Konjugat Dendrimer–tesaglitazar Menggerakkan Anjakan Fenotip Mikroglia Dan Meningkatkan -amyloid Fagositosis† Bahagian 3

D-Tesa meningkatkan ekspresi enzim yang bertanggungjawab untuk penyingkiran protein patogen

Enzim pengurai insulin (Ide) dan matriks metalloprotease 9(MMP9) ialah enzim yang dirembeskan oleh mikroglia yang merendahkan ekstraselular -amyloid dan -synuclein.71,72 Rawatan D-Tesa meningkatkan ekspresi Ide 3 dengan ketara.1-kali ganda (p < 0.001) dengan arah aliran ke arah meningkatkan ungkapan MMP9 (1.8-peningkatan kali ganda, p=0.057) berbanding kawalan yang dirawat LPS sahaja (Rajah 6A dan B).

Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, semakin banyak kajian telah menunjukkan bahawa terdapat hubungan rapat antara enzim yang merendahkan insulin dan ingatan. Penemuan ini memberikan kita petunjuk berharga untuk meneroka lebih lanjut pembentukan dan mekanisme penyelenggaraan memori.

Enzim pengurai insulin adalah enzim penting, yang fungsi utamanya adalah untuk memecahkan insulin untuk mengekalkan keseimbangan gula dalam darah. Walau bagaimanapun, kajian baru-baru ini telah menunjukkan bahawa enzim yang merendahkan insulin bukan sahaja memainkan peranan metabolik, tetapi juga secara langsung mempengaruhi pertumbuhan dan pembaikan neuron di otak, dan memainkan peranan penting dalam mengekalkan ingatan.

Banyak kajian telah menunjukkan bahawa semakin tinggi tahap enzim pengurai insulin, semakin baik daya ingatan. Ini kerana enzim yang merendahkan insulin boleh menggalakkan pertumbuhan dan pembaikan neuron, seterusnya meningkatkan keupayaan pembelajaran dan ingatan otak. Di samping itu, enzim yang merendahkan insulin juga boleh menggalakkan hubungan antara neuron, dengan itu meningkatkan persatuan dan pengekalan ingatan.

Peranan penting enzim yang merendahkan insulin dalam ingatan telah digunakan secara meluas dalam bidang perubatan klinikal. Penyelidik telah mendapati bahawa dengan menyedut enzim yang merendahkan insulin, bukan sahaja ingatan boleh diperbaiki, tetapi juga keupayaan kognitif dan gejala kemurungan boleh diperbaiki.

Ringkasnya, hubungan antara enzim yang merendahkan insulin dan ingatan adalah bidang yang sangat penting, yang memberikan kita petunjuk berharga untuk mengkaji mekanisme biologi ingatan. Penyelidikan masa depan akan meneroka lebih lanjut fungsi dan peranan enzim yang merendahkan insulin, membantu kita lebih memahami pembentukan dan mekanisme penyimpanan ingatan, dan menyediakan asas yang lebih baik untuk meningkatkan keupayaan pembelajaran dan ingatan otak manusia. Ia dapat dilihat bahawa kita perlu meningkatkan ingatan, dan Cistanche boleh meningkatkan ingatan dengan ketara kerana Cistanche juga boleh mengawal keseimbangan neurotransmitter, seperti meningkatkan tahap asetilkolin dan faktor pertumbuhan, yang sangat penting untuk ingatan dan pembelajaran. Selain itu, Cistanche juga boleh meningkatkan aliran darah dan menggalakkan penghantaran oksigen, yang dapat memastikan otak memperoleh nutrisi dan tenaga yang mencukupi, seterusnya meningkatkan daya hidup dan daya tahan otak.

Klik tahu cara untuk meningkatkan ingatan anda

Tesa Percuma meningkatkan dengan ketara ungkapanIde 2-lipat ganda (p=0.011), dan MMP92-kali ganda tidak ketara (p=0.35) (Gamb. 6A dan B). Mikroglia M2 dalam penyakit neurodegeneratif boleh mengeluarkan -amyloid, -synuclein, dan protein patogen lain melalui penguraian enzimatik atau fagositosis, dan D-Tesa mengimbangi protein yang terlibat dalam proses ini (iaitu Ide dan MMP9).71–73

Ideexpression dikurangkan dalam patologi AD dan PD dan diketahui dikawal oleh agonis PPAR, yang konsisten dengan keputusan kami.

