Corak Ungkapan -Tubulin, Inversin Dan Sasarannya yang Tercerai-berai-1 Dan Morfologi Silia Primer dalam Perkembangan dan Penyakit Ginjal Manusia Normal
Mar 10, 2022
Abstrak:Ekspresi spatiotemporal protein -tubulin, penyongsangan dan kusut-1 (DVL-1) yang dikaitkan dengan laluan isyarat Wnt dan morfologi silia primer telah dianalisis dalam membangunkanbuah pinggang(minggu perkembangan ke-14–38), selepas bersalin yang sihat (1.5- dan 7-tahun), dan manusia yang berubah secara patologibuah pinggang,termasuk displastik multicysticbuah pinggang(MCDK), glomerulosklerosis segmental fokus (FSGS) dan sindrom nefrotik jenis Finland (CNF). Analisis dilakukan dengan imunofluoresensi berganda, mikroskop elektron, semikuantitatif dan kaedah statistik. Ungkapan bersama sitoplasma -tubulin, penyongsangan dan DVL-1 diperhatikan dalam tubul berbelit proksimal (pct), tubul berbelit distal (dct) dan glomeruli (g) tisu yang dianalisis. semasabuah pinggangperkembangan, ungkapan keseluruhan -tubulin, penyongsangan dan DVL-1menurun, manakala dalam tempoh selepas bersalin meningkat sedikit. Ungkapan tertinggi bagi -tubulin dan penyongsangan mencirikan dct dan g, manakala pct bercirikan DVL-1 tinggi. -tubulin, penyongsangan dan corak ekspresi DVL-1 dalam MCDK, FSGS dan CNFbuah pinggangberbeza dengan ketara daripada kawalan sihat. Berbanding dengan sihatbuah pinggang, berubah secara patologibuah pinggangmempunyai silia primer dismorfik. Dinamik ungkapan yang berbeza bagi -tubulin, penyongsangan dan DVL-1 semasabuah pinggangpembangunan boleh menunjukkan bahawa pertukaran antara isyarat Wnt kanonik dan bukan kanonikal adalah penting untuk normalbuah pinggangmorfogenesis. Sebaliknya, ekspresi terganggu mereka dalam patologibuah pinggangmungkin dikaitkan dengan silia primer yang tidak normal, yang membawa kepada kronikpenyakit buah pinggang.
Kata kunci:perkembangan buah pinggang manusia; -tubulin; inversin; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; buah pinggang, buah pinggang
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI PENYAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
pengenalan
Perkembangan definitif atau metanephricbuah pinggangbermula semasa minggu kehamilan kelima (GW), yang kemudiannya terus membezakan untuk membentuk buah pinggang kekal [1,2]. Interaksi isyarat antara mesenkim metanefrik dan tunas ureter memastikan betulbuah pinggangperkembangan semasa nefrogenesis. Secara ringkas, tunas ureterik mendorong peralihan mesenchymal-to-epithelial (MET) dalam mesenchyme metanephric, yang terkondensat dan membentukbuah pinggangvesikel, diikuti oleh badan berbentuk koma dan berbentuk S, dan akhirnya membawa kepada pembentukan glomeruli [3]. Sebagai balasan, mesenkim mendorong percabangan lebih lanjut dari tunas ureterik. Buah pinggang metanefrik menjadi unit perkumuhan berfungsi pada minggu ke-11 perkembangan manusia. Walau bagaimanapun, nefrogenesis selesai dalam minggu ke-34 hingga ke-36 perkembangan janin, apabila beberapa peristiwa cawangan selesai, tetapi proses pembezaan selanjutnya buah pinggang berterusan ke dalam tempoh selepas bersalin [4,5]. Gangguan interaksi kompleks ini mengakibatkan pelbagai kelainan kongenital buah pinggang dan saluran kencing (CAKUT), termasuk displasia, penyakit buah pinggang polikistik, displastik multicystic.penyakit buah pinggang(MCDK), seterusnya membawa kepada kronikpenyakit buah pinggang(CKD) [6].
Dalam kajian ini, kami memberi tumpuan kepada penampilan silia primer dan laluan isyarat Wnt, yang memainkan peranan penting semasa nefrogenesis normal dan dalambuah pinggangproses pembaikan, berikutan akut atau kronikpenyakit buah pinggang[7]. Kewujudan silia primer semasa nefrogenesis dan bilangan besar perkembanganbuah pinggangkecacatan yang berlaku pada pesakit dengan penyakit silia menunjukkan bahawa fungsi silia primer yang tulen diperlukan untuk normalbuah pinggangorganogenesis [8,9]. Cilium primer adalah organel berasaskan mikrotubulus yang penting untuk homeostasis tisu, di mana -tubulin adalah komponen asas [10]. Kehilangan asetilasi -tubulin dalam sel yang diabadikan mencetuskan peralihan epitelium-ke-mesenchymal (EMT), sekali gus membayangkan bahawa -tubulin asetilasi adalah penting dalam penstabilan mikrotubulus [11]. Semasa pembangunan manusia, laluan Wnt yang dimediasi silia utama membolehkan percambahan sel, pembezaan dan morfogenesis tisu [12]. Sebilangan besar kanak-kanak yang mengalami gangguan fungsi silia primer dan laluan isyarat Wnt yang terganggu mengembangkan CKD, di mana kongenitalbuah pingganggangguan bertanggungjawab untuk hampir separuh daripada kes [13]. Penyakit sista kongenital yang paling biasa pada kanak-kanak ialah displastik multicysticpenyakit buah pinggang(MCDK) [14]. Pelbagai sista yang tidak berkomunikasi [15] dan kurang normalbuah pinggangparenkim adalah penemuan mikroskopik ciri untuk MCDK. Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) adalah salah satu penyakit glomerular yang paling biasa yang membawa kepada peringkat akhir.penyakit buah pinggang[16]. Pada mulanya, FSGS adalah ciri fokus, hanya melibatkan minoriti glomeruli dan segmental, melibatkan perubahan hanya dalam segmen bulatan glomerular [17]. Sindrom nefrotik kongenital jenis Finland (CNF) ialah autosomal yang jarang diwarisi secara resesifpenyakit buah pinggangdiwakili oleh wabak pranatal kehilangan protein yang meluas [18], yang dikaitkan dengan sisogenesis tubul proksimal [19]. Banyak bentuk penyakit glomerular primer membina proteinuria akibat daripada halangan penapisan glomerular yang rosak [20]. Sebilangan besar kajian menunjukkan bahawa kecederaan dan disfungsi podosit mempunyai peranan intrinsik dalam patogenesis proteinuria CKD [21]. Kajian oleh Vukojevic et al. menunjukkan peningkatan bilangan podosit bersilia dan tidak dibezakan dalam CNF [22]. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa laluan isyarat Wnt/ -catenin mempunyai peranan asas dalam menyederhanakan disfungsi podosit dengan proteinuria [23]. Terdapat dua laluan isyarat Wnt utama, satu dikenali sebagai kanonikal -catenin-bergantung dan lain bukan kanonikal, -katenin bebas. Semasa tetikusbuah pinggangperkembangan, isyarat Wnt kanonik aktif pada hujung tunas ureter dan dalam badan berbentuk S [24]. Tambahan pula, Wnt melalui isyarat kanonik mempunyai kaitan dalam mengekalkan MET semasa nefrogenesis [25]. Iaitu, pengikatan kompleks protein yang mengandungi Dvl ke reseptor membran adalah wajib untuk pengaktifan laluan Wnt, manakala melumpuhkan komponen utama laluan ini mengakibatkan kematian perinatal awal disebabkan ketiadaan zon nefrogenik dalambuah pinggang[25].
