Pengasingan Berpandukan Dereplikasi Diglikosida Tergantikan Phenylpropanoid Baru Dari Cistanche Salsa Dan Aktiviti Perencatannya Pada NO Pengeluaran dalam Makrofaj

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk lebih

Abstrak:

Dereplikasi membolehkan pengecaman pantas bagi sebatian yang diketahui dan tidak diketahui dalam ekstrak tumbuhan. Dalam kajian ini, kami melakukan dereplikasi berasaskan kromatografi cecair-spektroskopi jisim (LC-MS) menggunakan data daripada ESI ditambah QTOF-MS untuk analisisglikosida yang digantikan dengan fenilpropanoid, juzuk aktif utama Cistanche salsa (CA Mey.) Beck. Menggunakan TOF-MS sahaja, substruktur sebatian ini boleh disahkan dengan jelas berdasarkan corak pemecahan ciri pelbagai pengeluaran. Pemprofilan berasaskan HPLC-MS bagi C. salsa juga membenarkan pengesanan yang baharufenilpropanoid-digantikanglikosida daripadatumbuhan ini. Daripada mereka, lima fenilpropanoid diganti barudiglikosida, dinamakan cistansalsides A–E (5, 6, 12, 17 dan 18), telah diasingkan. Struktur mereka telah dijelaskan melalui kaedah spektroskopi termasuk analisis NMR dan MS. Semua isolat telah diuji untuk aktiviti perencatan mereka terhadap pengeluaran NO dalam RAW 264.7 sel yang dirangsang oleh LPS. Daripada sebatian yang diuji, sebatian 5, 11, 13 dan 18 menunjukkan aktiviti perencatan sederhana pada NO sintase yang boleh diinduksi. Sebatian 11, 13 dan 18 juga menghalang fosforilasi NF-κB dalam makrofaj. Tiada satu pun daripada sebatian tersebut menunjukkan ketarasitotoksisiti. 

Kata kunci:dereplikasi; diglikosida yang digantikan dengan fenilpropanoid; salsa cistanche; anti-radang

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

pengenalan

Cistanche salsa (CA Mey.) Beck, tergolong dalam keluarga Orobanchaceae, adalah tumbuhan parasit yang memperoleh khasiatnya daripada akar Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) dan tumbuhan padang pasir yang lain [1]. Tumbuhan ini telah digunakan dalam perubatan tradisional untuk rawatan neurasthenia, disfungsi seksual dan kekurangan buah pinggang [2,3]. Dalam kajian fitokimia sebelum ini, telah dilaporkan bahawa keseluruhan tumbuhan C. salsa mengandungi pelbagai jenis sebatian termasuk glikosida phenylethanoid dan glikosida iridoid [4–7]. Phenylethanoid glycosides, seperti acteoside dan echinacoside, adalah konstituen aktif utama tumbuhan [8]. Ekstrak C. salsa menunjukkan sifat berfaedah, termasuk aktiviti imunomodulator, antikanser dan anti-radang [9,10]. Dereplikasi ialah proses di mana campuran sampel akan diuji untuk membezakan juzuk yang tidak diketahui daripada sebatian yang diketahui. Strategi dereplikasi adalah berdasarkan teknik analisis dan pencarian pangkalan data untuk mengenal pasti metabolit sekunder pada awal proses penyelidikan fitokimia [11]. Daripada teknik analisis, ESI-QTOF-MS (electrospray ionization-quadrupole-time of flight-mass spectroscopy) boleh memberikan maklumat berharga tentang struktur kimia metabolit sekunder. Pecahan berpandukan dereplikasi berasaskan LC-MS telah ditunjukkan untuk membolehkan pengekstrakan dan penulenan metabolit sasaran daripada ekstrak mentah tumbuhan dengan kecekapan tinggi [12-15]. Kajian ini melakukan dereplikasi berasaskan LC-MS menggunakan data daripada ESI ditambah TOF-MS untuk analisis diglikosida tersubstitusi fenilpropanoid, juzuk aktif utama C. salsa. Data TOF-MS boleh mencadangkan substruktur sebatian ini berdasarkan corak pemecahan ciri pelbagai ion produk. Berdasarkan dereplikasi ini, profil LC-MS bagi pecahan etil asetat (EtOAc) dan pecahan larut air telah dianalisis. Pecahan EtOAc tertakluk kepada strategi dereplikasi untuk pemisahan selanjutnya, mengakibatkan pengasingan diglikosida tersubstitusi fenilpropanoid baru dan 13 sebatian yang diketahui (Rajah 1). Telah disahkan bahawa struktur diglikosida yang digantikan fenilpropanoid secara tentatif dipadankan dengan betul dengan struktur sebenar mereka. Di samping itu, aktiviti anti-radang isolat telah diterokai.

