Populasi Sel T CD8 Dan CD4 dalam Buah Pinggang Manusia
Mar 25, 2022
Abstrak:Latar belakang: Di tapak sempadan, dan dalam organ dalaman, sel T memori pemastautin tisu (TRM) menyumbang kepada penghalang imun terhadap patogen seperti virus, bakteria, kulat dan kanser. Walau bagaimanapun, maklumat mengenai kehadiran dan fungsi sel-sel ini dalam buah pinggang manusia adalah kurang. Untuk lebih memahami pertahanan imunologi pengantaraan sel T dalam organ ini, kami bertujuan untuk menentukan aspek fenotip dan fungsi sel T CD8 dan CD4 yang terdapat dalam sihat dan allograf.buah pinggang tisu. Kaedah: Menggunakan multichannel fellow cytometry, kami menilai fenotip dan fungsi sel T dalam sampel tisu buah pinggang yang sihat (n=5) danbuah pinggangtisu allograf (n=7) dan membandingkan aspek ini dengan sel T dalam darah periferi daripada kawalan sihat (n=13). Keputusan:buah pinggangsampel tisu mengandungi sejumlah besar sel CD8 dan CD4 T. Berbeza dengan sel yang beredar,buah pinggangSel T sering menyatakan CD69 dan CD103 dan lebih kerap berbasikal secara aktif. Tambahan pula, hampir semuabuah pinggangSel T menyatakan CXCR3, dan sering menyatakan CXCR6 berbanding sel T dalam edaran. Secara ketara,buah pinggangSel T menghasilkan kuantiti IFN yang lebih besar daripada sel yang beredar dan selalunya berfungsi polifungsi. Kesimpulan: Sel T berfungsi dengan ciri ciri TRM berada dalam manusiabuah pinggangtisu. Sel-sel ini lebih kerap berbasikal secara aktif dan kerap mengekspresikan CXCR3 dan CXCR6.
Kata kunci:limfosit pemastautin tisu; sel-T; CD8; CD4; CD69; CD103; buah pinggang; alograf
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI PENYAKIT BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
1. PengenalanSel T ingatan penduduk (TRM) kekal dalam tisu untuk menyediakan pertahanan setempat jangka panjang terhadap patogen. Berbeza dengan sel T yang beredar semula, populasi TRM tidak dapat dikesan dalam darah periferal, dan berbeza dengan ketara daripada populasi sel T yang beredar semula berkenaan dengan fenotip, fungsi dan metabolismenya [1]. Sesungguhnya, ini tidak menghairankan memandangkan fakta bahawa sistem organ yang berbeza, seperti paru-paru, terdedah kepada beban yang lebih tinggi daripada patogen yang berbeza daripada yang berlaku untuk peredaran, yang secara amnya terpencil dari dunia luar [2].Pengekalan tisu TkM berterusan selama bertahun-tahun dan dimediasi oleh mekanisme yang melibatkan paksi Sfingosine-1-phosphate receptor1 (S1PR1)-sfingosine 1-phosphate (SP1). S1PR1 ialah reseptor yang diungkapkan oleh sel T yang mengantara pelepasan daripada organ limfoid sekunder apabila mengikat molekul isyarat bioaktif SP1, yang merupakan pengantara penting pemerdagangan sel T. Paksi ini boleh diganggu oleh CD69, lektin jenis c terikat membran yang menentang ekspresi S1PR1, dengan itu menjadi pengantara pengekalan. Tambahan pula, dalam ekspresi S1PR1 tikus diinduksi oleh faktor transkripsi Krüppel-like Factor 2 (KLF2), yang didapati dikurangkan dalam TRM, dengan itu juga menghalang pengeluaran limfosit [3]. Sebaliknya, downregulation KLF2 ditunjukkan untuk dimediasi oleh homolog faktor transkripsi Blimpl dalam sel T (Hobit), yang dinyatakan dalam cara khusus TpM dalam sel T murine [4]. Tambahan pula, beberapa TRM juga menyatakan CD103 (integrin E), di mana TRM boleh dikenal pasti menggunakan ungkapan CD69 dan CD103 [1].
Walaupun pengetahuan tentang fenotip dan fungsi TRM semakin meningkat untuk pelbagai tisu manusia, sedikit yang diketahui tentang aspek ini dalambuah pinggang. Di sini, sel T terdedah kepada set patogen yang berbeza seperti bakteria yang naik dari saluran kencing yang lebih rendah dan virus renotropik seperti polyomavirus BK (BKPyV). Sesungguhnya, kami baru-baru ini menerangkan bagaimana buah pinggang manusia mengandungi subset sel T yang menyatakan CD69 dan/atau CD103, di antaranya terdapat sel CD8 T yang secara khusus menyasarkan protein BKPyV virion protein1(VP1) dan protein T antigen (LTAG) yang besar [5]. Kami, dan yang lain, turut menunjukkan kehadiran CD69/CD103-mengekspresikan sel T (MAIT) invarian berkaitan mukosa dalambuah pinggangtisu [6,7].
Untuk lebih memahami jenis sel T yang membentuk tindak balas imun setempat dalam organ ini, kami menggunakan sitometri aliran berbilang saluran untuk menyiasat fenotip dan fungsibuah pinggangTRM, diasingkan daripada pendermabuah pinggangbahan penerima pemindahan buah pinggang (RTR) dan daripada sihatbuah pinggangtisu bersebelahan dengan karsinoma sel jernih buah pinggang, untuk melihat bagaimana populasi ini dibandingkan dengan populasi sel T dalam peredaran.Kami mendapati manusia itubuah pinggangtisu memegang sejumlah besar sel CD4 dan CD8 T yang menyatakan hanya CD69, CD69, dan CD103, atau tiada satu pun penanda ini. Kami mendapati bahawa CD69-CD103- sel masukbuah pinggangtisu berbeza dengan ketara daripada sel T dalam edaran dan mungkin mewakili populasi TRM yang tidak mempunyai penanda TRM kanonik. Tambahan pula, kami menunjukkan bahawa sel T buah pinggang lebih kerap berbasikal secara aktif, seperti yang dinilai oleh peningkatan ekspresi Ki-67, jika dibandingkan dengan darah. Kami juga mendapati bahawa sel T CD8 dan CD4 masukbuah pinggangtisu hampir selalu menyatakan CXCR3 dan sering menyatakan CXCR6. Penemuan ini melibatkan peranan untuk reseptor kemokin ini dalam tarikan dan penyelenggaraan populasi sel T memori pemastautin buah pinggang.
