Pendedahan Ekzos Diesel Mengubah Ungkapan Rangkaian yang Terlibat dalam Neurodegenerasi dalam Otak Zebrafish Bahagian 2

Penyediaan sampel protein

Untuk menyediakan sampel protein, kepala daripada 80 hingga 100 larva yang telah dibius (5 pdf) telah diasingkan dengan teliti dan dicuci dengan PBS sebelum dipindahkan ke penimbal lisis yang terdiri daripada 15% TCA/acetone prasejuk yang mengandungi 0.07% beta-mercaptoethanol (ME ) dan koktel perencat protease (memerlukan pengilang) dalam jumlah keseluruhan 500 ul.

Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, terdapat minat yang besar dalam kesan sampel protein pada ingatan. Semakin ramai orang mula menyedari kepentingan diet kepada kesihatan, terutamanya peranan penting protein dalam tubuh manusia.

Protein adalah bahan binaan asas tubuh manusia dan ia memainkan peranan penting dalam tubuh manusia. Oleh sebab itu, sampel protein telah menjadi saluran penting bagi ramai orang dalam mengejar kesihatan dan kecantikan. Selain membina otot dan membentuk badan, sampel protein juga dapat meningkatkan daya ingatan seseorang.

Sesetengah saintis telah mengkaji hubungan antara protein dan ingatan. Mereka mendapati bahawa pengambilan jangka panjang protein yang mencukupi bermanfaat kepada semua aspek kesihatan fizikal, terutamanya ingatan. Terdapat bukti yang semakin meningkat bahawa pengambilan protein diet mempunyai kesan penting ke atas fungsi otak dan ingatan.

Protein adalah komponen penting neuron dalam otak manusia, jadi pengambilan protein setiap hari mempunyai kesan penting terhadap daya ingatan dan keupayaan berfikir manusia. Pengambilan protein jangka panjang bukan sahaja memenuhi keperluan protein badan tetapi juga membantu otak kekal aktif dan sihat.

Selain itu, protein juga boleh membantu badan mengekalkan keseimbangan gula dalam darah dan mengekalkan mood yang stabil. Ini sangat penting untuk mengekalkan daya ingatan dan kemahiran berfikir. Oleh itu, pengambilan protein yang sederhana boleh membantu meningkatkan pelbagai fungsi kognitif dan keadaan emosi badan manusia.

Secara keseluruhannya, terdapat hubungan yang kuat antara sampel protein dan ingatan. Meningkatkan pengambilan protein anda membantu memastikan otak dan badan anda sihat, meningkatkan kemahiran berfikir dan ingatan. Bagi orang yang perlu meningkatkan daya ingatan, sangat perlu mengambil jumlah protein yang sesuai. Kita harus makan makanan berprotein dengan sewajarnya dan memberi perhatian kepada makanan yang munasabah untuk mengekalkan badan yang sihat dan minda yang tajam. Ia boleh dilihat bahawa kita perlu meningkatkan ingatan, dan Cistanche deserticola boleh meningkatkan ingatan dengan ketara, kerana Cistanche deserticola mempunyai kesan antioksidan, anti-radang dan anti-penuaan, yang boleh membantu mengurangkan pengoksidaan dan tindak balas keradangan dalam otak, dengan itu melindungi kesihatan sistem saraf. Selain itu, Cistanche deserticola juga boleh menggalakkan pertumbuhan dan pembaikan sel saraf, sekali gus meningkatkan ketersambungan dan fungsi rangkaian saraf. Kesan ini boleh membantu meningkatkan ingatan, pembelajaran, dan kelajuan pemikiran, dan mungkin juga menghalang perkembangan disfungsi kognitif dan penyakit neurodegeneratif.

Klik tahu suplemen untuk meningkatkan ingatan

Selepas homogenisasi ringkas, protein dimendakkan selama 12 jam pada 20 darjah, diikuti dengan sentrifugasi pada 12,000 rpm selama 5 minit pada 4 darjah . Supernatan dikeluarkan, dan proteinpellet dibasuh dua kali dengan aseton sejuk (mengandungi 0.07% ME dan koktel perencat protease). Pelet protein akhir telah dibubarkan dalam penimbal lisis yang mengandungi 7.0 M urea, dan 2.0 M tiourea oleh sonikasi pada ais.

