Kekurangan Calreticulin Mengganggu Biogenesis Ribosom Dan Mengakibatkan Keterlambatan dalam Perkembangan Buah Pinggang Embrio

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrak

Nefrogenesis didorong oleh laluan isyarat kompleks yang mengawal pertumbuhan dan pembezaan sel. Retikulum endoplasma pendamping calreticulin (Calr) terkenal dengan fungsinya dalam penyimpanan kalsium dan dalam lipatan glikoprotein. Peranannya dalambuah pinggangpembangunan masih tidak difahami. Kami menyediakan bukti untuk peranan penting Calr dalam nefrogenesis dalam penyiasatan ini. Kami menunjukkan bahawa kekurangan Calr mengakibatkan pembentukan terganggu zon nefrogenik yang utuh dan melambatkan nefrogenesis, seperti yang dibuktikan oleh gangguan dalam pembentukan badan berbentuk koma dan berbentuk s. Menggunakan pendekatan proteomik dan transkriptomi, kami menunjukkan bahawa sebagai tambahan kepada perubahan dalam protein utama isyarat Wnt, embrionikbuah pinggangdari Calr // menunjukkan kemerosotan keseluruhan dalam ekspresi protein ribosom yang mendedahkan gangguan dalam sintesis protein dan nefrogenesis. Kalah mati pengantara CRISPR/cas9 mengesahkan bahawa kekurangan Calr dikaitkan dengan kekurangan beberapa protein ribosom dan protein utama dalam biogenesis ribosom. Data kami menyerlahkan hubungan langsung antara ekspresi Calr dan biogenesis ribosom.

pengenalan

buah pinggangorganogenesis dicirikan oleh urutan peristiwa morfogenetik yang didorong oleh pertumbuhan dan pembezaan sel. Semasa nefrogenesis, peralihan mesenchymal-epithelial (MET) dan cawangan ureteric bud (UB), yang merupakan hasil induksi timbal balik antara UB dan mesenchyme metanephric (MM) [1], adalah daya penggerak untuk pembentukan nefron. Semasa proses ini, interaksi kompleks dan timbal balik pelbagai laluan isyarat diperlukan untuk mengatur pembezaan epitelium dan pembentukan nefron [1-3]. Antara laluan utama dalam proses ini, isyarat faktor neurotropik (Gdnf) terbitan glia melalui reseptor Ret memainkan peranan penting semasa proses yang dipanggil tunas ureter. Gangguan isyarat ini boleh menyebabkan ureter ektopik ataubuah pinggangagenesis apabila isyarat tiada sepenuhnya [4]. Selain daripada isyarat Gdnf/Ret, isyarat Wnt/ -catenin kanonik diketahui menyelaraskan pelbagai aspekbuah pinggangpembangunan dalam kedua-dua MM dan UB [5] dan perencatan isyarat Wnt kanonik dalam keturunan tunas ureter dan nenek moyang nefron mengakibatkanbuah pinggangagenesis [6]. Penyelenggaraan pengaturcaraan semula transkrip semasa nefrogenesis bergantung kepada kebolehcapaian kromatin [7]. Kami menunjukkan bahawa protein heterochromatin, yang diketahui terlibat dalam peraturan epigenetik pembungkaman gen, sangat diperlukan untuk mengekalkan keseimbangan antara pengaktif cawangan dan perencat pada peringkat awal pembangunan [7].

