Bahagian2: Molekul Kecederaan Buah Pinggang-1 Merupakan Reseptor Berpotensi Untuk SARS-CoV-2
May 11, 2022
Untuk maklumat lanjut. kenalantina.xiang@wecistanche.com
Manifestasi klinikal coronavirus
1. Tempoh inkubasi adalah panjang, dan simptom utama adalah demam, keletihan, sakit tekak, dan batuk. Demam boleh menjadi demam tinggi, demam sederhana, atau demam rendah;
2. Bayi dan orang tua tidak tipikal dan selalunya disertai dengan semput dan sesak nafas. Dalam kes yang teruk, kerosakan berbilang sistem mungkin berlaku;
3. Batuk kering pada peringkat awal adalah terutamanya paroxysmal dan teruk, sama seperti batuk kokol, yang menjejaskan tidur dan aktiviti; pada peringkat akhir, batuk adalah kahak, kahak adalah ganas, kadang-kadang mengandungi sedikit darah, dan ada yang disertai dengan berdehit;
4. Sesetengah pesakit mempunyai simptom ringan dan mungkin tidak demam. Kebanyakan pesakit mempunyai prognosis yang baik, dan sebilangan kecil pesakit sakit kritikal atau mati;
5. Sindrom gangguan pernafasan akut, kejutan septik, asidosis metabolik refraktori, dan disfungsi pembekuan.
Bagaimana untuk mencegah coronavirus baru, meningkatkan imuniti sendiri adalah cara paling berkesan untuk orang ramai melawan virus. Cistanche, yang telah digunakan sebagai khazanah berkhasiat sejak zaman purba, dikenali sebagai "padang pasirginseng" dan merupakan raja meningkatkan imuniti. Cistanche - Raja Meningkatkan Imuniti
Penyelidikan perubatan moden telah membuktikan bahawa sebagai tambahan kepada fungsi menyuburkan dan menguatkan badan, Cistanche mempunyai kesan kuratif yang ketara dalam mencegah tumor, anti-penuaan, anti-aritmia, menghalang apoptosis, dan meningkatkan imuniti. nikmat.
Thejumlah glukosida Cistancheadalah komponen aktif ginseng untuk mengawal fungsi imun, yang boleh meningkatkan fungsi imun bukan sahaja untuk orang normal tetapi juga untuk orang yang mempunyai fungsi imun yang rendah.
Pemerhatian klinikal telah mengesahkan bahawa Cistanche mempunyai kesan kuratif tertentu pada tumor malignan, dan mempunyai kesan ketara meningkatkan leukosit. Mengambil ginseng semasa radioterapi dan kemoterapi boleh mengurangkan toksik dan kesan sampingan radioterapi dan kemoterapi, mempercepatkan pembaikan tisu yang rosak, dan mencegah leukopenia;
Perbincangan
Untuk melawanPandemik-19 COVID, pemahaman yang mendalam tentang bagaimanaSARS-CoV-2menyerang sel manusia adalah wajar. Kajian telah menunjukkan jangkitan langsung SARS-CoV-2 dalambuah pinggangsebagai tambahan kepada paru-paru (Braun et al., 2020; Farkash et al., 2020). Walau bagaimanapun, ACE2 kekal sebagai satu-satunya reseptor yang diiktiraf dengan baik yang boleh menjadi pengantara pencerobohan ini. Tambahan pula, tropisme buah pinggang SARS-CoV-2 dan yang berkaitankecederaan buah pinggangkelihatan tidak dapat dijelaskan oleh tahap ACE2 yang agak menurun apabila pencerobohan virus (Kuba et al., 2005). Di sini, kajian kami mencadangkan bahawa KIM1, biomarker terkawal secara drastik untuk kecederaan buah pinggang (Yang et al., 2015), mengantara pencerobohan buah pinggang SARS-CoV-2 sebagai reseptor.
Kami juga mendapati bahawa SARS-CoV-2-RBD mengikat kepada KIM1 dengan pertalian yang lebih tinggi daripada SARS-CoV-RBD dan MERS-COV-RBD, yang mungkin menjadi asas penularan SARS-CoV yang lebih kuat-2 (Rabaan et al,2020); oleh itu, jangkitan buah pinggang dan peranan KIM1 dalam penyakit pernafasan yang teruk ini patut dikaji semula. Terutama, keputusan kami mencadangkan tapak pengikatan KIM1 dan ACE2 yang berbeza pada RBD virus, oleh itu adalah wajar untuk menyiasat sama ada dan cara KIM1 dan ACE2 mengantara pencerobohan SARS-CoV-2 dalam organ ini. Di samping itu, memandangkan KIM1 diendositosis melalui laluan bergantung kepada clathrin (Zhao et al., 2016), ia juga menarik untuk menerokai proses bergantung1-KIM selepas virus melekat pada membran sel.
