Cistanche Deserticola memperbaiki kecederaan sel saraf hippocampus dalam tikus penyakit Parkinson melalui mengawal laluan Keap1/nrf2/ho -1

Abstrak:

 

Objektif untuk meneroka kesanCistanche Deserticola mengenai Kecederaan Sel Saraf dalam Penyakit Parkinson (PD)tikus dan mekanisme yang berkaitan. Kaedah tikus lelaki Sprague-Dawley (SD) secara rawak dibahagikan kepada tiga kumpulan (1 0 tikus dalam setiap kumpulan): kumpulan kawalan, kumpulan model dan kumpulan cistanche. Tikus dalam kumpulan model dan kumpulan rawatan telah disuntik secara intrakrani dengan 6- hydroxydopamine (6- Ohda). Tikus dalam kumpulan Cistanche diberikan 0.216g/ ml penyelesaian cistanche, tikus dalam kumpulan kosong dan kumpulan model diberi pengairan salin biasa, jumlah pengairan adalah 1ml/ (100g · d) selama dua minggu. Morfologi badan Nishi di rantau Hemimani diperhatikan oleh pewarnaan Nishi. Tahap malondialdehid (MDA) dan superoxide dismutase (SOD) dikesan oleh kaedah asid thiobarbituric dan kaedah nitroblue tetrazolium. Perubahan protein yang berkaitan dengan ech 1 (Keap 1), faktor nuklear e 2- faktor berkaitan 2 (NRF 2) dan protein heme cyclooxygenase 1 (HO -1) dianalisis oleh blot Barat. Keputusan Selepas rawatan ubat cistanche deserticola, struktur tisu hippocampal tikus PD telah diperbaiki, morfologi neuron diperbaiki, pyretosis nuklear telah dilepaskan, kandungan enzim antioksidan sod dalam hippocampus secara beransur -ansur, manakala kandungan yang dikurangkan secara beransur -ansur. menurun. Ekspresi protein Nrf 2 dan Ho -1 meningkat. Kesimpulan Cistanche Deserticola dapat meningkatkan kerosakan neuron hippocampus, dan mengurangkan tahap tindak balas tekanan oksidatif dalam hippocampus tikus PD. TheKesan Cistanche DesertacoladalamRawatan PDTikus berkait rapat dengan peraturan Keap -1 /nrf 2 /ho -1 laluan isyarat.

 

 

 

Cistanche berkualiti tinggi untuk rawatan PD

 

Kata kunci: Cistanche Deserticola;Penyakit Parkinson; Tekanan oksidatif; hippocampus; neuron; Keap1; NRF2; Ho -1

 

Menurut statistik dari kajian data penyakit global, penyakit neurologi telah menjadi penyebab utama kecacatan di seluruh dunia. Dalam bidang ini, Penyakit Parkinson (PD) telah menjadi salah satu penyakit yang paling pesat berkembang dengan peningkatan prevalensi yang signifikan umurnya, meningkatkan kes kecacatan, dan peningkatan kadar kematian. satu.
Dari tahun 1990 hingga 2020, bilangan pesakit PD di seluruh dunia meningkat sebanyak 118%, mencapai 6.2 juta, dan kejadian itu masih meningkat tahun demi tahun [1-2]. Pesakit PD biasanya hadir dengan gejala motor seperti gegaran, kekakuan otot, bradykinesia, dan keseimbangan keseimbangan di peringkat akhir. Walau bagaimanapun, gejala bukan motor seperti penurunan kognitif boleh berlaku pada peringkat awal penyakit. Apabila penyakit itu berlangsung, kemerosotan kognitif akan semakin buruk dan menjadi lebih teruk.