Protein yang penting sebagai suis molekul antara laluan isyarat Wnt kanonik dan bukan kanonikal didapati sebagai penyongsangan [26]. Walaupun interaksi pelbagai protein dengan penyongsangan telah dikesan, fungsi tepatnya masih belum dijelaskan sepenuhnya. Di dalambuah pinggangsel epitelium, penyongsangan terletak di silia primer, bertindak sebagai protein silia [27]. Di samping itu, penyongsangan membentuk kompleks mantap dengan tubulin dalam budayabuah pinggangsel, dan mereka berkolokalisasi dalam vivo [27,28]. Penyongsangan nampaknya memainkan peranan penting dalam morfogenesis awal sistem pronephric dan penentuan simetri kiri-kanan semasa pembangunan [29,30]. Peristiwa penting untuk kedua-dua laluan isyarat Wnt kanonik dan bukan kanonikal dalam pengambilan Dvl sitoplasma ke membran sel. Oleh kerana penemuan sebelumnya menunjukkan bahawa penyongsangan dan Dvl berkolokalisasi dalam sel epitelium buah pinggang, boleh dibuat spekulasi bahawa penyongsangan mungkin juga mempunyai peranan dalam isyarat bukan kanonikal. Disregulasi isyarat Wnt yang dimediasi oleh penyongsangan mencetuskan percambahan menyimpang dalam tubul [31]. Ujian genetik mendedahkan mutasi DVL-1 pada pesakit dengan sindrom Robinow yang dominan autosomal, menunjukkan gangguan heterogen pada sesetengah pesakit yang dikaitkan dengan urogenital danbuah pingganganomali [32].
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI DIALISIS BUAH PINGGANG/PINGGUL
Corak ekspresi perkembangan -tubulin, penyongsangan dan DVL-1 telah disiasat dalam model haiwan yang berbeza. Oleh itu, ekspresi mereka dalam pronephros Xenopus laevis telah disahkan dengan menggunakan mikroskop intravital [31], manakala mereka ditemui dalam garisan sel yang diperoleh daripada sel tubular proksimal murine dengan menggunakan mikroskop confocal dan spektrometri jisim [33]. Di samping itu, mikroskop cahaya dan imunofluoresensi berganda mendedahkan kehadiran mereka dalam bahagian tikusbuah pinggang[34]. Kajian ke atas tikus kalah mati penyongsangan melaporkan sista yang membesar dan meresap dalambuah pinggangmedula dan korteks yang dikaitkan dengan penyongsangan viseral tapak [35]. Pada manusia, mutasi penyongsangan dibentangkan dengan nephronophthisis bayi yang membawa kepada penamatan kehamilan [36]. Walaupun banyak kajian mengenaibuah pinggang-tubulin, penyongsangan dan corak dan fungsi ekspresi DVL-1, sepanjang pengetahuan kami, corak ekspresi protein ini dalam tisu manusia janin dan selepas bersalin manusia belum lagi disiasat dan membawa kepada korelasi. Selain itu, belum ada bukti yang dilaporkan mempertimbangkan ungkapan penyongsangan dan DVL-1 dalam pembangunan manusia awal. Oleh itu, kajian ini bertujuan untuk menganalisis corak ekspresi spatial dan temporal -tubulin, penyongsangan dan DVL-1 semasa peringkat janin dan selepas bersalin bagi manusia yang sihat.buah pinggang, serta dalambuah pinggangtisu MCDK, FSGS dan CNFbuah pingganguntuk mewujudkan kemungkinan pautan yang hilang antara entiti ini. Iaitu, kami mencadangkan bahawa corak ekspresi terganggu protein -tubulin, penyongsangan dan DVL-1 mungkin merupakan proses cystogenesis yang mendasari dan fungsi abnormal silia primer yang membawa kepada kronik.penyakit buah pinggang.
Keputusan
Analisis perkembangan dan selepas bersalinbuah pinggangtisu dilakukan pada struktur yang dibezakan dengan jelasbuah pinggang:tubul berbelit proksimal (pct), tubul berbelit distal (dct) dan glomeruli (g). Semasa peringkat perkembangan yang dianalisis dan dalam postnatalbuah pinggangtisu, -tubulin, penyongsangan dan DVL-1 menunjukkan corak ekspresi positif tetapi dengan perbezaan dalam keamatan, pengedaran dan kuantiti. Analisis patologitisu buah pinggangMCDK, FSGS dan CNF dilakukan pada kiraan imej penuh sel positif berbanding kawalan tisu buah pinggang yang sihat.
2.1. Mikroskopi Cahaya, Mikroskopi Elektron dan Imunohistokimia ( -Tubulin) Tisu Buah Pinggang Manusia Selepas Bersalin yang Sihat dan Berubah Secara Patologi
2.1.1. Cahaya Buah Pinggang Selepas Bersalin yang Sihat
mikroskop selepas bersalinbuah pinggangtisu menunjukkan jelasbuah pinggangstruktur, dengan perbezaan yang berbeza antara medula dan korteks dan pembentukan pct, dct, dan g di kawasan kortikal. Pewarnaan imunohistokimia -tubulin mendedahkan kehadiran satu cilium primer di tengah-tengah permukaan sel apikal setiap sel tiub dan dalam 0.018 peratus ± 0.00014 peratus SD pada permukaan sel glomerular. Mikroskopi elektron menunjukkan kehadiran hanya satu cilium primer yang timbul daripada badan basal pada permukaan sel apikal tubul (Rajah 1a).
2.1.2. CNF
Kebanyakan g yang dianalisis adalah lebih kecil dan berlobulasi (80 peratus ), manakala minoriti bersaiz normal atau hipertrofik (20 peratus , n=100). Sklerosis segmen atau global g ditemui, manakala pct dan dct sebahagiannya diluaskan dan disalut dengan epitelium atropik. Secara ultrastruktur, kehilangan mikrovili dan penurunan ketinggian sel dengan multifragmentasi nukleus diperhatikan. Dalam podosit, proses kaki hilang secara meresap. Silia primer tiub tidak teratur, terutamanya dalam sista tubulus proksimal, menunjukkan perubahan panjang dan kedudukan sitoplasma (Rajah 1b).
2.1.3. MCDK
Dalam tisu buah pinggang, g tidak matang dan matang sporadis boleh didapati.buah pinggangtisu dipenuhi dengan banyak sista bujur. Sel epitelium kolumnar menutupi sista dan dikelilingi oleh tisu penghubung yang longgar. Pewarnaan imunohistokimia kepada -tubulin menunjukkan berbilang silia primer yang panjang dan tidak teratur pada permukaan sel epitelium (Rajah 1c).
2.1.4. FSGS
Dalam 90 peratus g, sklerosis segmental meluas ditemui (n=100), dikaitkan dengan fibrosis interstisial dan tanda-tanda kerosakan tiub. Penurunan ketinggian sel epitelium dengan kehilangan mikrovili didapati dalam mikroskop elektron, manakala sel endothelial dan kawasan mesangial mempunyai ultrastruktur biasa. Dalam mikroskop elektron, cilium yang sangat panjang dan terkehel (terdesentralisasi) diperhatikan pada permukaan sel tiub distal (Rajah 1e). Podosit menunjukkan kehilangan meresap proses kaki dengan tisu mikrovillus yang luas. Pewarnaan imunohistokimia kepada a-tubulin menunjukkan berbilang silia primer yang panjang dan tidak teratur pada permukaan sel epitelium (Rajah 1c).