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG

Calreticulin (Calr) ialah pendamping promiscuous retikulum endoplasma (ER) dengan kapasiti pengikat kalsium yang tinggi dan pertalian rendah, yang penting untuk penyerapan Ca2 ditambah ke ER dan proses selular yang berbeza termasuk transduksi isyarat, ekspresi gen dan pemerdagangan protein. [8,9]. Mekanisme menangani peranan Calr dalam penyakit terutamanya berdasarkan Ca2 plus chelation oleh domain C-terminal pengikat Ca2 plus-mengikat Calr dan peranannya dalam tindak balas protein terungkap (UPR) [10,11]. UPR boleh memainkan peranan sitoprotektif semasa cabaran dengan protein tersalah lipat atau boleh memudaratkan sel kerana apoptosis yang disebabkan oleh isyarat UPR yang berterusan. Walaupun beberapa kajian menangani potensi peranan Calr dalam penyakit melalui peraturan transkripsi, fungsi ER chaperone Calr kekal sebagai salah satu mekanisme penting untuk nasib sel [9,12]. Tekanan ER yang berpanjangan dan salah lipatan protein menonjol dalam pelbagaipenyakit buah pinggangseperti glomerulopati, akutkecederaan buah pinggang, nefropati diabetik,buah pinggangfibrosis, dan kronikpenyakit buah pinggang[13,14]. Peranan Calr dalam perkembangan embrio masih tidak jelas. Kalah mati Calr menyebabkan kematian embrio semasa peringkat perkembangan E14.5 disebabkan oleh perkembangan jantung terjejas [15]. Akibat kekurangan Calr pada mekanisme molekulbuah pinggangperkembangan embrio, bagaimanapun, masih belum difahami sepenuhnya. Dalam kajian ini, kami melakukan analisis transkriptik dan proteomik perbandingan embriobuah pinggangdaripada tiga genotip Calr plus / plus , Calr plus //, dan Calr// dan menyerlahkan kesan kalah mati Calr terhadap nefrogenesis dan pada ekspresi protein ribosom.

Kata kunci:kekurangan calreticulin; nefrogenesis; biogenesis ribosom, buah pinggang, buah pinggang

2. Keputusan

2.1. Keputusan Kalah Mati Calreticulin dalam Keabnormalan Morfologi dan Histologi Buah Pinggang dan Cawangan Buah Pinggang Bermasalah

Kalah mati genetik Calr pada tikus menyebabkan kematian embrio awal akibat kecacatan septum ventrikel [15]. Untuk menyiasat sama ada Calr kalah mati memberi kesanbuah pinggangpembangunan, embrio tetikus pada peringkat E13.5 telah disediakan daripada Calr plus // tikus hamil (Rajah 1A). Embrio Calr// menunjukkan perubahan pertumbuhan yang ketara berbanding dengan Calr plus / plus dan Calr plus // dan mendedahkan kemerosotan yang ketara dalam perkembangan embrio. Morfologi kasar embrio danbuah pinggangmenunjukkan pengurangan ketara dalam saiz antara tikus Calr plus / plus dan Calr−// dengan tikus Calr// menunjukkan keabnormalan yang paling besar (Rajah 1A). Untuk menggambarkan kesan kalah mati Calr terhadapbuah pinggangpembangunan dan struktur, embrio pada tiga peringkat perkembangan berbeza (E13.5, E14.5, E16.5) dan daripada tiga genotip (Calr plus / plus , Calr plus // dan Calr//) telah dikorbankan danbuah pinggangtelah diperolehi. Bahagian tisu menunjukkan peringkat perkembangan yang berbezabuah pinggang,yang berkembang melalui struktur morfologi yang rumit seperti yang dibuktikan oleh PAS dan HE-mewarnai bahagian tisu.buah pinggangdaripada peringkat embrio yang sama dengan genotip yang berbeza menunjukkan tahap perkembangan yang berbeza (Rajah 1B). Selain itu, perbezaan yang ketara dalambuah pinggangstruktur diperhatikan terutamanya apabila membandingkan Calr // dengan Calr plus / plus dan Calr plus //. Perbezaan ini juga kekal dalam peringkat lanjut nefrogenesis (Rajah 1B). Calr //buah pinggangmenunjukkan kemerosotan teruk berbanding dengan Calr plus / plus dan Calr plus // (Rajah 1B). Pada peringkat E13.5 saiz Calr //buah pinggangadalah lebih kecil dan bilangan tunas ureter dan cawangan tunas ureter adalah jauh lebih rendah. Pemerhatian yang sama dibuat pada peringkat E14.5 dan E16.5. Kultur organ embriobuah pinggangdaripada tiga genotip embrio mendedahkan gangguan yang ketara dalam cawangan UB danbuah pinggangpertumbuhan. Untuk memvisualisasikanbuah pinggangstruktur, asas kultur telah diwarnai dengan laminin sebagai penanda untuk membran basal dan dengan lektin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) untuk menggambarkan UB.