71,72 Dari segi fungsi, hanya 2-peningkatan kali ganda dalam tahap Ide telah ditunjukkan untuk mengurangkan pengumpulan -amiloid dan kematian neuron dalam vivo.74,75 Oleh itu, 3-pertambahan kali ganda dalam Ide yang diperhatikan oleh D-Tesa, dan 2-peningkatan kali ganda Ide oleh freeTesa mungkin berkesan secara terapeutik dalam vivo.

D-Tesa meningkatkan fagositosis -amyloid

CD36 ialah reseptor penghapus mikroglial yang memudahkan fagositosis dan degradasi -amyloid.73 Penurunan regulasinya dalamAD mengakibatkan penyingkiran -amyloid berkurangan, tetapi ia dikawal oleh pengaktifan PPAR.

Kedua-dua D-Tesa dan Tesa percuma meningkatkan tahap ekspresi CD36 dengan ketara apabila dibandingkan dengan sel terdedah kepada LPS sahaja (p < 0.0001 lwn. p < 0.005 untuk D-Tesa dan Tesa percuma , masing-masing), tetapi D-Tesa jauh lebih berkesan daripada Tesa percuma (6-peningkatan kali ganda berbanding 2.8-peningkatan kali ganda untuk D-Tesaan dan Tesa percuma, masing-masing, p < 0.0005) (Gamb. 6C ).

Keputusan kami adalah konsisten dengan kajian terdahulu dengan pioglitazone (agonis PPAR lain) yang menunjukkan bahawa peningkatan fagositosis mikroglial -amyloid berlaku melalui mekanisme bergantung36-PPAR dan CD.73

Untuk menyiasat jika pengawalseliaan CD36 daripada D-Tesatreatment dikaitkan dengan peningkatan keupayaan fagositik sel-sel ini, kami melakukan ujian fagositosis berfungsi -amyloid. 73

Secara ringkas, selepas merawat sel seperti yang kami lakukan dalam ujian in vitro sebelum ini, kami menggunakan pendarfluor berlabel -amyloid1-42 pada sel selama dua jam, mencuci sel, dan kemudian melakukan flow-cytometri untuk menyiasat sejauh mana pengambilan selular -amyloid. D-Tesa meningkatkan kedua-dua peratusan sel yang memfagositosis -amyloid dan jumlah purata -amyloid yang dihayati setiap sel (Rajah 7A dan B).

Sebaliknya, Tesa percuma tidak menghasilkan peningkatan dalam fagositosis -amyloid. Kesan unggul D-Tesa berbanding Tesa berkemungkinan disebabkan oleh peningkatan dalaman selular yang didayakan oleh konjugasi dendrimer.

Ini konsisten dengan kerja sebelumnya yang menunjukkan lebih 95% sel BV2 yang dirawat dengan pendarfluor berlabel G4-PAMAM-OH telah menghayati dendrimer dalam masa tiga puluh minit dan terus menginternalisasi dendrimer selama sekurang-kurangnya 24 jam.76

Begitu juga, konjugasi molekul kecil minocycline kepada G4-PAMAM-OH berlabel pendarfluor menunjukkan bahawa 99% sel BV2 telah menghayati konjugat dendrimer-ubat berlabel pendarfluor dalam masa 3 jam.26 Mereka juga menunjukkan bahawa konjugat mengurangkan tahap nitrikoksida dengan lebih baik. kepada ubat percuma selepas merawat sel BV2 denganLPS, selaras dengan keputusan kami.

Sel yang dirawat dengan D-Tesaphagocytosed 1.9-kali ganda lebih banyak -amyloid daripada sel kawalan yang dirawat LPS (p < 0.001), yang setanding dengan 2.5-peningkatan kali ganda bagi -amyloid fagositosis oleh sel mikroglial primer tikus yang dirawat dengan pioglitazone yang dilaporkan oleh Yamanaka et al.73Tahap fagositosis -amyloid yang lebih tinggi sedikit oleh kajian terdahulu mungkin sama ada kerana mereka tidak merawat sel mereka dengan LPS seperti yang kita lakukan, atau kerana mikroglia primer mengekspresikan PPAR pada tahap yang lebih tinggi daripada sel BV2 yang digunakan dalam kajian ini.77