2.2. Pewarnaan Imunohistokimia kepada 心Tubulin, Penyongsangan dan DVL-1- dan Analisis Statistik Membangun dan Sihat Buah Pinggang Manusia Selepas Bersalin
Pada minggu kehamilan ke-14, ke-15 dan ke-16,buah pinggangtisu dibentangkan dengan peringkat perkembangan pembentukan nefron yang berbeza: dari cawan metanephric,buah pinggangvesikel berperingkat untuk memerintah nefron berbentuk S, dengan itu membentuk zon nefrogenik dalam korteks luar (Rajah 2). Membezakan pct, dct dan g boleh diperhatikan di kawasan kortikal yang lebih dekat denganbuah pinggangmedula. Semasa GW ke-22, bahagian medula dan korteks menjadi jelas tersendiri, manakala pada GW ke-38,buah pinggangstruktur kelihatan sangat berbeza, mengandungi bentuk matang pct, dct dan g
2.2.1. a-Tubulin
Semasa pembangunan, a-tubulin dinyatakan dengan kuat dalam semua pembangunanbuah pinggangstruktur, terutamanya menggambarkan bentuk silia primer pada permukaan sel epitelium parietal kapsul Bowman, g, pct dan dct. dalambuah pinggangtisu, 82-97 peratus sel pct mengekspresikan a-tubulin, manakala dalam ekspresi dct menurun daripada 99 peratus kepada 72 peratus dalam GW ke-38 (lihat Rajah 3, Jadual 1). Di antara peringkat perkembangan yang berbeza, ungkapan terkuat a-tubulin ditemui dalam g GW ke-16buah pinggang, mengandungi 93 peratus sel positif. GW ke-14, ke-15 dan ke-22 (lihat Rajah 3a,b, Jadual 1), sekitar 70 peratus daripada sel g mengekspresikan a-tubulin, manakala ungkapan paling sedikit diperhatikan dalam GW ke-38 (p < 0.01)="" dengan="" 34="" peratus="" daripada="" sel="" positif="" (rajah="" 3c).="" dalam="">buah pinggangtisu (1.5-tahun dan 7-tahunbuah pinggang), imunoreaktiviti terkuat kepada a-tubulin diperhatikan pada permukaan sel apikal pct dan dct (Rajah 3d-f). Ekspresi a-tubulin juga terdapat dalam sitoplasma perinuklear dct dan sel epitelium parietal kapsul Bowman. a-tubulin mengotorkan semuabuah pinggangstruktur dengan min 50 peratus sel positif dalam pct, 94 peratus dalam dct dan 85 peratus dalam g (Rajah 3f). Pewarnaan Dct berbeza dengan ketara daripada pct (p < 0.0001).="" semua="" struktur="" yang="" disiasat="" berwarna="" positif="" kepada="" a-tubulin,="" dengan="" 77="" peratus="" sel="" positif="" dalam="" pct,="" 72="" peratus="" dalam="" dct="" dan="" 58="" peratus="" dalam="" g="">
Rajah 3. Pewarnaan imunofluoresensi -tubulin dan DAPI dalam tisu buah pinggang manusia yang sedang berkembang dan selepas bersalin (a–e). Buah pinggang ke-14, ke-15/16, ke-38 GW (a–c);buah pinggangdaripada 1.5- dan 7-kanak-kanak berumur (d,e). Pewarnaan positif -tubulin (anak panah) ditunjukkan dalam setiap struktur dalam korteks melalui fasa perkembangan dan postnatal (a-e), tubul berbelit proksimal (pct), tubul berbelit distal (dct) dan glomeruli (g). Butiran silia primer dalam pct (d) dan dct (a–c, e) ditunjukkan sebagai inset pembesaran yang lebih tinggi (kotak putih). Pembesaran ×40, bar skala 100 µm. Taburan sel-sel positif -Tubulin setiap struktur sepanjang peringkat perkembangan yang berbeza dan dalam tempoh selepas bersalin ditunjukkan dalam graf (f). Graf (g) (jumlah keseluruhan sel protein-positif dalam struktur yang diperhatikan) menunjukkan ekspresi protein yang berkaitan dengan masa perkembangan (regresi Linear) dan saling hubungan -Tubulin kepada DVL-1 melalui pembangunan dan kematangan (ANOVA Dua Hala diikuti dengan ujian posthoc SIDAK). Data ditunjukkan sebagai min ± SD.
Taburan sel -tubulin-positif setiap struktur sepanjang peringkat perkembangan yang berbeza dan dalam tempoh selepas bersalin ditunjukkan dalam graf (f). Graf (g) (jumlah keseluruhan sel protein-positif dalam struktur yang diperhatikan) menunjukkan ekspresi protein yang berkaitan dengan masa perkembangan (regresi linear) dan saling kaitan -tubulin dengan DVL-1 melalui pembangunan dan kematangan (ANOVA dua hala diikuti dengan ujian post hoc Sidak). Data ditunjukkan sebagai min ± SD.
2.2.2. Pewarnaan Imunoflluoresensi Berganda kepada Penyongsangan dan DVL-1 dan Pewarnaan Nuklear DAPI dalam Membangun dan Menyihatkan Ungkapan Penyongsangan Buah Pinggang Selepas Bersalin dalam Membangunkan dan Tisu Buah Pinggang Selepas Bersalin
Dalam GW ke-14, ke-15 dan ke-16, penyongsangan menunjukkan ekspresi berbutir yang kuat dalam g, dan ungkapan berbutir ringan dalam sitoplasma pct dan dct (Rajah 4a, b), manakala dalam GW ke-22 dan ke-38 (lihat Rajah 4c), sangat kuat. ungkapan positif diperhatikan dalam g (Jadual 1). Antara GW ke-14 dan ke-22, kira-kira 50 peratus daripada versi ekspres sel. Dalam GW ke-16, sel pct menyatakan penyongsangan dalam 73 peratus sel, sambil menurun kepada 29 peratus sel (p <0.05) dalam="" gw="" ke-38="" (lihat="" rajah="" 4f).="" ekspresi="" penyongsangan="" positif="" didapati="" dalam="" kira-kira="" 80-90="" peratus="" daripada="" sel="" dct="" dan="" g="" dalam="">buah pinggangtisu GW ke-14 dan ke-16, dengan ungkapan terendah dalam dct sebanyak GW ke-38 (p < 0.05,="" p="">< 0.0001,="" masing-masing)="" di="" mana="" 66="" peratus="" sel="" adalah="" positif.