Diet Secara Ketara Mempengaruhi Imunopatologi Dan Keterukan Kecederaan Buah Pinggang
Feb 22, 2022
Kenalan: emily.li@wecistanche.com
John E. Brus, et al
Abstrak:
'Diet adalah faktor risiko penyebab utama morbiditi dan kematian di seluruh dunia, namun ia jarang dipertimbangkan dalam reka bentuk kajian haiwan praklinikal. Beberapa kekurangan nutrisi yang dilaporkan di Amerika telah terbukti memudaratkanbuah pinggangkesihatan; namun, mekanisme mekanisme yang bertanggungjawab tidak jelas dan sebahagian besarnya dikaitkan dengan perkembangan diabetes atau hipertensi. Di sini, kami menetapkan untuk menentukan sama ada diet mempengaruhi kerentanan kepada kecederaan buah pinggang pada tikus C57Bl/6 jantan. Tikus diberi diet chow standard, diet "Barat" (WD) yang tersedia secara komersial, atau diet Amerika (AD) novel selama 12 minggu sebelum induksibuah pinggangkecederaanmenggunakan model nefropati asid folik (FAN) atau unilateral renal ischemia-reperfusion injury (uIRI). Dalam FAN, tikus yang diberi makan WD dan AD mempunyai bukti histologi yang lebih teruk tentang kecederaan tisu dan ekspresi gen buah pinggang yang lebih besar yang dikaitkan dengan nefrotoksisiti berbanding tikus yang diberi makan chow. Tikus yang diberi makan AD mengembangkan hipertrofi buah pinggang yang lebih teruk berikutan FAN, dan data ekspresi gen mencadangkan mekanisme untuk FAN berbeza antara diet. Sementara itu, tikus yang diberi makan WD mempunyai kepekatan interleukin{1}} yang paling banyak beredar. Dalam uIRI, tiada perbezaan diperhatikan dalam kecederaan tisu buah pinggang antara diet; bagaimanapun, tikus yang diberi makan WD dan AD menunjukkan bukti tindak balas keradangan yang ditindas. Diambil bersama, data kami menyokong hipotesis bahawa diet secara langsung memberi kesan kepada keterukan dan patofisiologibuah pinggangpenyakitdan merupakan pembolehubah eksperimen kritikal yang perlu dipertimbangkan dalam kajian haiwan praklinikal mekanistik.
Kata kunci: diet barat; tetikus; akutbuah pinggangkecederaan; kualiti pemakanan; pemakanan
1. Pengenalan
Gaya hidup adalah penyumbang utama kepada kesejahteraan keseluruhan dan secara signifikan mempengaruhi hasil penyakit kardiovaskular (CVD) tanpa mengira risiko genetik [1]. Diet adalah komponen utama gaya hidup, dan diet yang buruk serta penyakit yang berkaitan dengan diet menyumbang lebih daripada lapan daripada 30 faktor risiko teratas untuk morbiditi dan kematian di seluruh dunia [2]. Walau bagaimanapun, mekanisme yang menggambarkan bagaimana pemakanan yang buruk memberi kesan negatif kepada kesihatan masih tidak jelas.
Halangan utama dalam penyelidikan pemakanan ialah kesukaran memodelkan sifat kompleks dan pelbagai aspek tabiat pemakanan manusia secara tidak wajar dalam kajian haiwan praklinikal mekanistik. Diet chow adalah sumber makanan yang paling banyak digunakan dalam kajian tikus praklinikal kerana kualiti pemakanan yang tinggi, kestabilan penyimpanan dan kos pembuatan yang agak rendah. Terdiri daripada campuran berasaskan bijirin yang ditambah dengan minyak berkualiti tinggi dan campuran vitamin/mineral, diet chow adalah gambaran yang buruk tentang kualiti pemakanan yang agak rendah yang dilaporkan dalam masyarakat maju. Ini telah membawa kepada penciptaan pelbagai diet yang mendorong penyakit, yang kebanyakannya memberi tumpuan kepada pengambilan kalori tinggi negara maju dan menghasilkan obesiti dan disfungsi metabolik dalam haiwan jenis liar. Walaupun obesiti dan disfungsi metabolik kekal sebagai kebimbangan kesihatan utama di seluruh dunia, diet berkalori tinggi yang tersedia secara komersil semasa mewakili pandangan yang melampau dan sangat sempit tentang kekurangan nutrisi kompleks yang dilaporkan dalam masyarakat Barat. Kesan fisiologi nutrien yang diberikan selalunya bergantung kepada kewujudan dan kelimpahan nutrien lain (seperti nisbah natrium-kalium [3,4]) dan interaksi ini tidak dipertimbangkan dalam diet mendorong penyakit yang tersedia secara komersial. Oleh itu, kemungkinan pendekatan reduksionis yang biasa dalam penyelidikan pemakanan telah secara tidak sengaja menghalang kejayaan terjemahan data mekanistik daripada tikus kepada manusia.
