Pengesanan Dan Pencirian Zarah Nano Mineralo-organik dalam Buah Pinggang Manusia

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* et al

Kalsifikasi ektopik dikaitkan dengan pelbagai penyakit manusia, termasuk aterosklerosis, kanser,kronikbuah pinggangpenyakit, dankencing manismellitus. Walaupun nanopartikel mineral telah dikesan dalam saluran darah terkalsifikasi, sifat dan peranan zarah ini dalam tubuh manusia masih tidak jelas. Di sini kita tunjukkan buat pertama kalinya manusia itubuah pinggangtisu yang diperolehi dari peringkat akhirkronikbuah pinggangpenyakitatau pesakit kanser buah pinggang mengandungi bulat, zarah mineral multilamellar 50 hingga 1,500 nm, manakala tiada zarah diperhatikan dalam kawalan sihat. Zarah mineral ditemui terutamanya dalam matriks ekstraselular yang mengelilingi tubul berbelit-belit, saluran pengumpul dan gelung Henle serta dalam sitoplasma sel penentu garis tubul, dan terdiri daripada kalsium fosfat polihabluran yang serupa dengan mineral yang terdapat dalam tulang dan kalsifikasi ektopik. Thebuah pinggangnanopartikel mineral mengandungi beberapa protein serum yang menghalang kalsifikasi ektopik dalam cecair badan, termasuk albumin, fetuin-A, dan apolipoprotein A1. Oleh kerana nanozarah mineral-organik ditemui bukan sahaja dalam deposit terkalsifikasi tetapi juga di kawasan yang tidak mempunyai kalsifikasi mikroskopik, pemerhatian kami menunjukkan bahawa nanozarah mungkin mewakili prekursor kalsifikasi dan batu buah pinggang pada manusia.

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kalsifikasi ektopik dikaitkan dengan aterosklerosis, kanser,kronikbuah pinggangpenyakit, dan diabetes mellitus1–3. Kajian terbaru menunjukkan bahawa aterosklerosis dankronikbuah pinggangpenyakitpesakit dengan tanda-tanda kalsifikasi vaskular menunjukkan peningkatan morbiditi dan risiko kematian, menunjukkan bahawa kalsifikasi ektopik memudaratkan kesihatan manusia1,3. Kalsifikasi yang tidak diingini juga diperhatikan pada individu yang semakin tua dan kebanyakan orang yang berumur lebih dari 60 tahun menunjukkan tanda-tanda kalsifikasi vaskular4. Atas sebab-sebab ini, menguraikan faktor-faktor yang mendorong kalsifikasi ektopik dan membangunkan rawatan yang berkesan mewakili matlamat penting.

Kalsifikasi ektopik boleh ditakrifkan sebagai ketidakseimbangan antara perencat dan induser kalsifikasi dalam badan. Inhibitor kalsifikasi termasuk protein serum seperti albumin, fetuin-A, osteopontin, dan protein GLA matriks serta sebatian kecil seperti pirofosfat, manakala hiperfosfatemia dan keradangan mewakili induktor utama kalsifikasi5-7. Kajian terbaru menunjukkan bahawa induser kalsifikasi mengaktifkan proses selular yang serupa dengan pembentukan tulang semasa kalsifikasi vaskular7,8. Vesikel matriks yang serupa dengan yang mendorong mineralisasi dalam pembentukan tulang juga telah dikesan dalam tisu lembut terkalsifikasi7–9. Vesikel matriks ini mungkin dikeluarkan oleh sel otot licin vaskular yang membezakan kepada sel seperti osteoblas, yang mendorong kalsifikasi7.

Nanopartikel mineral (NPs) telah dikesan dalam tisu lembut yang menunjukkan tanda-tanda kalsifikasi ektopik. Harga et al. mendapati bahawa serum tikus yang dirawat sama ada dengan bifosfonat etidronate atau dengan vitamin D mengandungi kompleks mineral-protein yang mengandungi perencat kalsifikasi fetuin-A dan protein GLA matriks10,11. Begitu juga, Jahnen-Dechent et al. memerhatikan bahawa kompleks mineral yang mengandungi fetuin-A, yang dipanggil zarah calciprotein (CPP), boleh dikesan dalam cecair ascitic pesakit dengan peritonitis kalsifikasi12. Kajian terbaru oleh Bertazzo et al. menunjukkan kehadiran NP mineral dalam injap aorta dan arteri koronari kedua-dua pesakit aterosklerotik dan demam reumatik13. Walaupun kajian tentang pembentukan zarah mineral biasanya tertumpu pada sistem kardiovaskular manusia, masih tidak jelas sama ada zarah itu boleh ditemui dalam tisu lain dan sama ada entiti ini memainkan peranan dalam kesihatan atau penyakit.

Kami memerhatikan sebelum ini bahawa NPS mineral-organik terbentuk secara spontan dalam cecair badan manusia dan haiwan14–28. NP mineral ini pada mulanya digambarkan sebagai nanobakteria (NB) dan dipercayai bukan sahaja sel terkecil di bumi29, tetapi juga kemungkinan penyebab pelbagai penyakit, termasuk penyakit Alzheimer, aterosklerosis, kanser,buah pinggangbatupembentukan, polikistikbuah pinggangpenyakit, dan prostatitis30–32. Walau bagaimanapun, keputusan kami telah menunjukkan bahawa NB sebenarnya adalah NP mineral bukan hidup yang meniru bakteria biasa dari segi morfologi, pertumbuhan, percambahan, dan subkultur15,18,22. Kemungkinan zarah mineral yang serupa dengan apa yang dipanggil NB boleh ditemui dalam tisu manusia dan sama ada zarah ini memainkan peranan dalam penyakit masih perlu diperiksa.