ACE2 ialah reseptor yang paling dikaji untuk SARS-CoV-2, namun ia bukanlah sasaran terapeutik yang ideal untuk COVID-19, kerana ia dinyatakan secara meluas dalam berbilang organ dan memainkan peranan penting dalam mengawal tekanan darah dan mencegah kecederaan jantung/buah pinggang (Imai et al., 2005; Li et al., 2020d). Sebaliknya, KIM1 mempunyai kaitan yang lebih kuat dengan fungsi buah pinggang dan sangat dinyatakan hanya selepaskecederaan buah pinggang(Kondratowicz et al,2011; Yuan et al, 2015; Costafreda dan Kaplan,2018), yang menjadikannya sasaran terapeutik yang lebih spesifik dan mungkin juga lebih selamat untuk pesakit COVID-19 dengan penyakit buah pinggang.
Ringkasnya, data kami mencadangkan peranan penting KIM1 dalam tropisme buah pinggang-2 SARS-CoV sebagai reseptor berpotensi untuk SARS-CoV-2. Di sini, kami mencadangkan model 'kitaran ganas' yang dimediasi oleh KIM1 dan ACE2 (Rajah 5G), yang mungkin menerangkan tropisme buah pinggang SARS-CoV-2 dalam pesakit-19 COVID. Semasa peringkat awal pencerobohan SARS-CoV{12}}, tahap fisiologi yang lebih tinggi (Rajah S1 Tambahan) dan pertalian mengikat (Jadual Tambahan S1) menjadikan ACE2 sebagai sasaran utama, yang tidak khusus untuk buah pinggang. Walau bagaimanapun, selepas permulaan AKl yang disebabkan oleh virus, KIM1 yang dikawal secara drastik yang terhasil dengan cepat menggalakkan jangkitan virus sekunder yang dimediasi oleh KIM1 dan ACE2, yang lebih khusus buah pinggang, dan akibatnya memburukkan lagi kerosakan buah pinggang dalam kitaran ganas (Rajah 5G). Pendekatan yang boleh memecahkan interaksi antara SARS-CoV-2 dan KIM1, termasuk antibodi anti-KIM1, perencat molekul kecil dan peptida antagonis terbitan KIM1-mungkin memberi penerangan tentang COVID-19 rawatan.
Bahan dan kaedah
Bahan
Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 peratus ) telah disintesis secara kimia oleh Genscript. Antibodi anti-tikus-lgG (p/n 18-8816-33) dan anti-badan anti-arnab-lgG (p/n 18-8817-33) diperoleh daripada Rockland. IgG with SureBeads" manik magnet Protein G (J2112LB-02) telah dibeli daripada Bio-Rad. DAPI (D9542) adalah daripada Sigma. Alex Flour 594 berlabel phalloidin (C2205S) adalah daripada Beyotimes. Antibodi terhadap KIM1 (NBP{{ 15}}, Novus Biologicals), Bendera (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma) dan ACE2 (2115-1-AP, Proteintech) telah digunakan.
Pemerolehan dan analisis profil ekspresi KIM1 dan ACE2
Untuk mendapatkan profil transkrip dan protein komprehensif KIM1 dan ACE2 untuk tisu manusia, kami mengumpul dan menganalisis data transkrip dan profil protein berasaskan imunohistokimia daripada Human Protein Atlas (HPA, https://www.proteinatlas.org), yang menunjukkan ekspresi dan penyetempatan protein manusia merentas tisu dan organ, berdasarkan penjujukan mendalam RNA (RNA-seq) daripada 37 tisu normal dan imunohistokimia pada microarrays tisu yang mengandungi 44 jenis tisu (Uhlen et al., 2015). Tisu HPA RNA-seq gen pengekodan protein direkodkan sebagai min transkrip pengekodan protein per juta (pTPM), sepadan dengan nilai purata sampel dari setiap tisu. Tahap ekspresi protein berasaskan histologi dianalisis secara manual kepada empat tahap (tidak dikesan, rendah, sederhana dan tinggi). Dalam Rajah Tambahan S1, 10 tahap transkrip tissular teratas dan tahap ekspresi protein berasaskan histologi KIM1 dan ACE2 disenaraikan, masing-masing, dan profil ekspresi bertindih KIM1 dan ACE2 diringkaskan.
