Cistanche:Echinacoside-induced Nitric Oxide Penghasilan dalam Sel Endothelial: Peranan Reseptor Androgen Dan Laluan PI3K‑Akt

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

LI GU, dANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU dan XIN LIU

pengenalan

CistancheHoffmg. Et Link ialah herba parasit saka dari genus keluarga Orobanchaceae. HerbaCistanche, batangCistanche deserticolaY. c . MA danCistanche tubulosa(Schenk) R. Weight, telah digunakan sebagai agen tonik untuk merawat kekurangan buah pinggang, mati pucuk, leukorea morbid dan sembelit nyanyuk (1), yang mungkin disebabkan oleh kesan pengawalan hormon seperti androgen atau hormon seks (2).Echinacoside(EcH; c35H46O20;

berat molekul, 786.73; Rajah 1), ialah salah satu daripada glikosida phenylethanoid (PhGs) yang diasingkan daripada batang HerbaCistanche, dan mempamerkan pelbagai sifat biologi, termasuk kesan anti-oksidan, antipenuaan, anti-radang, hepatoprotektif dan neuroprotektif (3). Penyiasatan farmakologi moden telah menunjukkan bahawa pelbagai juzuk HerbaCistanche, termasuk EcH, acteoside, kankanose, kankanoside F dan cistanoside F, mempamerkan aktiviti vasorelaxant (4).

Endothelium adalah pengawal selia kritikal vasculature, dan nitric oxide (NO) adalah faktor santai penting yang dikeluarkan oleh sel endothelial. Dengan meresap ke dalam sel otot licin, NO mengaktifkan guanylate cyclase, meningkatkan tahap cyclic guanosine monophosphate (cGMP), dan kemudian mengaktifkan cGMP-dependent protein kinase (PKGs) untuk menggalakkan kelonggaran otot licin (5). Sebelum ini telah ditunjukkan bahawa EcH pada 350-400 µM secara langsung bertindak pada otot licin vaskular dan menghalang percambahan yang disebabkan oleh hipoksia dalam sel otot licin arteri pulmonari tikus (6), manakala 30-300 µM EcH menyebabkan vasorelaksasi akut dalam endothelium- cincin utuh dalam cara yang bergantung kepada kepekatan, dan meningkatkan pengeluaran cGMP dalam otot licin corpus cavernosum cincin aorta yang dikontrak oleh phenylephrine (7). Dengan membuka saluran NO-cGMP-PKG-BKca dalam sel otot licin, 100 atau 300 µM EcH menyekat penguncupan yang disebabkan oleh noradrenalin dalam arteri pulmonari tikus, terutamanya dalam cincin berlubang endothelium (8). Sel endothelial adalah pengawal selia utama fungsi kardiovaskular dan, dalam beberapa kes, didapati bahawa kelonggaran yang bergantung kepada endothelial adalah disebabkan oleh bahan yang boleh dipindahkan, seperti NO, yang dilepaskan daripada endothelium (9). Walau bagaimanapun, mekanisme molekul huluan pengeluaran NO yang disebabkan oleh EcH dalam sel endothelial vaskular memerlukan penyiasatan lanjut.

Dalam endothelium vaskular, penjanaan NO dimediasi terutamanya oleh endothelial NO synthase (eNOS). Beberapa kumpulan telah menunjukkan bahawa laluan phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) mengaktifkan serine threonine protein kinase B (Akt), yang menyebabkan fosforilasi eNOS langsung pada serin 1177 (Ser1177) (10). Reseptor androgen (AR) ialah ahli subfamili reseptor nuklear s3, yang secara kanonik mengubah suai ekspresi gen. Penyetempatan AR ke caveolae dalam membran sel terlibat dalam