Cistanche berkualiti tinggi untuk rawatan PD

Mempengaruhi kualiti hidup pesakit [3]. Hippocampus adalah organisasi penting di otak untuk pembelajaran ruang dan menerima maklumat luaran. Ia adalah struktur utama untuk merealisasikan fungsi kognitif manusia. Disfungsi hippocampal berkait rapat dengan permulaan disfungsi kognitif dalam pesakit PD. Tekanan oksidatif terlibat dalam perkembangan sel saraf dalam tisu hippocampal. Kerosakan [4-5]. Oleh itu, jika neuron hippocampal dilindungi pada pesakit dengan PD, ia boleh meningkatkan kognisi pesakit dan menangguhkan perkembangan penyakit.
Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, pelbagai ubat herba Cina telah terbukti berkesan dalam merawat penyakit yang berkaitan dengan neurologi [6]. Cistanche Desertacola adalah ubat tradisional Cina yang dapat menyuburkan buah ginjal dan menambah intipati dan darah. Ia telah digunakan untuk merawat penyakit neurologi seperti strok iskemia dan neuromyelitis [7]. Kajian terdahulu oleh kumpulan penyelidikan telah menunjukkan bahawa cistanche desidencola dapat meningkatkan tingkah laku tikus model PD dan mengurangkan apoptosis sel -sel saraf dopamin di kawasan substantia nigra di tengah -tengah [8-9]. Walau bagaimanapun, tidak jelas sama ada Cistanche Desertacola boleh meningkatkan kerosakan tisu hippocampal dalam tikus model PD. Oleh itu, kajian ini menubuhkan model tikus PD untuk memerhatikan kesan desiden Cistanche pada kerosakan tisu hippocampal dan meneroka mekanismenya, untuk memberikan idea -idea baru untuk rawatan biologi PD); NISSL Pewarnaan Reagen (Nanjing Senbeijia Biological Company); Isoflurane (Syarikat Biologi Shanghai Yaji).

 

1 Bahan dan Kaedah

1.1 Bahan

1.1.1 Haiwan Eksperimen

30 6- tikus lelaki SD yang berusia seminggu yang beratnya 210-230 g digunakan. Pusat Haiwan Eksperimental Fujian Universiti Perubatan Tradisional Cina menyediakan haiwan eksperimen dan kemudahan persekitaran haiwan eksperimen perubatan umum. Eksperimen ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Institusi ini, dan Nombor Pendaftaran Etika adalah 1N2023019.

1.1.2 Reagen Eksperimen
Granul Cistanche Deserticola (Hospital Rakyat Ketiga Fujian); 6- hydroxydopamine (6- ohda) Reagent (Beijing Biolabor Technology Co., Ltd.); Hematoxylin-eosin (HE) pewarnaan reagen (Taizhou Yunke Biotechnology Co., Ltd.); Lysate protein tisu haiwan (Beijing Solebao Biological Company); Inhibitor protein fosfatase (Wuhan Pujian Biologi Syarikat); Perencat protease (Syarikat Bioteknologi Hunan Yunbang); Protein yang berkaitan dengan ech ech -1 (Keap1) antibodi monoklonal (Wuhan Saning Biotechnology Company); Glyceraldehyde 3- fosfat dehydrogenase (GAPDH) antibodi monoklonal (Wuhan HUAMEI BIOLOGI); Faktor Nuklear E2 Faktor Berkaitan 2 (Nrf2), Heme Oxygenase 1 (Hemoxygenas -1, Ho -1) antibodi monoclonal (Wuhan Pujian Biotechnology Co., Ltd.); Superoxide dismutase (SOD) dan kit pengesanan Malondialdehyde (MDA) (Shanghai Biotech Co., Ltd.); Nissl pewarnaan reagen (Nanjing Senbeijia Biotechnology Co., Ltd.); Isoflurane (Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd.).

 

1.1.3 Instrumen

JEA3001 Baki Elektronik (Shanghai Puchun Mengukur Instrumen Co., Ltd.); BSA224S Baki Elektronik (Sartorius, Jerman); Stab S2T shaker suhu rendah (Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., Ltd.); RM2235 Parafin Slicer sepenuhnya automatik (Leica, Jerman); Pectramax i3x pembaca mikroplat pelbagai fungsi (Peranti Molekul, Amerika Syarikat); BX63
mikroskop pendarfluor (Olympus, Jepun); Dlab Handheld Centrifuge D1008/D1008E (Beijing Dalong Xingchuang Instrumental Co., Ltd.); Cryocube F740Hi Ultra-Low Suhu Peti Sejuk (Epend, Jerman); Minipro Epbasic Asas Electrophoresis Instrumen Bekalan Kuasa (Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.); ketuhar pengeringan suhu berterusan (Hangzhou Notting Scientific Equipment Co., Ltd.); Ascent Max Ductless Fume Hood (Shanghai Yishike Enterprise Development Co., Ltd.).

