah pinggang. Analisis statistik Semua nilai dibentangkan sebagai min±sem kecuali analisis kesan utama Gdnf dan Wnt11 pada saiz buah pinggang, yang ditunjukkan sebagai min± sd Kepentingan statistik ditetapkan pada P<0.05 for="" all="" the="" analyses.="" independentsamples="" two-tailed="" t-test="" was="" used="" for="" pairwise="" comparisons="" with="" spss="" statistics="" software="" (ibm;="" version="" 25)="" in="" the="" study="" unless="" otherwise="" noted.="" the="" data="" obtained="" via="" in="" vitro="" tissue="" culture="" with="" exogenous="" gdnf="" was="" analyzed="" with="" the="" paired-sample="" t-test="" using="" spss="" statistics="" software.="" the="" impact="" of="" genetically="" modified="" gdnf="" and="" wnt11="" expression="" on="" kidney="" size="" was="" analyzed="" via="" two-way="" anova="" followed="" by="" main="" effects="" test="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" statistical="" significance="" for="" the="" deviation="" of="" gene="" distribution="" from="" mendelian="" ratio="" was="" performed="" using="" the="" χ2="" test="" also="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" data="" obtained="" from="" elisa,="" qrtpcr,="" and="" wnt="" inhibition="" experiments="" were="" analyzed="" with="" one-way="" anova="" followed="" by="" bonferroni="" posthoc="" test="" using="" spss="" statistics="" software.="" reverse="" transcription="" and="" quantitative="" rt-pcr="" (qrt-pcr)="" experiments="" were="" conducted="" as="" previously="" reported="" (kumar="" et="" al.,="" 2015).="" in="" more="" detail,="" 150-500="" ng="" of="" total="" rna="" from="" each="" sample="" (n="3" kidneys/genotype="" at="" the="" given="" stage)="" was="" treated="" with="" rnase-free="" dnase="" i="" (thermo="" fisher="" scientific).="" the="" reverse="" transcription="" reaction="" was="" performed="" with="" random="" hexamer="" primers="" and="" revertaid="" reverse="" transcriptase="" (thermo="" fisher="" scientific)="" immediately="" after="" inactivation="" of="" dnase="" i="" with="" 5="" mm="" edta="" at="" 65°c.="" complementary="" dna="" (cdna)="" was="" diluted="" 10×="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" qrt-pcr.="" for="" qrt-pcr,="" lightcycler="" 480="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" or="" bio-rad="" c1000="" touch="" thermal="" cycler="" upgraded="" to="" cfx384="" system="" (bio-rad),="" supplied="" with="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" and="" 250="" pmol="" primers="" were="" loaded="" into="" the="" well="" of="" 384-well="" plates="" with="" a="" total="" volume="" of="" 10="" µl.="" negative="" control="" was="" always="" included="" in="" every="" reaction="" via="" setting="" conditions="" with="" minus-reverse="" transcription="" or="" water.="" a="" combination="" of="" pgk1,="" hprt,="" and="" gapdh="" was="" used="" as="" the="" reference="" genes="" in="" all="" the="" qrt-pcr="" experiments,="" except="" the="" one="" with="" p7.5="" kidneys,="" in="" which="" mouse="" actb="" as="" the="" reference="" gene.="" primer="" sequences="" can="" be="" found="" in="" table="">

Penghargaan Kami berterima kasih kepada kakitangan Unit Pengimejan Bioperubatan dan Mikroskopi Cahaya di Helsinki Institute of Life Sciences (HiLIFE) atas bantuan berharga mereka dalam analisis imej dan teknik berkaitan kuantifikasi. Tikus Wnt11 telah disediakan oleh Profesor Seppo Vainio (Universiti Oulu, Finland) dan dihantar ke Pusat Haiwan Makmal HiLIFE, Universiti Helsinki