2. Bahan-bahan dan cara-cara
2.1. Pesakit dan SampelSampel diperolehi daripada Biobank Renal Diseases of the Amsterdam UMC location AMC. Dalam Biobank ini, sampel pesakit, seperti darah danbuah pinggangtisu, dikumpulkan dan disimpan daripada kehidupan yang sihatbuah pinggangpenderma dan RTR yang diikuti sebelum dan selepas pemindahan buah pinggang. Kajian ini dijalankan mengikut prinsip yang digariskan dalam Deklarasi Helsinki dan Istanbul dan semua peserta memberikan persetujuan bertulis secara bertulis sebelum mendaftar di Biobank. Selain itu, tisu sisa daripada pesakit yang menjalani tumor nephrectomy (tisu buah pinggang yang jauh dari tumor) telah didermakan oleh Jabatan Patologi dan juga disimpan di Biobank. Tisu-tisu ini diproses tanpa nama mengikut Tatakelakuan Persekutuan Persatuan Saintifik Perubatan Belanda (Tisu Manusia dan Penyelidikan Perubatan: Tatakelakuan untuk Penggunaan Bertanggungjawab, 2011 www.federa.org).
2.2. Sel Mononuklear Darah Periferi (PBMCs)Sampel darah diperoleh daripada cytomegalovirus (CMV)-seronegatif kawalan sihat (hidupbuah pinggangpenderma sebelum pembedahan, n= 13). Ciri-ciri peserta dalam kajian ini dipaparkan dalam Jadual 1. PBMC telah diasingkan daripada darah natrium heparin dengan sentrifugasi kecerunan ketumpatan piawai dan seterusnya dipelihara sehingga hari analisis.
2.3. Tisu Buah PinggangSampel tisu buah pinggang yang sihat (n {{0}})diperolehi daripada buah pinggang yang dibuang melalui pembedahan disebabkan oleh karsinoma sel renal(tisu tidak bertumor jauh dari kutub kontralateral buah pinggang) dan tisu buah pinggang pemindahan (n {{1 }}) diperoleh daripada allograf buah pinggang yang dieksplan selepas kegagalan pemindahan. Sampel ini dirujuk sebagai sampel buah pinggang yang sihat dan pemindahan, masing-masing. Kepingan korteks buah pinggang dicincang menjadi 1-mm kiub dengan McElwain Tissue Chopper(Ted Pella, Redding, CA, USA), dipindahkan ke 50 tiub mL dan dibasuh dengan PBS sejuk sehingga tiada darah nyata hadir dan supernatannya jelas. Medium penghadaman yang telah dipanaskan (37 darjah) telah ditambah, 40 mL setiap 10 g tisu (DNAse Type IV(50 KU/mL)(Sigma Aldrich, Zwiindrecht, Belanda), kolagenase jenis IV(0.5 mg/mL)(Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA), BSA(60 mg/mL)(Sigma Aldrich), 20 uL/mL serum betis janin (FCS, VWR International BV, Amsterdam, Belanda), TRIS (0.025 M)(Merck BV, Amsterdam, Belanda), penicillin-streptomycin (Biochrom GMBH, Berlin, Jerman) di HBSS (Westburg BV, Leusden, Belanda)), dan diinkubasi dalam shaker selama 20 minit pada 37 darjah . Penggantungan hangat telah dipindahkan ke tiub-C(Miltenvi, Bergisch Gladbach, Jerman) dan tertakluk kepada program M_limpa_04.01 pada GentleMacs(Miltenyi). Medium pencernaan dinyahaktifkan dengan PBS sejuk dan penggantungan sel yang terhasil melalui penapis sel untuk mendapatkan penggantungan sel tunggal, yang tertakluk kepada sentrifugasi kecerunan ketumpatan standard mengikut protokol pengeluar (Lymphoprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, Oslo, Norway ). Sel mononuklear terpencil (MNC buah pinggang) adalahcryopreserved sehingga hari analisis dalam IMDM ditambah dengan 20 peratus FCS,000036 v/v peratus -mercaptoethanol, 5 peratus DMSO, penicillin, dan streptomycin.
2.4. Sitometri AliranPengukuran dilakukan pada cytometer aliran LSRFortessa (BD Biosciences). Bagi setiap sampel, 2×106 PBMC atau 0.5×106 hingga 10×106 MNC buah pinggang telah dianalisis. Isipadu setiap tindak balas pewarnaan adalah relatif kepada bilangan sel dan kepekatan antibodi kekal malar. Sel telah diinkubasi dengan antibodi permukaan (Jadual Tambahan S1) selama 30 minit pada 4 darjah dalam gelap. Sel mati telah dikecualikan menggunakan pewarna daya maju yang boleh diperbaiki eFluor455UV (eBioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, Amerika Syarikat). Antibodi monoklonal dengan sasaran intraselular (Jadual Tambahan S1) ditambah selepas penetapan dan permeabilisasi sel menggunakan Set Pewarnaan Faktor FoxP3/Transkripsi (eBioscience Inc.). Kaedah yang diterbitkan untuk sitometri aliran dan pengisihan sel untuk tujuan imunologi telah diikuti [8]. Strategi gating yang digunakan untuk analisis fenotip boleh didapati dalam Rajah Tambahan S1. Kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa tiada satu pun penanda yang dianalisis dipengaruhi oleh kaedah pencernaan yang digunakan untuk mengasingkan MNC buah pinggang [7].