="" dalam="">buah pinggang, pct mengotorkan dengan kuat pada membran sel apikal, manakala dct mengotorkan kebanyakannya pada membran sel basal dan dalam sitoplasma perinuklear (Rajah 4d, e). Pada peringkat itu, kami mendapati ekspresi penyongsangan dalam semua yang disiasatbuah pinggangstruktur, termasuk pct, dct dan g, dengan ungkapan min sel positif sebanyak 92 peratus untuk pct, 88 peratus untuk dct dan 90 peratus untuk g (Rajah 4f). Kami tidak melihat perbezaan yang ketara dalam kekuatan isyarat ekspresi penyongsangan antara struktur. Ungkapan penyongsangan tertinggi terdapat dalam g, dengan min 94 peratus sel positif (Rajah 4f). Perbezaan ketara didapati membandingkan pewarnaan g (di mana 94 peratus sel mengotorkan secara positif) kepada pct, di mana 58 peratus sel mengotorkan secara positif (p < 0.01)="" dan="" dct,="" di="" mana="" 49="" peratus="" sel="" adalah="" positif="" (p="">< 0.0001,="" rajah="">
Ekspresi DVL-1 dalam Membangun dan Tisu Buah Pinggang Selepas Bersalin
Ekspresi ringan hingga kuat DVL{{0}} diperhatikan dalam sitoplasma pct, dct dan g dalam tempoh janin (lihat Rajah 4a–c, Jadual 1). Dalam pct, 76–86 peratus daripada sel menyatakan DVL-1 dalam GW ke-14–22, manakala dalam GW ke-38, terdapat 57 peratus sel positif (Rajah 4g). Dalam dct GW ke-14 dan ke-15, 68–7{31}} peratus daripada sel menyatakan DVL-1, dalam GW ke-16 dan ke-22, bilangan sel positif menurun kepada 42–5{{41} } peratus , manakala dalam ungkapan GW ke-38 (p <0.001), diperhatikan="" dalam="" 19="" peratus="" sel="" dct.="" ungkapan="" dvl-1="" meningkat="" dalam="" g="" sepanjang="" peringkat="" janin:="" pada="" gw="" ke-14,="" ia="" adalah="" 6="" peratus="" ,="" manakala="" pada="" gw="" ke-15,="" ke-16="" dan="" ke-22,="" ia="" meningkat="" kepada="" 10="" peratus="" (p="">< 0.01).="" dalam="" 38="" gw,="" 14="" peratus="" daripada="" sel="" g="" menyatakan="" dvl-1="" (rajah="" 4="" g).="" dalam="" tempoh="" selepas="" bersalin,="" imunoreaktiviti="" dvl{37}}="" tersebar="" dalam="" sitoplasma="" (jadual="" 1)="" kedua-dua="" pct="" dan="" dct="" (rajah="" 4d,e).="" isyarat="" ditemui="" dalam="" semua="" struktur="" yang="" disiasat="" tetapi="" kebanyakannya="" dalam="" sitoplasma="" perinuklear.="" keamatan="" ungkapan="" dvl-1="" adalah="" jauh="" lebih="" tinggi="" dalam="" pct="" berbanding="" dct="" dan="" g="" (p="">< 0.01).="" 39–45="" peratus="" daripada="" sel="" dalam="" pct="" dan="" dct="" menyatakan="" dvl-1,="" manakala="" dalam="" g,="" 21="" peratus="" daripada="" sel="" adalah="" positif="" (rajah="" 4="" g).="" kami="" tidak="" menemui="" perbezaan="" yang="" ketara="" antara="" peratusan="" sel="" imunoreaktif="" dalam="">buah pinggangstruktur. Peratusan sel imunoreaktif DVL-1 ialah 34 peratus dalam pct, 36 peratus dalam dct dan 27 peratus dalam g, masing-masing (Rajah 4g).
Rajah 4. Pewarnaan imunofluoresensi dua kali penyongsangan (hijau), DVL-1 (merah) dan DAPI (biru) dalam tisu buah pinggang yang sedang berkembang dan selepas bersalin (GW ke-14–38, 1.5- dan {{6 }} tisu buah pinggang berumur setahun). Pewarnaan positif (anak panah) ditunjukkan dalam setiap struktur sepanjang semua fasa perkembangan (a–c) dan tempoh selepas bersalin (d, e). Mikrofon yang digabungkan bersama-sama dengan struktur yang menarik dalam korteks: tubul berbelit proksimal (pct), tubul berbelit distal (dct) dan glomeruli (g). Kolokalisasi penyongsangan/DVL-1 (kepala anak panah) ditunjukkan dalam mikrofotograf bercantum. Pewarnaan kawalan negatif ditunjukkan sebagai inset pada penyongsangan dan DVL-1 (a). Eritrosit boleh dilihat sebagai sel bernoda kuat berhampiran dct. Butiran ditunjukkan sebagai inset pembesaran yang lebih tinggi. Pembesaran ×40, bar skala 100 µm. Taburan sel positif dinamik penyongsangan dan DVL-1 dalam struktur buah pinggang (pct, dct, g) sepanjang peringkat pembangunan dan selepas bersalin ditunjukkan dalam graf (f,g). Graf (h) menunjukkan ekspresi protein (jumlah keseluruhan sel positif dalam struktur) yang berkaitan dengan masa perkembangan (regresi linear) dan perkaitan penyongsangan kepada DVL-1 melalui pembangunan dan kematangan (ANOVA dua hala diikuti dengan ujian post hoc Sidak ). Data ditunjukkan sebagai min ± SD.
Ungkapan bersama penyongsangan dan DVL-1 diperhatikan dalam sitoplasma buah pinggang g, dct dan pct semasa pembangunan (lihat Rajah 4a–c, penggabungan). Dalam tempoh selepas bersalin, ekspresi bersama penyongsangan dan DVL-1 mencirikan petak selular sel tiub yang berbeza dalam pct dan dct, manakala ekspresi bersama dalam g dicirikan oleh kelaziman ungkapan penyongsangan yang kuat (lihat Rajah 4d, gabungan ). Dalam 7-tahun buah pinggang selepas bersalin, ekspresi bersama penyongsangan dan DVL-1 dilihat dalam sel tiub dct dan pct, dan dalam g di mana ungkapan penyongsangan berlaku sedikit berbanding DVL-1 (Rajah 4e, cantumkan).