Dalam usaha untuk menangani isu ini, kami sedang membangunkan diet Amerika (AD) novel yang merangkumi beberapa kekurangan nutrisi yang dilaporkan di Amerika [5]. AD ialah diet dua pelet yang terdiri daripada pelet berasaskan bijirin dan pelet "manis dan masin" sintetik dan dibangunkan dengan minat untuk mengkaji keutamaan diet dan mungkin mengimbangi kesan buruk yang dilaporkan daripada diet tikus tradisional berkalori tinggi [6 ]. Menariknya, beberapa pengubahsuaian nutrien yang dibuat dalam AD telah dicadangkan untuk memberi kesanbuah pinggangkesihatansama ada secara langsung atau tidak langsung [7–10].buah pinggangdisfungsiadalah penyebab utama CVD dan hasil biasa dalam penyakit yang disebabkan oleh diet sepertikencing manisdanhipertensi. Analisis terkini telah menunjukkan bahawa kualiti pemakanan yang buruk meningkatkan kejadianbuah pinggangkecederaandanpenyakit[11]; bagaimanapun, mekanisme yang bertanggungjawab masih tidak jelas. Oleh itu, kami menetapkan untuk menentukan sama ada diet memberi kesan ketara kepada hasil dua model tetikus kecederaan buah pinggang yang berbeza.
2. Bahan-bahan dan cara-cara
2.1. Haiwan dan Diet
Semua eksperimen haiwan dilakukan mengikut protokol yang diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Liberty University dan mengikut Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal [12]. Tikus C57Bl/6 jantan weanling (3-minggu) telah dibeli dari Makmal Jackson dan ditempatkan secara berkumpulan (3–5 ekor tikus setiap sangkar) dengan peralatan tempat tidur tongkol jagung, ayam tikus standard (Teklad Global 18 peratus , # 2018), dan air paip ditapis karbon. Selepas 1-tempoh penyesuaian minggu, tikus diberi akses ad libitum kepada salah satu daripada tiga diet: chow (Teklad Global 18 peratus , #2018, n=14), diet Barat yang tersedia secara komersial ("WD, " #TD.88137, n=13), atau novel kami "AD" (n=14).
AD terdiri daripada dua pelet, dirujuk sebagai AD chow (TD.170651) dan ADsyn thetic (TD.170698 & TD.170699). Pelet chow AD ialah pelet berasaskan chow yang diubah suai dengan vitamin larut lemak yang dikurangkan (A, D, dan E) dan serat tidak larut (serat detergen neutral). Pemakanan sintetik dirumuskan untuk memasukkan lebihan sukrosa, fruktosa, lemak tepu, kolesterol, omega-6 asid lemak tak tepu, asid trans-lemak, natrium dan fosforus sambil mengurangkan kalium dan omega-3 asid lemak tak tepu. . Asid trans-lemak dimasukkan dalam perumusan kerana ia masih digunakan daripada sumber semula jadi (seperti daging lembu), tetapi kemasukan dalam pelet ADsynthetic jauh lebih rendah daripada yang digunakan dalam kajian terdahulu yang lain [13-16]. Kemasukan setiap nutrien adalah berdasarkan padanan perbezaan peratus pengambilan sebenar dan disyorkan dalam tikus dan manusia (digambarkan dalam Lampiran A Jadual A1) berdasarkan laporan terkini oleh Jabatan Pertanian Amerika Syarikat [5,12]. Komposisi nutrien untuk setiap pelet adalah berdasarkan perbezaan peratus yang dikira bagi nilai pengambilan yang dilaporkan dan disyorkan bagi setiap nutrien di Amerika, dan perbezaan peratus ini kemudiannya digunakan untuk keperluan nutrien tikus [13]. Formulasi akhir setiap pelet kemudiannya diselaraskan lagi untuk mengambil kira purata penggunaan harian 2 dan 0.5 g AD sintetik dan ADchow, masing-masing. Satu lagi pelet sintetik, ADsythetic2, telah dirumuskan untuk menampung perubahan dalam keutamaan diet melebihi 8 minggu, di mana tikus mengambil kira-kira jumlah yang sama (1.5 g) kedua-dua ADchow dan ADsynthetic2 setiap hari. Ringkasan diet yang digunakan dalam kajian ini disediakan dalam Jadual 1.
2.2. Model Tetikus Kecederaan Buah Pinggang Akut (AKI)
Tikus kekal dalam diet eksperimen mereka selama 12 minggu sebelum induksibuah pinggangkecederaandengan nefropati akibat asid folik (FAN) atau model kecederaan iskemia-reperfusi unilateral (uIRI). Model-model ini dipilih kerana ia digunakan secara rutin dalam kesusasteraan dan mendorong teguhbuah pinggangkecederaandalam cara yang bergantung kepada dos [17]. Model FAN telah dilakukan berdasarkan penerbitan sebelumnya [18–21] dengan pengubahsuaian. Disebabkan oleh perbezaan berat badan antara kumpulan pemakanan, kami mengira dos 250 mg/kg untuk tetikus terkecil dalam kajian kami (25 g) dan memberikan dos yang sama (6.25 mg/500 µL) kepada semua tikus di bawah bius isoflurane ringkas (3 peratus dalam 100 peratus oksigen, 600 mL/min). Tikus kawalan (n=4 untuk setiap diet) menerima volum yang sama (500 µL) kenderaan natrium bikarbonat 0.3 mM dengan tikus yang menerima FAN (n=4 untuk setiap diet). Untuk model uIRI, tikus (n=5–6 untuk setiap diet) telah dibius dengan isoflurane dan hirisan sayap dibuat serta arteri dan vena sebelah kiri.buah pinggangtelah diasingkan daripada tisu penghubung dan adiposa sekeliling dan terhalang dengan pengapit mikrovaskular. Selepas 45 minit, pengapit dikeluarkan dan pemulihan aliran darah disahkan secara visual. Otot ditutup dengan jahitan sutera 4.0 dan hirisan kulit ditutup dengan staples pembedahan. Suhu badan permukaan dikekalkan pada 28–30 ◦C dengan lampu haba dan pad pemanas (suhu badan permukaan normal ~30 ◦C). Buprenorfin (0.1 mg/mL, 100 µL suntikan subkutan) telah diberikan sebagai analgesik sebaik sahaja haiwan itu mula sedar.
