Echinacoside Melindungi Terhadap Disfungsi Mitokondria 6-Hydroxydopamine dan Tindak Balas Keradangan dalam Sel PC12 Dengan Mengurangkan Pengeluaran ROS

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Yue-Hua Wang,1,2 Zhao-Hong Xuan,3 Shuo Tian,1 dan Guan-Hua Du1,2

Penyakit Parkinson (PD) adalah gangguan neurodegeneratif yang dicirikan oleh kehilangan progresif neuron dopaminergik (DA) di substantia nigra. Disfungsi mitokondrial dan tindak balas keradangan terlibat dalam mekanisme kerosakan sel dalam PD. 6-Hydroxydopamine (6-OHDA), analog dopamin, khususnya merosakkan neuron dopaminergik.Echinacoside(ECH) ialah phenylethanoid glikosida yang diasingkan dari batangCistanche salsa, menunjukkan pelbagai kesan neuroprotektif dalam kajian sebelumnya. Kajian ini adalah untuk menyiasat kesannya terhadap neurotoksikcity yang disebabkan oleh 6-OHDA dan mekanisme yang mungkin dalam sel PC12. Keputusan menunjukkan bahawa 6-OHDA mengurangkan daya maju sel, mengurangkan aktiviti pengurangan pengoksidaan, mengurangkan potensi membran mitokondria, dan menyebabkan apoptosis mitokondria yang dimediasi berbanding dengan sel PC12 yang tidak dirawat. Walau bagaimanapunechinacosiderawatan dengan ketara mengurangkan perubahan ini yang disebabkan oleh 6-OHDA. Sebagai tambahanechinacosidejuga dapat mengurangkan tindak balas keradangan yang disebabkan oleh 6-OHDA. Penyelidikan lanjut menunjukkan bahawaechinacosideboleh mengurangkan pengeluaran ROS yang disebabkan oleh 6-OHDA dalam sel PC12. Keputusan ini menunjukkan bahawa mekanisme asas asasechinacosideterhadap neurotoksikcity yang disebabkan oleh 6-OHDA mungkin terlibat dalam mengurangkan disfungsi mitokondria dan tindak balas keradangan dengan mengurangkan pengeluaran ROS.

1. Pengenalan

Penyakit Parkinson (PD)adalah gangguan neurodegeneratif yang dicirikan oleh kemerosotan neuron dopamin yang perlahan-lahan progresif dalam substantia nigra pars compacta [1]. Walaupun ciri-ciri neuropatologi PD diterangkan dengan baik, etiologi masih belum ditentukan. Terutama, beberapa pemerhatian menunjukkan bahawa disfungsi mitokondria terlibat dalam patogenesis PD dan kemerosotan neuron dopaminergik [2, 3]. Mitokondria mengandungi banyak enzim redoks dan ketidakcekapan fosforilasi oksidatif secara semula jadi menghasilkan spesies oksigen reaktif (ROS) [4]. Baru-baru ini, peningkatan bukti dari kajian manusia dan haiwan telah menunjukkan bahawa keradangan saraf juga merupakan penyumbang penting kepada kehilangan neuron dalam PD [5].

6-Hydroxydopamine (6-OHDA) adalah khusus untuk neuron dopaminergik dalam model tikus intrastriatal dan dalam beberapa sel [6-11]. Sel PC12 telah menjadi model sel yang popular untuk penyelidikan PD kerana garis sel ini mempunyai banyak ciri neuron DAergic. Ia telah digunakan sebagai model in vitro untuk kajian PD dan untuk menentukan kesan agen pelindung dan terapeutik. Echinacoside (Rajah 1) adalah phenylethanoid glikosida terpencil dan disucikan dari batangCistanche salsa[12], tumbuhan parasit yang berasal dari barat laut China, yang digunakan sebagai cuba mekanisme asas echinacoside terhadap 6-OHDA-disebabkan oleh kerosakaninPC12cells.

