Kronotoksisiti Renal Bromobenzene dan Metabolit Perantaraannya dalam Tikus

Bromobenzene (BB) diketahui menimbulkan ancaman serius kepada kesihatan manusia. Kami sebelum ini menunjukkan bahawa BB menunjukkan kronotoksisiti, iaitu turun naik harian dalam keterukan hepatotoksisiti yang disebabkan oleh tikus. Walaupun BB menunjukkan nefrotoksisiti ringan, turun naik harian tidak diperhatikan dalam ketoksikan ini. Ini mungkin disebabkan oleh fakta bahawa kronotoksisiti yang disebabkan oleh BB diperhatikan hanya di hati dan bukan di dalambuah pinggangdan bahawa kerosakan yang disebabkan oleh BB adalah ketara dalam hati, menutupi turun naik harian dalam nefrotoksisiti. Untuk mengesahkan kedua-dua kemungkinan ini, kami memeriksa turun naik harian dalam nefrotoksisiti disebabkan oleh metabolit perantaraan BB yang mensasarkanbuah pinggang: 3-bromophenol, bromohydroquinone, dan 4-bromocatechol. Tikus telah disuntik dengan 3-bromophenol, bromohydroquinone atau 4-bromocatechol secara intraperitoneal pada enam titik masa berbeza dalam sehari (masa zeitgeber (ZT): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 atau ZT22). Kematian dipantau untuk 7 hari selepas suntikan. Tikus lebih sensitif terhadap ketoksikan akut metabolit ini di sekitar pendedahan ZT14 (fasa gelap) daripada sekitar pendedahan ZT2 (fasa cahaya). Tambahan pula, tikus yang diberikan dengan dos bukan maut 4-bromocatechol menunjukkan peningkatan yang ketara dalam paras nitrogen urea darah plasma danbuah pinggangmalondialdehid pada pendedahan ZT14. Selain itu, glutathione peroxidase-4, penunjuk ferroptosis, telah dilemahkan pada pendedahan ZT14. Keputusan ini menunjukkan ketoksikan metabolit BB lebih tinggi semasa pendedahan fasa gelap, dan menunjukkan sebab mengapa variasi nefrotoksisiti diurnal oleh BB tidak diperhatikan dalam laporan kami sebelum ini adalah bahawabuah pinggangkerosakantelah bertopeng kerana kerosakan hati yang teruk.

Klik untuk Tablet Cistanche tubulosa untuk penyakit buah pinggang

Kata kunci bromobenzena; variasi harian; irama sirkadian; kronotoksisiti;buah pinggang

PENGENALAN

Bromobenzene (BB) ialah reagen industri am yang biasanya digunakan sebagai bahan mentah untuk sintesis farmaseutikal, pewarna, dan racun perosak.1,2) BB ialah bahan pencemar organik yang merosakkan alam sekitar semula jadi dan menimbulkan ancaman serius kepada kesihatan manusia. . Satu kajian menyatakan bahawa BB menyebabkan hepatotoksisiti teruk dan ringanbuah pinggangketoksikan pada tikus.3) Walaupun BB itu sendiri, bentuk bukan metabolit, mempunyai ketoksikan yang rendah, metabolit perantaraannya mempunyai kesan toksik pada hati danbuah pinggang. CYP450s hepatik, seperti CYP1A2, CYP1B1 dan CYP2E1, memetabolismekan BB kepada empat metabolit: 3-bromophenol (3-BrP), bromohydroquinone (BrHQ), 4-bromocatechol (4- BrC), dan BB-3,4-oksida. BB-3,4-oksida menunjukkan hepatotoksisiti yang tinggi dan metabolit lain menunjukkan nefrotoksisiti,4–6) menunjukkan bahawa metabolit ini mempunyai organ sasaran yang berbeza.