Pewarnaan pendarfluor FL gabungan yang dikulturbuah pinggangasas menunjukkan kerosakan cawangan yang ketara yang mengiringi kekurangan Calr dan mengakibatkan keterlambatan keseluruhan dalambuah pinggangpembangunan (Rajah 2A,B). Pada masa pengasingan, Calr //buah pinggangasas menunjukkan 6–10 petua UB, manakala Calr tambah / tambah dan Calr tambah // asas mempamerkan 20–30 petua UB. Calr plus / plus dan Calr plus // asas berbudaya berkembang secara normal semasa tempoh kultur (72 jam) dan menunjukkan UB yang bercabang baik (85 ± 9, n=6 setiap satu) serta struktur yang diketahui berbeza dari dalam vivo mengembangkan buah pinggang. Yang berbudayabuah pinggangmenunjukkan agregat pra-tubular,buah pinggangvesikel, dan mesenkim topi (Rajah 2A, B). Sebaliknya, asas Calr// gagal berkembang secara normal dan menunjukkan perubahan ketara dalam percabangan UB (15 ± 3 n=6) (Rajah 2B).

Rajah 2. Calr−/− tetikusbuah pinggangasas memaparkan perubahan teruk dalam pertumbuhan dan cawangan UB. (A):buah pinggangasas daripada Calr plus / plus Calr plus /− dan Calr−/− (E13.5) telah diasingkan dan dikultur ex vivo selama tiga hari. Calr−/−buah pinggangasas menunjukkan perubahan keseluruhan dalam pertumbuhan dan perubahan ketara dalam percabangan tunas ureterik. (B): pewarnaan imunofluoresensibuah pinggangasas selepas tiga hari budaya. Pewarnaan bersama laminin (merah) dan lektin DBA (hijau) telah dilakukan untuk menggambarkan struktur asas yang berbeza. Kuantifikasi percabangan dicapai dengan mengira bilangan cawangan putik ureter. Kuantifikasi dibentangkan sebagai carta bar dengan bar ralat. Setiap bar mewakili nombor cawangan bermakna ± sd daripada enam asas berbudaya. Perbezaan ketara: (*) p < 0.05,="" (***)="" p="">< 0.001.="" 2.5×="" 2.5×="" 2.5×="" int.="" j.="" mol.="" sci.="" 2021,="" 22,="" 5858="" 4="" daripada="" 21="" rajah="" 2.="" calr悆="" asas="" buah="" pinggang="" tetikus="" memaparkan="" perubahan="" teruk="" dalam="" pertumbuhan="" dan="" percabangan="" ub.="">buah pinggangasas daripada Calr plus / plus Calr plus // dan Calr / (E13.5) telah diasingkan dan dikultur ex vivo selama tiga hari. Calr /buah pinggangasas menunjukkan perubahan keseluruhan dalam pertumbuhan dan perubahan ketara dalam percabangan tunas ureterik. (B): pewarnaan imunofluoresensi daripadabuah pinggangasas selepas tiga hari budaya. Pewarnaan bersama laminin (merah) dan lektin DBA (hijau) telah dilakukan untuk menggambarkan struktur asas yang berbeza. Kuantifikasi percabangan dicapai dengan mengira bilangan cawangan putik ureter. Kuantifikasi dibentangkan sebagai carta bar dengan bar ralat. Setiap bar mewakili nombor cawangan bermakna ± sd daripada enam asas berbudaya. Perbezaan ketara: (*) p < 0.05,="" (***)="" p=""><>