Oleh itu, dos D-Tesa yang lebih rendah daripada yang dianggarkan daripada eksperimen in vitro dalam kajian kami berkemungkinan berkesan dalam kajian vivo dan manusia, kerana sel BV2 diketahui mengekspresikan PPAR pada tahap yang lebih rendah daripada mikroglia primer.77

Microglia telah terlibat dalam banyak penyakit neurodegeneratif, dan BBB telah menghalang banyak ubat yang boleh mengubah suai fenotip mikroglia daripada fenotip M1 pro-radang, neurotoksik kepada fenotip M2 anti-radang, neuroprotektif daripada mencapai tahap terapeutik di dalam otak.5,6, 14,15

Sebagai contoh, dua agonis PPAR, pioglitazone dan rosiglitazone, masing-masing telah disiasat melalui ujian klinikal fasa III untuk penyakit Alzheimer kerana keupayaan mereka untuk mengubah fenotip mikroglia, tetapi mungkin gagal disebabkan oleh pengangkutan yang lemah merentasi BBB.13,14 Oleh itu, terdapat perubahan minat klinikal. fenotip mikroglia dalam penyakit neurodegeneratif.

Pendekatan sedemikian memerlukan penghantaran ubat kepada mikroglia pada tahap yang mencukupi untuk memacu tindak balas. Untuk tujuan ini, dendrimer G4-OH-PAMAM telah ditunjukkan untuk menghantar ubat kepada mikroglia dalam banyak model haiwan selepas suntikan sistemik, dan akibatnya, kini sedang dinilai dalam ujian klinikal untuk rawatan ccTLD (NCT03500627) dan COVID yang teruk -19 keradangan yang berkaitan (NCT04458298).18–28

Untuk menggabungkan kesan berfaedah mengubah fenotip mikroglial dengan keupayaan untuk menghantar ubat kepada mikroglia, kami menggabungkan tesaglitazar (PPAR / agonis dwi) kepada G4-OH-PAMAMdendrimer (Rajah 1–3). Kami menunjukkan bahawa D-Tesa mampu mengubah fenotip M1 mikroglia ke arah fenotip M2 (Rajah 4 dan 5), mengakibatkan pengurangan dalam rembesan spesies oksigen reaktif yang berbahaya.

Tambahan pula, kami menunjukkan bahawa mikroglia yang dirawat dengan D-Tesa meningkatkan ekspresi enzim yang merendahkan protein patologi seperti -synuclein dan -amyloid, serta mengawal selia fagositosis -amyloid dalam ujian berfungsi (Rajah 6 dan 7).

Walaupun kami tidak membentangkan data yang menunjukkan keupayaan D-Tesa untuk memintas BBB dan terkumpul dalam mikroglia, kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa konjugat ubat G4-OH-PAMAM dengan pemuatan dadah, saiz dan potensi zeta yang serupa mampu melalui BBB terjejas dan terkumpul inmicroglia selepas pentadbiran intravena.26,36,52

Keputusan ini menyokong pembangunan lanjut D-Tesa untuk rawatan pelbagai penyakit neurologi. Walaupun kami memberi tumpuan kepada penyakit Alzheimer dan Parkinson dalam kertas ini, D-Tesa mempunyai potensi untuk terjemahan klinikal pelbagai gangguan neurologi. Oleh kerana peranan mikroglia yang sama dalam patologi pelbagai penyakit neurodegeneratif, pioglitazone agonis PPAR juga telah disiasat oris yang sedang disiasat dalam ujian klinikal fasa II untuk penyakit Parkinson, 78 ALS, 79 adrenomieloneuropathy (NCT03864523), sklerosis berbilang (NCT083), dan hematoma berbilang. resolusi dalam pendarahan intracerebral (NCT00827892).

Jika ujian klinikal ini juga gagal disebabkan penghantaran pioglitazone yang lemah merentasi BBB, D-Tesa boleh mengatasi halangan penghantaran ini dan merawat pesakit yang menghidap penyakit ini.

Kumpulan lain telah menggunakan nanopartikel untuk meningkatkan penghantaran agonis PPAR kepada makrofaj, tetapi mereka tidak cuba untuk menghantar agonis ini kepada mikroglia. Osinski et al.menunjukkan bahawa liposom yang dimuatkan Tesa kebanyakannya diambil oleh makrofaj dalam lemak putih viseral dalam model obesiti kekurangan leptin lelaki.80

Mereka juga menunjukkan bahawa liposom yang dimuatkan Tesa tidak mengubah ekspresi penanda M1 Mcp-1, tetapi meningkatkan ekspresi penanda M2 Arg1, manakala rawatan dengan Tesa percuma mengurangkan jumlah keseluruhan makrofaj M1 dan ekspresi Mcp{{6 }}, dan tidak meningkatkan ungkapan Arg1.