Dalam kajian ini, kami membangunkan pendekatan bahan nano untuk mengesan dan menganalisis NP mineral-organik dalam manusia yang berpenyakit.buah pinggangtisu. Kami menunjukkan bahawa tisu buah pinggang daripada penyakit buah pinggang kronik peringkat akhir dan pesakit kanser buah pinggang mengandungi NP mineral multilamellar yang serupa dengan zarah mineral biomimetik yang secara spontan memendakan dalam cecair badan secara in vitro. Keputusan kami mendedahkan pandangan kritikal mengenai komposisi biokimia, mekanisme pembentukan, dan fungsi biologi zarah mineral-organik ini dan ia memberi penerangan tentang mekanisme kalsifikasi ektopik dan permulaan penyakit dalam tubuh manusia.

Keputusan

Kami memeriksa tisu buah pinggang yang dikeluarkan melalui pembedahan daripada pesakit manusia yang menghidap penyakit buah pinggang kronik peringkat akhir (n=2) atau kanser buah pinggang (n=18; lihat Jadual 1; untuk sampel kanser buah pinggang, kami menumpukan pada bukan -bahagian tisu kanser). Sebagai kawalan yang sihat, kami mengkaji biopsi buah pinggang yang diperoleh daripada pesakit sama ada trauma atau hematoma tetapi tidak mempunyai fungsi buah pinggang yang tidak normal sebelumnya (n=2; Jadual 1).

Tisu buah pinggang daripada individu yang sihat menunjukkan ciri histologi normal, dan tiada kalsifikasi ektopik diperhatikan selepas pewarnaan von Kossa (Rajah 1A, B). Sebaliknya, tisu buah pinggang yang diperoleh daripada individu yang berpenyakit dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E) menunjukkan bukti kerosakan tisu (Rajah 2A–C, ditunjukkan dengan anak panah), dan 80 peratus daripada tisu berpenyakit yang diperiksa menunjukkan mendapan mineral seperti yang didedahkan. oleh pewarnaan von Kossa (Rajah 1C–T, Rajah 2E, F, kalsifikasi boleh dilihat sebagai bahan hitam yang ditunjukkan oleh anak panah hitam; lihat juga Jadual 1). Mendapan terkalsifikasi diperhatikan dalam korteks dan medula, termasuk ruang ekstraselular yang mengelilingi tubul berbelit distal, tubul berbelit proksimal, saluran pengumpul dan gelung Henle serta sitoplasma sel yang menggambarkan tubul dan saluran (Rajah 1C–T dan Rajah 1). 2E, F). Tiada kalsifikasi dikesan dalam corpuscle renal (Rajah 2D).

Untuk mengkaji sifat mendakan mineral, kami menyediakan bahagian buah pinggang ultra nipis untuk pemerhatian oleh mikroskop elektron penghantaran (TEM). Dalam spesimen yang mengandungi mendapan mineral mikroskopik, zarah atau butiran mineral dikesan dalam sitoplasma sel epitelium buah pinggang, dalam matriks ekstraselular di bawah membran bawah tanah, dan dalam lumen tubul berbelit proksimal dan distal (Rajah 3A, B, zarah diperbesarkan. dalam panel A1–A4 dan B1–B4). NP mineral juga diperhatikan dalam sel yang melapisi gelung Henle dan saluran pengumpul (Rajah 3C, D, diperbesarkan dalam panel C1, C2, dan D1). Beberapa zarah ditemui dalam vesikel intraselular dalam sel buah pinggang (Rajah 3A, panel A1 dan A2). Pendekatan mikroskop elektron yang digunakan di sini juga membolehkan kami memvisualisasikan bahagian dalam zarah mineral; sesetengah zarah mempunyai cincin padat elektron berselang seli dengan lapisan cahaya, cahaya elektron (Rajah 3A, panel A3 dan A4, Rajah 3C, panel C1). Beberapa saluran darah, seperti sewa vasa recta (arteri lurus buah pinggang), kita dikelilingi oleh sejumlah besar NP mineral (Rajah 3D, panel D1). Oleh itu, NP mineral ditemui di pelbagai lokasi dalam semua tisu buah pinggang manusia yang menunjukkan tanda-tanda kalsifikasi ektopik, manakala tiada zarah ditemui dalam kawalan sihat yang diperiksa.