Keputusan dan perbincangan

Diglikosida tersubstitusi fenilpropanoid yang diasingkan daripada C. salsa biasanya mempunyai struktur berdasarkan glikosida disakarida, yang terdiri daripada glukosa dan rhamnose dengan hubungan Rha (1→3) Glc dan satu substituen sinamoyl, seperti asid coumaric (Cou), kafeik. asid (Caf) dan asid feruloil (Fer), pada kedudukan C-4 atau C-6 glukosa. Aglikon biasanya dilekatkan pada kedudukan C-1 glukosa. Struktur diglikosida yang digantikan dengan fenilpropanoid dengan kumpulan asetil pada C{7}} glukosa sering dilaporkan [6,12,16]. Untuk melakukan dereplikasi, corak pemecahan MS sebatian ini dianalisis dengan mod positif ESI-QTOF-MS. Dalam spektrum MS, semua diglikosida yang digantikan dengan fenilpropanoid menghasilkan puncak ion tambah pada [M tambah NH4] tambah , [M tambah K] tambah dan [M tambah Na] tambah, yang memberikan berat molekul dan formula. Corak ion serpihan boleh didapati dengan kehilangan berturut-turut sisa aglikon dan glikosida ([M tambah H − Aglikon] tambah , [M tambah H − Aglikon − Rha] tambah dan [M tambah H − Aglikon – Rajah 1. Struktur sebatian 1–18. 2. Keputusan dan Perbincangan Diglikosida yang digantikan dengan fenilpropanoid yang diasingkan daripada C. salsa biasanya mempunyai struktur berdasarkan glikosida disakarida, yang terdiri daripada glukosa dan rhamnose dengan hubungan Rha (1→3) Glc dan satu substituen sinamoyl, seperti asid kuumarik (Cou), asid kafeik (Caf) dan asid feruloyl (Fer), pada kedudukan C-4 atau C-6 glukosa. Aglikon biasanya dilekatkan pada C{{24 }} kedudukan glukosa. Struktur diglikosida tersubstitusi fenilpropanoid dengan kumpulan asetil pada C-2 glukosa telah kerap dilaporkan [6,12,16]. Untuk melakukan dereplikasi, pola pemecahan MS sebatian ini telah dianalisis dengan mod positif ESI-QTOF-MS. Dalam spektrum MS, semua digliko yang digantikan fenilpropanoid sisi menghasilkan puncak ion tambah pada [M tambah NH4] tambah , [M tambah K] tambah dan [M tambah Na] tambah, yang memberikan berat molekul dan formula. Corak ion serpihan boleh didapati dengan kehilangan berturut-turut sisa aglikon dan glikosida ([M tambah H − Aglikon] tambah , [M tambah H − Aglikon − Rha] tambah dan [M tambah H − Aglikon – Rha − Glc (atau Asetil -Glc)] plus ), yang berguna untuk meramalkan jenis substituen cinnamoyl dan gula. Ion serpihan pada m/z 163 kumpulan caffeoyl, m/z 147 kumpulan kuumaroyl atau m/z 177 kumpulan feruloyl memberikan isyarat ciri substituen sinamoyl dalam diglikosida tersubstitusi fenilpropanoid [4,15] ( Rajah 2). Analisis ion serpihan akan memberikan maklumat yang berguna untuk mengenal pasti struktur diglikosida yang digantikan dengan fenilpropanoid. Walau bagaimanapun, isomer mereka tidak dapat dibezakan dengan spektrometri MS sahaja. Untuk pengecaman tepat struktur lengkap mereka, spektrum NMR diperlukan.

Semua isolat telah diuji untuk kesan perencatannya pada pengeluaran NO yang disebabkan oleh LPS dalam sel RAW 264.7. Dexamethasone telah digunakan sebagai kawalan positif dan IC5nya0 ialah 7.0 µM. Daripada sebatian yang diuji, sebatian 5 (IC50 42.7 ± 6.6 µM), 11 (IC50 37.3 ± 2.2 µM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} ± 4.0 µM) dan 18 (IC50 27.9 ± 0.8 µM) menunjukkan aktiviti perencatan sederhana pada NO synthase yang boleh diinduksi, manakala sebatian lain tidak aktif dalam ujian ini (IC50 nilai > 100 µM). Untuk mengesahkan sama ada sebatian ini mempunyai sitotoksisiti, daya maju sel diukur menggunakan ujian MTT. Akibatnya, tiada satu pun daripada mereka menunjukkan sitotoksisiti yang ketara (Tambahan Rajah S6-1). Empat sebatian ini dipilih untuk menilai aktiviti perencatan mereka terhadap laluan NF-κB dalam sel RAW 264.7 yang dirangsang LPS. Rangsangan sel RAW 264.7 dengan LPS mendorong fosforilasi IκB dan NF-κB (p65) selepas 0.5 jam pengeraman. Fosforilasi NF-κB (p65) telah dikurangkan dengan ketara oleh prarawatan dengan sebatian 11, 13 dan 18 seperti yang ditunjukkan oleh analisis blot barat (Rajah 5). Oleh itu, sebatian 11, 13 dan 18 mungkin memberikan kesan anti-radang melalui perencatan NF-κB dalam makrofaj.