Dalam kajian ini, kami menyasarkan "chronotoxicology" kerana kami sebelum ini telah mencadangkan hubungan antara masa pentadbiran dan keterukan ketoksikan bahan kimia.7–9) Kajian terdahulu kami menunjukkan turun naik harian yang ketara dalam keterukan tindak balas toksik kepada BB pada tikus, iaitu. , tikus lebih tahan terhadap kecederaan hepatik akibat BB semasa pendedahan fasa gelap (2:00) berbanding semasa pendedahan fasa cahaya (14:00).8) Walaupun BB menunjukkan nefrotoksisiti ringan , kronotoksisiti tidak diperhatikan dalambuah pinggang. Oleh itu, kronotoksisiti yang disebabkan oleh BB mungkin hanya diperhatikan dalam hati dan bukan dalambuah pinggang. Dalam kajian terdahulu kami, streptomycin, antibiotik yang diketahui mendorong nefrotoksisiti yang ditentukan, menunjukkan variasi diurnal yang jelas dalam nefrotoksisiti teraruh pada tikus.9) Berdasarkan data yang tersedia, kami membuat hipotesis bahawa kronotoksisiti yang disebabkan oleh BB adalah menonjol dalam hati dan bukannya dalam yangbuah pinggang, dengan itu menutupi kronotoksikan dalam organ yang terakhir. Metabolit BB yang dijana melalui pelbagai laluan metabolik berlaku dalam kepekatan rendah dan dengan itu mungkin menyumbang kepada kerosakan buah pinggang yang boleh diabaikan; disebabkan ini, nefrotoksisiti akibat metabolit BB tidak boleh dianggarkan secara klinikal. Dalam kajian ini, kami mengkaji variasi diurnal dalam nefrotoksisiti metabolit perantaraan BB: 3-BrP, BrHQ dan 4-BrC (Rajah 1).

BAHAN DAN KAEDAH

Rawatan Haiwan

Tikus ICR jantan telah dibeli daripada Japan SLC Inc. (Shizuoka, Jepun) dan dikekalkan di bawah keadaan standard suhu terkawal (24 ± 1 darjah ), kelembapan (55± 5 peratus ), dan cahaya (12: 12-h kitaran terang/gelap, lampu menyala pada 08: 00), dengan akses percuma kepada air dan makanan. Rawatan eksperimen dijalankan menggunakan 7-haiwan berumur seminggu. Selepas selesai eksperimen, tikus yang masih hidup dikorbankan menggunakan pentobarbital. Semua eksperimen telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Eksperimen Haiwan Institusi Universiti Kinjo Gakuin.

Protokol Eksperimen

Untuk ujian kematian, {{0}}tikus ICR jantan berumur seminggu telah menerima suntikan intraperitoneal (ip) tunggal sebanyak 500 mg/kg 3-BrP, 180 mg/kg daripada BrHQ, atau 220 mg/kg 4-BrC (pada volum 0.1 mL/10 g berat badan; Tokyo Kasei Corp, Tokyo, Jepun). Dos ini diputuskan mengikut nilai LD50 dalam helaian data keselamatan untuk setiap bahan kimia. Untuk suntikan setiap metabolit, tikus ditugaskan kepada enam kumpulan lima haiwan setiap satu. Metabolit BB ditadbir pada enam titik masa yang berbeza (masa jam: 10:00, 14:00, 18:00, 22:00, 02 : {{21 }}, dan 06 : 00), diterangkan sebagai masa zeitgeber (ZT): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 dan ZT22, masing-masing. Tikus kawalan menerima jumlah garam yang sama. Kematian dipantau untuk 7 hari selepas suntikan.

Untuk menganalisis variasi sirkadian dalambuah pinggangkecederaan, 7-tikus ICR jantan berumur seminggu (5–9 tikus) telah diberikan suntikan ip sebanyak 165 mg/kg 4-BrC pada ZT2 atau ZT14. Tikus kawalan menerima jumlah garam yang sama seperti yang diterangkan di atas. Ani mals telah dieutanasi menggunakan pentobarbital, dan sampel plasma mereka dikumpulkan 24 jam selepas suntikan. Sampel plasma yang diperolehi disimpan pada suhu -80 darjah . Thebuah pinggangdaripada semua haiwan telah dituai dan disimpan pada suhu -80 darjah .

Tahap Plasma Blood Urea Nitrogen (BUN), Aspartate Aminotransferase (AST), dan Renal Malondialdehyde (MDA)

Tahap BUN dan AST plasma ditentukan menggunakan Ujian BUN Wako dan transaminase CII-Test Wako (FUJIFILM Wako Chemicals, Osaka, Jepun), mengikut arahan pengilang.8) Jumlahbuah pinggangTahap MDA diukur melalui ujian mikroplate kolorimetrik (Oxford Biomedical Research, MI, USA), mengikut arahan pengilang.8)

Analisis Western Blot

Sampel protein (50 µg) yang diekstrak daripadabuah pinggangtelah diasingkan melalui elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida 10 peratus.10) Antibodi utama yang digunakan adalah seperti berikut (semua dicairkan 1: 1500): protein berinteraksi dengan reseptor tikus (RIP) 1 antibodi monoklonal, antibodi monoklonal RIP3 tetikus dan glutation tetikus peroksidase 4 (GPX4) antibodi monoklonal (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, Amerika Syarikat); arnab membelah caspase{10}} antibodi poliklonal (Teknologi Isyarat Sel); dan antibodi monoklonal aktin tikus (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Aichi, Jepun).