Zarah mineral yang terdapat dalam tisu buah pinggang kelihatan sangat serupa dengan NP mineralo-organik yang diterangkan terbentuk secara spontan dalam cecair badan dalam kajian terdahulu kami15,17 (dan yang kami namakan bion24). Untuk mengesahkan kemungkinan ini, kami menyediakan NP organik mineral (atau bion) menggunakan kaedah pemendakan seperti yang kami nyatakan sebelum ini15. Kaedah ini terdiri daripada menambah ion pemendakan seperti kalsium dan fosfat ke dalam medium kultur sel (medium Eagle's modified Dulbecco atau DMEM) yang mengandungi cecair badan seperti serum manusia (HS), diikuti dengan pengeraman dalam keadaan kultur sel (lihat Kaedah). Zarah yang dihasilkan dengan cara ini (HS-NPS) adalah sama ada sfera atau ellipsoid dan menunjukkan permukaan mineral yang licin atau berhablur (Rajah 4A–E), sama dengan zarah yang diterangkan sebelum ini dalam cecair badan22,23 serta dalam asites manusia12 dan arteri terkalsifikasi13. Zarah mineral sangat serupa dengan NP mineral atau butiran yang diperhatikan dalam tisu buah pinggang dari segi morfologi keseluruhannya, struktur berbilang lapisan dan ciri permukaan (Rajah 4F–J). Saiz zarah yang diperolehi HS dan butiran buah pinggang juga boleh dibandingkan, berbeza dari diameter 50 hingga 1,500 nm (Rajah 4A–E, F–J). Seperti yang dinyatakan di atas, beberapa butiran buah pinggang dikelilingi oleh membran lipid, mungkin mewakili vesikel kargo intraselular atau vesikel membran ekstraselular (Rajah 4H,I, membran dilambangkan dengan anak panah); struktur membran tersebut tidak terdapat dalam spesimen HS-NP yang disediakan secara in vitro (Rajah 4A–E). Pemerhatian ini menunjukkan bahawa butiran buah pinggang adalah serupa dengan NP mineralo-organik yang dipasang dalam serum.

Dengan menggunakan analisis pembelauan elektron kawasan terpilih, kami memerhatikan bahawa fasa mineral HS-NP yang telah dikupas secara in vitro terdiri daripada bahan nano polihabluran (Rajah 4E, inset; perhatikan gelang sepusat yang samar). Keputusan yang sama diperoleh untuk butiran buah pinggang (Rajah 4J, inset) dan untuk tulang dan kalsifikasi ektopik seperti yang diterangkan dalam kajian terdahulu33,35.

Kami mengkaji komposisi kimia HS-NPs dan butiran buah pinggang menggunakan spektroskopi sinar-X (EDX) penyebaran tenaga. HS-NPs menunjukkan puncak utama karbon (C), kalsium (Ca), oksigen (O), dan fosforus (P) (Rajah 4K), selaras dengan kehadiran mineral kalsium fosfat. Puncak rendah silikon (Si) juga dicatatkan dalam HS-NPs (Rajah 4K), mungkin mewakili konstituen zarah kecil. Butiran buah pinggang juga menunjukkan puncak karbon, kalsium, oksigen dan fosforus, menunjukkan mineral kalsium fosfat, bersama dengan puncak tambahan silikon dan besi (Fe) (Rajah 4L). Puncak uranium (U) dikaitkan dengan uranil asetat yang digunakan sebagai reagen kontras semasa penyediaan sampel (kehadiran uranium dalam beberapa sampel zarah mineral seperti butiran buah pinggang dan ketiadaannya dalam tisu kawalan dalam Rajah 4M mungkin dikaitkan dengan tingginya pertalian uranium untuk fosfat, seperti yang dilaporkan sebelum ini35). Kawal spektrum EDX tisu buah pinggang yang mengelilingi zarah menunjukkan puncak karbon dan oksigen (Rajah 4M), menunjukkan bahawa kalsium dan fosforus ditemui terutamanya dalam zarah mineral.

Kalsium: nisbah fosforus (Ca:P) HS-NPs dan butiran buah pinggang berbeza-beza daripada 0.65 hingga 1.18. Nisbah ini berbeza daripada nilai teori 1.67 yang diperhatikan untuk hidroksiapatit stoikiometri tetapi masih dalam julat yang dilihat sebelum ini untuk kristal kalsium fosfat dan apatit yang diperhatikan pada pelbagai darjah penghabluran15. Bersama-sama, penemuan ini mengesahkan bahawa butiran buah pinggang terdiri daripada NP kalsium fosfat.

Pelbagai protein telah didapati menghalang kalsifikasi ektopik secara sistemik dalam badan36,37. Selain itu, korona protein yang terdapat pada permukaan NP sintetik dipercayai menentukan pengagihan bio dan kesan zarah pada sel dalam vivo38,39. Sebaliknya, komposisi protein NP mineralo-organik yang terdapat dalam tisu buah pinggang manusia masih tidak difahami sepenuhnya. Kami mendapati sebelum ini bahawa albumin, fetuin-A, dan apolipoprotein-A1 (apo-A1) mewakili protein utama yang berinteraksi dengan NP mineralo-organik yang terbentuk dalam cecair badan17,20. Di sini kami menggunakan pelabelan immunogold untuk memeriksa kehadiran dan lokasi ultrastruktur protein ini dalam butiran buah pinggang.

Kami menggunakan antibodi poliklonal terhadap albumin serum manusia (HSA), fetuin-A serum manusia (HSF), apo manusia-1A dan keseluruhan HS untuk memeriksa kehadiran protein serum dalam HS-NP dan butiran buah pinggang. Kekhususan antibodi poliklonal (disediakan seperti yang diterangkan sebelum ini25) telah disahkan menggunakan Western blotting (Rajah 5). Setiap satu daripada antibodi poliklonal bertindak balas secara positif dengan HS-NP yang disediakan secara in vitro serta dengan butiran mineral yang terdapat dalam tisu buah pinggang manusia (Rajah 6A, B, panel A1-A3 dan B1-B3; titik hitam). Antibodi bertindak balas terutamanya dengan lapisan padat elektron atau teras gelap HS-NP dan butiran buah pinggang (Rajah 6A, B), menunjukkan bahawa kawasan gelap ini mungkin mengandungi tahap protein yang lebih tinggi berbanding dengan kawasan bercahaya elektron. Kawalan negatif yang dilakukan tanpa antibodi primer tidak menghasilkan tindak balas (Rajah 6A, B, panel A4 dan B4, kawalan). Kami membuat kesimpulan bahawa butiran buah pinggang mewakili NP mineralo-organik yang serupa dengan HS-NP berdasarkan bukan sahaja pada morfologi dan komposisi mineral tetapi juga pada pengikatannya kepada perencat kalsifikasi utama yang terdapat dalam serum.