Cistanche boleh merawat kecederaan buah pinggang
2.3. Euthanasia Haiwan, Analisis Histologi, dan Ukuran Serum Fungsi Buah Pinggang
Haiwan telah dieuthanasikan 24 (uIRI) atau 48 jam (FAN) kemudian dengan dislokasi serviks semasa di bawah anestesia isoflurane ringkas. Jantung dikeluarkan dan darah batang dikumpulkan, dibiarkan pada suhu bilik selama 10 min dan menjalani sentrifugasi selama 10 min pada 2500 g. Serum dikumpul dan dibekukan pada −80 ◦C sehingga dianalisis untuk kreatinin (Crystal Chem), nitrogen urea darah (BUN, Arbor Assays), atau interleukin-6 (IL6, Biolegend) menggunakan ujian yang tersedia secara komersial. Buah pinggang telah dibedah dan dinyahkapsul, dan bahagian sagital tengah difiksasi dalam 10 peratus formalin penampan fosfat, tertanam dalam parafin, dan bahagian 5 µm dipotong dan diwarnai dengan H&E atau Picro Sirius Red (ABCAM). Dalam bahagian yang diwarnai H&E, keterukan nekrosis tubular akut dinilai oleh individu yang buta terhadap reka bentuk eksperimen berdasarkan skala 0–4, di mana (0) merujuk kepada tiada bukti kecederaan, (1) adalah<25% of="" the="" identifiable="" tissue="" area="" consists="" of="" injury,="" (2)="" 25–50%,="" (3)="" 50–75%,="" and="" (4)="">75 peratus. Sama seperti kerja sebelumnya [22], "kecederaan tiub" terdiri daripada pelebaran tiub, tuangan protein, dan pembentukan semula tubulointerstitial yang jelas. Tahap fifibrosis tubulointerstitial dinilai dalam bahagian berwarna Picro Sirius.
2.4. Susunan PCR nefrotoksisiti
Kira-kira 30–100 mg keping dekapsulasibuah pinggangtisutelah disimpan dalam larutan RNAlater™ (Thermo). Satu sampel wakil tunggal dari setiap kumpulan diet dalam kajian FAN telah dipilih yang hampir sama dengan purata kumpulan untuk kreatinin serum, BUN, dan skor histologi dalam setiap kumpulan rawatan. Sampel yang dipilih kemudiannya diproses untuk mengukur ekspresi 84 gen yang berkaitan dengan nefrotoksisiti menggunakan RT2 ProfilerTM PCR Array—Tetikus Nefrotoksisiti(#PAMM-094Z) seperti yang disyorkan oleh pengilang (Qiagen). Jumlah RNA telah diasingkan menggunakan kit RNeasy®, DNA genomik telah dialih keluar melalui pencernaan DNA dan 0.5 ugs daripada jumlah RNA telah digunakan untuk sintesis cDNA menggunakan Kit Strand Pertama RT2. Campuran cDNA dicampur dengan Mastermix Hijau RT2 SYBR® dan air bebas nuklease dan kemudian digunakan pada plat RT2 dan dianalisis seperti yang disyorkan menggunakan instrumen Lightcycler™ 96 (Roche). Nilai ∆Ct untuk setiap kumpulan rawatan dikira berdasarkan ekspresi gen pengemasan menggunakan persamaan berikut: 2ˆ (∆CT), di mana ∆CT=(pengemasan (GAPDH))-CT (gen kepentingan)] . Perbezaan peratus dalam ekspresi berbanding dengan tikus kawalan (tikus yang diberi makan dengan rawatan kenderaan) dikira untuk setiap gen. Untuk mengenal pasti gen yang berpotensi dipengaruhi olehFAN dan diet, kami mengubah suai analisis yang disediakan oleh pengilang (Qiagen). Gen yang mempunyai perbezaan yang lebih besar daripada 2-kali ganda daripada tikus kawalan telah dikenal pasti dan daripada senarai ini, kami mengenal pasti gen dengan perbezaan Lebih besar daripada atau sama dengan 25 peratus antara tikus yang diberi makan WD dan AD. Enam gen telah dikenal pasti menggunakan metodologi ini dan ekspresi mRNA buah pinggang mereka dikira menggunakan RT-PCR masa nyata konvensional.
2.5. RT-PCR untuk Gen yang Berkaitan dengan Nefrotoksisiti, Keradangan dan Pengubahsuaian Tisu
Buah pinggang dan limpa telah diproses untuk RT-PCR menggunakan kit yang tersedia secara komersial (Qiagen dan BioRad) mengikut cadangan pengilang. Primer yang merangkumi intron untuk gen yang terlibat dalam nefrotoksisiti atau penanda khusus leukosit telah dibeli daripada BioRad atau dicipta menggunakan perisian Primer3 [23-25]. Maklumat primer disediakan dalam Lampiran C Jadual A2. Kemudian, 10 µL tindak balas RT-PCR dilakukan menggunakan iTaq Universal SYBR Green Supermix (BioRad) dan nilai ∆CT dikira untuk setiap gen. Semua data dibentangkan sebagai dinormalkan kepada purata kumpulan kawalan untuk setiap satubuah pinggangkecederaanmodel (tikus yang diberi makan chow dengan suntikan kenderaan untuk FAN atau buah pinggang kontralateral tikus yang diberi makan ayam dalam IRI).