2.2.3. Perbezaan dalam Ungkapan -Tubulin, Inversi dan DVL-1 antara Peringkat Buah Pinggang Perkembangan Berbeza dan Buah Pinggang Selepas Bersalin
Bilangan sel -tubulin-positif dalam peratusan tisu buah pinggang janin secara statistik adalah lebih tinggi secara statistik berbanding dengan 7-tisu buah pinggang kanak-kanak berumur (ke-13 (p < 0.0{="" {11}}1),="" ke-15="" (p="">< 0.0001)="" dan="" ke-16="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" peringkat="" awal="" janin="" (gw="" ke-13,="" ke-15,="" ke-16="" dan="" ke-22)="" mempunyai="" lebih="" banyak="" sel="" positif="" berbanding="" dengan="" gw="" ke-38="" dan="" tisu="" buah="" pinggang="" kanak-kanak="" berumur="" 1.5-tahun="" (masing-masing="" p="">< 0.0001,="" rajah="" 3f).="" apabila="" peringkat="" perkembangan="" yang="" berbeza="" dibandingkan,="" kami="" mendapati="" tahap="" ekspresi="" penyongsangan="" yang="" lebih="" rendah="" dalam="" peratusan="" ke-13="" (p=""><0.0001), ke-15="" (p=""><0.00001), ke-22="" (p=""><0.001) dan="" ke-38="" (p=""><0.0001) gw="" berbanding="" dengan="">buah pinggangtisu daripada kanak-kanak berumur 1.5-tahun. Dalam dct, ungkapan penyongsangan yang lebih rendah secara statistik didapati membandingkan GW ke-16 dengan tisu buah pinggang GW ke-38 (p < 0.0001).="" tambahan="" pula,="" ungkapan="" penyongsangan="" yang="" lebih="" rendah="" dalam="" dct="" diperhatikan="" dalam="" tisu="" buah="" pinggang="" kanak-kanak="" berumur="" 7-tahun;="" membandingkan="" ke-13,="" ke-15="" (p="">< 0.001,="" kedua-duanya),="" ke-16="" dan="" ke-1.5-tisu="" buah="" pinggang="" berumur="" tahun="" dengan="" dct="" tisu="" buah="" pinggang="" berusia="" 7-tahun="" (masing-masing="" p="">< 0.00001,="" rajah="" 4f).="" isyarat="" yang="" diperhatikan="" bagi="" ekspresi="" dvl-1="" melalui="" peringkat="" yang="" berbeza="" mendedahkan="" bahawa="" peratusan="" daripada="" ke-13="" (p="">< 0.01),="" ke-15,="" ke-16="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">
2.2.4. Hubungan antara Ungkapan -Tubulin dan Penyongsangan kepada DVL-1 dalam Tisu Buah Pinggang Membangun dan Selepas Bersalin
-Ekspresi tubulin dan penyongsangan dibandingkan dengan ekspresi DVL-1 sepanjang peringkat perkembangan dan dalam tisu buah pinggang selepas bersalin. -tubulin mempunyai ekspresi statistik yang lebih tinggi dalam semua peringkat yang diperhatikan, berbanding dengan ungkapan DVL-1 (p < 0.001,="" rajah="" 3g).="" melalui="" semua="" peringkat="" yang="" diperhatikan,="" penyongsangan="" mempunyai="" ekspresi="" yang="" lebih="" tinggi="" jika="" dibandingkan="" dengan="" dvl-1="" (p="">< 0.0001,="" rajah="" 4="">
2.2.5. Perbandingan Pewarnaan Imunohistokimia kepada -Tubulin, versi dan DVL-1- dan Analisis Statistik Tisu Buah Pinggang Berubah Secara Patologi (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulin Perbezaan pewarnaan -tubulin dalam MCDK, FSGS dan CNF adalah signifikan secara statistik berbanding kepada tisu buah pinggang selepas bersalin yang sihat sebagai kumpulan kawalan (p < 0.0001,="" masing-masing).="" tisu="" buah="" pinggang="" displastik="" mempunyai="" ekspresi="" yang="" jauh="" lebih="" tinggi="" berbanding="" kumpulan="" kawalan,="" manakala="" fsgs="" dan="" cnf="" menunjukkan="" ekspresi="" -tubulin="" yang="" jauh="" lebih="" rendah="" jika="" dibandingkan="" dengan="" kawalan="" sihat="" (rajah="">
Penyongsangan
Penyongsangan dinyatakan dalam sitoplasma sel epitelium yang tidak teratur dan tubul MCDK (Rajah 5a). Dalam CNF, ungkapan penyongsangan mencirikan g dan dct, sementara ia menunjukkan kurang intensif dalam sista pct (Rajah 5b). Dalam FSGS, penyongsangan dinyatakan dengan kuat dalam g dan dct tetapi kurang intensif dalam sista pct (Rajah 5c). Ungkapan spatial penyongsangan menunjukkan kadar pewarnaan yang lebih tinggi secara statistik dalam tisu buah pinggang yang sihat (Rajah 5g) jika dibandingkan dengan MCDK, FSGS dan CNF (masing-masing p <>
Rajah 5. Pewarnaan imunofluoresensi berganda bagi penyongsangan (hijau), DVL-1 (merah) dan DAPI (biru) dalam tisu buah pinggang patologi dalam MCDK (a), CNF (b) dan FSGS (c): tubul (t) , glomeruli (g), pct cyst (c), ketinggian pct sel epitelium (*). Struktur dan penyetempatan bersama sel penyongsangan dan DVL-1 (anak panah) ditunjukkan dalam bahagian bercantum dengan butiran dalam inset pembesaran yang lebih tinggi. Pewarnaan kawalan negatif ditunjukkan sebagai inset pada penyongsangan dan DVL-1 (a). Pembesaran ×40, bar skala 10{{20}} µm. Hubungan -tubulin (d) dan penyongsangan (e) kepada ekspresi DVL-1 dalam MCDK, FSGS dan CNF (ANOVA dua hala diikuti dengan ujian post hoc SIDAK). Perbezaan ketinggian sel epitelium (f) FSGS, CNF dan MCDK pct berbanding kawalan sihat (ANOVA sehala diikuti ujian post hoc Tukey, n=50). Perbezaan peratusan sel positif keseluruhan -tubulin, penyongsangan dan DVL-1 dalam MCDK, CNF dan FSGS jika dibandingkan dengan kawalan sihat (g–i), ANOVA sehala diikuti dengan ujian post hoc Tukey). Data ditunjukkan sebagai min ± SD. Perbezaan yang ketara ditunjukkan oleh nilai-p (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ****="" p="">< 0.0001).="" dvl-1="" dvl-1="" dinyatakan="" dengan="" sangat="" lembut="" hanya="" dalam="" tubul="" mcdk="" yang="" tidak="" teratur,="" manakala="" dalam="" cnf,="" ungkapannya="" mencirikan="" dct="" dan="" g="" (rajah="" 5a,b).="" dalam="" fsgs,="" dvl-1="" diperhatikan="" sebagai="" kereaktifan="" ringan="" dalam="" g,="" dct="" dan="" pct="" (rajah="" 5c).="" tisu="" buah="" pinggang="" yang="" sihat="" yang="" diwarnakan="" kepada="" dvl-1="" menunjukkan="" kadar="" pewarnaan="" yang="" jauh="" lebih="" tinggi="" (rajah="" 5="" h)="" berbeza="" dengan="" mcdk="" dan="" kepada="" fsgs="" (p="">< 0.0001,="" kedua-duanya),="" manakala="" tiada="" perbezaan="" ketara="" ditemui="" untuk="">
2.2.6. Hubungan antara Ungkapan -Tubulin dan Penyongsangan kepada DVL-1 dalam Tisu Buah Pinggang Berubah Secara Patologi (MCDK, CNF, FSGS)Dalam MCDK, FSGS dan CNF, -tubulin diwarnakan dengan ketara lebih tinggi daripada DVL-1 (p < 0.0001,="" masing-masing,="" rajah="" 5d).="" penyongsangan="" diwarnakan="" dengan="" ketara="" lebih="" tinggi="" jika="" dibandingkan="" dengan="" dvl-1="" dalam="" mdck="" (p="">< 0.0001)="" dan="" dalam="" fsgs="" (p="">< 0.01,="" rajah="">