peraturan bukan genomik fungsi sel endothelial atau ekspresi gen dengan mencetuskan lata c-Src/PI3K/Akt, yang akhirnya menghasilkan fosforilasi eNOS dan pengeluaran NO (11). Dalam sel endothelial aorta manusia, testosteron telah dilaporkan mengaktifkan isyarat PI3K/Akt dan dengan cepat mendorong pengeluaran NO disebabkan oleh interaksi langsung AR dan subunit p85 PI3K pada sistem kardiovaskular (12). Telah dilaporkan bahawa EcH memburukkan simptom yang berkaitan dengan kekurangan hormon dan memberikan kesan seperti androgen akibat pengikatan kompetitif kepada AR dan bukannya testosteron (2). Oleh itu, kajian ini membuat hipotesis bahawa laluan PI3K/Akt mungkin terlibat dalam pengeluaran NO melalui fosforilasi eNOS yang bergantung kepada AR yang disebabkan oleh EcH. Matlamat kajian ini adalah untuk menilai kesan EcH berikut: i) Induksi pengeluaran NO dan fosforilasi eNOS; ii) penglibatan AR dalam fosforilasi eNOS; dan iii) pengaktifan laluan PI3K/Akt dalam sel endothelial vena umbilical manusia (HUVEcs), model eksperimen yang terkenal untuk mengkaji peraturan fungsi sel endothelial dan angiogenesis (13).

Bahan dan kaedah

Bahan kimia dan reagen.EcH (ketulenan, 92.5 peratus ) diperoleh daripada Piawaian Rujukan ubat Kebangsaan di Institut Kebangsaan untuk Makanan dan kawalan dadah. Antibodi terhadap p-Akt (Ser473; cat. no. ab8805), Akt (cat. no. ab81283), p-eNOS (Ser1177; cat. no. ab184154) dan eNOS (cat. no. ab76198) telah dibeli daripada Abcam. Inhibitor nilutamide dan IcI 182780 diperolehi daripada Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME telah dibeli daripada Adamas-Beta, Ltd., dan wortmannin dibeli daripada Pribolab.

sel budaya dan dadah rawatan.HUVEcs diperoleh daripada Sciencell Research Laboratories Inc. dan dikultur dalam medium sel endothelial (EcM; Sciencell Research Laboratories) dengan 5 peratus (v/v) serum lembu janin (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) dan 1 peratus sel endothelial tambahan pertumbuhan (ECGS) pada 37˚C (5 peratus CO2 dan 95 peratus kelembapan) (14). Apabila mencapai pertemuan, sel-sel dicerna dengan trypsin dan disalut dalam EcM dengan 1 peratus FBS dan 1 peratus EcGS. Untuk semua eksperimen, HUVEc disalut pada kepekatan 1x104/ml dan ditanam sehingga mencapai pertemuan. Sebelum rawatan dengan EcH atau perangsang lain, sel telah diinkubasi dalam EcM bebas merah fenol tanpa FBS dan EcGS selama 6 jam untuk mendorong

penangkapan pertumbuhan. Dalam eksperimen perencatan, HUVEc telah diinkubasi dengan pelbagai antagonis atau perencat, termasuk 10 µM nilutamide, 10 µM IcI 182780, 0.5 mM L-NAME atau 5 µM wortmannin, selama 30 minit, dengan atau tanpa ECH, pada 37˚C. Dalam semua kumpulan, termasuk kawalan, dMSO digunakan sebagai pelarut pada kepekatan yang sama 0.001 peratus .

Pengukuran intrasel NOpengeluaran.

Perubahan relatif dalam kepekatan NO cytosolic dalam HUVEcs dipantau menggunakan probe NO pendarfluor DAF‑FM (Cayman Chemical Company), seperti yang dilaporkan sebelum ini (12). Secara ringkas, sel-sel telah dimuatkan dengan 5 µM DAF‑FM diasetat selama 20 minit pada 37˚C dalam plat mikrotiter hitam dan dibilas beberapa kali dengan PBS (pH 7.4). Pendarfluor ditentukan pada pengujaan dan panjang gelombang pelepasan masing-masing 495 dan 515 nm, menggunakan pembaca plat mikro pendarfluor (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) dan mikroskop terbalik padat (Nikon eclipse Ts2R; Nikon corporation).