2.2. Kekurangan Calr Dikaitkan dengan Perubahan Transkriptom yang Besar dan Ketara

Penyiasatan morfologi dan histologi menunjukkan kemerosotan dalambuah pinggangperkembangan dalam embrio Calr/ tetikus berbanding dengan Calr plus / plus dan Calr plus // . Untuk menyiasat sama ada kalah mati Calr memberi kesan kepada ekspresi protein dan laluan utama nefrogenesis, keseluruhan analisis transkriptombuah pinggangasas telah dilakukan daripada tiga genotip embrio. Untuk menilai gen yang dinyatakan secara berbeza antara Calr plus / plus , Calr plus // , dan Calr/buah pinggangsampel, ujian kuantitatif berdasarkan kiraan bacaan dilakukan menggunakan ujian tepat Fisher dengan pelarasan Benjamini-Hochberg untuk pelbagai ujian. Angka Tambahan S1 dan S2 memaparkan peta haba analisis perbandingan antara ekspresi gen dalambuah pinggangasas daripada Calr plus / plus , Calr plus // , dan Calr / . Untuk mendapatkan gambaran menyeluruh tentang perubahan ekspresi gen antara Calr plus / plus dan Calr/ ginjal, plot MA telah dibuat dengan perubahan lipatan terubah (FC) ekspresi antara Calr plus / plus dan Calr / kepada log2 yang diubah. tahap ekspresi purata bagi setiap gen merentas semua sampel (Rajah 3A, Rajah Tambahan S1). Plot MA menunjukkan gen yang dikawal secara berbeza dalam Calr tambah / tambah berbanding dengan Calr / . Klasifikasi fungsional gen terkawal mengikut proses biologi mendedahkan perubahan proses perkembangan dalam Calr /buah pinggang(Rajah 3B, Jadual Tambahan S1). Penyiasatan lebih dekat ke dalam anotasi laluan gen terkawal mendedahkan penyimpangan dua proses utama: isyarat Wnt dan lipatan protein kerana majoriti protein terkawal didapati terlibat dalam dua laluan utama ini (Rajah 3B). Pengelompokan hierarki dan pengelompokan k-means pada profil ekspresi mengesahkan bahawa embriobuah pinggangtranskriptom Calr plus / plus dan Calr plus // sangat serupa tetapi berbeza dengan ketara daripada transkrip Calr / (Rajah 3C, Rajah Tambahan S1 dan S2).

CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI JANGKITAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG

Data analisis transkrip kami menunjukkan bahawa kalah mati Calr disertai dengan perubahan dalam ekspresi protein utama dalambuah pinggangpembangunan (Rajah 3C dan 4A, Jadual Tambahan S2) di samping protein utama dalam isyarat Wnt dan sebilangan besar gen nefrogenik telah dikawal atau tidak dikesan dalam Calr /buah pinggangasas (Rajah 3C, Rajah 4A). Antara lain, faktor transkripsi, seperti Six1 dan Six2, yang sebelum ini dilaporkan berfungsi dalam pelbagai peringkat nefrogenesis telah dikawal dengan ketara dalam buah pinggang embrio Calr //. Osr1 ialah salah satu gen yang ekspresinya diperlukan untuk Eya1, Pax2, Six2, Sall1, dan GDNF dan ekspresi gen ini hampir tiada dalam Calr / . Untuk menyiasat kesan perubahan isyarat Wnt dan gen kunci nefrogenik padabuah pinggangpembangunan dalam tikus kalah mati Calr, pewarnaan imunofluoresensi dengan penanda perkembangan embrio telah dijalankan dibuah pinggangbahagian daripada embrio pada peringkat E14.5. Pewarnaan dengan jelas mengesahkan perubahan gen yang disiasat dalam Calr / (Rajah 4B). Selain itu, jika dibandingkan dengan Calr plus / plus dan Calr plus // , Calr /buah pinggangtidak mempunyai zon nefrogenik yang jelas (Rajah 4B) seperti yang dibuktikan oleh pewarnaan dan ini mengesahkan gangguan teruk dalambuah pinggangperkembangan dalam Calr/embrio.