2. Bahan dan Kaedah

2.1. Bahan. Echinacoside diperolehi dari Institut Nasional untuk Kawalan Makanan dan Dadah (Beijing, China). RPMI-1640 dan serum lembu janin diperolehi daripada Gibco

(Grand Island, NY, Amerika Syarikat). 6-OHDA, MTT, 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate, propidium iodide (PI), dan resazurin dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). Kit ujian bioluminescent ATP diperolehi dari Promega (Madison, Amerika Syarikat). 5,5,6,6 -Tetrachloro-1,1,3,3,3 -tet- raethyl benzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1) kit ujian diperolehi daripada Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Jiangsu, China). Kit Cytochrome C ELISA dan substrat fluorogenik Ac-DVD-AMC diperolehi daripada Invitrogen (Carlsbad, CA, Amerika Syarikat). Kit IL-1 dan IL-6 ELISA diperolehi daripada syarikat terhad Boster Bio-engineer (Wuhan, China). Pembaca mikroplate Spectramax M5 dibeli dari syarikat Molecular Devices (Sunnyvale, CA, Amerika Syarikat).

2.2. Budaya dan Rawatan Sel. Sel PC12 ditanam dalam RPMI-1640 ditambah dengan 10% serum kuda dan 5% serum lembu janin. Keadaan dikekalkan pada 37∘C dalam suasana lembap yang mengandungi 5% CO2 [19]. Sel-sel itu dilapisi ke dalam plat 96-baik pada ketumpatan 2 × 105 sel / mL. Selepas pertemuan 80%, sel-sel telah diprapasang dengan kepekatan echinacoside yang berbeza dalam medium RPMI-1640 bebas serum untuk 1 h. Kemudian, 6-OHDA telah ditambah ke telaga pada kepekatan akhir 100 M dan diinkubasi untuk yang lain Selepas rawatan, perubahan morfologi diperhatikan di bawah mikroskop. Daya maju sel dinilai oleh ujian MTT [19]. Secara ringkas, selepas rawatan, MTT pada kepekatan akhir 0.5 mg/ mL telah ditambah kepada setiap telaga dan diinkubasi untuk 4 h pada 37∘C.

2.3.Perubahan Morfologi dan Ujian Daya Maju Sel PC12. Selepas rawatan, perubahan morfologi diperhatikan di bawah mikroskop. Daya maju sel dinilai oleh ujian MTT [19]. Secara ringkas, selepas rawatan, MTT pada kepekatan akhir 0.5 mg/ mL telah ditambah kepada setiap telaga dan diinkubasi untuk 4 h pada 37∘C. Kemudian, supernatant telah dikeluarkan dan produk formazan dibubarkan dalam 100 L dimethyl sulfoxide dengan kacau selama 15 minit pada penggoncang plat microtiter dan penyerap dibaca pada 570 nm menggunakan pembaca mikroplate Spectramax M5. Perubatan Pelengkap dan Alternatif Berasaskan Bukti

2.4. Ujian Tahap ATP Intraselular. Tahap ATP selular diukur dengan kit ujian bioluminescent ATP mengikut arahan pengeluar. Luminescence dipantau pada pembaca mikroplate dalam mod luminescence berikutan penambahan 100 L luciferin dan luciferase [20].

2.5. Pengukuran Aktiviti Pengurangan Pengoksidaan Mitokondria oleh Resazurin. Selepas rawatan, resazurin pada concen akhir 5 M telah ditambah ke dalam telaga dan keamatan pendarfluor diperiksa pada pengujaan 530 nm dan pelepasan 590 nm [21].

2.6. Pengukuran Potensi Membran Mitokondrial oleh JC-1. Potensi membran mitokondria diukur menggunakan kit ujian JC-1 mengikut arahan pengeluar. Selepas rawatan, medium budaya telah dikeluarkan dan dimuatkan dengan penyelesaian JC-1 selama 15 minit pada 37∘C dalam gelap. Keamatan pendarfluor nisbah merah / hijau ditentukan pada pengujaan 490 nm dan pelepasan 530 nm (monomer pendarfluor hijau) dan 590 nm (agregat pendarfluor merah), masing-masing [22].