Had sampel tisu mengakibatkan pengecualian sampel daripada panel tirai. Kiraan sel CD3 ditambah yang dianalisis setiap sampel dalam PBMC yang sihat, MNC buah pinggang yang sihat dan buah pinggang TX boleh didapati dalam Rajah S3. Sampel MNC hanya dianalisis apabila ia mengandungi lebih 50 peratus sel hidup dalam limfosit, seperti yang dinilai oleh daya maju, dan subset sel T berasaskan CD69/CD103 hanya dicirikan lebih lanjut jika jumlah selnya melebihi 50.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI KEGAGALAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
2.5. Ujian StimulasiPBMC dan buah pinggang MNC telah dirangsang seperti yang diterangkan sebelum ini [7,9]. PBMC dan MNC buah pinggang telah dicairkan dengan kehadiran DNAse I(200 KU/mL), dicuci dan dibiarkan pulih semalaman dalam plat telaga (Corning) dalam medium kultur yang tidak dirawat, bulat-bawah, 96-ditambah dengan 10 peratus FCS dan penisilin-streptomisin) pada kepekatan 20× 106/mL （100 μL/telaga）.
Keesokan paginya, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 10 ng/mL; Sigma Aldrich)dan ionomycin(1 ug/mL; Sigma Aldrich) telah ditambah untuk merangsang sel. Medium sahaja telah ditambah sebagai kawalan negatif. Semua inkubasi dilakukan dalam medium kultur dengan kehadiran CD28 (klon 15E8;2 ug/mL), CD29 (klon TS 2/16;1 ug/mL), brefeldin A(10 ug/mL, Invitrogen), dan GolgiStop ( BD Biosciences) dalam isipadu akhir 200 uL selama 4 jam pada 37 darjah dan 5 peratus CO2.
Selepas itu, sel-sel telah diinkubasi selama 30 minit dengan antibodi permukaan (Jadual Tambahan S2). Sel-sel mati telah dikecualikan menggunakan pewarna daya maju yang boleh diperbaiki eFluor780 (bioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, Amerika Syarikat). Antibodi monoklonal untuk pewarnaan intraselular (Jadual S1) telah ditambah selepas penetapan dan permeabilisasi sel menggunakan Set Reagen Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences). Sel telah dibasuh dua kali dan dianalisis pada cytometer aliran LSRFortessa. Strategi gating yang digunakan dalam analisis fungsi boleh didapati dalam Rajah Tambahan S2. Untuk menentukan kepolifungsian setiap subset sel T, purata bilangan fungsi setiap populasi dikira menggunakan formula berikut:((peratusan sel yang menghasilkan 1 sitokin]*1) campur ([peratusan sel yang menghasilkan 2 sitokin]*2) tambah ([peratusan sel yang menghasilkan 3sitokin]*3) campur ([peratusan sel yang menghasilkan 4 sitokin]*4) tambah ([peratusan sel yang menghasilkan kesemua 5 sitokin]*5))/100.
2.6.Analisis Data
Data dianalisis menggunakan FlowJo versi 10 (FlowJo, Ashland, OR, USA). Semua graf dan rajah telah dibuat menggunakan Graphpad Prism versi 8.00 untuk Windows(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Program yang sama juga digunakan untuk analisis statistik data. Ujian Mann-Whitney-U bukan parametrik digunakan untuk menentukan kepentingan sampel tidak berpasangan. Untuk membandingkan sampel berpasangan, ujian peringkat bertanda Wilcoxon digunakan. nilai-p<0.05 were="" considered="" statistically="">
3. Keputusan
3.1.Ungkapan Berbeza CD8 dan/atau CD4 dan Penanda Kediaman Tisu oleh Sel T dalam Tisu Buah Pinggang SihatPertama, kami membandingkan ekspresi CD4 dan CD8 oleh CD3-sel T positif dalam darah periferi dengan sel yang dikesan dalam tisu buah pinggang yang sihat. CD4-Sel T CD8 tambah (CD8) secara ketara lebih kerap dikesan dalam tisu buah pinggang berbanding dalam darah((median)25 peratus vs.38 peratus )(Rajah la). Sebaliknya, CD4*CD{{9} }(CD4)Sel T dikesan dalam frekuensi yang lebih tinggi dalam darah berbanding dalam tisu buah pinggang((70 peratus vs. 52 peratus )Rajah la). Secara keseluruhannya, sel CD4 T dilihat lebih kerap dalam tisu buah pinggang yang sihat daripada sel CD8 T (Rajah 1b).
Seterusnya, kami menyiasat ungkapan penanda residensi tisu, CD69 dan CD103, dalam CD8 dan CD4-subset sel T yang ditentukan. Seperti yang dijangkakan, CD69 dan CD103 hampir tidak dinyatakan oleh sel dalam darah periferi (Rajah 1c). Dalam tisu yang sihat, CD69-CD103-, CD69 plus CD103-, CD69tCD103 plus, dan CD69-CD103 plus fenotip dinyatakan oleh, 46 peratus , 45 peratus , 6.6 peratus ,dan 1.8 peratus sel CD8T, masing-masing 61 peratus ,38 peratus ,0.44 peratus dan 0.43 peratus sel CD4T (Rajah lc). Kesimpulannya, CD8, tetapi terutamanya sel T CD4 dikesan dalam jumlah yang besar dalam tisu buah pinggang manusia yang sihat. Tambahan pula, ekspresi CD69 dan CD103, penanda residensi tisu, dikesan terutamanya di kalangan sel T yang terdapat dalam tisu sihat dan bukan dalam darah.