Nakashiro et al. nanopartikel poli(laktik-ko-glikolik-asid) (PLGA) untuk menghantar pioglitazon (agonis PPAR) kepada makrofaj dalam konteks aterosklerosis.81

In vivo, mereka menunjukkan bahawa PLGA-pioglitazone mengurangkan tahap sel imun dalam darah. Makrofaj turunan sumsum tulang primer yang dirawat dengan LPS dan interferon-, mereka mendapati bahawa PLGA-pioglitazone meningkatkanIL-4 dan IL-10 (penanda M2) dan tidak menurunkan tahap IL-6 atau TNF.

Penemuan mereka serupa dengan kami; Penanda M2 telah ditingkatkan dengan rawatan agonis nanopartikel-PPAR, manakala paras IL-6dan TNF- tidak berkurangan. Di Mascolo et al. menggunakan nanopartikel alkohol PLGA-polivinil untuk menyampaikan rosiglitazone (satu lagi agonis PPAR).82

In vitro mereka menunjukkan kompleks ubat-ubatan nanopartikel mereka mengurangkan ekspresi iNOS, TNF- dan IL-1 dalam makrofaj yang berasal dari sumsum tulang. Mereka merawat sel mereka dengan ubat nanopartikel sebelum merangsang dengan LPS, manakala kami merawat sel dengan LPS sebelum merawat dengan D-Tesa, yang boleh menjadi sebab kami tidak melihat penurunan dalam TNF- dan IL-1 , walaupun kami juga memerhatikan penurunan dalam ekspresi iNOS.

Kesimpulan

Pada masa ini tiada terapi pengubah patologi untuk banyak penyakit neurodegeneratif, dan apabila populasi terus meningkat, kelaziman dan kos rawatan penyakit ini akan terus meningkat, menonjolkan keperluan mendesak untuk penyelesaian untuk dibangunkan. Baru-baru ini, mikroglia M1 pro-radang adalah kritikal dalam patologi pelbagai penyakit neurodegeneratif.

Selepas itu, keupayaan untuk menghantar dadah merentasi penghalang darah-otak yang boleh mendorong anjakan fenotip 'M1 keM2' dalam mikroglia mempunyai potensi terapeutik untuk pelbagai penyakit, terutamanya penyakit Alzheimer dan Parkinson.

D-Tesa direka bentuk untuk menghantar ubat 'M1 ke M2' yang mendorong kepada mikroglia selepas pentadbiran sistemik untuk mengurangkan rembesan mikroglial bahan neurotoksik, sementara juga mendorong keadaan anti-radang yang meningkatkan degradasi dan fagositosis protein patogenik dalam otak. Kami berjaya mensintesis D-Tesa menggunakan pendekatan kimia klik yang sangat cekap.

Ubat ini dilekatkan pada dendrimer melalui esterbond yang boleh dibelah intrasel pada keadaan lisosom, dengan kira-kira 60% Tesa dilepaskan dalam 48 jam pertama di bawah keadaan lisosom.

D-Tesa terbukti lebih unggul daripada Tesa in vitro dalam mendorong anjakan M1 kepada M2a/M2b/M2cphenotype, yang mengakibatkan pengurangan rembesan nitrik oksida, peningkatan ekspresi enzim -synuclein dan -amyloiddegradasi, dan peningkatan fagositosis -amyloid.

Oleh itu, D-Tesa menggabungkan sifat penghantaran berfaedah dendrimer, dengan sifat penukaran M1 ke M2 Tesa. Disebabkan oleh peranan mikroglia yang sama dan faedah terapeutik biasa untuk mendorong anjakan fenotip M1 kepada M2, D-Tesa berpotensi untuk merawat banyak gangguan neurologi apabila diberikan pada peringkat perkembangan penyakit yang betul.

Sumbangan pengarang

Eksperimen berkonsepkan LD, AS, KL, RS, SK dan RMK. LD, AS, dan RS melakukan sintesis dan pencirian konjugat dendrimer-ubat. LD, KL, dan JJ melakukan eksperimen sel. LD dan K. L. melakukan perangkaan. LD dan AS menulis manuskrip, dan semua pengarang menyunting manuskrip.