2.6. Analisis statistik
Semua kajian dilakukan menggunakan reka bentuk rawak sepenuhnya. Dalam kajian FAN, "Diet" dan "Rawatan" ialah pembolehubah bebas dengan "Diet" mempunyai 3 tahap (chow, WD, dan AD), dan "Rawatan" mempunyai 2 tahap (kenderaan atau FAN). Analisis serupa telah digunakan dalam kajian uIRI, di mana "Rawatan" ditentukan dengan membandingkan data ekspresi gen dalam buah pinggang iskemia kepada buah pinggang kawalan kontralateral bukan iskemik. Semua data telah disemak sebelum analisis GLM dan outlier telah dikenal pasti menggunakan fungsi Explore dan dianalisis menggunakan prosedur model linear am dalam SPSS (IBM). Nilai dianggap penting dengan p Kurang daripada atau sama dengan 0.05 dengan analisis Tukey Post Hoc dan kecenderungan ditakrifkan sebagai p Kurang daripada atau sama dengan 0.1.
3. Keputusan
3.1. Diet yang Tidak Baik Memburukkan Kecederaan Tisu pada KIPAS
Tikus yang diberi makan WD mempunyai jumlah berat badan yang paling besar (37.4 ± 4.1 g) berbanding tikus yang diberi makan AD (30.3 ± 1.0, p=0.{{ 17}}01) dan tikus diberi makan chow (26.8 ± 1.1, p < {{20}}.001).="" adipositi="" juga="" berbeza="" antara="" kumpulan,="" di="" mana="" tikus="" yang="" diberi="" makan="" wd="" mempunyai="" berat="" pad="" lemak="" epididimis="" tertinggi="" (2.0="" ±="" {{30}}.6="" g,="" p="">< 0.="" 001)="" berbanding="" tikus="" yang="" diberi="" makan="" chow="" (0.4="" ±="" 0.08,="" p=""><0.001) dan="" ad(0.7="" ±="" 0.3,="" p=""><0.001). peningkatan="" berat="" badan="" dan="" adipos="" yang="" diperhatikan="" pada="" tikus="" yang="" diberi="" makan="" ad="" juga="" lebih="" besar="" daripada="" tikus="" yang="" diberi="" makan="" chow="" (p="0.001" dan="" p="">< 0.001,="" masing-masing).="" berat="" tisu="" adipos="" tidak="" berbeza="" antara="" tikus="" dalam="" kenderaan="" atau="" kumpulan="" yang="" dirawat="" dengan="" kipas="" (p="">
Menariknya, tikus yang diberi makan AD mempunyai berat buah pinggang yang paling besar berbanding dengan kedua-dua tikus yang diberi makan chow (p < {{0}}.001)="" dan="" wd="" (p="" {{2="" }}.01)="" (jadual="" 2).="" berat="" buah="" pinggang="" tidak="" berbeza="" antara="" tikus="" yang="" diberi="" makan="" chow="" atau="" wd="" (p="0.1)" dan="" data="" ini="" konsisten="" apabila="" berat="" badan="" digunakan="" sebagai="" kovariat="" (p="0.52)." kreatinin="" yang="" beredar="" (p="">< 0.001)="" dan="" bun="" (p="">< 0.001)="" telah="" meningkat="" dengan="" ketara="" sebagai="" tindak="" balas="" kepada="" fan,="" namun="" kedua-duanya="" tidak="" dipengaruhi="" dengan="" ketara="" oleh="" diet="" (p="0.74" dan="" 0.67,="" masing-masing).="" diet,="" bagaimanapun,="" mempengaruhi="" dengan="" ketara="" keterukan="" kecederaan="" tisu="" yang="" dinilai="" oleh="" mikroskopi="" dengan="" tikus="" yang="" diberi="" makan="" wd="" (p="0.001)" dan="" ad="" (p="0.004)" yang="" mengalami="" kecederaan="" tisu="" yang="" lebih="" teruk="" berbanding="" dengan="" tikus="" diberi="" makan="" chow="" (jadual="" 2="" dan="" rajah="" 1).="" ciri="" histologi="" utama="" kecederaan="" buah="" pinggang="" ialah="" pelebaran="" tiub="" dan="" nekrosis="" tiub="" akut,="" yang="" lebih="" teruk="" dan="" meluas="" di="" seluruh="" korteks="" pada="" tikus="" yang="" diberi="" makan="" ad="" dan="" wd.="" tiada="" perbezaan="" dalam="" fifibrosis="" buah="" pinggang="" diperhatikan="" antara="" kumpulan="" diet="" dalam="" bahagian="" bernoda="" picro="" sirius="" (lampiran="" c="" rajah="" a1).="" kipas="" menyebabkan="" peningkatan="" (p="0.005)" yang="" ketara="" dalam="" interleukin="" yang="" beredar-6="" (il6)="" yang="" diburukkan="" lagi="" dengan="" wd="" berbanding="" tikus="" yang="" diberi="" makan="" ad="" (p="0.01)" dan="" chow="" (p="0.006," jadual="" 2).="" begitu="" juga,="" fan="" menyebabkan="" peningkatan="" drastik="" dalam="" ekspresi="" mrna="" il6="" buah="" pinggang="" (p=""><0.001); walau="" bagaimanapun,="" tiada="" perbezaan="" yang="" ketara="" antara="" kumpulan="" diet="" (p="">