Mikroskopi imunofluoresensi digunakan seterusnya untuk mengesahkan kehadiran butiran mineral yang mengandungi HSA dan HSF dalam buah pinggang manusia yang berpenyakit. Menggunakan teknik ini, tisu buah pinggang manusia menunjukkan

pewarnaan positif untuk kedua-dua protein dalam pelbagai kawasan, termasuk interstitium yang mengelilingi tubul renal serta sitoplasma sel-sel penentu garisan tubul (Rajah 7A, panel A1 dan A2). Agregat protein yang mengandungi kedua-dua albumin dan fetuin-A juga diperhatikan di kawasan ini, walaupun dalam jumlah yang lebih rendah berbanding dengan pewarnaan protein tunggal (Rajah 7A dan panel A3, pewarnaan digabungkan dalam warna kuning). Terutama, kami mendapati bahawa pewarnaan protein yang dikesan oleh imunofluoresensi bertindih rapat dengan corak kalsifikasi ektopik yang diperhatikan menggunakan pewarnaan von Kossa (Rajah 7A, B, kalsifikasi kelihatan sebagai bahan hitam yang ditunjukkan oleh anak panah dalam B). Keputusan ini memberikan sokongan lanjut untuk kehadiran zarah mineralo-organik dalam tisu buah pinggang manusia yang diperiksa.

Perbincangan

Walaupun kemajuan telah dibuat dalam pemahaman kita tentang interaksi antara NP sintetik dan sel manusia, kita tahu jauh lebih sedikit tentang kesan NP mineralo-organik yang terbentuk secara spontan dalam cecair badan. Kajian terdahulu kami telah menunjukkan bahawa zarah-zarah ini terbentuk dalam cecair biologi apabila kepekatan kalsium dan fosfat melebihi ketepuan15,16. Kami juga memerhatikan bahawa zarah ini dihayati oleh sel imun tetapi hanya zarah besar yang mendorong tindak balas imun pro-radang23. Walau bagaimanapun, pengedaran zarah-zarah ini dalam tisu manusia dan sama ada ia memainkan sebarang peranan fisiologi atau patologi dalam badan belum diperiksa setakat ini.

Dalam kajian ini, kami mengesan buat kali pertama NP mineralo-organik dalam buah pinggang pesakit manusia yang menderita sama ada penyakit buah pinggang peringkat akhir atau kanser buah pinggang. NP mineralo-organik yang dikesan mengandungi kalsium fosfat yang tidak terhablur sama dengan mineral tulang, serta albumin, fetuin-A, dan apo-A1 yang bertindak sebagai perencat kalsifikasi sistemik dalam cecair badan. Keputusan kami adalah bersetuju dengan laporan terdahulu yang menggambarkan kehadiran kompleks protein mineral dalam tisu vaskular dan cecair badan12,13,34,40. Oleh kerana zarah yang kami perhatikan ditemui di kawasan yang tidak mengandungi kalsifikasi mikroskopik, pemerhatian kami mencadangkan bahawa zarah mungkin mewakili prekursor kalsifikasi ektopik dalam tisu manusia. Memandangkan kemungkinan bahawa NP mineralo-organik boleh berkembang secara beransur-ansur dalam saiz dan menjalani penukaran zarah-ke-filem di bawah keadaan yang menggalakkan seperti yang diterangkan dalam kajian terdahulu kami15, 18, pemerhatian yang dibentangkan di sini mencadangkan bahawa prekursor mineral boleh membawa kepada pembentukan yang lebih besar. deposit mineral dalam vivo, seperti plak Randall dan batu karang.

Pemerhatian kami bahawa kalsifikasi ektopik mineral dan NP mineralo-organik ditemui dalam pelbagai struktur anatomi buah pinggang adalah konsisten dengan penemuan sebelumnya tentang kalsifikasi ektopik dalam organ ini41. Pemerhatian Evan et al. menunjukkan bahawa mineralisasi dalam buah pinggang pesakit dengan nefrolitiasis mungkin bermula dan berlaku terutamanya dalam tisu interstisial gelung Henle40,42. Pengarang ini memerhatikan bahawa mendapan mineral yang terbentuk di kawasan ini mungkin menonjol dari bahagian basal urothelium dan membawa kepada pembentukan batu karang. Pemerhatian kami mencadangkan bahawa, sebagai tambahan kepada gelung Henle, kawasan buah pinggang lain mungkin mengandungi NP mineral yang akhirnya mungkin berkembang untuk membentuk deposit mineral yang besar dalam buah pinggang manusia. Kami juga sedang menyiasat kemungkinan bahawa NP mineral yang terbentuk dalam peredaran darah boleh translokasi ke dalam tisu buah pinggang dan mendorong kalsifikasi ektopik dan pembentukan batu dalam buah pinggang.