3.2. Corak Ungkapan Berbeza Penanda Subset Biasa oleh Sel T dalam Kesihatan/mengikut Tisu Buah Pinggang
CD45RA, tyrosine phosphatase, CCR7, reseptor kemokin yang dikenali sebagai pengantara pemerdagangan sel T kepada organ limfoid sekunder, dan CD28 dan CD27, kedua-dua reseptor kostimulasi yang sangat terlibat dalam pengaktifan sel T, semuanya adalah penanda yang digunakan secara tradisional untuk mengenal pasti subset sel T berfungsi J1{ {53}},1l. Kami ingin menyiasat sejauh mana taburan subset ini dalam darah berbeza daripada taburan dalam tisu buah pinggang. Seperti yang dijangkakan, subset sel T CD8 terbesar yang dikesan dalam edaran (iaitu, yang berkenaan Lebih daripada atau sama dengan 5 peratus daripada jumlah populasi) adalah subset CD45RA tambah CCR7 tambah CD28 tambah CD27 tambah (sel T naif atau TN, ( median) 13 peratus ), CD45RA-CCR7 campur CD28 campur CD27 tambah (Tcells memori pusat atau TcM, 6 peratus ), CD45RA-CCR7-CD28 campur CD27 tambah (TEv1,30 peratus ), CD45RA-CCR7-CD28 campur CD27-(Tau2,10 peratus ), CD45RA-CCR7-CD28-CD27*(TEy3,6 peratus ) , CD45RA-CCR7-CD28-CD27-(TM4,6 peratus )dan CD45RA plus CCR7-CD28-CD27-(TEMRA ,10 peratus )fenotip. Dalam tisu yang sihat, hampir tiada (0.6 peratus) sel T CD8 dikesan dengan fenotip TN dan hanya beberapa (0.8 peratus) yang memaparkan fenotip Cukai. Sebaliknya, sel T CD8 yang dikesan dalam tisu buah pinggang yang sihat terdiri daripada TEv yang banyak1-(22 peratus ), TEM2-(12 peratus ), Tpx3-(18 peratus ),TEx{ {65}} (23 peratus ), dan TEyRA(11 peratus ) populasi sel T(Rajah ld dan Rajah S4). Apabila melihat sel T CD4 dalam darah, populasi terbesar ialah mereka yang menyatakan Ty-(35 peratus ), TcM-(25 peratus ), TEMl-(16 peratus ), TFM2-(9 peratus ), dan populasi yang tidak dinyatakan sebaliknya CD45RAtCCR7-CD28 campur CD27* fenotip (0.4 peratus )(Rajah 1d dan Rajah S4).Dalam tisu buah pinggang yang sihat, beberapa sel T CD4 menyatakan TN- (3 peratus )atau TcM -(3 peratus )fenotip. Sebaliknya, sejumlah besar sel dengan TEM1-(22 peratus ), TEM2-(40 peratus ), atau TEM4(14 peratus )fenotip telah dikesan dalam tisu sihat (Rajah ld dan Rajah S4) . Kesimpulannya, taburan CD45RA/CCR7/CD28/CD{101}}subset CD8 dan CD4 T yang ditakrifkan berbeza dengan ketara antara darah dan tisu buah pinggang yang sihat.
3.3. Sel CD8 dan CD4 T dalam Tisu Buah Pinggang Manusia yang Sihat Lebih Selalunya Terdiri daripada Sel Berbasikal AktifSeterusnya, kami menyiasat sama ada terdapat perbezaan dalam ekspresi penanda tipikal profil ingatan effector sitotoksik, antara populasi sel CD8 dan CD4 T dalam darah dan tisu buah pinggang. Pertama, kita melihat ekspresi faktor transkripsi T-box T-bet dan eomeso-dermin (Eomes). Pengawal selia transkrip ini terlibat secara langsung dalam menghasilkan sel effector fasa akut, mendorong ekspresi molekul seperti interferon-y dan granzyme B, dan dalam penjanaan tindak balas memori sekunder. Seperti yang dijangkakan, ekspresi T-bet adalah kerap dalam kalangan CD8 Tcells peredaran (54 peratus ), manakala sel T CD4 peredaran jarang menekan faktor transkripsi ini (13 peratus). Menariknya, untuk sel T CD4, ekspresi T-bet adalah jauh lebih tinggi dalam kalangan sel T yang dikesan dalam tisu buah pinggang yang sihat berbanding dalam peredaran (53 peratus vs 13 peratus). Beberapa ungkapan juga kerap dikesan di kalangan sel T CD8 peredaran darah (59 peratus), sementara sekali lagi jarang berlaku di kalangan sel CD4 T peredaran darah (15 peratus). Walau bagaimanapun, ekspresi Eomes lebih kerap di kalangan sel T CD4 dalam tisu buah pinggang (32 peratus ) berbanding dalam darah (Rajah 2a, b).
Seterusnya, kami menyiasat ungkapan granzyme B, protease serine yang dikenali sebagai pengantara apoptosis selepas suntikan ke dalam sitoplasma oleh sel T sitotoksik. Selaras dengan laporan terdahulu, ekspresi T-bet dan granzyme B dikesan dalam jumlah yang besar dalam sel CD8 T yang beredar (28 peratus ). Walau bagaimanapun, ekspresinya jarang berlaku dalam kalangan sel CD4 T yang beredar(1 peratus ), Untuk sel T CD8, ekspresi granzim B adalah serupa dalam tisu buah pinggang dan populasi yang beredar(28 peratus ys.23 peratus )(Rajah 2c). Menariknya, frekuensi ekspresi T-bet dan Eomes yang lebih tinggi yang dikesan dalam sel T CD4 buah pinggang tidak sepadan dengan frekuensi ekspresi granzyme B yang lebih tinggi dalam petak ini (5 peratus). Kami kemudian melihat ungkapan KLRGl, reseptor coinhibitory yang diketahui kebanyakannya dinyatakan oleh sel efektor fasa akut sitotoksik dan sel memori effector. KLRG1 sering dinyatakan dengan mengedarkan sel CD8 T (54 peratus), tetapi bukan oleh sel CD4 T ( 10 peratus). Tiada perbezaan ditemui antara petak anatomi dalam ekspresi KLRG1l untuk sel CD8 atau CD4 T. Akhir sekali, kami menyiasat ungkapan Ki-67, penanda yang menandakan sel berbasikal secara aktif. Selaras dengan pemerhatian sebelum ini, ungkapan Ki-67 dalam kalangan sel CD8 dan CD4 T yang beredar adalah jarang berlaku (masing-masing 1 peratus dan 2 peratus). Menariknya, dalam kalangan sel T CD8, tetapi terutamanya dalam kalangan sel T CD4, ekspresi Ki-67 secara ketara lebih kerap dikesan dalam sel T dalam tisu buah pinggang (masing-masing 3 peratus dan 11 peratus) (Rajah 2e). Kesimpulannya, sel T CD4 dikesan dalam tisu buah pinggang manusia yang sihat, tetapi bukan sel T CD8 dalam petak ini, yang lebih kerap dinyatakan T-bet dan Homes. Walau bagaimanapun, ini tidak diterjemahkan ke dalam ungkapan granzyme B yang lebih kerap oleh sel CD4 T buah pinggang. Lebih-lebih lagi, walaupun bilangan keseluruhan sel berbasikal adalah rendah, tisu buah pinggang mengandungi sel CD8 dan CD4 T yang lebih aktif berbasikal daripada peredaran.