Bahan dan Kaedah

Putaran optik diukur dengan polarimeter digital Jasco P-2000 (Jasco, Tokyo, Jepun). Spektrum UV telah direkodkan pada spektrometer Chirascan plus Circular Dichroism(Chirascan, APL, UK). Spektrum IR telah dirakam menggunakan spektrofotometer Jasco FT/IR-4200. Pengionan elektrospray resolusi tinggi spektrometri jisim quadrupole-time-of-flight (HR-ESI-qTOF-MS) telah dilakukan pada Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS yang dilengkapi dengan siri Agilent 1260 Infinity(Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, USA),dan lajur yang digunakan ialah lajur Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id150 ×4.6 mm,5 um). Perisian MassHunter Workstation digunakan untuk pemerolehan data.

Spektrum NMR 1D (H dan 13C) dan 2D('H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) diperoleh dengan Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Jepun), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 dan Bruker AVANCE 800 HDspektrometer digabungkan dengan cryoprobe (Bruker, Ettlingen, Jerman). DMSO-d6(Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Andover, MA, USA) digunakan sebagai pelarut NMR dan puncak rujukan（6H 2.50 dan δc 39.5）. Kromatografi lajur （CC） dilakukan menggunakan Sephadex LH-20(25-100 um; Pharmacia, Uppsala, Sweden) atau Kieselgel 60 silika gel(40-63 um,230-400 mesh, Art 9385; Merck, Darmstadt, Jerman). Kromatografi lapisan nipis(TLC) telah dijalankan pada plat Kieselgel 60 silika gel F254 pra-bersalut (Art.5715;Merck). Tompok pada TLC dikesan menggunakan lampu UV pada 254 nm dan 365 nm (VL-4.LC, 365 /254;Vilber Lourmat, Torcy, Perancis). Kromatografi cecair tekanan sederhana (MPLC) telah dilakukan pada lajur kilat silika RediSep 120g (lsco, Lincoln, NE, USA) dan gel silika Kiesegel 60 (40-63 um,230-400 mesh, Art.9385; Merck )menggunakan rakan Combiflash (Isco). Sistem kromatografi cecair tekanan tinggi (HPLC) ialah HPLC Gilson yang dilengkapi dengan pam Gilson 321 dan pengesan UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, Amerika Syarikat), menggunakan lajur ODS separuh persediaan（Luna 5 um C18 （2） 100 Å, id 250×10 mm, 5 μm, Phenomenex Inc, Torrance, CA, Amerika Syarikat; Hypersil GOLDrM aQ 175A,id250×10mm,5 um, Thermo ScientificTM, Hennigsdorf,Jerman;Inno C18column 120 A,id250× 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea).RP- analitikal Sistem HPLC ialah sistem perikatan Waters 2695 dengan pengesan 996 Photodiode Array(PDA) (Waters Corp, Milford, MA, USA), dan lajur yang digunakan ialah HypersilTM BDS C18column （130 A, id150×4.6 mm, 5 μm, Thermo ScientificTM）. Asid formik dibeli daripada Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd.(Seoul, Korea). Pelarut gred HPLC dibeli daripada Fisher Scientific Korea Ltd.(Seoul, Korea). HSOA, Na,CO dan pelarut gred pertama untuk pengekstrakan, pecahan dan pengasingan telah dibeli daripada Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seoul, Korea). L- dan D-cysteine ​​methyl ester hydrochloride dan o-tolylisothiocvanate telah dibeli dari Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Jepun).

Kesimpulan

Dalam kajian ini, kami mengasingkan dan menjelaskan struktur lima diglikosida tersubstitusi fenilpropanoid baharu, dinamakan cistansalside AE(5,6, 12, 17 dan 18), selain mengasingkan dan mengenal pasti 13 sebatian yang diketahui, menggunakan strategi nyahreplikasi. Sebatian yang diketahui telah ditentukan sebagai lipedoside AI(1)[21], 2'-acetylacteoside (2)[22], isocistanoside C(3)[15], osmanthuside B (4)[21], epimeridinoside A(7) [15], cistanoside D(8)[23], salsaside B(9) [6l, tubuloside E (10)[16]cistanoside M(11)[15],isomartynoside(13) [24], salsaside C(14 )[6], jionoside C(15)[25] dan salsaside F (16)[6]. Struktur mereka telah ditubuhkan melalui analisis data spektroskopi yang luas dan dengan perbandingan dengan data yang dilaporkan dalam kesusasteraan. Telah disahkan bahawa struktur diglikosida yang digantikan fenilpropanoid secara tentatif dipadankan dengan betul dengan struktur sebenar mereka.

Dalam ujian perencatan NO, sebatian 5 （IC50 42.7±6.6 μM）, 11（IC50 37.3±2.2 μM）,13 （IC50 40.0 ±4.0 μM） dan 18（IC0 27.9±0.8uM menunjukkan aktiviti perencatan sederhana. Daripada sebatian ini, sebatian 11,13 dan 18 didapati menghalang fosforilasi NF-kB dalam makrofaj dan dengan itu mungkin melakukan aktiviti anti-radang yang perlu dibuktikan dalam eksperimen selanjutnya.

Mengekstrak daripada: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ("Lesen"). Walau apa pun Terma dan Syarat ProQuest, anda boleh menggunakan kandungan ini mengikut terma Lesen.