Beberapa butiran buah pinggang yang dikesan dalam kajian ini terdapat dalam vesikel intrasel atau ekstraselular (Rajah 4H, I) dan ini adalah serupa dengan vesikel matriks yang ditunjukkan untuk mendorong kalsifikasi dalam tulang dan gigi7,8. Kami baru-baru ini memerhatikan bahawa vesikel yang diasingkan daripada serum manusia dan haiwan mendorong pembentukan NP mineral dan mendakan mikroskopik dalam vitro25 . Schlieper et al.34 juga memerhatikan bahawa zarah mineral yang terdapat dalam arteri dikaitkan dengan struktur membran dan mencadangkan bahawa vesikel matriks atau badan apoptosis mungkin mewakili nukleator zarah mineral dalam tisu ini. Begitu juga, Khan et al. melaporkan bahawa deposit kalsium fosfat yang terdapat dalam buah pinggang pesakit manusia dengan batu karang idiopatik dikaitkan dengan gentian kolagen dan vesikel matriks9. Keputusan ini menunjukkan bahawa NP mineralo-organik yang dikesan dalam tisu buah pinggang mungkin terbentuk melalui mekanisme yang melibatkan vesikel membran, keadaan yang serupa dengan apa yang dilihat dalam arteri aterosklerotik7,8. Sebaliknya, kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa kalsifikasi ektopik yang terdapat dalam arteri payudara wanita tidak dikaitkan dengan penanda sel osteogenik atau apoptosis43, menunjukkan bahawa mekanisme kalsifikasi mungkin khusus untuk organ atau konteks biologi yang terlibat. Selain itu, NP mineralo-organik seperti yang diterangkan di sini tisu buah pinggang manusia juga mungkin terbentuk kerana kegagalan mengekalkan kepekatan fisiologi ion (cth, kalsium dan fosfat) dan perencat kalsifikasi (cth, albumin, fetuin-A, dan apo). -A1) dalam cecair badan manusia.

Keputusan kami mencadangkan bahawa lapisan padat elektron dan teras NP mineral-organik mungkin mengandungi tahap protein dan molekul organik yang lebih tinggi berbanding dengan kawasan bercahaya elektron bagi zarah (Rajah 6A, B). Lapisan padat elektron ini kelihatan bermineral seperti yang dilihat oleh sifat kristal bahan ini di bawah TEM (lihat Rajah 4A–J). Pengarang lain, termasuk Ryall41 dan Evan et al.44, telah mencadangkan bahawa lapisan lusen elektron mungkin mewakili mineral manakala lapisan tumpat elektron mungkin sepadan dengan molekul organik. Tafsiran ini mungkin disebabkan sekurang-kurangnya sebahagian daripada cara sampel diproses dan diperiksa dalam setiap kajian serta sifat tisu permulaan yang digunakan.

Selain memainkan peranan dalam kalsifikasi ektopik, zarah mineral-organik boleh menyebabkan keradangan pada tisu buah pinggang. Kami telah menunjukkan baru-baru ini bahawa walaupun NP mineralo-organik gagal mendorong rembesan interleukin pro-radang-1 oleh makrofaj manusia, agregat mineral yang lebih besar daripada 1 μm mampu melakukannya23. Pembebasan interleukin-1 sebagai tindak balas kepada bahan kristal telah ditunjukkan bergantung pada pengaktifan kompleks molekul intraselular yang dipanggil inflammasomes45–47. Di samping itu, zarah mineral dikesan dalam buah pinggang yang menyimpan tumor dan persatuan antara kanser dan keradangan kini diiktiraf dengan baik48. Kemungkinan zarah mineral terkumpul boleh mengaktifkan inflammasom dan menyumbang kepada perkembangan keradangan dan kanser dalam buah pinggang atau tisu lain masih perlu disiasat.

Sebagai tambahan kepada kalsifikasi ektopik, butiran mineral yang diterangkan di sini mungkin mengambil bahagian dalam proses penyakit lain. Sebagai contoh, kami telah mencadangkan sebelum ini bahawa NP mineral boleh mengikat pelbagai protein dalam cecair badan dan menghabiskan molekul organik ini daripada cecair badan20,26. Sebaliknya, tubuh manusia boleh menghalang pembentukan dan pengumpulan NP mineral dalam keadaan biasa dengan bergantung pada kehadiran perencat kalsifikasi dan sistem retikuloendothelial (iaitu, makrofaj). Oleh itu, NP mineral mungkin terkumpul hanya sekali homeostasis kalsium sistemik atau tempatan terganggu dan apabila mekanisme perlindungan telah gagal dalam tubuh manusia.

Kami mencadangkan pendekatan bahan nano yang dibangunkan di sini boleh digunakan untuk mengkaji pembentukan NP mineralo-organik dalam tisu haiwan dan manusia. Sebagai contoh, antibodi yang dibangkitkan terhadap protein perencat kalsifikasi seperti albumin, fetuin-A, dan apo-A1 boleh digunakan dalam kombinasi dengan analisis mineral untuk mengesan dan mencirikan pembentukan NP mineralo-organik dalam tisu model haiwan. Keputusan yang diperoleh menggunakan pendekatan ini boleh digunakan untuk pengukuran klinikal yang dibuat pada cecair badan manusia untuk mengenal pasti parameter biologi yang mencerminkan keadaan pembentukan zarah mineral dan kalsifikasi ektopik dalam badan. Kami menjangkakan bahawa pengetahuan ini boleh membawa kepada pembangunan strategi terapeutik baru untuk mencegah dan merawat penyakit dan keadaan manusia yang berkaitan dengan kalsifikasi ektopik.