Barat hapuskan analisis.Seperti yang dilaporkan sebelum ini (15), lapisan tunggal sel yang bercampur telah dibasuh dua kali dalam PBS sejuk ais dan dilisekan dengan penimbal RIPA (P0013d; Institut Bioteknologi Beyotime). Kepekatan protein dalam supernatan diukur menggunakan kaedah ujian asid bicinchoninic (16). Selepas itu, 30 µg protein dimuatkan setiap lorong, diasingkan menggunakan 10 peratus gel poliakrilamida dan dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida. Membran telah disekat dengan susu skim 5 peratus selama 1 jam pada suhu 25˚C. Selepas pengeraman dengan antibodi monoklonal terhadap Akt (1:1,000 pencairan), p-Akt (1:500 pencairan), eNOS (1:2,000 pencairan) atau p-eNOS (1 :1,000 pencairan) pada 4˚C semalaman, membran dibasuh dengan TBST (mengandungi 0.1 peratus Tween-20) 4 kali selama ~15 minit setiap cucian pada suhu 25˚C. Selepas itu, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder konjugasi peroksidase lobak pedas (pencairan 1:5,000; antibodi anti-tikus, kucing. no. A0216, atau anti-arnab antibodi, kucing. no. A0208, Beyotime Institute bioteknologi) selama 1 jam pada 25˚C, dan dikesan menggunakan kit chemiluminescence yang dipertingkatkan (cat. no. 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Keamatan jalur dikira menggunakan perisian analisis gel Image J, versi 1.8.0_112 (Institut Kesihatan Negara).

Kecil mengganggu (si) RNA persiapan dan pemindahan.RNA rantai dua yang panjang telah disintesis oleh mRNA sasaran AR dan reseptor estrogen (ER) dengan jujukan ditunjukkan dalam Jadual I. Keadaan untuk ketukan siRNA melibatkan pemindahan HUVEC pada pertemuan 7{31}} peratus yang dikekalkan dalam bukan antimikrobial medium kultur dalam hidangan kultur bersalut kolagen 60 mm. Pemindahan 5 nM AR-siRNA atau 10 nM ER -siRNA dengan reagen Lipofectamine 3000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) telah dilakukan secara berasingan, mengikut protokol pengeluar. Kecekapan pemindahan telah dinilai dengan analisis terbalik transkripsi kuantitatif-PcR (RT-qPcR), seperti yang dilaporkan sebelum ini (17). Keadaan kitaran termo adalah seperti berikut: 10 minit pada 95˚C; 40 kitaran 95˚C selama 5 saat dan 60˚C selama 1 minit, dan lengkung lebur pada 95˚C selama 15 saat, 60˚C selama 1 minit dan 95˚C selama 15 saat; tiga replika biologi bebas telah dilakukan untuk setiap sampel. Eksperimen seterusnya dijalankan 48 jam selepas pemindahan. Pasangan primer direka bentuk menggunakan perisian Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) dengan urutan berikut: AR ke hadapan, 5'-GGTTAcAccAAAGGGcTAGAA-3' dan terbalik, 5'-GAcTTGTAGAGAGAcAGGGTAGA-3'; ER ke hadapan, 5'-ccAGTAccA ATGAcA AGG GAAG -3' dan ke belakang, 5'-TcAcAGGAccAGAcTccATAA-3'; dan GAPdH ke hadapan, 5'-cAGGGcTGcTTTTAAcTcTGGTAA-3' dan ke belakang, 5'-GGGTGGAATcATATTGGAAcATGT-3'.