3.4. Sel T CD8 dan CD4 dalam Tisu Buah Pinggang Sihat adalah Hampir Semua Kedudukan CXCR3-Kami kemudian mencari perbezaan dalam ekspresi penanda lain, tipikal dalam populasi beredar yang tidak serta-merta memori sitotoksik, seperti yang ditunjukkan sebelum ini untuk populasi sel T yang beredar. Kami mula-mula melihat ungkapan IL-7R , yang dinyatakan terutamanya pada sel memori yang naif dan dibezakan awal dalam peredaran, di mana ia terlibat dalam mengekalkan percambahan homeostatik [10,12,13]. Dalam darah periferi, IL-7Ra sering dinyatakan oleh sel T CD8 (84 peratus ) dan sel T CD4 (98 peratus ). CD8 dan CD4 sel T dalam tisu buah pinggang yang sihat menyatakan penanda ini dengan ketara kurang kerap berbanding sel T yang beredar (masing-masing 71 peratus dan 76 peratus) (Rajah 2f).
Seterusnya, kami menyiasat ekspresi pelbagai reseptor kemokin yang lain Menariknya, CXCR3, reseptor kemokin yang terlibat dalam pemerdagangan Tcell kepada tisu yang meradang[14-17], diekspresikan oleh bilangan sel T CD8 dan CD4 yang sangat besar dalam tisu buah pinggang(99 peratus dan 91 peratus , masing-masing), dan kurang kerap dengan mengedarkan sel T (masing-masing 58 peratus dan 26 peratus)(Rajah 2g). Akhirnya, kami menentukan ungkapan CXCR6, yang diketahui terlibat dalam membentuk populasi TRM [18-22]. Manakala CXCR6 dinyatakan oleh hanya sebilangan kecil populasi sel T CD8 yang beredar (16 peratus ), dan hampir tidak dengan sel T CD4 yang beredar. bahagian CD8 dan CD4 Tcells yang lebih besar dalam tisu buah pinggang menyatakan molekul ini (masing-masing 40 peratus dan 40 peratus) (Rajah 2h). Kesimpulannya, penanda biasanya dikaitkan dengan keadaan yang tidak dibezakan dengan serta-merta dalam peredaran, mungkin-7Ra, CCR7, CD28 dan CD27, secara ketara kurang kerap dinyatakan oleh sel CD8 dan T buah pinggang jika dibandingkan dengan yang ada dalam darah. Sebaliknya, sel T buah pinggang lebih kerap menyatakan CXCR6 dan hampir selalu menyatakan CXCR3.
3.5. Perbezaan dalam Fenotip antara Buah Pinggang Sihat dan Sel T Allograft Adalah MinimumSeterusnya, kami ingin menyiasat sama ada penemuan ini kekal dalam tisu daripada allograf buah pinggang yang dipindahkan yang diperolehi untuk pelbagai tanda klinikal (Jadual 1).Berkenaan dengan bilangan sel CD8 dan CD4 T dalam tisu sihat dan allograf, tiada perbezaan yang dilihat (Rajah 3a). Walau bagaimanapun, kami melihat trend yang tidak penting ke arah lebih banyak sel CD4T dan kurang sel CD8T dalam tisu sihat daripada tisu allograf (Rajah3b). Selain itu, apabila melihat CD69/CD103expression dan CD45RA/CCR7/CD28/CD27-subset yang ditentukan, tiada perbezaan dalam pengedaran CD69/CD103- atau CD45RA/CCR7/CD28/CD27- subset yang ditentukan telah diperhatikan, tanpa mengira fenotip CD8/CD4 (Rajah 3d dan Rajah S5). Apabila memeriksa frekuensi ekspresi penanda yang lebih tipikal untuk sel T yang beredar sitotoksik, kami mendapati tiada perbezaan dalam ekspresi T-bet, KLRG1 atau granzyme B antara sel T buah pinggang atau allograft yang sihat (Rajah 3a, gh). Kami mendapati bahawa ekspresi Eomes dilihat kurang kerap dalam sel CD4 T tisu allograf, berbanding sel T tisu yang sihat (Rajah 3f). Tiada perbezaan dalam ekspresi penanda lain diperhatikan. (Rajah 3-l dan Rajah S5b-d). Kesimpulannya, selain daripada kekerapan ekspresi Eomes yang lebih rendah di kalangan sel T CD4 allograf, populasi sel tidak berbeza antara populasi kajian.