Analisis statistik

Pelbagai perbandingan telah dijalankan menggunakan ujian post-hoc Tukey-Kramer. Semua analisis statistik telah dilakukan menggunakan perisian SPSS 25.0 (Chicago, IL, USA). Keputusan dengan p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN

Dalam kajian ini, kami membandingkan kronotoksikan tiga metabolit perantaraan BB (3-BrP, BrHQ dan 4-BrC) yang diketahui mendorongbuah pinggangketoksikan. Kami mula-mula menyiasat kesan masa suntikan pada kematian akibat metabolit perantaraan BB. Rajah 2 menunjukkan bilangan haiwan yang masih hidup dan min masa hidup (MST) 7 d selepas suntikan. Apabila 3-BrP ditadbir pada ZT10 dan ZT14, semua tikus mati (0 peratus ) dalam masa 4 jam (Rajah 2A). Sebaliknya, apabila 3-BrP ditadbir pada ZT6 dan ZT22, tiga tikus (60 peratus ) terselamat; apabila ditadbir pada ZT2 dan ZT18, bilangan tikus yang masih hidup ialah satu dan dua (20 dan 40 peratus), masing-masing. Berikutan pentadbiran BrHQ, kematian tikus diperhatikan hanya dalam masa 4 jam selepas pentadbiran dalam semua kumpulan ZT. Pada 7 hari selepas pentadbiran, tiada tikus yang terselamat dalam kumpulan ZT14 dan ZT18 dan tiga (60 peratus ) terselamat dalam kumpulan ZT2 dan ZT6. Dalam kumpulan ZT10 dan ZT 22, bilangan tikus yang masih hidup adalah dua dan satu (40 dan 20 peratus), masing-masing (Rajah 2B). Berikutan 4-pentadbiran BrC, semua tikus mati dalam masa 3 hari apabila didos pada ZT14 atau ZT18 (0 peratus ) dan hanya satu atau dua (20 atau 40 peratus ) terselamat dalam kumpulan ZT yang lain (Rajah 2C). MST hampir konsisten dengan bilangan tikus yang masih hidup dalam semua kumpulan (Rajah 2D–F). Keputusan ini menunjukkan kronotoksikan maut bagi tiga metabolit perantaraan BB. Selepas pentadbiran pada ZT14 (fasa gelap), ketiga-tiga metabolit menunjukkan ketoksikan yang tinggi. Menariknya, corak chronotoxicity metabolit BB ini berbeza daripada BB itu sendiri, iaitu, tikus yang terdedah kepada BB dalam fasa gelap mempunyai kepekaan yang lebih rendah terhadap ketoksikan.8) Kami sebelum ini melaporkan bahawa streptomycin, yang menunjukkan nefrotoksisiti, adalah sangat toksik berikutan pendedahan fasa gelap dan kurang toksik selepas pendedahan fasa cahaya.9) Penemuan kajian terdahulu ini tidak bercanggah dengan kajian ini, menunjukkan bahawa perbezaan ketoksikan BB dan tiga metabolit perantaraan BB dikaitkan dengan organ sasarannya. . BB menyasarkan hati, manakala metabolit perantaraannya menyasarkanbuah pinggang.

Kami seterusnya meneliti kesan masa suntikan ke atas keterukan ketoksikan organ menggunakan dos bukan maut 4-BrC (165 mg/kg). Memandangkan kematian awal dalam masa 4 jam diperhatikan dengan suntikan 3-BrP dan BrHQ, yang diterangkan seperti di atas, kami hanya memilih 4-BrC untuk percubaan berikutnya. Untuk kemudahan percubaan, kami memilih ZT2 dan ZT14 sebagai masa suntikan. Dalam kumpulan ZT2, paras plasma BUN, penunjuk nefrotoksisiti, tidak meningkat berikutan 4-pendedahan BrC; walau bagaimanapun, tahap BUN telah meningkat dengan ketara dalam kumpulan ZT14 (Rajah 3A). Selari dengan BUN, kami mengukur tahap AST plasma, penunjuk hepatotoksisiti. Kami mendapati bahawa 4-Pentadbiran BrC tidak menjejaskan tahap AST plasma kedua-dua ZT2 dan ZT14 (Rajah 3B), menunjukkan bahawa 4-BrC adalah toksik hanya kepadabuah pinggang. Selain itu, kami menganggarkan tahap MDA sebagai penunjuk tekanan oksidatif dalambuah pinggang. Pentadbiran 4-BrC telah meningkatkan tahap MDA buah pinggang dengan ketara dalam kumpulan ZT14 dan ZT2. Walau bagaimanapun, paras MDA dalam kumpulan suntikan ZT2 adalah jauh lebih rendah daripada paras dalam kumpulan ZT14 (Rajah 3C).