Statistik analisis.Semua data dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai. Perbandingan statistik antara kumpulan dilakukan menggunakan ujian Kruskal-Wallis atau ANOVA dua hala dengan ujian post hoc Tukey untuk pelbagai perbandingan. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Keputusan

ECH mendorong TIDAK pengeluaran dan eNOSphosphorylation.Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2A dan B, 1 µM ECH meningkatkan pengeluaran NO intraselular dengan ketara dalam HUVEcs berbanding dengan sel kawalan negatif, manakala kesan rangsangan EcH telah dilemahkan ke tahap kawalan dengan prarawatan dengan L-NAME. Untuk mendapatkan kepekatan optimum, fosforilasi eNOS diuji pada 60 minit selepas rawatan dengan EcH pada kepekatan

daripada {{0}}, 0.01, 0.1, 1 dan 10 µM. Keputusan menunjukkan bahawa EcH pada kepekatan 0.01‑10 µM boleh menyebabkan fosforilasi eNOS dengan ketara pada Ser 1177 dalam cara yang bergantung kepada kepekatan, dengan fosforilasi eNOS maksimum diperhatikan pada aruhan EcH 10 µM (Rajah 2c dan d). Tambahan pula, fosforilasi eNOS pada Ser1177 telah diperiksa oleh analisis western blot pada 0, 5, 15, 30, 60 dan 120 minit selepas pengeraman dengan 1 µM EcH. Telah diperhatikan bahawa fosforilasi eNOS telah dicetuskan dengan pantas oleh EcH pada 5 minit, dan terus meningkat sehingga 30 minit pengeraman (Rajah 2E dan F). Selepas itu, walaupun rawatan EcH, magnitud relatif fosforilasi eNOS kekal stabil dari 30 minit dan seterusnya; oleh itu, EcH tidak menjejaskan jumlah ekspresi eNOS (Rajah 2c dan E).

AR perantara disebabkan oleh ECH TIDAK pengeluaran dan eNOSkesan mengganggu AR-siRNA-1 dan ER -siRNA-2 adalah yang paling berjaya dalam menghalang ekspresi AR dan ER dalam HUVEcs dalam kajian ini (Rajah 3). Selepas itu, antagonis untuk analisis perencatan fungsi AR dan siRNA untuk analisis kehilangan fungsi AR digunakan untuk menilai penglibatan AR dalam pengaktifan eNOS yang disebabkan oleh EcH dan pengeluaran NO. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4A, 1 µM ECH meningkatkan pengeluaran NO dengan ketara dalam HUVEcs (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789,="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibi-="" tion="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphoryla-="" tion="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH mengaktifkan yang PI3K/Akt laluan.Dalam kajian ini, fosforilasi Akt pada Ser473 telah diuji 60 min selepas pengeraman EcH pada kepekatan 0, 0.01, 0.1 , 1 dan 10 µM. Keputusan menunjukkan bahawa EcH (0.01-10 µM) mungkin mendorong pemfosforilasi Akt dengan ketara. Tahap ekspresi relatif p-Akt memuncak pada 1 dan 10 µM rawatan EcH (Rajah 5A dan B). Tambahan pula, fosforilasi Akt telah diperiksa oleh analisis western blot pada 0, 5, 15, 30, 60 dan 120 min selepas penambahan 1 µM EcH kepada kultur HUVEc. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5c dan d, EcH dengan cepat meningkatkan fosforilasi Akt selepas 5 minit pengeraman, dan tahap protein maksimum p-Akt diperhatikan pada 60 minit. Sebaliknya, EcH tidak menjejaskan jumlah ekspresi Akt (Rajah 5A dan c). Selain itu, untuk menyiasat kesan potensi laluan PI3K pada fosforilasi eNOS, HUVEcs telah dirawat terlebih dahulu dengan wortmannin perencat PI3K sebelum aplikasi EcH. Wortmannin didapati mengurangkan pengeluaran NO akibat EcH ke tahap asas (Rajah 5E). Fenomena yang sama diperhatikan menggunakan mikroskop pendarfluor apabila memeriksa pendarfluor DAF‑FM yang disebabkan oleh EcH (Rajah 5F). Tambahan pula, wortmannin mungkin mempunyai keupayaan untuk menghapuskan fosforilasi eNOS pantas dalam HUVEcs (Rajah 5G dan H). Keputusan yang dinyatakan di atas menunjukkan bahawa EcH boleh mengaktifkan fosforilasi eNOS dan pengeluaran NO melalui laluan PI3K/Akt.