3.2. Diet Secara Ketara Mempengaruhi Ekspresi mRNA Renal bagi Gen Nefrotoksik dan Leukosit Khusus dalam KIPAS
Kami seterusnya menetapkan untuk mengenal pasti mekanisme berpotensi yang bertanggungjawab untuk memburukkan lagi kecederaan tisu pada tikus yang diberi makan WD dan AD. Sampel perwakilan dari setiap diet telah dipilih dan ekspresi 84 gen yang dikaitkan dengan nefrotoksisiti telah disaring menggunakan tatasusunan PCR yang tersedia secara komersil (data mentah dibentangkan dalam Lampiran E Jadual A3). Berbanding dengan tikus yang diberi makan chow yang dirawat dengan kenderaan, 57 gen nefrotoksik dikenal pasti mempunyai perubahan lebih daripada 50 peratus dalam ekspresi dengan FAN, dan enam daripadanya dikenal pasti sebagai berbeza berdasarkan diet (Lampiran F Jadual A4). Daripada enam gen yang dikenal pasti oleh ujian nefrotoksisiti, ekspresi buah pinggang Btg2 (p=0.03), Cdkn1a (p=0.01) dan Spp1 (p=0.001) adalah ketara. dipengaruhi oleh diet seperti yang ditentukan menggunakan RT-PCR konvensional. Tikus yang diberi makan WD mempunyai ekspresi Btg2 dan Spp1 yang lebih besar berbanding tikus yang diberi makan chow dan AD, manakala tikus yang diberi makan AD mempunyai ekspresi Cdkn1a yang lebih besar berbanding tikus yang diberi makan chow dan WD (Lampiran F Jadual A4 dan Rajah 2) . Kami juga mengukur ekspresi mRNA buah pinggang 4 penanda khusus leukosit (CD3e, CD19, CCR2, dan Ly6G), yang semuanya dipengaruhi oleh FAN (Lampiran F Jadual A4). Walau bagaimanapun, diet tidak mempunyai kesan yang ketara terhadap ekspresi penanda spesifik leukosit dalam buah pinggang.
Kami sebelum ini telah menunjukkan limpa mempengaruhi dengan ketara imunopatologi kecederaan buah pinggang [26-28]. Oleh itu, kami menetapkan untuk menentukan sama ada diet mengubah suai ekspresi mRNA splenik penanda khusus leukosit yang sama dalam FAN. FAN menyebabkan penurunan ketara dalam ekspresi mRNA splenik bagi penanda sel T Cd3e (p=0.001) dan penanda sel B Cd19 (p < 0.001)="" (rajah="" 3="" dan="" lampiran="" f="" jadual="" a4).="" mengenai="" diet,="" tikus="" yang="" diberi="" makan="" ad="" mempunyai="" ekspresi="" mrna="" splenik="" yang="" lebih="" rendah="" daripada="" cd3e="" (p="0.01)" dan="" cd19="" (p="0.009)" berbanding="" tikus="" yang="" diberi="" makan="" chow="" tetapi="" tidak="" tikus="" yang="" diberi="" makan="" wd="" (p="" lebih="" besar="" daripada="" atau="" sama="" dengan="" 0.2).="" tiada="" kesan="" ketara="" diet="" (p="0.8)" atau="" fan="" (p="0.1)" pada="" ekspresi="" il6="" splenik="" (data="" tidak="">
3.3. Diet dengan Ketara Mempengaruhi Ekspresi Gen Khusus Leukosit dalam uIRI
Kami mengulangi kajian diet kami dalam model uIRI untuk menilai kebolehgeneralisasian data FAN. Walaupun terdapat perbezaan ketara dalam adipositi antara kumpulan rawatan diet, tidak terdapat perbezaan ketara dalam masa pembedahan (~5 min) antara kumpulan rawatan (p=0.5). Diet tidak mempunyai kesan ke atas keterukan kecederaan tisu seperti yang ditentukan oleh kuantifikasi H&E- (p=0.7, Rajah 4) atau slaid bernoda Picro Sirius (Lampiran D Rajah A2). Walaupun tikus yang diberi makan AD mempunyai berat buah pinggang yang lebih besar dalam kajian FAN, hanya terdapat kecenderungan untuk diet mempengaruhi berat buah pinggang (p=0.07) dalam kajian uIRI. Dalam buah pinggang kontralateral bukan iskemik, tikus yang diberi makan chow mempunyai berat buah pinggang berangka yang lebih rendah (160 ± 22 mg) berbanding tikus yang diberi makan AD (168 ± 14) dan WD (186 ± 15). Trend berangka yang sama diperhatikan dalam buah pinggang iskemia di mana tikus yang diberi makan chow (173 ± 24 mg) atau tikus yang diberi makan AD (170 ± 12) mempunyai berat buah pinggang berangka yang lebih rendah berbanding dengan tikus yang diberi makan WD (195 ± 32). Data ini mencadangkan bahawa kesan diet ke atas berat buah pinggang dengan kecederaan adalah bergantung kepada model yang digunakan.