3.6. CD69-CD103-Sel T dalam Tisu Buah Pinggang Berbeza daripada sel BeredarMemandangkan solekan fenotip serupa sel CD8 dan CD4 T yang terdapat dalam tisu buah pinggang yang sihat dan dalam tisu allograft buah pinggang, kami mengumpulkan data daripada kedua-dua kumpulan kajian untuk mengkaji lebih lanjut ciri-ciri sel ini mengikut ekspresi CD69 dan CD103. Memandangkan CD69-CD103 plus sel sentiasa dikesan dalam frekuensi yang sangat rendah(<50 events),="" we="" excluded="" these="" cells="" from="" further="" analyses.="">Mula-mula, kami menyiasat perbezaan dalam subset ini mengikut ekspresi bersama CD69/CD103 dalam populasi sel T buah pinggang (Rajah 4 dan Rajah S6). Menariknya, untuk kedua-dua sel CD8 dan CD4 T, perbezaan yang ketara telah diperhatikan dalam pengedaran CD45RA/CCR7/CD28/CD27-subset yang ditentukan antara CD69-CD103-,CD69 tambah CD{ {14}}dan subset CD69*CD103*. Untuk sel T CD8, sel CD69-CD103-mengandungi populasi sel TeyRA yang besar (21 peratus )yang jauh lebih kecil antara subset CD69 tambah CD103- dan CD69 tambah CD103 (5.8 peratus dan 2.2 peratus , masing-masing). Sebaliknya, populasi terakhir ini mengandungi subpopulasi TEy3 (masing-masing 13 peratus , 30 peratus dan 32 peratus) dan TEy4 (masing-masing 8 peratus ,19 peratus dan 33 peratus) yang lebih besar. Untuk sel T CD4, beberapa sel TEyRA dilihat antara CD69-CD103-, CD69*CD103- dan CD69 campur CD103* subset (2.6 peratus ,0 peratus dan 1.7 peratus , masing-masing). Sebaliknya, sel-sel ini mempunyai subpopulasi besar TFw1 (26 peratus .24 peratus , dan 10 peratus, masing-masing) dan TEy2 ells (masing-masing 30 peratus ,46 peratus dan 27 peratus). Antara CD69 tambah CD103-dan khususnya antara sel CD69*CD103*, subpopulasi TEM4 yang lebih besar telah dilihat (masing-masing 6 peratus , 11 peratus dan 34 peratus).
Memandangkan perbezaan ini dan pemerhatian sebelum ini bahawa populasi sel T buah pinggang hampir tidak terdiri daripada sel TN dan TcM, kami menyiasat selanjutnya sel69-CD103-CD yang terdapat dalam tisu buah pinggang untuk menentukan sejauh mana sel-sel ini bukan sahaja sel beredar melalui peredaran buah pinggang. Untuk berbuat demikian, kami membandingkan sel-sel ini dengan sel yang beredar. CD69-sel CD103~ dalam tisu buah pinggang berbeza dengan ketara daripada sel-sel dalam edaran: T-bet, Ki-67 dan CXCR3 diekspresikan dengan lebih kerap oleh sel T buah pinggang, tanpa mengira fenotip CD8/CD4 (Rajah 5a-c). Sebaliknya, IL-7R , CCR7, CD28 dan CD27 semuanya dinyatakan dengan ketara kurang kerap oleh CD69-CD103- sel T buah pinggang, tanpa mengira fenotip CD8/CD4 (Rajah 5d- g). CD69-CD103-CD4 Tsel dalam tisu buah pinggang mengekspresikan KLRG1 dengan ketara lebih kerap berbanding dalam darah dan CD69-CD103-CD8 sel T dalam tisu buah pinggang mengekspresikan Eomes dengan ketara lebih kerap daripada dalam darah.
Seterusnya, kami ingin melihat bagaimana ekspresi bersama CD69 dan CD103 mempengaruhi penanda potensi berfungsi. Pertama, kami melihat penanda yang dikaitkan dengan potensi sitotoksik. Walaupun perbezaan telah diperhatikan antara subpopulasi individu, tiada corak akibat dilihat untuk T-bet dan Eomes dalam sel T CD8 apabila CD69 atau CD103 diekspresikan bersama (Rajah 6a, b). Sebaliknya, dalam sel T CD4 faktor transkripsi kedua-duanya meningkat bersama-sama dengan Ekspresi bersama CD69 dan CD103 (Rajah 6a, b). Apabila melihat KLRG1, kami mendapati bahawa untuk sel T CD8, ekspresi KLRG1 menurun bersama-sama dengan ekspresi bersama CD69/CD103. Untuk sel CD4 T trend yang sama dilihat. Walau bagaimanapun, di sini hanya sel CD69-CD103-yang menyatakan KLRG1 pada frekuensi yang lebih tinggi daripada sel CD69 tambah CD103- dan CD69 tambah CD103*(Rajah 6c). Kekerapan ekspresi granzyme B juga merosot bersama-sama dengan penanda residensi tisu, dengan kekerapan ekspresinya paling rendah di kalangan sel CD69 ditambah CD103*, dalam kedua-dua sel CD8 dan CD4 T (Rajah 6d). Ungkapan Ki-67, yang lebih tinggi di kalangan sel T buah pinggang jika dibandingkan dengan sel T dalam darah, tidak berbeza mengikut ekspresi bersama CD69 atau CD103 (Rajah 6e).
Kami kemudian menyiasat penanda yang biasanya dikaitkan dengan profil memori bukan sitotoksik mengikut ekspresi bersama CD69/CD103. Ungkapan IL-7Ra, CCR7 dan CD28 adalah tertinggi dalam populasi CD69-CD103-, dengan trend dalam mentakrifkan ungkapan bersama-sama dengan ekspresi bersama CD69/CD103 (Rajah 6f-h ). Kami kemudian melihat ekspresi CXCR3 dan CXCR6. Kedua-dua reseptor chemokine paling kerap dinyatakan oleh sel CD69tCD103t, tanpa mengira fenotip CD8/CD4, dan menunjukkan trend menaik dengan ekspresi bersama CD69/CD103. Hanya untuk CXCR6, trend ini adalah signifikan secara statistik, menjejaskan kedua-dua CD8 dan CD4 Tells (Rajah 6j, k). Kesimpulannya, sel CD69-CD103- dalam tisu buah pinggang berbeza dengan ketara daripada sel dalam edaran dan mungkin melibatkan populasi TBv lain yang tidak ditandakan dengan ungkapan CD69 atau CD103. Satu-satunya penanda yang berbeza secara konsisten, tanpa mengira fenotip CD8/CD4, dari segi ekspresi bersama CD69 dan CD103, ialah CXCR6.