2.2.7. Perbezaan Ketinggian Sel Epitelium Tubul Berbelit Proksimal antara Kawalan Sihat dan Tisu Buah Pinggang Berubah Secara Patologi (MCDK, CNF, FSGS)Ketinggian pct sel epitelium (n {{0}} setiap kumpulan) dibandingkan antara sel tubul dalam tisu buah pinggang yang sihat dan tisu buah pinggang yang berubah secara patologi (Rajah 5b,c,f). Purata ketinggian sel epitelium dalam HC ialah 12.91 µm ± 1.847 µm dan jauh lebih tinggi jika dibandingkan dengan CNF dan FSGS (masing-masing p < 0.0001).="" purata="" ketinggian="" sel="" dalam="" peratusan="" cnf="" ialah="" 9.011="" µm="" ±="" 1.453="" µm,="" manakala="" dalam="" fsgs="" ialah="" 8.114="" µm="" ±="" 0.9248="" µm.="" sel="" epitelium="" pct="" mcdk="" tidak="" menunjukkan="" perubahan="" ketara="" dalam="" ketinggian="" (12.17="" µm="" ±="" 1.476="" µm)="" jika="" dibandingkan="" dengan="">
2.2.8. Perbezaan Panjang Silia Utama Antara Kawalan Sihat dan Tisu Buah Pinggang Berubah Secara Patologi (MCDK, CNF, FSGS)
Panjang cilium primer (n= 50 setiap kumpulan) dibandingkan antara HC dan tisu buah pinggang yang berubah secara patologi (Rajah 6c). Tisu buah pinggang yang sihat dan MCDK telah diwarnai dengan -tubulin untuk memastikan kekhususan pewarnaan -tubulin cilium (Rajah 6a, b). Dalam tisu buah pinggang yang sihat, cilium primer adalah 5.065 µm ± 1.229 µm panjang, manakala dalam MCDK, CNF dan FSGS adalah lebih lama (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>
Perbincangan
Matlamat kajian kami adalah untuk menyiasat ekspresi imunohistokimia a-tubulin, penyongsangan dan DVL-1 dalam janinbuah pinggangtisu dan tisu buah pinggang selepas bersalin. Tambahan pula, kami ingin meneroka sama ada ekspresi dan corak pewarnaan a-tubulin, penyongsangan dan DVL-1 terganggu dalam penyakit buah pinggang yang berbeza jika dibandingkan dengan kawalan sihat. Iaitu, walaupun terdapat minat yang meluas penyelidik lain mengenai peranan a-tubulin, penyongsangan dan DVL-1 semasa pembangunan buah pinggang, kebanyakan kajian terdahulu telah menggunakan haiwan atau model eksperimen in vitro. Setakat yang kami sedia maklum, ini adalah kajian pertama yang telah menunjukkan ekspresi dan penyetempatan a-tubulin bersama-sama penyongsangan dan DVL-1 dalam buah pinggang manusia janin dan selepas bersalin, dan yang telah meneroka ekspresi protein yang disebut dalam buah pinggang penyakit, seperti MCDK, FSGS dan CNF. Kami juga menganalisis perubahan dalam panjang silia dan penampilan oleh mikroskop cahaya dan elektron, kerana kajian terdahulu kami telah menunjukkan bahawa gangguan ciliary mungkin dikaitkan dengan cystogenesis dalam FSGF dan CNF [19].
Dalam laluan isyarat Wnt kanonik, pengikatan ligan Wnt kepada reseptor merekrut Dvl [37]. Proses MET dan laluan polariti sel planar semasa peringkat awal morfogenesis buah pinggang dikawal oleh isyarat Wnt. Dengan pengantaraan laluan Wnt, silia utama mengawal percambahan sel, pembezaan dan morfogenesis tisu [12] melalui penyusunan sitoskeleton sel dan orientasi sel serta pemanjangan struktur tiub [2,38]. Dalam kajian kami, -tubulin, penyongsangan dan DVL-1 semuanya terdapat dalam struktur buah pinggang, dan semuanya dikolokalisasikan bukan sahaja semasa perkembangan buah pinggang janin tetapi juga dalam tisu buah pinggang dari 1.5- dan {{9 }}kanak-kanak berumur tahun. Penemuan ini adalah selaras dengan pengaktifan laluan isyarat Wnt yang terbukti telah berlaku semasa tubulogenesis [39]. Selain itu, keputusan kami telah mendedahkan bahawa ungkapan -tubulin dan penyongsangan adalah berkaitan secara timbal balik dengan DVL-1 dan bahawa ia menunjukkan perbezaan yang signifikan secara statistik antara corak ungkapan mereka. Itu adalah dalam kaitan dengan model eksperimen, kerana mutasi keluarga protein Dvl penuh pada tikus mengakibatkan kekurangan proses gastrulasi, manakala mutasi yang tidak termasuk keseluruhan keluarga protein menunjukkan kecacatan dalam penempatan silia nod bersama-sama dengan kecacatan organ [40] . Penemuan sebelumnya mencadangkan bahawa penyongsangan mempunyai peranan dalam penghijrahan sel dalam Xenopus pronephros. Oleh kerana segmen itu berkorelasi dengan gelung mamalia Henle dan tubulus distal, ini boleh menunjukkan kepentingan penyongsangan semasa pembangunan buah pinggang pada manusia juga [41]. Selaras dengan premis itu, kajian terdahulu mendedahkan bahawa mutasi gen penyongsangan boleh mengakibatkan nephronophthisis jenis 2, yang dimediasi oleh ekspresi DVL{18}} abnormal [42]. Walaupun peranan cilium primer menjadi kontroversi dalam pengawalseliaan laluan isyarat Wnt, kami mendapati bahawa -tubulin dikolokalisasikan dengan penyongsangan dan DVL-1 dalam sampel buah pinggang yang dianalisis. Tambahan pula, kajian terdahulu menunjukkan bahawa cilium primer bersama-sama dengan penyongsangan mengawal degradasi Dvl dengan mempengaruhi laluan isyarat Wnt [43]. Dalam penyakit buah pinggang manusia yang berkaitan dengan perkembangan sista, penyetempatan yang tidak normal dan fungsi silia primer telah diperhatikan [19]. Begitu juga, kajian ini juga mengesahkan perubahan morfologi pembentukan silia primer dalam keadaan patologi seperti CNF, FSGS dan MCDK. Penemuan sebelumnya mengakui bahawa pengaktifan berlebihan laluan Wnt kanonik berikutan kerosakan buah pinggang membawa kepada perubahan struktur tisu buah pinggang yang tidak dapat dipulihkan [44]. Sebaliknya, silia primer diberi peranan untuk beralih daripada laluan Wnt kanonik kepada bukan kanonikal dalam membantubuah pinggangpembaikan. Tambahan pula, lebihan pengaktifan laluan Wnt kanonik dalam tisu buah pinggang yang dipindahkan didapati mempunyai nilai ramalan yang positif terhadap fibrosis buah pinggang [45]. Jika laluan Wnt kanonik diguna pakai dengan mengorbankan bukan kanonikal, ia menyokong teori fibrosis buah pinggang sebagai hasilnya. Penemuan kami terhadap ekspresi -tubulin dan penyongsangan yang diturunkan dalam CNF dan FSGS membayangkan ketidakaktifan laluan Wnt bukan kanonikal, terutamanya kerana kedua-dua keadaan cenderung membawa kepada peringkat akhirpenyakit buah pinggang.Iaitu, dipercayai bahawa penyetempatan normal dan fungsi silia primer boleh menjadi faktor dalam mengekalkan laluan Wnt biasa dan, oleh itu, prasyarat untuk pembangunan normal. Sebaliknya, jika