 

1.2 Kaedah

1.2.1 Penubuhan Model dan Pengumpulan Haiwan

Rats were placed in an environment with a temperature of 24-25℃, a humidity of 55%-60%, and a 12/12 h light/dark cycle, with free access to food and water. SD rats were randomly divided into 3 groups (10 rats in each group): blank group, model group, and Cistanche deserticola group. According to the PD animal model establishment method [5], SD rats in the model group and Cistanche deserticola group were anesthetized by 2% isoflurane inhalation and fixed on a brain stereotaxic instrument. The skin was incised along the midline of the skull, and the skull membrane was bluntly separated. The coordinates of the right striatum were determined by referring to the rat brain stereotaxic atlas. 8μL of 6-OHDA was injected intracranially at the above target at a concentration of 2μg/μL, and the blank group rats were injected with an equal volume of saline. Successful modeling criteria: One week after modeling, apomorphine (0.5 mg/kg) was intraperitoneally injected to induce rat rotation. The rats rotated from the healthy side to the affected side, and the number of rotations within 30 min was >21 0 Circles, yang dianggap sebagai pemodelan yang berjaya. Selepas itu, tikus dalam kumpulan Cistanche Desertacola telah disalurkan dengan penyelesaian 0.216 g/ml Cistanche Desertacola setiap hari, dan kumpulan kosong dan kumpulan model telah dialihkan dengan garam normal. Jumlah gavage tiga kumpulan tikus adalah 1 ml/(100 g · d) selama dua minggu [9]. Selepas rawatan setiap kumpulan tikus selesai, tikus telah dikosongkan oleh 2% anestesia penyedutan isoflurane dan tisu otak dikumpulkan untuk kajian eksperimen berikutnya.

 

1.2.2 Pemerhatian perubahan patologi dalam tisu hippocampal oleh pewarnaan hematoxylin-eosin

 

Tisu hippocampal tikus dalam setiap kumpulan dikumpulkan, diletakkan dalam larutan formaldehid, dehidrasi dengan etanol kecerunan, dibakar dalam ketuhar pengeringan, lilin dibubarkan, dikeringkan, dihiasi, ternoda dengan dia, telus dengan xilena, dimeteraikan dengan gusi neutral, dan diperhatikan di bawah mikroskop.

 

1.2.3 Pemerhatian Mikroskopi Elektron Penghantaran Ultrastruktur Sel Saraf Hippocampal

Tisu hippocampal diletakkan dalam 3% glutaraldehyde fixative, dehidrasi dengan etanol kecerunan, tertanam (resin epoksi), dan bahagian ultrathin disediakan. Pewarnaan sitrat dan uranyl asetat digunakan untuk melihat perubahan ultrastruktur sel saraf hippocampal (di bawah mikroskopi elektron penghantaran).

 

1.2.4 NISSL Pewarnaan Untuk memerhatikan perubahan badan NISSL dalam tisu hippocampal

Bahagian parafin tisu hippocampal yang disebutkan di atas telah terhidrasi dalam etanol anhydrous, 95% dan 70% etanol kecerunan. Selepas mencuci dengan air suling 3 kali, noda dengan larutan pewarnaan NISSL selama 5 minit, kemudian basuh dengan alkohol kecerunan dehidrasi dan air suling, dan jelas dengan xilena. Bahagian -bahagian itu dimeteraikan dengan gam neutral, dan diperhatikan dan direkodkan di bawah mikroskop optik selepas pemejalan.

 

1.2.5 Kaedah Colorimetric Kimia Untuk mengesan kandungan MDA dan SOD dalam tisu hippocampal

Selepas tisu hippocampal kumpulan eksperimen yang berbeza telah homogen, mereka disentrifugasi pada 1000 g selama 20 minit dan supernatan setiap kumpulan eksperimen dikumpulkan. Menurut arahan kit, kit ujian MDA dan SOD digunakan untuk mengesan kandungan MDA dan SOD dalam setiap kumpulan sampel eksperimen.