Sampel protein terlarut telah disentrifugasi pada 15,000 rpm selama 10 minit pada 4 darjah untuk memendakan zarah tidak larut, dan kepekatan sampel protein akhir diukur menggunakan kaedah Bradford.

Analisis proteomik throughput tinggi berasaskan TMT

Sampel dikurangkan, dialkilasi, dan dicerna oleh penambahan berurutan trypsin dan protease lys-C. Peptida kemudiannya dilabelkan menggunakan 10-tag isobarik plexTMT mengikut arahan pengilang. Sampel yang dilabelkan dicampur dan kemudian difraksinasi dengan baik menggunakan kromatografi fasa terbalik pH tinggi.

Pecahan individu kemudiannya dianalisis oleh LC–MS/MS menggunakan kromatografi fasa terbalik dalam talian dan spektrometri jisim tandem pada spektrometer jisim Thermofsher Fusion Lumos. Data diperoleh menggunakan kaedah MS3 berasaskan pemilihan prekursor segerak, seperti yang diterangkan sebelum ini (McAlister et al. 2014). Pencarian pangkalan data dan pengekstrakan maklumat ion wartawan TMT dilakukan menggunakan platform perisian MaxQuant (Cox dan Mann 2008).

Perbandingan data TMT merentas sampel dilakukan menggunakan MSStats (Choiet al. 2014).Analisis transkriptomi Kira-kira 80-100 ekor telah diasingkan daripada embrio yang telah dibius (120 jam), dibasuh dengan PBS, dan tertakluk kepada pengekstrakan RNA keseluruhan menggunakan Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis). , USA) reagen mengikut arahan pengilang.

Kualiti dan kuantiti RNA dinilai menggunakan spektrofotometer NanoDrop2000 (Thermo Scientific, MA) dan seterusnya oleh Agilent 2100 Bioanalyzer untuk memastikan kepekatan minimum 50 ng/ul dan nombor integriti RNA (RIN) sebanyak 8. Penyediaan perpustakaan kemudiannya dilakukan menggunakan Illumina HiSeq4000mengikut protokol: "Aliran kerja Persediaan Perpustakaan RNA Jumlah TruSeqStranded denganRibo-Zero Gold," dan sampel disusun mengikut keadaan berikut: "Larian Akhir Berpasangan, R1=75 kitaran (untai antisense), Indeks=8 kitaran, R2=75 kitaran (helai deria)."

Analisis data

Kedua-dua set data untuk kajian proteomik dan transkriptomi telah dimuat naik dan dianalisis secara serentak menggunakan alat dalam talian Metascape, yang membolehkan anotasi gen untuk pelbagai spesies, termasukDanio rerio (Zhou et al. 2019). Untuk menilai sumbangan sama ada laluan khusus pengubahan profil protein atau transkrip, data telah dianalisis melalui penggunaan perisian Ingenuity Pathways Analysis (IPA)(Krämer et al. 2014).

Set data yang mengandungi pengecam gen atau protein dan nilai ekspresi yang sepadan telah dimuat naik ke dalam aplikasi. Setiap pengecam telah dipetakan ke objek yang sepadan dalam pangkalan pengetahuanIngenuity.

Potongan pengubahan ungkapan sebanyak 1.3-lipatan ditetapkan untuk mengenal pasti molekul yang ekspresinya dikawal secara berbeza. Analisis fungsian mengenal pasti fungsi biologi dan/atau penyakit yang paling penting kepada set data. Molekul daripada dataset yang memenuhi cut-off dan dikaitkan dengan fungsi biologi telah dipertimbangkan untuk analisis. Ujian tepat Right-tailedFisher digunakan untuk mengira nilai p yang menentukan kebarangkalian bahawa setiap fungsi biologi dan/atau penyakit yang diberikan kepada set data itu adalah disebabkan oleh kebetulan sahaja.

Analisis laluan

Untuk menilai sumbangan sama ada perubahan profil proteom atau transkriptom dalam laluan tertentu, kedua-dua set data telah dimuat naik ke perisian IPA (Krämer et al. 2014). Laluan kanonik yang diubah paling ketara kemudiannya dinilai dan ditafsirkan dengan menggunakan PCR dan western blotting seperti yang diterangkan di bawah.