Perbincangan

EcH ialah sebatian semula jadi yang diasingkan daripada HerbaCistanche, dengan pelbagai sifat farmakologi. Sebelum ini telah ditunjukkan bahawa EcH memberikan kesan kelonggaran vaskular yang bergantung kepada endothelium dengan membuka saluran NO-cGMP-PKG-BKca dalam sel otot licin saluran darah (7, 8). Penemuan semasa memberikan bukti bahawa ECH menggunakan pengaktifan AR yang bergantung kepada eNOS untuk mendorong pengeluaran NO dengan penglibatan laluan isyarat PI3K / Akt dalam sel endothelial vaskular.

Sebagai lapisan paling dalam dinding saluran, endothelium dapat dengan cepat merasakan dan bertindak balas terhadap perubahan dalam aliran darah, seterusnya mengakibatkan penghantaran isyarat ke sel otot licin yang mendasari untuk mengawal nada vaskular (18). Telah dilaporkan secara meluas bahawa pelbagai sebatian vasodilator yang berasal dari endothelial wujud, dengan bahan yang paling prototaip.menjadi NO, terbentuk daripada isoform endothelial eNOS, yang menghasilkan fosforilasi (19). Di bawah keadaan biasa, eNOS kekal tidak aktif apabila terikat kepada caveolin, dan diaktifkan dengan berturut-turut peristiwa berikut dalam endothelialsel: i) eNOS berpisah daripada caveolin-1 dan mengaitkan dengan ca2 tambah /caM; ii) protein kejutan haba (HSP)90 menggalakkan eNOSdimerisasi dan memihak kepada pembentukan sterik untuk merekrut Akt; dan iii) calcineurin dephosphorylates Thr495 untuk menguatkan keadaan pengaktifan (20). Dalam kajian ini, pengeluaran NO telah meningkat dengan ketara dalam HUVEC yang dirawat dengan 1 µM ECH. Fenomena ini adalah serupa dengan keputusan sebelumnya, di mana EcH meningkatkan pelepasan NO dan merangsang sintesis cGMP dalam cincin aorta toraks tikus (7). Tambahan pula, dua tapak fosforilasi, Ser1177 dan Thr495, nampaknya amat penting untuk mengawal aktiviti eNOS (20), dan kajian ini mendedahkan bahawa EcH menyebabkan fosforilasi eNOS akut pada Ser1177 dalam cara yang bergantung kepada kepekatan. Di samping itu, rangsangan yang dikaitkan dengan kesan pada tahap protein eNOS terutamanya menentukan kestabilan mRNA eNOS, dan jika rangsangan dikekalkan untuk jangka masa yang lebih lama, transkripsi mRNA eNOS berlaku melalui kinase protein diaktifkan mitogen dan faktor nuklear κB (20). Diambil bersama, pemerhatian ini menunjukkan bahawa pengaktifan eNOS pada Ser1177 bertanggungjawab untuk sintesis NO yang disebabkan oleh EcH.