Semua gen nefrotoksik dan spesifik leukosit yang dikira dalam buah pinggang dipengaruhi dengan ketara oleh uIRI kecuali Cd3e (p=0.1, Lampiran G Jadual A5). Walau bagaimanapun, tiada gen nefrotoksik yang dikenal pasti dalam kajian FAN dipengaruhi dengan ketara oleh diet. Berkenaan dengan ekspresi gen spesifik leukosit, kesan uIRI pada ekspresi mRNA Cd19 buah pinggang sangat bergantung kepada pemakanan diet (p=0.008), dengan tikus yang diberi makan WD dan AD mempunyai kira-kira empat kali ganda. ekspresi Cd19 buah pinggang yang lebih tinggi selepas uIRI berbanding tikus yang diberi makan chow (Rajah 5). Terdapat juga kecenderungan untuk tikus yang diberi makan chow mempunyai ekspresi Ly6g buah pinggang yang lebih besar selepas uIRI (p=0.06, Lampiran G Jadual A5). Menariknya, tikus yang memberi makan WD (p=0.006) dan AD (p=0.004) mempunyai kepekatan IL6 edaran yang jauh lebih rendah berbanding tikus yang diberi makan chow (Rajah 5).
Diet memberi kesan ketara pada ekspresi mRNA splenik Cd19 (p=0.008), Ccr2 (p =0.004) dan Ly6g (p {{7} }.03) berikutan uIRI (Rajah 6 dan Lampiran G Jadual A5). Tikus yang diberi makan chow mempunyai ekspresi splenik tertinggi bagi penanda ini, dengan Ccr2 berbanding tikus yang diberi makan WD (p=0.02) dan AD (p=0.005), ungkapan Cd19 jauh lebih besar daripada tikus yang diberi makan AD (p=0.007), tetapi bukan WD (p=0.4), dan ekspresi Ly6g yang lebih besar daripada tikus yang diberi makan AD (p=0.04) dan kecenderungan untuk ekspresi yang lebih besar pada tikus yang diberi makan WD (p=0.07). Tiada perbezaan dalam ekspresi penanda khusus leukosit antara tikus yang diberi WD atau AD (p=0.9, 0.8 dan 0.1 untuk Ccr2, Cd19 atau Ly6g, masing-masing.
4. Perbincangan
Di sini, kami membentangkan data yang menunjukkan kesan diet terhadap keterukan dan imunopatologi penyakit buah pinggang dalam model tetikus praklinikal. Tikus yang diberi makan WD dan AD kedua-duanya mempunyai tahap kecederaan tisu yang tinggi dan ekspresi berbeza gen nefrotoksik berikutan FAN berbanding tikus yang diberi makan chow. Tikus yang memberi makan WD, tetapi bukan AD, juga mempunyai tahap edaran IL6 yang lebih tinggi dengan ketara selepas FAN. Dalam uIRI, kami tidak melihat kesan ketara diet terhadap keterukan kecederaan tisu atau ekspresi buah pinggang gen nefrotoksik yang serupa. Walau bagaimanapun, kami melihat pengurangan ketara dalam IL-6 yang beredar dan ekspresi gen spesifik leukosit dalam buah pinggang dan limpa tikus yang diberi makan WD dan AD. Diambil bersama, data ini mencadangkan bahawa diet secara signifikan mempengaruhi imunopatologi dua model tetikus berasingan kecederaan buah pinggang.
Terdapat sedikit kajian yang menghairankan yang menangani kesan diet terhadap hasil kecederaan buah pinggang. Tikus C57Bl/6 yang diberi diet tinggi lemak selama 9 minggu mengalami kecederaan buah pinggang yang disebabkan oleh cisplatin yang lebih teruk jika dibandingkan dengan tikus yang diberi makan ayam [29]. Perlu diingatkan bahawa dos cisplatin dalam kajian ini adalah berdasarkan berat badan dan menyebabkan tikus tinggi lemak menerima jumlah mutlak cisplatin yang lebih tinggi. Ini adalah komplikasi biasa dalam kajian pemakanan dan merupakan rasional untuk pentadbiran kami dengan jumlah yang sama dan jumlah mutlak FA kepada semua tikus.
Walaupun terdapat sebilangan terhad kertas kerja yang menerangkan kesan diet ke atas hasil penyakit buah pinggang, terdapat kesusasteraan yang boleh didapati yang menerangkan kesan diabetes terhadap kerentanan dan perkembangan kecederaan buah pinggang dalam tikus [30–33]. Kajian berterusan (tidak diterbitkan) di makmal kami mencadangkan bahawa tikus yang diberi makan WD dan AD mempunyai pengambilan kalori harian yang lebih tinggi (masing-masing 16 dan 15 kcal/hari) berbanding tikus yang diberi makan chow (12 kcal/hari). Menariknya, hanya tikus yang diberi makan WD menunjukkan bukti rintangan insulin, dengan hipoglikemia berpuasa (120.3 mg/dL) diperhatikan seawal 8 minggu selepas permulaan diet dan mengembangkan peningkatan empat kali ganda dalam insulin yang beredar berpuasa ( 4.2 ng/mL) selepas 24 minggu. Tikus yang diberi makan chow dan AD mempunyai glukosa puasa yang hampir sama (masing-masing 166 dan 167 mg/dL) dan tahap insulin (masing-masing 0.6 dan 1.0) pada titik masa yang sama. Memandangkan kinetik data ini, kami percaya AD berjaya memodelkan ketidakcukupan nutrisi yang sederhana dan tidak mempunyai disfungsi metabolik dalam jangka masa kajian semasa, manakala tikus yang diberi makan WD berkemungkinan mengalami rintangan insulin.