Kaedah

Tisu buah pinggang.Penggunaan tisu manusia dan eksperimen yang dilakukan dalam kajian ini telah diluluskan oleh Lembaga Kajian Institusi Hospital Memorial Chang Gung; kaedah dan eksperimen telah dijalankan mengikut garis panduan yang diluluskan. Persetujuan bertulis secara bertulis telah diperolehi daripada pesakit. Kawalan tisu buah pinggang yang sihat diperoleh daripada biopsi pesakit trauma dan hematoma tanpa sejarah penyakit buah pinggang (n=2); tisu buah pinggang juga diperoleh daripada pesakit kanser buah pinggang (n=20) dan daripada pesakit penyakit buah pinggang peringkat akhir (n=2) yang buah pinggangnya telah dikeluarkan atau dibiopsi semasa pembedahan pemindahan (Jadual 1). Untuk tisu kanser buah pinggang, bahagian tisu bukan kanser telah dibedah dan dianalisis dalam kajian ini.

Analisis histologi.Tisu buah pinggang dipasang pada blok parafin. Blok-blok tersebut dibelah dan hirisan tisu dipanaskan di atas plat panas pada suhu 70 darjah selama 30 minit untuk mengeluarkan parafin. Bahagian tersebut direndam ke dalam larutan xilena segar tiga kali selama 15 minit untuk mengeluarkan sepenuhnya baki parafin. Bahagian tersebut telah dihidrasi semula dengan 95 peratus, 80 peratus, dan 70 peratus etanol selama 5 minit setiap kali. Spesimen terhidrat semula dicuci dengan air suling dua kali (ddH2O) selama 5 minit. Nukleus sel telah diwarnai dengan hematoxylin selama 8 minit. Pewarna dikeluarkan daripada spesimen dengan air suam selama 10 minit. Spesimen buah pinggang dibilas dalam ddH2O dan dicelup 10 kali dalam etanol 95 peratus. Spesimen yang dirawat etanol telah diwarnakan balas dengan eosin Y selama 1 minit. Spesimen telah didehidrasi dengan 95 peratus dan 100 peratus etanol selama 10 minit setiap kali, diikuti dengan langkah dehidrasi dalam xilena selama 10 minit. Spesimen buah pinggang dehidrasi terakhir telah dipasang pada slaid kaca dengan gliserol 50 peratus dan diperhatikan di bawah mikroskop cahaya yang dilengkapi dengan kamera digital.

Spesimen yang dinyahparafin dan terhidrat semula telah disediakan seperti yang diterangkan untuk pewarnaan H&E. Bahagian terhidrat semula diwarnakan dengan perak nitrat (5 peratus ), diikuti dengan pendedahan kepada cahaya UV selama 20 minit. Larutan dicuci dengan ddH2O selama 15 minit. Bahagian tersebut diwarnakan dengan natrium tiosulfat (5 peratus ) selama 5 minit, diikuti dengan mencuci dengan ddH2O selama 15 minit. Bahagian itu diwarnai dengan merah pantas nuklear (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) selama 5 minit. Spesimen yang diwarnakan telah didehidrasi berturut-turut dengan 95 peratus dan 100 peratus etanol selama 10 minit setiap satu, sebelum dehidrasi dalam xilena selama 10 minit. Spesimen buah pinggang telah dipasang pada slaid kaca dan diperiksa seperti yang diterangkan di atas.

Mikroskopi elektron dan analisis EDX.Sampel buah pinggang dipotong menjadi kepingan kecil dengan ketebalan kurang daripada 1 mm menggunakan mikroskop pembedahan LGPS (Olympus, Tokyo, Jepun). Tisu telah dibetulkan dengan 2.5 peratus glutaraldehid dan 1 peratus paraformaldehid dalam 0.1 M penampan cacodylate pada 4 darjah semalaman. Sampel tetap dibasuh tiga kali dengan 0.1 M penampan cacodylate dalam 8 peratus sukrosa (pH 7.2) pada ais selama 10min. Tisu yang telah dibasuh diinkubasi dalam salin penampan fosfat (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) yang mengandungi 1 peratus osmium tetroksida dan 1.5 peratus kalium ferrocyanide selama 2 jam di atas ais. Tisu telah dibasuh dengan ddH2O pada ais 10 minit tiga kali. Tisu yang dibasuh diwarnakan pada ais dengan 1 peratus uranil asetat dalam ddH2O selama 1 jam, sebelum dibasuh tiga kali dengan ddH2O pada ais. Tisu buah pinggang telah dehidrasi dengan 30, 50, 70, 80, dan 90 peratus etanol selama 10 minit setiap kali, kecuali apabila etanol mencapai 70 peratus, dalam kes ini sampel disimpan pada suhu 4 darjah semalaman. Tisu diwarnai dengan 1 peratus asid fosfotungstik dalam 95 peratus etanol selama 15 minit, sebelum dehidrasi dengan 95 peratus etanol selama 5 minit. Spesimen telah direndam ke dalam propilena oksida pada 40, 57, 67, dan 100 peratus dalam etanol selama 10 minit setiap kali, diikuti dengan rendaman lain dalam 100 peratus propilena oksida selama 5 minit. Tisu buah pinggang telah menyusup dengan 50, 70, dan 100 peratus Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) selama 1 jam setiap kali. Eponat 812-sampel buah pinggang tertanam telah disediakan dengan mengeram dua kali ke dalam 100 peratus Eponat. Sampel tertanam diinkubasi ke dalam ketuhar pada 60 darjah semalaman untuk membolehkan pempolimeran resin.