Tambahan pula, peningkatan bilangan kajian telah menunjukkan bahawa AR dinyatakan dalam sel endothelial dalam beberapa tisu manusia, yang mencadangkan peranan yang berpotensi untuk androgen dan analognya, yang bertindak melalui proses pengantaraan AR, dalam modulasi endothelial manusia. homeostasis sel (21). Dalam laluan PI3K/Akt bukan klasik, AR boleh mengaktifkan PI3K dengan berinteraksi secara langsung dengan subunit pengawalseliaan PI3K p85 (22). Kajian ini menunjukkan bahawa antagonis AR atau AR siRNA mengurangkan pengeluaran NO dan fosforilasi eNOS yang disebabkan oleh EcH dalam HUVEcs. Telah dilaporkan sebelum ini bahawa estrogen mendorong fosforilasi eNOS dan merangsang pengeluaran NO melalui pengaktifan ER klasik dalam sel endothelial (23), dan pentadbiran ECH dengan ketara meningkatkan ekspresi ER dalam rahim (24). Walau bagaimanapun, dalam kajian ini, kesan AR adalah lebih ketara berbanding dengan ER pada pengaktifan eNOS yang disebabkan oleh EcH dan pengeluaran NO. Di samping itu, diperhatikan bahawa EcH menyebabkan pengeluaran NO akut dalam beberapa minit melalui pengaktifan eNOS yang terlibat AR dalam HUVEcs, yang konsisten dengan sifat tindak balas bukan genomik dalam sel endothelial. AR dikaitkan dengan protein perancah, termasuk HSP90, HSP70 dan kinase Src, dalam sitoplasma, dan ia boleh diangkut ke membran dari kompleks AR dalam masa 5 minit rawatan testosteron (23). Berdasarkan strategi 'sasaran memancing', HSP90 telah dikenal pasti sebagai sasaran berganding PhGs, yang menunjukkan bahawa EcH boleh memudahkan pemisahan AR daripada protein perancah (25). Kajian lain mencadangkan bahawa, dalam hipotalamus, EcH mungkin bergabung dengan poket AR pada asid amino Met-894 dan Val-713 dan menghalang pengangkutan AR sitoplasma ke nukleus (26). Walau bagaimanapun, mekanisme asas di mana EcH mengantara translokasi AR sitoplasma ke membran memerlukan penyiasatan lanjut. Oleh itu, penyelidikan lanjut diperlukan untuk menjelaskan mekanisme di mana EcH mencapai pengaktifan eNOS yang bergantung kepada AR dan bagaimana ia boleh dikaitkan dengan pengikatan kepada HSP90 dalam sel endothelial vaskular.

Laluan PI3K/Akt ialah salah satu lata isyarat yang paling penting, pengaktifannya didorong dengan menghasilkan phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate untuk mengikat domain homologi pleckstrin N-terminal Ser/ Thr kinase Akt. Ini memudahkan pengambilan Akt ke membran plasma (27). Laluan PI3K/Akt mungkin memainkan peranan penting dalam kawalan kelonggaran yang bergantung kepada NO yang disebabkan oleh EcH.

Kajian ini mendedahkan bahawa pengeluaran NO yang disebabkan oleh EcH berkurangan dengan ketara apabila sel diinkubasi dengan wortmannin perencat PI3K. Laporan terdahulu menunjukkan bahawa 15 mg/kg EcH mengaktifkan laluan isyarat PI3K/Akt dalam sel sum-sum tulang yang ditekan 5-fluorourasil (28). Dalam kajian ini, perencat PI3K menurunkan fosforilasi eNOS yang disebabkan oleh EcH dengan ketara pada Ser1177. Selain itu, aktiviti Akt kebanyakannya dikawal oleh laluan pengawalseliaan huluan, terutamanya fosforilasi yang bergantung kepada PI3K di Ser473 (20). Dalam kajian ini, EcH mendorong fosforilasi Akt pada Ser473 dalam cara yang bergantung kepada dos; begitu juga, kajian terdahulu menunjukkan bahawa 5, 10 atau 20 µM EcH memberikan kesan kardioprotektif terhadap rawatan anoksia/reperfusi dalam cara yang bergantung kepada dos dengan berpotensi mengawal selia p-Akt dan SLc8A3 (29). Peraturan transkrip gen Akt masih tidak diketahui (30); Oleh itu, kajian ini memberi tumpuan kepada kesan pengawalseliaan pasca transkrip EcH pada Akt. Dengan mengambil kira penemuan yang disebutkan di atas, telah disimpulkan bahawa penggunaan EcH kepada HUVEcs boleh membawa kepada pengaktifan laluan PI3K/Akt, yang memfosforilasi eNOS dan, seterusnya, meningkatkan pengeluaran NO.