Previous work has shown diabetic mice have altered renal hemodynamics [30], exacerbated inflflammatory response [31,32], and altered expression of cell-cycle regulators [33] following kidney injury. Interestingly, we also observed alterations in the immune response and cell-cycle regulators in both WD- and AD-fed mice. Regarding the immune response, mice fed the WD had greater circulating IL6 concentrations than mice fed chow and the AD. This suggests that the overt obesity and developing metabolic dysfunction that is likely developing in the WD-fed mice exacerbates the immune response in FAN. We did not observe a signifificant increase in renal or splenic mRNA expression of IL6 in either the FAN or uIRI model suggesting another tissue source (perhaps the liver [34]) is responsible. The spleen is a reservoir of deployable leukocytes [35,36] and we have previously shown the spleen to play a signifificant role in the pathophysiology of kidney injury with splenic size being inversely correlated with kidney injury [26–28]. Mice fed the WD and AD had a>Pengurangan 30 peratus dalam ekspresi penanda leukosit dalam limpa, yang boleh ditafsirkan kerana terdapat peningkatan penggunaan leukosit dari limpa. Ini akan mencadangkan peningkatan keradangan pada tikus yang diberi makan WD dan AD; walau bagaimanapun, data IL6 yang beredar hanya menyokong hipotesis ini dalam tikus yang diberi makan WD. Kajian tambahan dengan sitometri aliran dan pencirian yang lebih luas bagi kemokin dan sitokin yang beredar diperlukan untuk lebih memahami cara diet mempengaruhi imunologi dan patofisiologi FAN.
Mengenai pengawal selia perkembangan kitaran sel, diet juga secara signifikan mempengaruhi ekspresi mRNA Btg2 dan Cdkn1a (p21) berikutan FAN. Kajian kalah mati mencadangkan peranan perlindungan untuk Cdkn1a dalam penyakit buah pinggang (disemak dalam [37]) dan ungkapan Btg2 juga ditunjukkan meningkat dalam iskemia, tetapi bukan kawalan kontralateral, buah pinggang [38]. Walau bagaimanapun, fungsi dan kepentingan peningkatan Btg2 dalam kecederaan dan penyakit buah pinggang belum ditentukan. Btg2 ialah pengesan hiliran NFκB dan pengawal selia kitaran sel p53 dan p19 yang mengakibatkan sekatan kitaran sel menggunakan pelbagai mekanisme selular (disemak dalam [39]). Bersama-sama, kesusasteraan semasa menunjukkan bahawa perencat kitaran sel bermanfaat dalam mengurangkan kecederaan buah pinggang awal, tetapi juga boleh meningkatkan, atau bahkan memudahkan, perkembangan seterusnya kepada bentuk penyakit yang lebih kronik [37,38,40-43]. Perbezaan dalam ekspresi Btg2 dan Cdkn1a pada tikus yang diberi makan WD dan AD mencadangkan obesiti morbid dan kekurangan nutrisi mempengaruhi patofisiologi kecederaan buah pinggang melalui mekanisme selular yang berbeza dan mungkin mempunyai hasil jangka panjang yang berbeza. Tambahan pula, perbezaan dalam ekspresi Btg2 dan Cdkn1a boleh menyumbang kepada hipertrofi buah pinggang yang diperhatikan dalam model FAN. Model FAN telah ditunjukkan untuk mendorong hipertrofi buah pinggang akut [20,21], dan AD mempunyai komposisi mineral pemakanan yang juga telah ditunjukkan untuk mendorong hipertrofi buah pinggang dan kecederaan pada tikus [44,45]. Oleh itu, ada kemungkinan bahawa kandungan mineral yang diubah (terutamanya kalsium dan fosforus) dalam AD bertanggungjawab untuk pemburukan hipertrofi buah pinggang dalam FAN. Kajian masa depan diperlukan untuk mengesahkan spekulasi ini dan jika Btg2 dan Cdkn1a terlibat.
Kami juga mendapati ekspresi mRNA Spp1 buah pinggang dipengaruhi dengan ketara oleh kedua-dua FAN dan diet, dengan ekspresi yang lebih tinggi pada tikus yang diberi makan WD berbanding dengan tikus yang diberi makan chow, tetapi bukan AD. Spp1 (osteopontin) ialah glikoprotein yang biasanya dirembeskan dalam air kencing dan sangat diekspresikan dalam buah pinggang, terutamanya dalam nefron kortikal distal. Spp1 memainkan peranan penting dalam mengawal pembentukan dan pemendapan kristal kalsium dalam tubul buah pinggang [46-49], satu proses yang bergantung kepada diet, estrogen, dan FGF23 [7,50,51]. Ia biasanya dikawal selia berikutan kecederaan buah pinggang [52]; bagaimanapun, peranan Spp1 dalam kecederaan buah pinggang iskemia tidak jelas dan kajian lanjut diperlukan untuk menjelaskan kepentingan fisiologi peningkatan ekspresinya dengan adipositas dan penyakit.