2.7. Kuantifikasi Pelepasan Cytochrome C. Tahap cytochrome C sitotolik diukur menggunakan kit ELISA mengikut arahan pengeluar [23]. Secara ringkas, selepas rawatan, sel-sel telah dilysed dan sentrifugated pada 1000 g selama 15 minit, dan kemudian supernatant dikumpulkan sebagai pecahan cytoplasmic dan digunakan untuk pengukuran pelepasan cytochrome C.

2.8. Penentuan Aktiviti Caspase-3. Aktiviti Caspase-3 dilakukan mengikut rujukan dengan pengubahsuaian [24]. Secara ringkas, selepas rawatan, penampan lysis telah ditambahtoeach dengan baik dan diikuti dengan sentrifugation pada 12 000 g selama 10 minit. Aktiviti Caspase-3 diuji dalam supernatants yang terhasil dengan mengukur cleavage proteolytic substrat fluorogenik Ac-DVD-AMC dengan panjang gelombang pengujaan 380 nm dan panjang gelombang pelepasan 460 nm.

2.9. Ujian Cytometry Aliran dalam Sel PC12. Selepas rawatan, sel-sel telah trypsinized, dibasuh dua kali dengan PBS, sentrifuged pada 1000 r / min selama 5 minit, dan kemudian ditetapkan dengan 70% etanol semalaman pada 4∘C. Sel-sel itu ditenun dan dibasuh dua kali dengan PBS, digunakan semula dalam PBS (mengandungi 50 g / mL RNaseA), diwarnakan dengan PI pada kepekatan akhir 10 M selama 30 minit pada suhu bilik dalam gelap, dan membaca dalam cytometer aliran pada 488 nm pengujaan [10].

2.10. Pengukuran Tahap IL-1 dan IL-6 oleh ELISA Assay. Medium sel PC12 berbudaya dikumpulkan selepas rawatan, dan kepekatan IL-1 dan IL-6 diukur dengan kit ELISA yang tersedia secara komersial mengikut protokol pengeluar manusia.

2.11. Penentuan Tahap Spesies Oksigen Reaktif Intraselular. Selepas inkubasi dengan 6-OHDA, sel dimuatkan dengan 10M H2DCFH-DA selama 30 minit pada 37∘C dalam gelap. Keamatan pendarfluor DCF diukur pada pengujaan

Panjang gelombang Perubatan Komplementari dan Alternatif Berasaskan Bukti 495 nm dan panjang gelombang pelepasan 530 nm pada pembaca mikroplate [25].

2.12. Analisis Statistik. Semua data dinyatakan sebagai min ± SD. Analisis statistik keputusan telah dijalankan oleh analisis sehala varians (ANOVA), diikuti dengan -test. Kepentingan statistik diterima di<>

3. Keputusan

3.1. KesanEchinacosideonMorphologydan Sel Viabilityin Sel PC12 Yang Rosak oleh 6-OHDA. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2(A), daya maju sel PC12 tidak mempunyai perbezaan yang ketara pada kepekatan 0.1∼10 M rawatan echinacoside untuk

24 h. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2(B), dalam tempoh 24 h rawatan dengan 6-OHDA sahaja, majoriti sel PC12 telah mengalami perubahan morfologi seperti blebbing membran dan pengecutan sel. Rawatan dengan echinacoside melindungi sel-sel dari kerosakan 6-OHDA. Ujian MTT menunjukkan bahawa rawatan sel PC12 dengan 6-OHDA sahaja mengakibatkan pengurangan kira-kira 25% dalam kelangsungan hidup sel dalam 24 h, manakala rawatan cotreatment dengan 0.1 M, 1 M, dan 10 M echinacoside menunjukkan pengurangan sitotoksiscity 6-OHDA (semua< 0.01,="" figure="">