Pelabuhan molekul dan simulasi dinamik
Docking telah dijalankan melalui Z-Dock (http://zdock. umassmed.edu/). Struktur kristal SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2(PDB ID 1R42) dan KIM1 Ig Domain V (PDB ID 5DZO) digunakan untuk mencari model pengikatan yang berpotensi. Kompleks protein yang mendapat markah terbaik telah dipilih untuk simulasi dinamik molekul berikut, yang dijalankan oleh pelayan Desmond dan dianalisis oleh Pymol2.3 dan Maestro11.8.012. Gambar rajah simulasi dinamik 50 ns digunakan untuk mengkaji parameter dinamik kompleks protein . Tenaga bebas pengikat MM-GBSA dikira oleh HawkDock (Misini lgnjatovic et al., 2016).
Sisihan kuasa dua akar (RMSD) dan turun naik purata kuasa dua akar (RMSF)
RMSD digunakan untuk menganggarkan purata perubahan dalam sesaran pemilihan atom untuk kerangka tertentu seperti yang diterangkan (Li et al., 2011). RMSF telah dijalankan untuk mengkaji perubahan sesaran dalam rantai protein (Li et al., 2011) .
model tetikus AKI dan qPCR
Kecederaan I / R dilakukan pada tikus C57BL / 6 seperti yang kami nyatakan sebelum ini (Chen et al, 2015, 2017). Untuk AKI yang disebabkan oleh cisplatin, 30 mg/kg cisplatin berat badan disuntik secara intraperitoneal ke dalam 8-tikus jantan berumur seminggu dan tikus dikorbankan 3 hari kemudian. Sampel darah dan buah pinggang telah dikumpul untuk analisis lanjut, dengan n=4 bagi setiap kumpulan haiwan eksperimen. Jumlah RNA telah diasingkan daripada buah pinggang oleh RNAiso Plus (TaKaRa) dan ditranskripsikan terbalik ke dalam cDNA menggunakan sistem sintesis untaian pertama M-MLV (Invitrogen). Banyaknya transkrip gen tertentu dinilai oleh qPCR. Primer yang digunakan dalam kajian disediakan (Jadual Tambahan S4).
Membina
Plasmid ekspresi mamalia untuk manusia KIM1, KIM1 Ig V (sisa KIM1 aa 20-127), KIM1 △lg V(KIM1 terpotong tanpa sisa aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-Sisa aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP dan TIM4-YFP telah dibina. Produk penguatan PCR bagi serpihan cDNA yang sepadan telah diklonkan ke dalam vektor berasaskan promoter pRK yang mengandungi sama ada tag HA atau FLAG. Plasmid berkaitan SARS-CoV-2-adalah hadiah baik daripada Dr. PHWang di Universiti Shandong.
Kultur sel dan pemindahan
Talian sel tiub buah pinggang manusia HK-2 (diperolehi daripada China Center for Type Culture Collection) telah dikultur dalam media DMEM/F12 (Hyclone) yang mengandungi 17.5 mM glukosa dan 10 peratus serum lembu janin. Untuk menilai kesan SARS-CoV-2 pada sel, sel HK-2 telah ditransfeksi dengan plasmid SARS-CoV-2-S dan SARS-CoV-2-RBD-2-dan kemudian dikumpulkan untuk pengesanan lanjut.
Co-IP
Sel HK-2/HEK293T (1×10) yang ditunjukkan telah disaring dalam 1 ml penimbal pra-lisis (25 mM Tris-HCl, pH7.4,150mM NaCl, 1 peratus NP-40, 1mM EDTA, 5 peratus gliserol), yang dirumus untuk ujian tarik turun dan IP dan sebagai penimbal pencuci untuk manik. Untuk IP, lisat sel telah diimunopresipitasi dengan antibodi yang ditunjukkan atau gG masing-masing dengan manik magnet SureBeadsTM Protein G semalaman pada suhu 4C. Selepas mencuci dengan penimbal pra-lisis yang mengandungi 500 mM NaCl, manik telah direbus dalam penimbal pemuatan dan tertakluk kepada immunoblotting (Wan et al., 2017).