Kesimpulannya, EcH adalah produk semulajadi yang kebanyakannya diasingkan daripada HerbaCistanche.Mekanisme potensi yang mendasari pengeluaran NO akibat EcH dalam sel endothelial mungkin termasuk yang berikut (Rajah 6): i) EcH bertindak sebagai ligan berfungsi AR yang disetempatkan kepada caveolae dalam membran sel; ii) PI3K mengikat kepada domain hidrofobik Akt pada Ser473 dan memudahkan pengambilan Akt ke membran sel; iii) pengambilan lata PI3K/Akt mencetuskan fosforilasi eNOS yang bergantung kepada AR; dan iv) penjanaan NO dimediasi oleh eNOS dalam sel endothelial. Pemerhatian bahawa EcH mendorong pengeluaran NO melalui fosforilasi yang bergantung kepada AR bagi eNOS dengan penglibatan laluan PI3K/Akt boleh menyumbang kepada pemahaman yang lebih lanjut tentang kesan vasorelaxant EcH. Tambahan pula, EcH yang menyasarkan laluan NO yang berasal dari endothelial mungkin disebabkan oleh kesan bukan genomik. Oleh itu, kajian ini boleh membantu menjelaskan mekanisme di mana EcH memberikan kesan farmakologinya untuk mencegah penyakit kardiovaskular.

Ucapan terima kasih

Tidak berkaitan.

Pembiayaan

Kajian ini disokong oleh Yayasan Sains Semula Jadi Kebangsaan china (geran no. 81503333).

Ketersediaan daripada data dan bahan

Set data yang dijana dan dianalisis semasa kajian ini boleh didapati daripada pengarang yang berkaitan atas permintaan yang munasabah.

pengarang sumbangan

LG dan XL menyusun dan mereka bentuk eksperimen. dL dan YZ melakukan eksperimen. WZ dan JG menganalisis data. LG mendraf manuskrip. XL menyemak dan menyunting manu- skrip. Semua pengarang membaca dan meluluskan manuskrip akhir.

1202 GUet al: PENGELUARAN NITRIK OKSIDE PENGARUHAN ECHINACOSIdE OLEH LALUAN PI3K/AKT BERGANTUNG AR

etika kelulusan dan persetujuan kepada mengambil bahagian

Tidak berkaitan.

sabar persetujuan untuk penerbitan

Tidak berkaitan.

bertanding kepentingan

Penulis mengisytiharkan bahawa mereka tidak mempunyai kepentingan bersaing.

Rujukan

1. komisen Pharmacopoeia cina:CistancheHerba. In: Pharmacopoeia of the People's Republic of china 1. dagu. Med. Sci. Akhbar, Beijing, ms 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X dan Zhang X: Echinacoside danCistanche tubulosa(Schenk)R. wight memperbaiki kerosakan testis dan sperma akibat bisphenol A pada tikus melalui enzim steroidogenik terkawal paksi gonad. J Ethnopharmacol 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, dong Y, Zhang B dan Ma X: Echinacoside, produk semulajadi yang tidak ternilai dalam rawatan gangguan neurologi dan lain-lain. Molekul 23: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S dan Muraoka O: Phenylethanoid oligoglycosides dan oligosugar tesilat dengan aktiviti vasorelaxant daripadaCistanche tubulosa. Bioorg Med kimia 14: 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, ​​Mittal cK, Katsuki S dan Murad F: Nitric oxide mengaktifkan guanylate cyclase dan meningkatkan tahap guanosine 3':5'-cyclic monofosfat dalam pelbagai persediaan tisu. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wuren TN, Lu dX, Zhou Y dan Ge RL: Kesan antiproliferatif echinacoside pada sel otot licin arteri pulmonari tikus di bawah hipoksia. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ dan Tu PF: Echinacoside menimbulkan kelonggaran yang bergantung kepada endotelium dalam cincin aorta tikus melalui laluan NO-cGMP. Planta Med 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wuren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y dan Ge RL: Echinacoside mendorong vasorelaxation arteri pulmonari tikus dengan membuka NO-cGMP-PKG- saluran BKca dan mengurangkan tahap ca2 tambah intraselular. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y dan Higashi Y: Penilaian vasodilasi bebas endothelium: Dari metodologi kepada perspektif klinikal. J Hipertensi 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, chen J, Khan FU, chen X, Xu J dan derivatif pada sel endothelial vena umbilik manusia terhadap kecederaan akibat tekanan oksidatif: Penglibatan antioksida dan laluan isyarat PI3k/Akt/eNOS/NO. Biomed Pharmacother 106: 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y dan Okabe T: Src kinase-mengantarakan pengaktifan bukan genomik yang bergantung kepada reseptor androgen bagi lata isyarat yang membawa kepada sintase nitrik oksida endothelial . Biochem Bioph Res commun 424: 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y dan Okabe T: Pengaktifan bergantung kepada reseptor androgen sintase nitrik oksida endotel dalam sel endothelial vaskular: Peranan fosfatidillinositol {{3} }laluan kinase/Akt.Endokrinologi 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F dan Reno F: percambahan dan penghijrahan yang bergantung kepada NO yang disebabkan oleh vitamin d dalam HUVEc. J Steroid Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X dan Xu X: Ekspresi berlebihan protein uncoupling 2 menghalang apoptosis yang disebabkan oleh glukosa tinggi sel endothelial vena umbilical manusia. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X , Jian-Hua H , Wen-Jiang Z dan Bing S: Icariin melambatkan penuaan selular endothelial yang disebabkan oleh homocysteine ​​yang melibatkan pengaktifan laluan isyarat PI3K/AKT-eNOS. Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ dan Klenk dc: Pengukuran protein menggunakan asid bicinchoninic. Biokim Dubur 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H dan Liu X: Biosintesis triterpenoid dan tindak balas transkrip yang ditimbulkan oleh nitrik oksida dalam penapaian terendamGanoderma lucidum. Proses Biokim 60: 19-26, 2017.