laluan Wnt dipertingkatkan, ia boleh mengakibatkan percambahan sel yang tidak terkawal dan pembezaan yang membawa kepada karsinogenesis [46]. Seperti yang diterangkan sebelum ini, laluan Wnt kanonik adalah wajib untuk permulaan MET dan pembentukan nefron, manakala gangguannya mungkin menyebabkanbuah pingganghipoplasia [47]. Keputusan kami menyokong idea ini dengan mendedahkan ekspresi terendah DVL-1 dengan ungkapan -tubulin tertinggi dalam MCDK berbanding dengan kawalan sihat. Keputusan ini mungkin membayangkan pengaktifan terendah laluan Wnt kanonik, yang boleh menjadi punca asas untuk ketiadaan pembentukan nefron. Sebaliknya, ungkapan -tubulin tertinggi dengan ungkapan DVL-1 terendah mungkin menjelaskan penemuan berbilang sista kerana tiada pemanjangan dan polarisasi sel yang teratur dipandu oleh laluan Wnt bukan kanonikal. Kajian terdahulu juga menunjukkan bahawa penyongsangan menghalang laluan isyarat Wnt kanonik dengan menyasarkan Dvl untuk degradasi [26]. Langkah dalam interaksi mereka didapati perlu untuk menghalang isyarat Wnt kanonik dalam penyelenggaraan pemanjangan dan kedudukan tiub biasa. Mutasi penyongsangan mengakibatkan penyelarasan isyarat Wnt kanonik, yang kemudiannya mencetuskan percambahan abnormal dalam sel tiub. Langkah ini telah terbukti penting dalam cystogenesis [42], manakala kalah mati penyongsangan pada tikus membawa kepada penyakit buah pinggang polikistik [48]. Mengikut teoribuah pinggangcystogenesis, penyongsangan dianggap sebagai "mycoprotein", kerana penyetempatannya kepada silia primerbuah pinggangsel tiub. Dalam kajian kami, silia primer terdapat pada permukaan sel apikal sel tubular dalam semua peringkat yang dianalisis, manakala semasa peringkat janin, ekspresi -tubulin adalah lebih kuat daripada dalam tempoh selepas bersalin.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI SAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa fungsi silia primer mungkin dipengaruhi oleh disregulasi -tubulin semasa pembangunan, yang boleh membawa kepada cystogenesis, perkembangan buah pinggang yang tidak normal dan kemungkinan penyakit buah pinggang kronik pada zaman kanak-kanak [31,49]. Ini adalah selaras dengan penemuan kami tentang silia primer yang dipendekkan dan dismorfik yang diperhatikan dalam MCDK atau dengan silia berbilang dan sangat memanjang atau terkehel yang terdapat dalam tubul CNF dan FSGS yang diluaskan jika dibandingkan dengan kawalan sihat. Untuk menyokong fakta bahawa laluan isyarat Wnt kanonik dan bukan kanonikal, dikawal oleh silia primer, dianggap wajib untuk perkembangan buah pinggang yang normal, kami mendapati pewarnaan penyongsangan dan DVL yang jauh lebih rendah-1 dalam MCDK jika dibandingkan dengan kawalan sihat [31,49]. Dinamik corak ekspresi yang berbeza bagi -tubulin, penyongsangan dan DVL-1 sepanjang fasa perkembangan buah pinggang yang berbeza mungkin menunjukkan pertukaran antara laluan isyarat Wnt kanonik dan bukan kanonikal semasa morfogenesis buah pinggang normal. Kami mencadangkan bahawa pertukaran mereka menentukan transkripsi dalam laluan kanonik atau susunan penghijrahan sel dan polarisasi semasa pembangunan buah pinggang dalam laluan isyarat bukan kanonikal. Keseimbangan dan ekspresi mereka dalam semua struktur buah pinggang yang disiasat membayangkan peranan penting mereka dalam perkembangan buah pinggang yang normal. Semasa perkembangan buah pinggang normal (dari GW ke-13 hingga GW ke-38), ekspresi keseluruhan -tubulin, penyongsangan dan DVL-1 semakin berkurangan apabila tisu buah pinggang memperoleh morfologi matang. Dalam tisu buah pinggang berusia 1.5- dan 7-tahun, -tubulin dan penyongsangan menunjukkan sedikit peningkatan dalam ekspresi yang menyokong fakta bahawa laluan Wnt bukan kanonikal kekal aktif selepas kelahiran. Sebaliknya, DVL-1 berterusan dengan corak ekspresi yang berkurangan, yang mungkin menambah kesimpulan bahawa laluan Wnt kanonik disenyapkan dalam tisu buah pinggang yang sihat. Akibat keadaan buah pinggang patologi, sel epitelium buah pinggang mungkin bertindak balas dengan kemunculan semula EMT dan fibrosis [50] yang dikaitkan dengan pengaktifan semula laluan Wnt kanonik [44]. Oleh itu, gangguan -tubulin, penyongsangan dan DVL-1 yang ditemui dalam buah pinggang berpenyakit mungkin merupakan mekanisme patologi yang mendasari dan hasil daripada peralihan daripada laluan Wnt bukan kanonik kepada kanonik dalam buah pinggang yang sedang berkembang merujuk kepada pertukaran antara buah pinggang boleh balik kepada tidak boleh balik. kerosakan. Tambahan pula, perubahan dalam pranatal dan postnatal merekabuah pinggangcorak ekspresi mungkin dikaitkan dengan kemerosotan fungsi buah pinggang pada masa dewasa, yang membawa kepada penyakit kongenital dan kegagalan buah pinggang kronik.
4. Bahan dan Kaedah
4.1. Sampel Manusia
Sampel tisu buah pinggang janin dikumpul selepas kehilangan kehamilan pada GW ke-14, ke-15, ke-16, ke-22 dan ke-38 di Jabatan Ginekologi dan Obstetrik Pusat Hospital Universiti Split. Semua bahan janin yang diperoleh telah diperiksa oleh ahli patologi, dan hanya tisu tanpa tanda-tanda keabnormalan, macerations atau kematian intrauterin dan dengan karyogram biasa digunakan untuk kajian. Rekod perubatan ibu telah diperiksa sebelum pengambilan sampel dan sekiranya terdapat masalah kesihatan yang mungkin mempengaruhi hasil kehamilan, tisu buah pinggang dikecualikan daripada kajian. Kematangan ditentukan oleh lilitan kepala, lilitan perut dan panjang femur [51] dalam kaitan dengan kalendar haid pesakit. Spesimen tisu buah pinggang berusia 1.5- dan 7-tahun telah dikumpulkan selepas kematian akibat kemalangan. Sampel telah diperolehi di Jabatan Patologi Pusat Hospital Universiti Split. Sampel tisu buah pinggang displastik multicystic (MCDK) diperoleh selepas kehilangan kehamilan, glomerulosklerosis segmental fokus (FSGS) dan sindrom nefrotik jenis Finland (CNF) diperoleh kerana nefrectomy. Semua bahan yang diperoleh telah diperiksa dan dinilai oleh ahli patologi, yang mengklasifikasikan diagnosis. Protokol kajian telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Universiti Split School of Medicine (20 Mei 2016) menurut Deklarasi Helsinki dan kemas kininya (no. klasifikasi: 003-08/16-03/0001, no pendaftaran: 2181-198-03-04-16-0024, 20 Mei 2016) [52].