Konflik kepentingan

RMK dan SK ialah pencipta bersama menggunakan dendrimer yang ditamatkan hidroksil untuk penghantaran disasarkan kepada mikroglia dalam penyakit neurologi, serta paten yang berkaitan dengan teknologi dendrimer yang diterangkan dalam kertas ini.

Mereka adalah pengasas bersama Ashvattha Therapeutics, Orpheris Inc., dan RiniSight Inc., yang merupakan syarikat yang menerajui pembangunan klinikal platform. SK dan RMK ialah Ahli Lembaga Pengarah AshvatthaTherapeutics Inc. RS kini bekerja di AshvatthaTherapeutics dan memiliki saham dalam syarikat itu; kerjaR. S. dilakukan untuk kertas kerja ini telah dilakukan sebelum beliau menyertai Ashvattha. Konflik kepentingan diuruskan oleh Universiti JohnsHopkins.

Ucapan terima kasih

Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Elizabeth Smith Khoury untuk perbincangan yang berguna tentang eksperimen in vitro. Projek ini dibiayai oleh Patz Distinguished Professorship Endowment daripada JohnsHopkins dan NICHD (nombor geran HD076901) (RMK). Terima kasih kepada Geran Teras Wilmer untuk Penyelidikan Penglihatan, Mikroskop dan Modul Teras (nombor geran EY001865) untuk akses kepada sitometer aliran Sony.

Kami berterima kasih kepada Servier Medical Arts atas penggunaan koleksi imej mereka (http://smart.servier.com/) yang dilesenkan di bawah Creative Common Attribution 3.0 GenericLicense, yang telah diubah suai untuk menjadikan grafik abstrak.

Rujukan

1 CL Gooch, E. Pracht, dan AR Borenstein, Beban penyakit neurologi di Amerika Syarikat: Laporan ringkasan dan seruan untuk bertindak, Ann. Neurol., 2017, 81, 479–484.

2 JL Cummings, T. Morstorf dan K. Zhong, saluran paip pembangunan ubat penyakit Alzheimer: beberapa calon, kegagalan yang kerap, Alzheimer's Res. Kemudian, 2014, 6, 37.

3 P.-P. Liu, Y. Xie, X.-Y. Meng dan J.-S. Kang, Sejarah dan kemajuan hipotesis dan ujian klinikal untuk penyakit Alzheimer, Transduksi Isyarat Sasaran Ther., 2019, 4, 1–22.

4 C. Soto dan S. Pritzkow, Kesalahan lipatan protein, pengagregatan, dan strain konformasi dalam penyakit neurodegeneratif, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332–1340.

5 VH Perry dan C. Holmes, Penyebuan mikroglial dalam penyakit neurodegeneratif, Nat. Rev Neurol., 2014, 10, 217–224.

6 Y. Tang dan W. Le, Peranan Berbeza M1 dan M2Microglia dalam Penyakit Neurodegeneratif, Mol. Neurobiol., 2016, 53, 1181–1194.

7 MW Salter dan B. Stevens, Microglia muncul sebagai pemain utama dalam penyakit otak, Nat. Med., 2017, 23, 1018–1027.

8 S. Krasemann, et al., Laluan TREM2-APOE Memacu Fenotip Transkripsi Mikroglia Disfungsi dalam Penyakit Neurodegeneratif, Kekebalan, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao, et al., Kesan pioglitazone seperti antidepresan dalam model tetikus tekanan ringan kronik dikaitkan dengan perubahan PPAR -pengantara fenotip pengaktifan mikroglial, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen, et al., Polarisasi Mikroglia kepada Fenotip M2 dalam Reseptor Diaktifkan Proliferator Peroksisom Cara Bergantung Gamma Melemahkan Kecederaan Akson Disebabkan oleh Kecederaan Otak Traumatik pada Tikus, J. Neurotrauma,2018, 35–2330.

11 W. Cai, et al., Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR ): Seorang penjaga pintu utama dalam kecederaan dan pembaikan CNS, Prog. Neurobiol., 2018, 163–164, 27–58.12 B. Brakedal, et al., Penggunaan Glitazone yang dikaitkan dengan pengurangan risiko penyakit Parkinson, Mov. Disord., 2017, 32, 1594–1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com