3.2. Kesan Echinacoside pada Disfungsi Mitokondria yang disebabkan oleh 6-OHDA dalam Sel PC12. Tahap ATP selular menurun dengan ketara berikutan 24 h inkubasi dengan 100M 6-OHDA, manakala rawatan dengan 1 Mand 10 M echinacoside mengurangkan 6-OHDA-mediated ATP mengurangkan perubahan anabolik dalam sel PC12. Keputusan menunjukkan bahawa cotreatment dengan 1 Mand 10 M echinacoside boleh mengurangkan kemerosotan aktiviti pengurangan pengoksidaan mitokondria dengan ketara yang disebabkan oleh 6-OHDA (kedua-duanya< 0.05="" and="" figure="">

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3(c), rawatan dengan 100 M 6- OHDA untuk 24 h mengakibatkan penurunan ketara potensi membran mitokondria berbanding dengan kumpulan yang tidak dirawat (< 0.01).="" however,="" the="" decrease="" of="" mitochondrial="" membrane="" potential="" induced="" by="" 6-ohda="" was="" significantly="" attenuated="" by="" cotreatment="" with="" 0.1="" m,="" 1="" m,="" and="" 10="" m="" of="" echinacoside="" (all=""><>

3.3. Apoptosis Anti-Mitochondria-Mediated Echinacoside dalam Sel PC12 terhadap Neurotoxicity 6-OHDA. Keputusan menunjukkan bahawa pendedahan 6-OHDA menghasilkan peningkatan cytochrome C cytosolic sebanyak 167% berbanding kumpulan yang tidak dirawat (< 0.01).="" echinacoside="" at="" the="" dose="" of="" 0.1="" m,="" 1="" m,="" and="" 10m="" could="" significantly="" reduce="" the="" cytochrome="" c="" release="" into="" cytosol="" induced="" by="" 6-ohda="" (="">< 0.05,="">< 0.01,="" and="">< 0.01,resp.;="" figure="">

Aktiviti Caspase-3 meningkat kira-kira 3.3 kali ganda berbanding dengan kumpulan yang tidak dirawat selepas pendedahan 6-OHDA (< 0.01).="" in="" contrast,="" cotreatment="" with="" 1="" m="" and="" 10="" m="" of="" echinacoside="" showed="" a="" significant="" decrease="" in="" caspase-3="" activity="" compared="" with="" 6-ohda-treated="" cells,="" respectively="" (both="">< 0.05="" and="" figure="" 4(b)).pi="" is="" membrane="" permeability="" and="" is="" generally="" excluded="" from="" viable="" cells.="" so="" it="" is="" commonly="" used="" for="" identifying="" dead="" cells="" in="" a="" population.="" the="" results="" showed="" that="" the="" apoptosis="" rate="" was="" significantly="" increased="" following="" 24="" h="" incubations="" with="" 100="" m="" 6-ohda,="" whereas="" cotreatment="" with="" 1="" and="" 10="" m="" echinacoside="" significantly="" reduced="" 6-ohda-induced="" apoptosis="" (="">< 0.05,="">< 0.01,resp.,="" figure="">

3.4. Kesan anti-radang Echinacoside dalam sel PC12 yang disebabkan oleh 6-OHDA. Keputusan menunjukkan bahawa pendedahan 6-OHDAmengenai tahapinanincreaseinIL-1 berbanding dengan kumpulan yang tidak dirawat (< 0.05;="" figure="" 4(a)).="" however,="" 10="" m="" of="" echinacoside="" could="" significantly="" reduce="" il-1="" release="" induced="" by="" 6-ohda="" (="">< 0.05;="" figure="">

Tahap IL-6 juga meningkat dengan ketara berbanding dengan kumpulan yang tidak dirawat (< 0.01).="" however,="" cotreatment="" with="" 0.1,="" 1,="" and="" 10="" m="" of="" echinacoside="" all="" significantly="" decreased="" il-6="" release="" compared="" with="" 6-ohda-treated="" cells="" (both="">< 0.05="" and="" figure="">