Barat blotting

Sebanyak 25 µg protein telah dimuatkan pada 12%NuPAGE (Novex, CA) dan dipindahkan ke PVDFmembranes (Novex, CA) seperti yang diterangkan (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). Membran disekat dengan susu skim 5% dalam Tris-bufferedsaline dan 0.01% tween 20 (penampan TBST) untuk 30 minat suhu bilik dan kemudian diinkubasi semalaman pada 4 darjah dengan sama ada arnab poliklonal anti-Cyp1A1(Abcam, CA) atau tikus monoklonal anti-GAPDH( Abcam, CA), dicairkan dalam penimbal TBST yang mengandungi 1% susu skim.

Selepas dicuci dalam TBST, bintik-bintik itu diinkubasi dengan antibodi anti-arnab-HRP(Abcam, CA) atau kambing anti-tikus-HRP (Santa Cruz,CA) keldai sekunder selama 2 jam, diikuti dengan pembangunan dengan substrat blotting barat Pierce™ ECL Plus( Thermo Fisher Scientific, Amerika Syarikat). Jalur telah divisualisasikan dengan pengimejan menggunakan Pengimbas LI-COR dan dianalisis melalui densitometri (LI_COR Biosciences, NE).

PCR masa nyata

Jumlah RNA telah diasingkan daripada kepala menggunakan reagen TRIzol (Sigma Aldrich, Saint Louis, Amerika Syarikat) mengikut arahan pengilang dan kemudian diukur menggunakan spektrofotometer NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, MA). Sejumlah 1 ug bagi setiap sampelRNA telah ditranskripsi terbalik menggunakan supermix transkripsi terbalik iScript™ (Bio-Rad, CA), dan PCR masa nyata dilakukan menggunakan supermix Hijau SsoAdvancedUniversal SYBR Green (Bio-Rad, CA), dan primer disenaraikan dalam Jadual Tambahan 1. Tahap ekspresi relatif dikira menggunakan kaedah 2−ΔΔCT, dan ujian-T statistik digunakan untuk menilai perbezaan ketara.

Keputusan dan perbincangan

Analisis proteomik dan transkriptik ialah dua alat utama untuk memahami mekanisme molekul yang mendasari proses penyakit dan tindak balas terhadap rangsangan persekitaran (Duan et al. 2017; García-Estrada et al.2013; Jami et al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al.2012). . Di sini, kami melakukan analisis ekspresi mendalam pada kedua-dua tahap transkriptom dan proteomik dalam kepala embrio ikan zebra yang terdedah kepada DEPe.

Kepala, kebanyakannya terdiri daripada tisu otak, telah diasingkan untuk menghapuskan profil ekspresi tisu lain kerana kami berminat untuk menentukan laluan patologis CNS.

Profil ekspresi kepala zebrafishembryo

Analisis profil menghasilkan 11,172 protein yang dikesan dan 14,748 sasaran mRNA daripada lebih 26,000 gen pengekodan (Howe et al. 2013). Antara 11,172 protein yang dikenal pasti daripada sampel berlabel TMT (Jadual Tambahan 2), 141 protein dikawal dengan ketara, dan 607 telah dikurangkan (Jadual Tambahan 3 dan Rajah 1a). Begitu juga, 367 transkrip dikawal selia, dan 149 telah dikurangkan dalam kalangan 14,748 transkrip (Jadual Tambahan 4) yang dikesan dalam analisis RNA-seq (Rajah 1b dan Jadual Tambahan 5).
Dalam kebanyakan kes, penemuan daripada analisis proteomik dan transkriptomik terkawal adalah konsisten. Contohnya, protein terkawal tinggi atas termasuk cytochrome P450 Cyp1a, Cyp1c1, gama subunit protein pengikat Guaninenucleotide, Annexin, Isoform pendek Plexin B2b, ahli Dehidrogenase/reduktase (keluarga SDR) 13-seperti 1, S-antigen ofretina/kelenjar pineal (arrestin) b, dan Sulfotransferase6B1.