4.2. Imunohistokimia
Penetapan sampel tisu yang dikumpul telah diproses dengan 4 peratus paraformaldehid dalam garam penampan fosfat (PBS) selama 24 jam pada suhu 22 ◦C. Selepas dehidrasi dalam 100 peratus etanol, sampel dibenamkan dalam parafin, seperti yang diterangkan sebelum ini [53]. Spesimen dihiris kepada bahagian setebal 5 µm menggunakan mikrotom dan seterusnya dipasang pada slaid mikroskop. Untuk mengesahkan pemeliharaan tisu, setiap bahagian ke-10 diwarnai dengan hematoxylin dan eosin [54]. Depart- feminisasi dan imunohistokimia telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [2,55,56]. Selepas membilas dalam PBS, slaid mikroskop diinkubasi semalaman dengan antibodi utama dalam ruang lembap pada 22 ◦C (Sistem pewarnaan slaid StainTray; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat). Antibodi utama yang digunakan ialah antibodi anti-alfa tubulin monoklonal arnab (pencairan 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, UK), antibodi Anti-penyongsangan Poliklonal Arnab (pencairan 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, UK), DVL monoklonal tetikus -1 antibodi (pencairan 1:150; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) dan antibodi tubulin anti-gamma poliklonal arnab (untuk mengesahkan pewarnaan khusus silia primer dengan alfa- tubulin, pencairan 1:500; ab11321, Abcam, Cambridge, UK). Selepas membilas dalam PBS, antibodi sekunder diberikan selama sejam seperti yang disenaraikan: keldai anti-arnab IgG H&L, Alexa Fluor 488 (pencairan 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, UK) dan kambing anti-tikus IgG H&L, TRITC (pencairan 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, UK) 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) telah digunakan untuk mengotorkan nukleus dan selepas pengeraman 2-min, slaid telah dibasuh dalam PBS dan ditindih dengan medium pelekap dan penutup. Pewarnaan tidak spesifik telah dihalang dengan menggunakan blok protein (ab64226; Abcam, Cambridge, UK) sebelum aplikasi antibodi utama. Sebagai kawalan negatif, ujian pra-penjerapan telah dijalankan, manakala kekhususan antibodi sekunder telah diperiksa dengan menghilangkan antibodi utama daripada prosedur pewarnaan.
4.3. Mikroskopi Elektron
Penetapan daripadabuah pinggangtisu dilakukan dalam 4 peratus paraformaldehid selama 24 jam, diikuti dengan pasca penetapan dalam 1 peratus osmium tetroksida selama 1 jam. Proses dehidrasi dilakukan dengan siri etanol dan diakhiri dengan pemasukan dalam resin LX 112 [22]. Bahagian nipis satu mikrometer telah diwarnakan menggunakan toluidine blue dan dikaji untuk memilih bahagian ultranipis. Bahagian ultranipis dengan ketebalan 0.05 mikrometer telah diperiksa selepas pewarnaan dengan uranil asetat dan plumbum sitrat. Mikroskop JEOL 1200 EX digunakan untuk mendapatkan mikrofotograf.
4.4. Analisis Genetik
Seperti yang diterangkan sebelum ini [19], menggunakan leukosit daripada darah periferi, DNA genomik telah diekstrak. Mutasi missense homozigot dalam gen NPHS1 ditemui (c.1096A > C; p.Ser366Arg) yang mengesahkan diagnosis sindrom nefrotik kongenital jenis Finland (CNF) [57].
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI JANGKITAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
4.5. Analisis data
Analisis bahagian dilakukan pada mikroskop pendarfluor FL menggunakan 3 saluran pendarfluor FL (Olympus BX51, Tokyo, Jepun). Imej ditangkap oleh kamera digital DP71 (Olympus, Tokyo, Jepun) pada pembesaran berkuasa tinggi (×40). Hanya yangbuah pinggangkorteks yang mengandungi tubul berbelit proksimal (pct), tubul berbelit distal (dct) dan glomeruli (g) adalah menarik. Imej kemudiannya diproses oleh perisian ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ (diakses pada 15 Oktober 2018), 1997–2021. ) dan Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, California, Amerika Syarikat) untuk penilaian lanjut. Sebelum pengiraan sel, alat ImageJ saluran split telah digunakan. Selepas itu, foto mikroskopik imunofluoresensi asal telah ditolak dengan saluran merah atau hijau (bergantung pada saluran asal) menggunakan alat ImageJ kalkulator imej untuk mengelakkan kebocoran isyarat. Nilai di bawah tahap ambang 50 dianggap negatif. Kami mengira isyarat imunoreaktif dalam sel sekurang-kurangnya 20 struktur (pct, dct atau g) setiap peringkat atau keseluruhan bilangan sel positif setiap foto mikro displastik multicysticbuah pinggangtisu, FSGS dan CNF. Kami mengklasifikasikan sel sebagai positif jika isyarat imunofluoresensi terkumpul pada mana-mana tahap membran, sitoplasma atau nukleus melebihi nilai 50 diukur pada perisian ImageJ menggunakan arahan ambang. Sel negatif dikategorikan sebagai sel dengan ketiadaan sebarang imunoreaktiviti. Dua penyiasat bebas menganalisis data.
4.6. Analisis Semikuantitatif
Keamatan isyarat pewarnaan -tubulin, penyongsangan dan DVL-1 telah dinilai oleh dua penyelidik bebas menggunakan perisian ImageJ. Keamatan isyarat keseluruhan diukur selepas imej ditetapkan dalam 8-jenis bit; selepas itu, keamatan pewarnaan penanda dinilai dalam 20 pct, dct dan g dengan mengukur kawasan yang digariskan bagi struktur. Jika keputusan antara penilai adalah berbeza, penyelidik bebas ketiga menjelaskan keraguan itu. Keamatan isyarat maksimum untuk -tubulin ialah 84.125 ± 3.214 SD, untuk penyongsangan ialah 71.50 ± 2.715 SD dan untuk DVL-1 80.916 ± 1.875 SD. Ketepuan warna isyarat tertinggi pada gambar mikroskop ditandakan sebagai 3 (66.66–99.99 peratus daripada keseluruhan keamatan imej isyarat), diikuti oleh 2 (33.33–66.66 peratus ) untuk keamatan isyarat pertengahan dan 1 (0.33 peratus –33.33 peratus ) untuk keamatan isyarat yang rendah (Jadual 1.).
4.7. Analisis statistik
Untuk penentuan perbezaan antara peringkat dan struktur, ujian Kruskal–Wallis telah dilakukan, diikuti dengan post hoc Dunn menggunakan perisian GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego California, USA, www.graphpad.com (diakses pada 15 Oktober 2018.)). Bilangan sel positif dinyatakan dalam peratusan sebagai nilai min ± sisihan piawai (SD), manakala kepentingan statistik diakui pada p <0.05. bilangan="" struktur="" yang="" dianalisis="" adalah="" 4200="" dalam="" 35="" sampel,="" dengan="" jumlah="" keseluruhan="" 135,256="" sel="" dikira.="" kami="" menggunakan="" 2-anova="" cara="" dengan="" ujian="" post="" hoc="" sidak="" untuk="" menguji="" perbezaan="" dalam="" ungkapan="" -tubulin,="" penyongsangan="" dan="" dvl-1="" dalam="" peringkat="" perkembangan="" yang="" berbeza.="" untuk="" mengkaji="" ungkapan="" protein="" mengenai="" masa="" perkembangan,="" kami="" menggunakan="" regresi="" linear.="" anova="" sehala="" diikuti="" ujian="" post="" hoc="" tukey="" digunakan="" untuk="" meneroka="" perbezaan="" dalam="" ungkapan="" -tubulin,="" penyongsangan="" dan="" dvl-1="" dalam="">buah pinggangtisu berbanding dengan tisu MCDK, FSGS dan CNF. Perbezaan dalam ekspresi protein antara MCDK, FSGS dan CNF telah disiasat dengan 2-cara ANOVA diikuti dengan ujian post hoc Sidak. ANOVA sehala diikuti dengan ujian post hoc Tukey digunakan untuk menilai perbezaan panjang silia dan ketinggian sel epitelium pct antara kawalan sihat dan patologi.buah pinggangtisu. Data ditunjukkan sebagai nilai min ± sisihan piawai (SD) dengan perbezaan statistik diakui pada p <>