3.5. Kesan ECH pada pengeluaran ROS yang disebabkan oleh 6-OHDA dalam sel PC12. Sel yang dirawat dengan 6-OHDA menunjukkan peningkatan yang ketara (kira-kira 1.4 kali ganda) ROS intraselular berbanding dengan sel yang tidak dirawat (< 0.01).="" this="" increase="" was="" significantly="" attenuated="" by="" coincubation="" with="" 0.1,="" 1,="" and="" 10="" m="" echinacoside="" (="">< 0.05,="">< 0.01,and="">< 0.01,resp.;="" figure="">

4. Perbincangan

Echinacoside adalah salah satu konstituen utama phenylethanoid glikosida yang diekstrak dari ekhinacoside tradisional yang terkenal yang dilaporkan mempunyai sifat anti-apoptotik dan neuroprotektif dalam penyakit neurodegeneratif [18]. Dalam kajian vivo melaporkan bahawa echinacoside mempunyai kesan neuroprotektif dan peningkatan tingkah laku dalam model tetikus kerosakan neuron dopaminergik yang disebabkan oleh MPTP, sementara siasatan lanjut mendedahkan bahawa echinacoside menyebabkan downregulation caspase-3 dan caspase-8 pengaktifan dalam apoptosis yang disebabkan oleh MPP + neuron butiran cerebellar [16]. Satu lagi kajian in vivo melaporkan kesan neuroprotektif echinacoside pada neuron dopaminergik striatal yang cedera oleh 6-OHDA [17]. Walau bagaimanapun, mekanisme selular dan molekul yang mendasari tindakan ini tidak difahami sepenuhnya, terutamanya untuk pengaruh mereka terhadap fungsi mitokondria dan tindak balas keradangan. Oleh itu, kajian semasa kami menyiasat kesan echinacoside pada fungsi mitokondria dan tindak balas keradangan untuk menjelaskan mekanismenya terhadap PD. Keputusan pertama menunjukkan bahawa echinacoside dengan ketara mengurangkan neurotoksikcity yang disebabkan oleh 6-OHDA dalam sel PC12 dengan melindungi fungsi mitokondria dan anti-radang.

Disfungsi mitokondrial telah lama terlibat dalam kematian neuron dopaminergik nigrostriatal dalam penyakit Parkin- anak lelaki dan model eksperimennya [26]. Mitokondria sangat terlibat dalam pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) melalui pembawa elektron rantaian pernafasan dalam penyakit neurodegeneratif [27]. Pelbagai jenis ROS dihasilkan dalam perjalanan metabolisme normal dalam sistem biologi, tetapi pengumpulan mereka di luar

jumlah yang diperlukan berpotensi merosakkan lipid, protein, dan asid nukleik.

6-OHDA, analog catecholamine, menyebabkan kemerosotan tertentu neuron substantia nigra. Neurotoxicity yang disebabkan oleh 6-OHDA, sebahagiannya, disebabkan oleh pengeluaran ROS [28-32].

OHDA menyebabkan kematian neuron dengan mempengaruhi fungsi mitokondria, termasuk pengurangan dalam produksi ATP, gangguan metabolisme ROS, dan induksi apoptosis [10, 33, 34]. Dalam kajian ini, keputusan kami juga menunjukkan bahawa 6-OHDA merosakkan fungsi pengurangan oksidatif mitokondria, mengurangkan potensi membran mitokondria, apoptosis mitokondria yang disebabkan, dan peningkatan pengeluaran ROS dalam sel PC12.