Ujian FRET
Interaksi intraselular antara KIM1 dan SARS-CoV-2-RBD telah dikesan oleh ujian berasaskan FRET standard(Karpova dan McNally,2006) menggunakan KIM1-CFP dan SARS-CoV-2-RBD-YFP . Secara ringkas, plasmid ekspresi mamalia yang menyatakan KIM1-CFP atau KIM1 Alg V-CFP telah ditransfeksi bersama dengan SARS-CoV-2-RBD-YFP ke dalam-293sel T. Untuk pengesanan berasaskan spektrofotometer pendarfluor, sel dikumpulkan dan dilisiskan 24 jam selepas pemindahan, dan lisat dikesan oleh F{18}} Spektrofotometer Pendarfluor (Hitachi) melalui imbasan panjang gelombang(500-600nm) dan imbasan masa (435 /527 nm, pengujaan/pelepasan).Untuk pengesanan berasaskan confocal, sel telah diimej dengan mikroskop confocal Leica TCS SP8 di bawah kanta objektif berkuasa tinggi(40×)(saluran CFP:435/485 nm, pengujaan/pelepasan; saluran YFP :485/527nm, pengujaan/pelepasan; saluran FRET:435/527 nm, pengujaan/pelepasan) (Li et al,2020b). Cotransfection CFP dan YFP yang tidak terkonjugasi dimasukkan sebagai kawalan negatif seperti yang diterangkan (Karpova dan McNally, 2006). Interaksi antara KIM1 dan ligannya TIM4 telah dikesan oleh ujian FRET sebagai kawalan positif (Rong et al, 2011).
CRISPR-Cas9-mengantara kalah mati KIM1
Protokol berasaskan CRISPR-Cas9-untuk kejuruteraan genom telah digunakan seperti yang diterangkan (Zhang et al., 2017). Urutan sasaran RNA panduan untuk KIM1 disediakan (Jadual Tambahan S4).
Pelabelan FITC dan mikroskop confocal
Label FITC telah dilakukan seperti yang kami nyatakan sebelum ini (Li et al, 2020b; Zhang et al., 2020). Secara ringkas, SARS-CoV-2-RBD diinkubasi dengan FITC (nisbah molar 1:5) semalaman, dan kemudian 5 mM NHCL ditambahkan untuk menghentikan tindak balas dan memadamkan FITC yang tidak bertindak balas. Penyelesaian itu didialisis dua kali dan diliofilkan untuk kegunaan selanjutnya.
Sel HEK293T (5×109) atau sel HK-2 (1×107) diinkubasi dengan FITC atau FITC-SARS-CoV-2-RBD （100ug/ml percuma selama 2. Untuk ujian dalaman berasaskan peptida, AP1 atau AP2（50μM）ditambah bersama dengan FITC-SARS-CoV-2-RBD （100 ug/m）. Selepas membetulkan dengan 4 peratus (w/v) formaldehid, membran sel telah diwarnakan dengan Alex Flour 594 berlabel phalloidin （2ug/ml）, dan nukleus telah diwarnai oleh DAPI（1ug/m）, dan kemudian digambarkan dengan Leica TCS Mikroskop confocal SP8. Bagi setiap kumpulan, sekurang-kurangnya 100 sel daripada lima medan di bawah kanta objektif berkuasa tinggi (64×) dimasukkan dalam penilaian. Imej perwakilan telah dibentangkan. Kuantifikasi imej telah dijalankan oleh ImageJ1.8.0.
Ujian daya maju sel
Sel telah disadur pada 3000-4000 sel setiap telaga dalam 96-plat telaga. Pada pertemuan 80 peratus, sel yang diinkubasi dengan SARS-CoV-2-RBD （100 ug/ml） dirawat dengan atau tanpa AP1 atau AP2（10,50,100 μM）. Selepas itu, 10ul MTT （5 mg/ml ditambah kepada setiap satu
baik selama 4 jam, medium telah dikeluarkan, dan DMSO telah ditambah. Serapan yang diukur pada 490nm telah dinormalkan kepada kumpulan kawalan masing-masing.
Analisis statistik
Data dinyatakan sebagai min ± SD. Perbezaan yang ketara telah dinilai dengan ujian Pelajar dua hujung. Nilai P dua belah<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">