Begitu juga, gen yang mempunyai transkripomicupregulasi tertinggi termasuk cytochrome P450 (Cyp1a), chemokine (motif C-C) ligan 27a, aril-hydrocarbonrepressor repressor A, cytochrome P450 (Cyp1b), dan Rh family C glikoprotein. Protein dan transkrip yang tidak dikawal, pada tangan lain, tidak selalu sangat berkorelasi.

Contohnya, Complexin 2, Spectrin alpha, Cardiac myosin light chain-1, SEC23 interakting protein, ATPsynthase membrane subunit EA, Cytochrome b, dan NAD-dependent protein deacetylase adalah antara protein teratas yang sangat terkawal, manakala protein membran segmen retinalouter 1a , pembawa bahan terlarut keluarga 5 (pengangkut iodida), FBJ murine osteosarcoma virus onkogen homolog B, complexin 4c, antigen 1a seperti FOS, opsin 1, dan v-fos menunjukkan regulasi transkripsi tertinggi (Jadual 1 dan 2).

Antibodi yang mengiktiraf protein ikan zebra adalah terhad, tetapi kami mengesahkan sampel perubahan ini menggunakan analisis western blot. Peningkatan pengawalseliaan protein Cyp1A dan pengurangan pengawalseliaan Complexin 2(CPLX2) telah disahkan menggunakan GAPDH sebagai kawalan pemuatan (Rajah 2a). Tahap transkripsi TAT dan UGT1B1 yang lebih tinggi dan tahap CHNRB dan TH2 yang lebih rendah turut disahkan oleh qPCR menggunakan Elf-alpha sebagai kawalan dalaman (Rajah 2b).

Anotasi gen

Terdapat beberapa alat dan perisian bioinformatik dalam talian yang boleh memberikan maklumat berguna tentang anotasi gen. Antaranya, Metascape, dengan keupayaan anotasi gen untuk Danio rerio (Zhouet al. 2019), telah digunakan dalam kerja ini.

Kedua-dua set data untuk kajian proteomik dan transkriptom telah dimuat naik dan dianalisis secara serentak menggunakan alat dalam talian ini. Selepas menggabungkan output kedua-dua perubahan proteomik dan transkriptom dalam perisian, beberapa proses seperti tindak balas kepada rangsangan xenobiotik, metabolisme xenobiotik oleh sitokrom P450, dan pengawalan ekspresi gen. didapati disebabkan oleh rawatan DEPe (Rajah 3a).

Analisis ini juga mencadangkan tahap proses biologi yang ditindas seperti "Persepsi visual," "Phototransduction," dan "pengintegrasian reseptor yang digabungkan dengan protein G." Perubahan dalam profil ekspresi berkaitan penglihatan tidak dijangka kerana rawatan DEPe semasa pembangunan awal menghasilkan mata yang lebih kecil (data tidak ditunjukkan).

Isyarat metabolisme xenobiotik

Xenobiotik, yang merupakan sebatian kimia semula jadi atau sintetik asing, boleh mencetuskan tindak balas tekanan selular, yang membawa kepada pembezaan, percambahan, apoptosis atau nekrosis. Malah, badan perlu secara aktif melindungi dirinya daripada xenobiotik, dan juga sebatian endogen toksik dan metabolitnya, melalui ekspresi enzim dan pengangkut yang terlibat dalam penyingkiran dan detoksifikasinya.

Enzim ini dikelaskan kepada tiga kumpulan: Enzim FasaI (CYP, ALDH, FMO) yang memperkenalkan polariti ke dalam xenobiotik; Enzim fasa II (UGT,GST, SULT) yang memperkenalkan hidrofilik melalui konjugasi molekul hidrofilik seperti sulfat, asid glukuronik dan glutation kepada xenobiotik; dan enzim Fasa III (MDR1, OATP2, MRP) yang mengangkut xenobiotik atau konjugat yang terbentuk semasa Fasa II ke kawasan ekstraselular.

Enzim ini diinduksi melalui lata isyarat yang melibatkan reseptor khusus (CAR, PXR, AHR) dan pengaktifan faktor transkripsi yang dimediasi MAPK (NRF2, MAF)(Omiecinski et al. 2011).