Resazurin adalah penunjuk pendarfluor yang hanya pertengahan antara pengurangan akhir oksigen molekul dan cytochrome oxidase. Oleh itu, potensi pengurangan oksidatif resazurin membolehkan rantaian pernafasan berfungsi hampir selesai, yang akan memberikan petunjuk yang lebih tepat dan sensitif fungsi mitokondria. JC-1 ialah siasatan sensitif potensi membran yang menyetempatkan kepada membran mitokondria dalaman di mana ia membentuk sama ada monomer (hijau) atau agregat (merah) berdasarkan potensi membran mitokondria. Oleh itu, resazurin dan JC-1 adalah alat analisis yang berharga untuk memeriksa fungsi mitokondria [35]. Kajian ini menunjukkan bahawa penurunan dalam aktiviti pengurangan oksidatif mitokondria dan potensi membran mitokondria mungkin memainkan peranan penting dalam neurotoksik dotoksik yang disebabkan oleh 6-OHDA. Keputusan kami juga menunjukkan aktiviti pengurangan oksidatif mitokondria dan potensi membran mitokondria. Keputusan ini memberikan bahawa peningkatan disfungsi mitokondria mungkin merupakan cara yang lebih baik untuk melambatkan neurodegenerasi dopaminergik progresif yang biasa dikaitkan dengan PD.

Secara amnya diterima bahawa apoptosis sel yang disebabkan oleh 6- OHDA dimediasi oleh disfungsi mitokondria, dicirikan oleh pelepasan cytochrome C, dan pengaktifan caspase-3 [36]. Rangsangan apoptotik mencetuskan pembebasan cytochrome C dari mitokondria ke dalam cytosol di mana ia kemudian mengaktifkan caspase-3 dan caspases hiliran lain. Dalam kajian ini, keputusan menunjukkan bahawa sel PC12 yang terdedah kepada 100 M daripada 6-OHDA meningkatkan pelepasan cytochrome C dan caspase bergantung kepada pelepasan cytochrome C dan caspase- 3 pengaktifan. Keputusan ini menunjukkan bahawa echinacoside boleh menghalang apoptosis mitokondria dengan mengurangkan pelepasan cytochrome C dari mitokondria kepada cytosol dan pengaktifan caspase-3.

Keradangan adalah ciri neuropatologi otak Parkinsonian dan juga dalam model eksperimen penyakit ini. Strategi terapeutik yang menjurus ke arah mengurangkan keradangan dan menghalang pengeluaran faktor keradangan ini mungkin merupakan strategi neuroprotektif yang menjanjikan untuk rawatan penyakit Parkinson dan keadaan yang berkaitan [37]. Beberapa kajian juga dilakukan dalam cecair serebrospinal dan semasa analisis postmortem pada pesakit Parkinson mendedahkan peningkatan tahap sitokin, seperti interleukin-1 (IL-1) dan interleukin-6 (IL-6), mencadangkan pengaktifan aproinflammatoryresponse[38, 39]. Dalam kajian ini, hasilnya menunjukkan pelepasan IL-1 dan IL-6 dalam sel PC12. Walau bagaimanapun, rawatan dengan echinacoside boleh menghalang pelepasan IL-1 dan IL-6 yang disebabkan oleh 6-OHDA. Hasilnya menunjukkan bahawa mengurangkan tindak balas keradangan juga terlibat dalam mekanisme echinacoside terhadap neurotoksikcity yang disebabkan oleh 6-OHDA.

Kesimpulannya, hasil penyelidikan ini menunjukkan bahawa echinacoside dapat menyekat neurotoksikcity yang disebabkan oleh 6-OHDA dalam sel PC12, dan mekanisme mungkin berkaitan dengan perlindungan mitokondria dan anti-radang dengan mengurangkan pengeluaran ROS. Maklumat yang diberikan oleh kerja ini akan berguna untuk menjelaskan mekanisme echinacoside untuk anti- PD. Disimpulkan bahawa echinacoside mungkin merupakan pilihan terapeutik yang menjanjikan untuk pencegahan dan rawatan PD.

Konflik Kepentingan

Penulis telah mengisytiharkan tiada konflik kepentingan

Pengakuan

Kerja ini disokong oleh Geran dari Yayasan Sains Semula Jadi Kebangsaan China (81473383) dan Projek Utama Sains dan Teknologi Kebangsaan (2012ZX09103101-078; 2013ZX09103-001-008; dan 2013ZX09102106).