3.7. Sel T dalam Tisu Buah Pinggang Lebih Banyak Menghasilkan Interferon- daripada Sel T dalam DarahAkhir sekali, kami menyiasat kapasiti pengeluaran sitokin oleh CD8/CD4-populasi sel T yang ditentukan dalam tisu buah pinggang. Pertama, kami membandingkan penghasilan interferon-y (IFNy), faktor nekrosis tumor (TNF), interleukin-2 (IL-2), faktor perangsang koloni-makrofaj granulosit(GM-CSF), dan IL-17 oleh CD8/CD yang dirangsang4-mentakrifkan populasi sel T yang terdapat dalam darah kepada mereka dalam tisu buah pinggang yang sihat (Rajah 7a-e). Menariknya, hanya IFNy secara konsisten dinyatakan oleh bahagian sel T yang lebih besar dalam tisu buah pinggang yang sihat, jika dibandingkan dengan sel T dalam darah, tanpa mengira fenotip CD8/CD4 (Rajah 7a). Perbezaan juga diperhatikan pada tahap subset individu. Khususnya, TNF dan GM-CSF lebih kerap dihasilkan oleh sel T CD4 dalam tisu buah pinggang (Rajah 7b.c). Berkenaan dengan polifungsi (iaitu, bilangan sitokin yang dihasilkan serentak), sel T CD4 dalam tisu buah pinggang didapati lebih polifungsi daripada sel CD4 dalam darah (Rajah7f).
Seterusnya, kami melihat perbezaan kapasiti pengeluaran sitokin antara sel T yang dirangsang daripada tisu sihat dan allograf. Tiada perbezaan dalam pengeluaran sitokin individu, atau dalam beberapa sitokin yang dihasilkan secara serentak telah dikesan antara sel T daripada tisu buah pinggang yang sihat atau allograft (Rajah S7). Memandangkan CD69 dinyatakan semasa rangsangan sel T, kami hanya mengkaji perbezaan antara CD103-negatif dan CD103-mengekspresikan sel CD4 dan CD8 T (Rajah 7g-). Apabila membandingkan sel T CD4 dan CD8 yang mengekspresikan CD103 dengan sel yang tidak mengekspresikan CD103 dalam tisu buah pinggang, kami mendapati bahawa sel CD8 dan CD4 CD103 mengekspresikan lebih banyak IFNy daripada sel103-CD (Rajah 7g). Selain itu, walaupun sel-sel penghasil IL-1ZA adalah rendah dalam kalangan sel CD103 ditambah CD8 dan CD4 T dalam tisu buah pinggang, sel-sel ini secara konsisten ditemui lebih kerap dalam populasi ini berbanding populasi CD103-. Kesimpulannya, lebih banyak sel T' dalam tisu buah pinggang menghasilkan IFNy jika dibandingkan dengan sel T yang beredar, tanpa mengira fenotip CD8/CD4. Sememangnya, peratusan tertinggi sel penghasil IFNy ditemui dalam kalangan103-CD yang mengekspresikan CD4 dan CD8 sel T terbitan buah pinggang. Di samping itu, sel T dalam allograf buah pinggang tidak berbeza daripada sel T dalam tisu buah pinggang yang sihat berkenaan dengan parameter ini.
4. Perbincangan
Dalam kajian semasa, kami membincangkan kepelbagaian subset sel T, mengikut ungkapan CD8 dan CD4, dan penanda residensi tisu, CD69 dan CD103, dalam buah pinggang manusia dan dibandingkan dengan darah. Sebilangan besar sel CD8 dan CD4 T memang dikesan dalam tisu buah pinggang. Tambahan pula, sel T dalam buah pinggang ini mengandungi sejumlah besar sel CD69*CD103-. CD69 plus CD103 plus sel juga dikesan, tetapi kebanyakannya di kalangan sel CD8 T dan hampir tidak wujud di kalangan sel CD4 T. Penemuan yang sama melibatkan TRM paru-paru sebelum ini [23]. Seperti yang dijangkakan, populasi yang menyatakan CD69 dan CD{15}}sebegitu hampir tidak hadir dalam edaran. Perbezaan yang ketara apabila membandingkan sel T dalam buah pinggang dengan sel T dalam darah, melibatkan pengedaran yang berbeza bagi subset yang ditentukan CD45RA/CCR7/CD28/CD{19}}tradisional. Menariknya, ungkapan CD28 lebih kerap tidak dinyatakan apabila sel T mengekspresikan CD69 sahaja atau digabungkan dengan CD103. Secara teorinya, ini sepatutnya menyebabkan populasi ini kurang terdedah kepada isyarat kostimulasi oleh CD80 dan CD86. Perbezaan lain melibatkan kekerapan ungkapan yang lebih tinggi bagi CXCR3, CXCR6 dan Ki-67. Selain itu, sel T buah pinggang lebih kerap mengandungi sel penghasil IFNy dan selalunya bersifat polifungsi. Malah, dalam buah pinggang, CD103 plus Tpys mengandungi lebih banyak sel penghasil IFN berbanding CD{31}}negatifnya. Selain itu, sel CD103T lebih kerap menghasilkan IL-17, walaupun ini melibatkan Populasi yang sederhana.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI JANGKITAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Berkenaan dengan ekspresi CXCR3 yang lebih kerap oleh sel T buah pinggang CD8 dan CD4, paksi CXCR3/CXCL10 sebelum ini ditunjukkan terlibat dalam pembentukan populasi TpM dalam kulit, hati dan tisu limfoid [24-28]. Selain itu, ia terlibat dalam pemerdagangan kepada epitelium tertekan dan keradangan dalam erti kata umum [14-17]. Memandangkan frekuensi tinggi CXCR3 di kalangan sel T ini dalam tisu buah pinggang yang sihat, CXCR3 nampaknya terlibat dalam homeostasis TRM dalam tisu buah pinggang juga dan mungkin tidak semestinya melibatkan keradangan atau isyarat bahaya untuk berbuat demikian. Berkenaan dengan CXCR6, paksi CXCR6/CXCL16 sememangnya telah ditunjukkan sebagai penting untuk pemerdagangan Tpst ke petak yang berbeza seperti paru-paru, kulit, hati dan otak, dan mungkin melibatkan mekanisme universal yang penting untuk membimbing dan mengekalkan TRM kepada dan dalam tisu, juga berkenaan TRM dalam tisu buah pinggang manusia [18-22].