Dengan ketiadaan pengaktif, reseptor konstitutif aktif (CAR) terletak di kompleks asa sitoplasma dengan CCRP dan HSP90. Tetapi apabila pengaktif hadir, CAR berpindah ke dalam nukleus dan mengikat kepada RXR untuk membentuk heterodimer dan seterusnya mengikat kepada beberapa varian motif ulangan, seperti DR3, DR4, ER6, dan ER8, dan menyumbang kepada peraturan ekspresi gen (Jadual Tambahan 2).

Analisis proteomik kami mendedahkan pengaktifan metabolisme xenobiotik. Malah, pengawalseliaan jelas CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (heme oxygenase 1), CAT (catalase), dan CES1 (carboxylesterase 1) menunjukkan induksi metabolisme Fasa I, manakala peningkatan ekspresi UGT1A1 (UDP glucuronosyltransferase family 1 ahli A1) dan GSTP1 glutathioneS-transferase pi 1) menunjukkan pengaktifan metabolisme FasaII.

Menariknya, downregulation of sulfate transferase seperti SULT1A1 (sulfotransferasefamily 1A member 1), SULT1C2 (sulfotransferasefamily 1C member 2), dan SULT2B1 (sulfotransferase family 2B member 1) menunjukkan bahawa peningkatan hidrofilik dalam metabolisme Fasa II cenderung berlaku melalui konjugasi dan glutaglutaglutaglutonic acid. , tetapi bukan konjugasi sulfat (Rajah 4).

Keputusan kajian transkriptik adalah agak konsisten, kerana CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1, dan UGT1A1 semuanya dikawal pada tahap RNA. Walau bagaimanapun, SULT2B1 menunjukkan regulasi pada tahap RNA (sementara kurang diwakili pada tahap protein).

Ini mungkin disebabkan oleh penglibatan mekanisme lain yang mendorong degradasi atau ketidakaktifan enzim transferase sulfat selepas rawatan dengan DEPe. Apa yang sangat mengejutkan ialah perubahan dalam metabolisme xenobiotik ini berlaku di kepala (mungkin otak) ikan. Ekspresi gen xenobiotik telah diterangkan dalam sistem saraf mamalia, tetapi ini adalah laporan pertama mereka dalam otak ikan zebra (McMillan dan Tyndale 2018).

Penemuan ini konsisten dengan kajian serupa yang dijalankan oleh Shankar dan rakan sekerja yang menguji kesan kumpulan berbeza hidrokarbon aromatik polisiklik alam sekitar (PAH) terhadap perkembangan embrio dan seterusnya menilai kesan setiap rejimen rawatan pada profil transkrip.

Pada keseluruhan badan 48 embrio hpost-fertilization (hpf), mereka menunjukkan regulasi Cyp1a pada kedua-dua tahap transkripsi dan protein sebagai penanda bio awal yang boleh dipercayai bagi pengaktifan AHR xenobiotik dan perubahan transkriptik hiliran (Shankar et al. 2019).

NRF2-mengantarakan tindak balas tekanan oksidatif

Tekanan oksidatif boleh mencetuskan apoptosis dan nekrosisdan dipercayai terlibat dalam neurodegenerasi (Ahmadinejad et al. 2017; Jami et al. 2014b, 2015). Tindak balas pertahanan selular utama kepada tekanan oksidatif ialah induksi antioksidan dan detoksifikasi enzim.

Faktor nuklear-erythroid 2-faktor berkaitan 2(Nrf2) mengikat unsur tindak balas antioksidan penggalak (ARE) dan mengaktifkan transkripsinya. Nrf2 yang tidak aktif dikaitkan dengan proteinKeap1 yang mengikat aktin dan dikekalkan dalam sitoplasma.

Dicetuskan oleh tekanan oksidatif, Nrf2 terfosforilasi sebagai tindak balas kepada protein kinase C, phosphatidylinositol 3-kinase, dan laluan kinase MAP. Nrf2 yang terfosforilasi kemudiannya boleh dipindahkan ke nukleus dan mengikat AREuntuk mentransaktivasi enzim penyahtoksin dan antioksidan (Jadual Tambahan 3) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com