Sehingga kini, pelbagai laluan kematian sel seperti apoptosis, nekroptosis dan ferroptosis telah dilaporkan.11) Selain itu, telah dilaporkan bahawa kematian sel yang disebabkan oleh 4-BrC adalah pengantara terutamanya melalui nekrosis.6) Untuk menyiasat jenis kematian sel yang disebabkan oleh 4-BrC, kami menganalisis tahap protein yang berkaitan dengan kematian sel: caspase terbelah-3 untuk apoptosis, RIP1/ RIP3 untuk nekroptosis dan GPX4 untuk ferroptosis. Tiada perubahan yang jelas diperhatikan dalam tahap caspase-3, RIP1 dan RIP3 yang dibelah dalam mana-mana kumpulan, menunjukkan bahawa apoptosis dan nekroptosis tidak diinduksi oleh 4-BrC (Rajah 4). Sebaliknya, penurunan dalam tahap GPX4 diperhatikan selepas mentadbir 4-BrC pada ZT14 (Rajah 4). Kami tidak memerhatikan 4-nekrosis buah pinggang yang disebabkan oleh BrC melalui analisis histopatologi (data tidak ditunjukkan). Ini mencadangkan bahawa 4-kepekatan BrC yang digunakan dalam kajian ini menyebabkan kerosakan buah pinggang ringan dan tidak membawa kepada nekrosis. Daripada keputusan ini, boleh dicadangkan bahawa 4-BrC menyebabkan ferroptosis, yang menunjukkan variasi diurnal.

Dalam kajian ini, kami menunjukkan metabolit perantaraan BB yang disebabkan kronotoksisiti dalambuah pinggang. Sebaliknya, keputusan kami sebelum ini menunjukkan nefrotoksisiti yang disebabkan oleh BB. Walau bagaimanapun, kronotoksisiti buah pinggang tidak berubah antara fasa terang dan fasa gelap.8) Walaupun sebab kritikal perbezaan antara penyelidikan terdahulu dan semasa masih belum jelas, kami fikir ia berlaku untuk menutupi kronotoksisiti buah pinggang dengan mendorong hepatik yang teruk. kecederaan. Dalam percubaan akan datang, kita perlu mengukur jumlah terkumpul setiap metabolit perantaraan BB kerana jumlah ini mungkin berubah mengikut tahap CYP dan/atau kecederaan.

Banyak faktor biologi menunjukkan irama sirkadian dalam tahap ekspresinya. Sebagai contoh, Xu et al. telah melaporkan variasi diurnal dalam ekspresi gen antioksidan hepatik pada tikus.12) Glutathione (GSH) ialah antioksidan yang penting untuk mengekalkan kesihatan dan melindungi daripada sebatian toksik. Kedua-dua 4-BrC dan 3-BrP telah dilaporkan mengurangkan tahap GSH buah pinggang.4,13) Ferroptosis telah dicadangkan pada tahun 2012 sebagai bentuk kematian sel yang disebabkan oleh elastin, yang menghalang pengimportan sistein, membawa kepada pengurangan GSH dan penyahaktifan GPX4.14) Keputusan kami menunjukkan bahawa GPX4 hanya ditindas pada ZT14 oleh 4-BrC. Oleh itu, protein atau gen berkaitan GSH mungkin dikaitkan dengan kronotoksisiti.

Untuk membuat kesimpulan, kajian kami sekarang menunjukkan bahawa BB mendorong kerosakan buah pinggang serta kerosakan hepatik melalui metabolitnya, seperti 3-BrP, BrHQ dan 4-BrC. Sebab mengapa variasi nefrotoksisiti diurnal oleh BB tidak diperhatikan dalam laporan kami sebelum ini ialah kerosakan buah pinggang bertopeng akibat kerosakan hepatik yang kuat.

RUJUKAN

1) Lau SS, Monks TJ. Sumbangan bromobenzene kepada pemahaman semasa kami tentang ketoksikan yang disebabkan oleh kimia. Life Sci., 42, 1259–1269 (1988).