Farber dan rakan sekerja telah mencirikan dan membandingkan secara meluas populasi CD8 dan CD4 TRM yang tinggal dalam jenis tisu manusia yang berbeza yang diperoleh daripada penderma organ. Mereka menerangkan bagaimana populasi TRM dalam paru-paru, limpa, usus kecil dan pelbagai tisu limfoid sekunder berbeza berkaitan dengan transkrip, tetapi juga dengan ekspresi pelbagai protein, termasuk sitokin, yang disiasat dalam kajian semasa [29-31. Walau bagaimanapun, penyiasatan ini tidak terdiri daripada populasi TRM dalam buah pinggang manusia, dan data mengenai perkara ini
subjek adalah terhad. Kami sebelum ini menunjukkan bahawa sel T CD8 yang menyasarkan protein polyomavirus BK VP1 dan LTAG, yang berasal daripada virus yang mempunyai tropisme yang kuat untuk sel epitelium buah pinggang, boleh dikesan dalam buah pinggang allograft. Sel T khusus virus ini mengekspresikan CD69 dan CD103 dalam jumlah yang lebih tinggi daripada rakan sejawatannya yang terdapat dalam peredaran pesakit yang sama. Tambahan pula, sel T ini secara amnya menyatakan fenotip B-negatif CD45RA-CD27-granzyme[5]. Kemudian, yang lain juga telah melaporkan populasi TRM dalam tisu buah pinggang manusia yang diperoleh daripada nephrectomies pemindahan. Dalam penerbitan ini, penulis melaporkan bahawa sel T dalam tisu ini terutamanya berkaitan CD8 T cels [321. Sebaliknya, kami mendapati bahawa sel T CD4, sebenarnya, terdiri daripada subset sel T terbesar. Walau bagaimanapun, kami juga mendapati bahawa keseimbangan beralih, walaupun tidak ketara, ke arah lebih banyak sel T CD8 dalam tisu allograf jika dibandingkan dengan tisu buah pinggang yang sihat. Oleh itu, percanggahan ini mungkin dijelaskan oleh kumpulan kajian yang berbeza, dan mungkin dalam kesihatan, pertahanan imunologi lebih tertumpu pada ancaman ekstraselular, seperti bakteria, berbanding lebih banyak ancaman intrasel, seperti virus dan kanser dalam hos yang terjejas imun. Kami tidak menemui perbezaan lain dalam penanda yang dikaji, antara buah pinggang yang sihat dan sel T allograft. Walau bagaimanapun, penyelidikan lanjut, menggunakan teknik dengan pandangan yang lebih luas tentang transkriptom, seperti penjujukan RNA, atau proteom, seperti spektrometri jisim, harus digunakan untuk menentukan sama ada ini benar-benar berlaku.
Di samping itu, de Leur et al. terangkan bagaimana TRM dalam buah pinggang kerap mengekspresikan granzyme B, manakala kami hanya mengesan jumlah granzim B yang rendah dalam kedua-dua tisu buah pinggang yang sihat dan allograft [32]. Walau bagaimanapun, kami telah mengesan banyak T-bet dan sel T yang mengekspresikan Eomes dalam tisu buah pinggang, yang dalam populasi sel T yang beredar, biasanya dikaitkan dengan ekspresi granzyme B yang lebih tinggi [10]. Walaupun yang terakhir mungkin tidak menghairankan, memandangkan fakta bahawa ekspresi granzyme B juga secara langsung disebabkan oleh T-bet [33,34], persatuan ini tidak jelas di kalangan sel T buah pinggang dalam kajian semasa. Seperti yang telah kami dan orang lain tunjukkan bahawa juga TRM yang berasal dari paru-paru, otak dan kulit manusia [25,26,3536], serta MAIT ælls 【6,7】yang berasal dari buah pinggang, adalah rendah dalam granzim B mereka. kandungan, walaupun sering menyatakan jumlah T-bet dan Eomes yang banyak, ini mungkin sifat biasa TkM (manusia). Tambahan pula, dalam paru-paru TRM ekspresi granzyme B dilihat dikawal dengan cepat apabila rangsangan [35l, menunjukkan bahawa ini mungkin juga berlaku dalam TeM lain. Di sini, penulis membuat hipotesis bahawa 'sitotoksisiti tersembunyi itu berfungsi untuk melindungi integriti struktur tisu daripada kerosakan oleh sel T sitotoksik.
Kesimpulannya, kami menunjukkan bahawa T clls dalam tisu buah pinggang hadir dalam jumlah yang besar dan terdiri daripada populasi yang kerap menyatakan CD69 plus dan CD103 plus , molekul yang sel T melekat pada, dan berterusan dalam, tisu. Namun begitu, sel T CD69-CD103- dalam tisu buah pinggang kelihatan berbeza daripada sel T yang beredar dan mungkin melibatkan populasi TiM lain yang berbeza, mungkin berterusan dalam buah pinggang oleh mekanisme veterinar lain yang akan didedahkan. Pilihan lain mungkin ialah sel CD69-CD103-T ini melibatkan populasi yang baru-baru ini keluar daripada peredaran dan haye hanya memperoleh sifat fenotip baharu secara sementara akibat interaksi dengan persekitaran mikro buah pinggang. Siasatan lanjut ke atas populasi ini diperlukan untuk menjelaskan kemungkinan ini. Tambahan pula. Sel T buah pinggang CD8 dan CD4 sering berbasikal secara aktif dan lebih kerap menyatakan CXCR6. Di samping itu, populasi CD8 dan CD4 menggantikan ekspresi CXCR3 yang sangat tinggi, yang sangat membabitkan reseptor chemokine ini, serta CXCR6 dalam akruan dan kegigihan TRM dalam buah pinggang manusia. Oleh itu, siasatan lanjut diperlukan untuk meningkatkan imej populasi Tpv kami dalam buah pinggang manusia. Walau bagaimanapun, penemuan yang dibentangkan di sini membentuk langkah pertama yang kukuh ke arah pencirian populasi sel T yang lebih terperinci dalam tisu buah pinggang dan peranan mereka dalam kesihatan dan penyakit.