Pelet HS-NP yang telah dibasuh yang diperoleh seperti di atas telah difiksasi dengan glutaraldehid (2.5 peratus ) dan paraformaldehid (1 peratus ) dalam ddH2O selama 4 jam pada 4 darjah . Pelet tetap dibasuh dengan ddH2O tiga kali selama 10 minit setiap kali. Pelet telah didehidrasi dengan pengeraman berturut-turut ke dalam etanol 30, 50, 70, 80, 90, 95, dan 100 peratus, selama 10 minit setiap kali, kecuali apabila etanol mencapai 70 peratus, di mana pelet disimpan pada suhu 4 darjah semalaman. Larutan etanol lain hanya disentuh dengan pelet selama 10 minit. Pelet dehidrasi telah menyusup dengan medium benam putih LR (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) menggunakan nisbah etanol dan medium LR (3:1, 1:1, dan 1:3) yang berbeza selama 30 minit setiap satu. Pelet telah menyusup dengan medium LR segar (100 peratus) semalaman sebelum pempolimeran. Pelet yang diserap dengan medium LR diinkubasi dalam ketuhar pada suhu 60 darjah selama 2 hari untuk membolehkan pempolimeran resin. Blok buah pinggang dan HS-NP dipotong untuk menghasilkan kepingan dengan ketebalan 70-100 nm menggunakan mikrotom Reichert Ultracut S (Leica, Wetzlar, Jerman). Bahagian tisu telah diwarnai dengan 4 peratus uranil asetat sebelum visualisasi di bawah mikroskop elektron penghantaran JEM 1230 (JEOL, Tokyo, Jepun) dikendalikan pada 100 kV. Corak pembelauan elektron diperoleh menggunakan sistem yang sama. Grid nikel digunakan sebagai sokongan.

Untuk analisis EDX, bahagian nipis tisu buah pinggang diwarnakan dengan uranil asetat dan dibasuh dengan ddH2O seperti di atas, diikuti dengan pengeringan dalam kabinet desikator elektronik. Spesimen telah diperhatikan di bawah mikroskop elektron penghantaran JEM 2100 (JEOL) resolusi tinggi yang dikendalikan pada 120 kV. Spektrum EDX diperolehi dalam tiga kali ganda menggunakan sistem INCA Energy EDS (Oxford Instruments, Abingdon, UK). Bahagian nipis HS-NPs diperhatikan tanpa pewarnaan.

Penyediaan NP mineralo-organik.Semua penyelesaian permulaan telah dilaraskan kepada pH 7.4 dan disterilkan melalui penapisan melalui 0.2μm membran sebelum digunakan. HS diperoleh daripada sukarelawan manusia yang sihat menggunakan teknik venipuncture konvensional. Penggunaan cecair biologi manusia dalam kajian ini telah diluluskan oleh Lembaga Kajian Institusi Hospital Memorial Linko Chang Gung dan persetujuan bertulis secara bertulis diperoleh daripada sukarelawan. HS-NPs disediakan dengan menambahkan 3 mM CaCl2 dan Na2HPO4 setiap satu ke dalam DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) yang mengandungi 10 peratus HS, diikuti dengan pengeraman selama satu minggu dalam keadaan kultur sel (37 darjah, 5 peratus CO2, udara lembap). Zarah-zarah tersebut telah dipeli dengan sentrifugasi pada 16,000 ×g selama 15min pada 4 darjah dan dibasuh dua kali dengan penimbal HEPES (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) menggunakan prosedur sentrifugasi yang sama.

SDS-PAGE dan Western blotting.Analisis SDS-PAGE dan Western blot dilakukan pada asasnya seperti sebelum15. Secara ringkas, 0.2 ug (Rajah 5A,D) atau 1.2 ug (Rajah 5B,C) protein HS, 47 ug (Rajah 5A,B,D) atau 590ug protein HS-NP (Rajah 5C), 0.1ug HSA (Rajah 5A–D), dan 0.6ug (Rajah 5A, C, D) atau {{23} }.15ug HSF (Rajah 5B) telah dilarutkan dalam 5× "penampan pemuatan" (0.313 M Tris-HCl pH 6.8, 10 peratus SDS, 0.05 peratus biru bromofenol, 50 peratus gliserol, 12.5 peratus - mercaptoethanol) kepada kepekatan akhir 1×, sebelum dipanaskan pada 95 darjah selama 5min dan pengasingan di bawah keadaan penyahnatutan dan pengurangan pada 10 peratus SDS-PAGE menggunakan sistem mini-gel (Hoefer, Holliston, MA). Kawalan NP (digunakan dalam lorong 1 Rajah 5A–D) terdiri daripada NP mineral yang disediakan dengan menambahkan 3 mM CaCl2 dan Na2HPO4 setiap satu ke dalam DMEM (isipadu akhir 1ml), diikuti dengan pengeraman selama satu hari dalam keadaan kultur sel; zarah-zarah telah dipeli dengan sentrifugasi pada 16,000 ×g selama 15min, dibasuh dua kali dengan penimbal HEPES dan digantung semula dalam 50ul penimbal HEPES. Aliquot 20ul zarah terampai semula telah diproses untuk SDS-PAGE seperti di atas. Membran PVDF disekat selama 1j dalam 5 peratus (b/v) susu yang dinyahlemak pada suhu bilik. Antibodi utama yang dijana secara dalaman seperti yang diterangkan sebelum25 digunakan pada pencairan 1:1,000 (-apo-A1 dan -HS-NP), 1:3,000 ( -HSF) , atau 1:6,000 ( -HSA). Antibodi sekunder konjugasi peroksidase anti-arnab lobak pedas kambing digunakan berdasarkan arahan yang diberikan oleh pengilang (Millipore, Billerica, MA). Tompok itu didedahkan menggunakan chemiluminescence yang dipertingkatkan (Amersham Biosciences, Amersham, UK) dan filem autoradiografi.