18. Ellinsworth dc , Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY dan Gutterman dd: Hiperpolarisasi dan vasodilasi koronari yang berasal dari endothelium: pelbagai dan peranan bersepadu asid epoksieikosatrienoik, hidrogen peroksida, dan persimpangan jurang. Peredaran mikro 23: 15-32, 2016.

19. Freed JK dan Gutterman dd: komunikasi adalah kunci: Mekanisme isyarat antara sel dalam vasodilasi. J cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A, Fromy B dan debret R: Penderiaan persekitaran mikro endothelium yang membawa kepada vasodilasi pengantara oksida nitrat: Kajian semula isyarat saraf dan biomekanik. Nitrik Oksida 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, carreno dV, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS dan Smith GJ: Reseptor androgen dalam sel endotel manusia. J Endokrinol 224: 131-137, 2015.

22. deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H dan Gui YT: Tindakan bukan genomik androgen dimediasi oleh fosforilasi pantas dan pengawalan pemerdagangan reseptor androgen. Sel Physiol Biochem 43: 223‑236,2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP dan Ghedini Pc: Pengaktifan laluan PI3K/Akt yang dimediasi oleh reseptor estrogen menyumbang kepada yang disebabkan oleh estrone pengaktifan vaskular isyarat cGMP. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z dan Li P: Aktiviti antiosteoporotik echinacoside dalam tikus ovariectomized. Phytomedicine 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y dan Tu PF: Pengenalpastian sasaran farmakologi dan analisis keberkesanan glikosida phenylethanoid daripadaCistanchesHerba berasaskan strategi 'target fishing'. Dagu Tradit ubat Herba 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM dan Zhang X: Echinacoside meningkatkan kuantiti sperma dalam tikus dengan menyasarkan reseptor androgen hipotalamus. Sci Rep 8: 3839-3850, 2018.

27. tabung PJ, Jin J dan Woodgett JR: Protein kinase B (c-Akt): Pengantara pelbagai fungsi pengaktifan phosphatidylinositol 3-kinase. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y dan Qian J: Echinacoside meningkatkan fungsi hematopoietik dalam 5-tikus myelosuppression yang disebabkan oleh FU. Life Sci 123: 86-92, 2015.

29. chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W dan Zhou H: Kesan perlindungan echinacoside terhadap kecederaan anoksia/reperfusi dalam sel H9c2 melalui p-AKT dan SLc8A3 yang mengawal selia. Biomed Pharmacother 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P dan Su Y: Peranan kritikal Akt dalam fungsi kardiovaskular. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.