 

1.2.6 Protein Immunoblotting Untuk mengesan ekspresi spesifik Keap1, Nrf 2, dan Ho -1 protein dalam tisu hippocampal

Tisu hippocampal setiap kumpulan telah ditambah dengan penampan lisis dan disentrifugasi pada 12, 000 r · min -1 selama 15 minit. Supernatan dikumpulkan untuk kegunaan siap sedia. Kepekatan protein ditentukan oleh kaedah BCA. Menurut hasil kuantifikasi protein, jumlah protein yang sama ditambah dan dimuatkan dengan elektroforesis gel protein. Sampel -sampel itu disenaraikan pada 95 darjah selama 10 minit, dipindahkan ke membran, memotong, dan disekat dalam larutan menghalang selama 1 jam. Antibodi utama yang dicairkan Keap1, Nrf 2, Ho -1, dan Gapdh (1: 500) telah ditambah, bertindak balas semalaman pada 4 darjah, dibasuh dengan 1 × TBST, diinkubasi dengan antibodi sekunder (1: 4000), dan dibasuh dengan 1 × TBST sekali lagi untuk pencitraan warna.

 

1.3 Analisis Statistik

Data pengiraan dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai. Data yang disesuaikan dengan pengagihan normal dan homogeniti varians tertakluk kepada ujian t, data yang sesuai dengan pengedaran normal dan varians yang tidak sama rata tertakluk kepada ujian t yang diperbetulkan; Data yang tidak sesuai dengan taburan normal tertakluk kepada ujian nonparametrik. ANOVA satu arah digunakan untuk membandingkan perbezaan antara kumpulan yang berbeza, dan kemudian kaedah LSD digunakan untuk membandingkan kedua-dua kumpulan. P <0. 05 dianggap signifikan secara statistik.

 

2 Keputusan

2.1 Kesan Cistanche Deserticola pada struktur morfologi rantau CA1 hippocampal dalam tikus model PD dia mengotorkan hasil menunjukkan bahawa neuron di rantau CA1 hippocampus tikus kumpulan kosong disusun dengan kemas dan ketat, dengan morfologi biasa dan pengedaran seragam, dan tidak ada sel neuron yang jelas; Sel -sel neuron dalam kumpulan model disusun lebih tidak senonoh, nukleus sel telah merosot, pewarnaan nuklear semakin mendalam, dan kerosakan sel neuron adalah jelas; Sel -sel neuron dalam kumpulan cistanche desertacola disusun lebih kerap daripada kumpulan model, bilangan pemeluwapan nuklear dikurangkan, dan kerosakan sel neuron dikurangkan. Hasilnya ditunjukkan dalam Rajah 1.

 

 

Rajah 1 Kesan Cistanche Deserticola pada struktur patologi di rantau CA1 hippocampus di tikus Parkinson (HE, × 400) Nota: A: Kumpulan Kawalan; B: Kumpulan Model; C: Kumpulan Cistanche. Anak panah hitam menunjukkan sel saraf yang rosak.

 

2.2 Kesan Cistanche Deserticola pada ultrastruktur neuron hippocampal dalam tikus model PD

Dalam kumpulan kosong, apabila memerhatikan neuron hippocampal, dapat dilihat bahawa struktur sel mengekalkan morfologi yang jelas, nukleus membentangkan bentuk bulat atau bujur, membran nuklear tetap licin dan utuh, dan kromatin dalam nukleus diedarkan secara sama rata, dan tidak ada agregasi kelebihan kromomatin. Sebaliknya, neuron hippocampal kumpulan model menunjukkan perubahan yang jelas: ketumpatan elektron keseluruhan sel meningkat, nukleus pekat, kromatin dalam nukleus diagregatkan dan dilekatkan ke bahagian bawah membran nuklear, membran nuklear, dan vacuoles dilihat di sitoplasm. Setelah campur tangan dengan cistanche desidenes, berbanding dengan kumpulan model, neuron hippocampal dari kumpulan desiden cistanche menunjukkan trend pemulihan tertentu: saiz badan sel neuron telah dipulihkan, membran sel yang tidak dibebankan. Sitoplasma menurun, menunjukkan bahawa cistanche deserticola mempunyai kesan perlindungan atau pembaikan tertentu pada sel -sel saraf. Lihat Rajah 2.