Kami juga menilai hasil dalam model kecederaan iskemia-reperfusi unilateral. Kami tidak melihat perubahan dalam histologi atau ekspresi mRNA bagi gen yang berkaitan dengan nefrotoksisiti yang dikenal pasti dalam kajian FAN dalam model uIRI kami. Kekurangan perbezaan dalam ekspresi Btg2 dan Cdkn1a buah pinggang dalam kajian uIRI mungkin menjelaskan mengapa hipertrofi buah pinggang tidak diperhatikan pada tikus yang diberi AD dalam kajian FAN. Walau bagaimanapun, terdapat kesan diet terhadap ekspresi penanda imun dalam buah pinggang dan limpa. Ekspresi buah pinggang penanda sel B CD19 adalah lebih daripada dua kali ganda pada tikus yang diberi makan WD dan AD berbanding dengan tikus yang diberi makan chow. Kepentingan penemuan ini tidak jelas, kerana peranan sel B dalam model tetikus AKI iskemia adalah kompleks dan hasilnya bergantung kepada beberapa faktor (subjenis, kelas antibodi, dll.) [53-56]. Diet juga secara signifikan mempengaruhi ekspresi mRNA penanda imun dalam limpa (Ccr2, Cd19, dan Ly6g), di mana tikus yang diberi makan WD dan AD mempunyai ekspresi yang lebih rendah berbanding dengan tikus yang diberi makan chow. Seperti yang dinyatakan di atas, ini boleh ditafsirkan sebagai peningkatan penggunaan leukosit dari limpa dan pemburukan tindak balas imun sistemik pada tikus yang diberi makan WD dan AD. Walau bagaimanapun, IL6 beredar yang ditindas pada tikus yang diberi makan WD dan AD akan mencadangkan kesan imunosupresif diet ini dalam model uIRI. Mekanisme molekul kecederaan selular yang berbeza dalam model penyakit buah pinggang telah diterangkan [57-59], dan kajian kami mencadangkan bahawa diet boleh mengubah mekanisme ini. Kajian tambahan diperlukan untuk mengesahkan spekulasi ini dan menentukan bagaimana diet secara signifikan mengubah suai tindak balas keradangan dan laluan kematian sel yang terlibat dalam kecederaan buah pinggang
Terdapat had yang perlu dipertimbangkan semasa membandingkan data kami dengan orang lain dalam literatur, terutamanya dalam kajian uIRI. Kami memilih model unilateral untuk mengurangkan komplikasi yang kami temui semasa mengasingkan vaskular buah pinggang daripada tisu adiposa yang berlebihan dalam tikus yang diberi makan WD dan AD. Oleh itu, ukuran serum fungsi buah pinggang tidak dikira dalam kajian uIRI memandangkan kehadiran buah pinggang kontralateral yang sihat dan bukan iskemia. Kami juga menggunakan anestesia isoflurane kerana tikus obes tidak bertolak ansur dengan campuran anestetik ketamin/xylazine yang biasa digunakan dalam model ini [60]. Isoflurane telah ditunjukkan untuk mengurangkan kecederaan buah pinggang dalam IRI [61] dan memerlukan kami meningkatkan masa iskemia kami daripada 30 hingga 45 minit untuk mencapai kerosakan yang diperhatikan. Pengalaman ini menimbulkan kebimbangan tentang hasil kajian uIRI kami dan merupakan rasional untuk tumpuan kami pada model FAN. Ia juga penting untuk menyerlahkan bahawa perubahan dalam ekspresi gen tidak sama dengan perubahan dalam pengeluaran protein, dan kajian tambahan diperlukan untuk mengesahkan perubahan dalam kelimpahan protein dan perubahan seterusnya dalam kesihatan dan fungsi selular.
Cistanche boleh merawat kecederaan buah pinggang
5. Kesimpulan
Kesimpulannya, kami membentangkan data yang menyokong kepentingan diet terhadap kerentanan kepada kecederaan buah pinggang. Findings kami mencadangkan bahawa diet yang dicipta untuk memodelkan persentil ke-50 pengambilan nutrien di Amerika adalah mencukupi untuk memburukkan lagi kecederaan buah pinggang pada tikus ke tahap yang sama seperti yang diperhatikan dalam WD yang tersedia secara komersial. Data kami juga mencadangkan hubungan mekanistik antara pemakanan, keradangan, dan peraturan kitaran sel dalam imunopatologi kecederaan buah pinggang yang secara signifikan mengubah hasil penyakit. Secara keseluruhan, kajian kami menekankan keperluan untuk meningkatkan penghargaan dan pertimbangan pemakanan dalam kajian haiwan praklinikal mekanistik.
Sumbangan Pengarang:
Pengkonsepan, JCG; metodologi, JCG, JFH, JEB, RL; analisis formal, JCG; penyiasatan, JEB, DLQ, KJW, BB, HTH, RL, JFH; sumber, JCG, JFH; penyusunan data, JCG, JFH; penulisan—penyediaan draf asal, JCG, JFH; menulis— menyemak dan menyunting, JEB, DLQ, KJW, BB, HTH, RL, JFH; penyeliaan, JCG, JFH; pentadbiran projek, JCG, JFH; pemerolehan pembiayaan, JCG Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.
Pembiayaan:
Penyelidikan ini disokong oleh geran dalaman daripada Liberty University dan Liberty University College of Osteopathic Medicine, geran daripada American Osteopathic Association (geran #19133749) dan geran daripada National Institutes of Health (1R01DK113632-01A1) .
Penyata Lembaga Semakan Institusi:
Kajian ini dijalankan mengikut Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal [8] dan diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Liberty (#49.190710, 11 Julai 2019).
Penghargaan:
Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Jessica Flowers, di Teklad Diets (Envigo) atas bantuannya dalam mencipta AD dan Kemudahan Teras Histologi Universiti Virginia untuk perkhidmatan histologi mereka.
Konflik Kepentingan:
Penulis mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.
Daripada: ' Diet Mempengaruhi Ketara Imunopatologi dan Keterukan Kecederaan Buah Pinggang' olehJohn E. Brus, et al
---Nutrien 2021, 13, 1521