Pelabelan imunogold.Sampel telah disediakan untuk pemerhatian TEM. Blok HS-NP telah dibahagikan kepada kepingan kurang daripada 70 nm tebal. Bahagian sampel pada grid telah disekat dengan 1 peratus gelatin ikan (Sigma) dalam 0.1 M penampan HEPES (pH 8.0) selama 25min. Grid telah diinkubasi dengan antibodi utama berikut: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Kawalan negatif tidak mengandungi antibodi primer (1 peratus gelatin ikan dalam penimbal HEPES). Bahagian yang diinkubasi dibilas dengan penimbal HEPES selama 15 minit. Bahagian yang telah dibilas disekat dengan gelatin ikan 1 peratus dalam penimbal HEPES selama 20 minit. Spesimen telah dirawat dengan 5-nm-emas-konjugat kambing anti-arnab IgG sekunder selama 1 jam. Spesimen telah dibasuh dengan penimbal HEPES selama 10 minit, sebelum dibasuh dengan ddH2O selama 10 minit. Pemerhatian TEM telah dilakukan seperti di atas.

Mikroskopi pendarfluor.Slaid tisu buah pinggang histologi yang disediakan seperti di atas telah disekat dengan 1 peratus albumin serum lembu selama 1 jam pada suhu bilik. Slaid telah diinkubasi dengan antibodi poliklonal primer pada pencairan 1:4,000. Selepas langkah mencuci, sampel diinkubasi dengan antibodi sekunder kambing anti-arnab-FITC (492/520nm) dan kambing anti-arnab-TRITC (550/570nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) pada 1:100 untuk 1j. Kompleks dicuci dengan PBST selama 15 minit. Pewarna pendarfluor 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) telah digunakan pada 10 ug/ml selama 15 minit. Spesimen yang diwarnakan DAPI telah didehidrasi dengan 95 dan 100 peratus etanol selama 10 minit setiap satu, diikuti dengan dehidrasi dalam xilena selama 10 minit lagi. Spesimen buah pinggang dehidrasi telah dipasang dengan medium pelekap pendarfluor Vectashield H-1000 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) dan diperhatikan di bawah mikroskop confocal (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Jerman) dilengkapi dengan kamera Spot Flex.

Cistanche tubulosa mencegah penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel

Rujukan

1. Giachelli, CM Kalsifikasi ektopik: mengumpul fakta keras tentang mineralisasi tisu lembut. Am J Pathol 154, 671–675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Kalsifikasi vaskular: mekanisme dan kesan klinikal. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1161–1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Kalsifikasi dalam aterosklerosis. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Corak dan faktor risiko untuk aterosklerosis berkalsifikasi sistemik. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 331–336 (2004).

5. Ketteler, M. et al. Kekurangan protein kawal selia kalsium dalam pesakit dialisis: konsep baru kalsifikasi kardiovaskular dalam uremia. Buah Pinggang Int Suppl 84, S84–87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Menyasarkan kalsifikasi vaskular: melembutkan sasaran yang keras. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Peraturan kalsium vesikel matriks yang berasal dari sel otot licin vaskular. Trend Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM et al. Kalsifikasi dalam aterosklerosis: biologi tulang dan keradangan kronik di persimpangan arteri. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Persatuan plak Randall dengan gentian kolagen dan vesikel membran. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Harga, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Pencirian biokimia kompleks serum fetuin-mineral. J Biol Chem 278, 22153–22160 (2003).

11. Harga, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Tahap serum kompleks mineral janin berkorelasi dengan kalsifikasi arteri pada tikus. J Biol Chem 279, 1594–1600 (2004).

12. Heiss, A. et al. Peranan hierarki fetuin-A dan protein serum berasid dalam pembentukan dan penstabilan zarah kalsium fosfat. J Biol Chem 283, 14815–14825 (2008).

13. Bertazzo, S. et al. Mikroskopi elektron analisis nano mendedahkan pandangan asas ke dalam kalsifikasi tisu kardiovaskular manusia. Nat Mater 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Mengatakan nanobakteria dalam darah manusia sebagai nanopartikel kalsium karbonat. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).

15. Muda, JD et al. Nanobakteria Putative mewakili sisa fisiologi dan hasil sampingan kultur homeostasis kalsium normal. Plos One 4, e4417 (2009).

16. Muda, JD et al. Pencirian granulasi kalsium dan apatit dalam serum sebagai kompleks mineralo-protein pleomorfik dan sebagai prekursor nanobakteria diduga. Plos One 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuin-A/albumin-mineral kompleks yang menyerupai butiran kalsium serum dan nanobakteria dugaan: demonstrasi konsep pembenihan perencatan dwi. Plos One 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Kebangkitan dan kejatuhan nanobakteria. Sci Am 302, 52–59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Penilaian kritikal serum sinaran gamma yang digunakan sebagai penyuap dalam kultur dan demonstrasi nanobakteria putatif dan nanopartikel kalsifikasi. Plos One 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. et al. Analisis proteomik komprehensif bagi nanopartikel mineral yang diperoleh daripada cecair badan manusia dan dianalisis dengan spektrometri jisim tandem kromatografi cecair. Biokim Dubur 418, 111–125 (2011).