 

Rajah 2 Kesan Cistanche Deserticola pada ultrastruktur neuron dalam hippocampus tikus penyakit Parkinson (× 7000) Nota: A: Kumpulan Kawalan; B: Kumpulan Model; C: Kumpulan Cistanche.

 

2.3 Kesan Cistanche Deserticola pada badan Nissl dalam neuron hippocampal tikus model PD

Hasil pewarnaan NISSL menunjukkan bahawa neuron dalam kumpulan kosong telah diatur dengan teliti, dengan morfologi biasa, badan NISSL yang banyak dan pewarnaan gelap; Neuron dalam kumpulan model telah diatur, bengkak, dan kebanyakan badan NISSL dibubarkan dan ringan bernoda; Neuron -neuron dalam kumpulan Cistanche Deserticola telah diatur dengan teliti, dengan morfologi biasa, dan bilangan dan pewarnaan badan NISSL diperbaiki berbanding dengan kumpulan model. Hasilnya ditunjukkan dalam Rajah 3.

 

Rajah 3 Kesan Cistanche Deserticola pada badan saraf hippocampal Nissl dalam tikus penyakit Parkinson (NISSL, × 200) Nota: A: Kumpulan Kawalan; B: Kumpulan Model; C: Kumpulan Cistanche.

 

2.4 Kesan Cistanche Deserticola pada kandungan SOD dan MDA di hippocampus tikus penyakit Parkinson

 

Berbanding dengan kumpulan kosong, kandungan SOD dalam hippocampus kumpulan model menurun, manakala kandungan MDA meningkat; Berbanding dengan kumpulan model, kandungan SOD dalam hippocampus kumpulan Cistanche Desertacola meningkat, manakala kandungan MDA menurun. Lihat Jadual 1.

 

Tab. 1 Kesan Cistanche Deserticola pada kandungan SOD dan MDA di hippocampus tikus penyakit Parkinson

Kumpulan	Sod (pg/ml)	MDA (pg/ml)
Kawalan	12.36±2.75	2.85±0.83
Model	2.75±0.83*	9.95±0.37*
Rhynchophylla	7.22±1.32#	5.16±1.75#

Nota: Berbanding dengan kumpulan kawalan, *p<0.05; compared with model group, #P<0.05.

 

2.5 Kesan Cistanche Deserticola pada Ekspresi Keap1, Nrf2, dan Ho -1 protein dalam hippocampus tikus penyakit Parkinson

Hasil eksperimen blot Barat menunjukkan bahawa ekspresi protein Nrf2 dan Ho -1 dalam hippocampus tikus dalam kumpulan model menurun, sementara ekspresi protein Keap1 meningkat; Berbanding dengan kumpulan model, ekspresi protein Nrf2 dan Ho -1 dalam hippocampus tikus dalam kumpulan cistanche desidencola meningkat, manakala ekspresi protein Keap1 menurun. Lihat Rajah 4 dan Jadual 2.

Rajah 4 Kesan cistanche deserticola pada ekspresi Keap1, Nrf2, dan Ho -1 dalam hippocampus tikus penyakit Parkinson

Nota: A: Kumpulan Kawalan; B: Kumpulan Model; C: Kumpulan Cistanche

 

 

Tab. 2 Kesan Cistanche Deserticola pada Ekspresi Keap1, Nrf2, Ho -1 dalam hippocampus tikus penyakit Parkinson

 

Kumpulan	KEAPL	NRF2	Ho -1
Kumpulan kosong	0.16±0.05	0.38±0.07	0.33±0.05
Kumpulan model	0.85±0.23*	0.12±0.09*	0.11±0.02*
Kumpulan positif	0.22±0.03#	0.86±0.06#	0.79±0.05#

 

Nota: berbanding dengan kumpulan kawalan, *p <{{0}}. 05; Berbanding dengan kumpulan model, #p <0.05.