2) Zhao H, Cheng N, He L, Peng G, Liu Q, Ma T, Cao W. Kesan Hepatoprotektif Madu Apis cerana Fabricius pada kerosakan hati yang disebabkan oleh bromobenzene pada tikus. J. Food Sci., 83, 509–516 (2018).

3) Vedi M, Sabina EP. Penilaian potensi hepatoprotektif dan nefroprotektif withaferin A pada kecederaan yang disebabkan oleh bromobenzene dalam tikus albino Switzerland: kemungkinan penglibatan disfungsi mitokondria dan keradangan. Biol Sel. Toxicol., 32, 373–390 (2016).

4) Dankovic DA, Billings RE. Peranan 4-bromophenol dan 4-bromocatechol dalam pengikatan kovalen bromobenzena dan ketoksikan dalam hepatosit tikus terpencil. Toksik. Appl. Pharmacol., 79, 323–331 (1985).

5) Lau SS, Monks TJ, Gillette JR. Pengenalpastian 2-bromohydroquinone sebagai metabolit bromobenzene dan o-bromophenol: implikasi untuk nefrotoksisiti akibat bromobenzena. J. Pharmacol. Exp. Ther., 230, 360–366 (1984).

6) Rush GF, Newton JF, Maita K, Kuo CH, Hook JB. Nefrotoksisiti metabolit bromobenzena fenolik dalam tetikus. Toksikologi, 30, 259–272 (1984).

7) Miura N, Yoshioka H, ​​Nishimori A, Ohtani K, Hasegawa T, Hwang GW, Ikeda M, Nonogaki T. Analisis pelbagai arah kronotoksisiti hepatik yang disebabkan oleh kadmium dan pada tikus. J. Toksik. Sci., 42, 597–604 (2017).

8) Yoshioka H, ​​Nonogaki T, Fukuishi N, Shinohara Y, Hwang GW, Ohtani K, Miura N. Chronotoxicity kecederaan hepatik yang disebabkan oleh bromobenzene pada tikus. J. Toksik. Sci., 42, 251–258 (2017).

9) Yoshioka H, ​​Tominaga S, Shinohara Y, Hwang GW, Maeda T, Miura N. Chronotoxicity kecederaan buah pinggang yang disebabkan oleh streptomycin pada tikus. biol. Pharm. Lembu jantan, 43, 53–58 (2020).

10) Yoshioka H, ​​Ichimaru Y, Fukaya S, Nagatsu A, Nonogaki T. Kesan potensi asetaminofen dan hepatotoksisiti akibat karbon tetraklorida dimediasi oleh pengaktifan protein interaksi reseptor pada tikus. Toksik. Mech. Kaedah, 28, 615–621 (2018).

11) Kim EH, Wong SW, Martinez J. Nekrosis dan Penyakit yang Diprogramkan: Kami mengganggu pengaturcaraan biasa anda untuk membawa kepada anda keradangan nekro. Kematian Sel Berbeza., 26, 25–40 (2019).

12) Xu YQ, Zhang D, Jin T, Cai DJ, Wu Q, Lu Y, Liu J, Klaassen CD. Variasi diurnal ekspresi gen antioksidan hepatik pada tikus. PLOS ONE, 7, e44237 (2012).

13) Sami TJ, Hinson JA, Gillette JR. Ketoksikan Bromobenzene dan p-bromophenol dan pengikatan kovalen dalam vivo. Life Sci., 30, 841–848 (1982).

14) Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, Patel DN, Bauer AJ, Cantley AM, Yang WS, Morrison B 3rd, Stockwell BR. Ferroptosis: bentuk kematian sel nonapoptosis yang bergantung kepada besi. Sel, 149, 1060–1072 (2012).

Hiroki Yoshioka, a,b,# Sarah Tominaga, a,# Mai Nishikawa, Yasuro Shinohara, Makoto Nakao, Masae Yoshikawa, Tohru Maeda,*, a dan Nobuhiko Miura*,c

sebuah Kolej Farmasi, Universiti Kinjo Gakuin; 2–1723 Omori, Moriyama-Ku, Nagoya 463–8521, Jepun: b Pusat Penyelidikan Craniofacial, Pusat Sains Kesihatan Universiti Texas di Houston, Sekolah Pergigian; 1941 East Road, Houston, TX 77054, Amerika Syarikat: dan cJabatan Sains Kesihatan, Universiti Farmasi Yokohoma; 601 Momono-Cho, Totsuka-Ku, Yokohama 245–2006, Jepun. Diterima pada 30 Ogos 2020; diterima pada 25 Oktober 2020

untuk maklumat lanjut: Ali.ma@wecistanche.com