2.3. Analisis Proteomik Perbandingan Perubahan Ketara yang Dikenal pasti dalam Proteome Calr / Buah Pinggang Embrio

Analisis morfologi dan histologi menunjukkan bahawa sekatan Calr adalah bermasalah untuk perkembangan embrionikbuah pinggang. Untuk lebih memahami peranan Calr dalambuah pinggangperkembangan embrio, analisis proteom yang luas telah dijalankan pada embriobuah pinggangmenggunakan dua strategi. Dalam eksperimen pertama, kami menggunakan elektroforesis gel 2D untuk membandingkan embriobuah pinggangproteomes daripada Calr plus / plus dan Calr plus // embrio tetikus dari peringkat E13.5. Corak 2D menunjukkan perubahan ketara dalam proteom Calr plus //buah pinggang(p < 0.05)="" (tambahan="" rajah="" s3a).="" pengenalpastian="" protein="" yang="" banyak="" berbeza="" menunjukkan="" perubahan="" dalam="" ekspresi="" protein="" yang="" terlibat="" dalam="" laluan="" tekanan="" dan="" dalam="" metabolisme="" rna="" dalam="" calr="" plus="">buah pinggang(Rajah Tambahan S3B, C). Untuk menerokai pengubahan proteom dengan lebih baik dalam Calr plus // dan Calr悆 / berbanding dengan Calr plus / plusbuah pinggang, kami melakukan pemprofilan protein berasaskan spektrometri jisim (Rajah 5, Jadual Tambahan S3-S8). Analisis pertindihan menunjukkan kebolehulangan tinggi pengesanan protein antara genotip (Rajah 5A). Analisis statistik menunjukkan perubahan ketara dalam ekspresi protein antara Calr plus / plus vs. Calr悆 / (Rajah 5A, Jadual Tambahan S3 dan S4, Rajah Tambahan S4A.), Calr plus // vs. Calr/ (Rajah 5A, Jadual Tambahan S5 dan S6, Rajah Tambahan S4B), dan Calr tambah / tambah berbanding Calr tambah // (Rajah 5A, Jadual Tambahan S7 dan S8, Rajah Tambahan S4C). Pewarnaan imunofluoresensi mengesahkan kalah mati Calr dalam Calr //buah pinggang. Selain itu, kami mengesahkan penemuan proteomik untuk dua protein terkawal bawah dalam Calr / : Calbindin 1(Calb-1) dan Superoxide dismutase 1 (Sod1). Dalam kes Sod1, kedua-dua data proteomik dan transkriptom mendedahkan kalah mati Sod1 dalam Calr悆 // embrionikbuah pinggangdan pewarnaan imunofluoresensi mengesahkan kekurangan Sod1 dalam Calr / embriobuah pinggang(Rajah 5B). Sod1 ialah metaloenzim antioksidan yang memainkan peranan penting dalam detoksifikasi spesies oksigen reaktif (ROS) dengan menukar radikal superoksida bebas kepada hidrogen peroksida untuk detoksifikasi selanjutnya oleh katalase selular, dengan itu menghalang ketoksikan. Calb-1 ialah protein pengikat kalsium intraselular utama dalam tubul kontortus distal (DCT) dan memainkan peranan penting dalam penyerapan semula Ca2 transselular. Sebagai protein Ca2 tambah -penampan dan Ca2 tambah -transit intrasel, Calb-1 mengangkut Ca2 tambah dari apikal ke sisi basolateral tanpa pengubahsuaian ketara dalam kepekatan Ca2 tambah intrasel. Hubungan antara kalah mati Calr dan perubahan dalam ekspresi kedua-dua protein tidak jelas dan memerlukan siasatan lanjut.

Rajah 3. Analisis ekspresi gen perbandingan tikus kalah mati calreticulin. (A): Plot MA menunjukkan gen terkawal dan terkawal berskala luas dalam tikus Calr plus / plus berbanding Calr /. Ujian kuantitatif bagi perubahan lipatan (berdasarkan kiraan bacaan diubah log yang dinormalkan) telah dilakukan menggunakan ujian tepat Fisher dengan pembetulan Benjamini–Hochberg (p < 0.05)="" dan="" gen="" tidak="" ketara="" diwakili="" dalam="" warna="" kelabu.="" plot="" ma="" digunakan="" untuk="" memaparkan="" gen="" yang="" dinyatakan="" secara="" berbeza="" dalam="" calr="" plus="" plus="" vs.="" calr="" (b):="" taburan="" proses="" biologi="" gen="" terkawal="" bawah="" dalam="" calr/berbanding="" dengan="" calr="" tambah="" tambah="" -.="" klasifikasi="" gen="" yang="" dikenal="" pasti="" telah="" dijalankan="" menggunakan="" alat="" bioinformatik="" david.="" simbol="" gen="" digunakan="" untuk="" mengkategorikan="" anotasi="" ontologi="" gen,="" contohnya,="" proses="" biologi.="" (c):="" analisis="" pengayaan="" gen="" teratas="" didapati="" dikawal="" dengan="" ketara="" antara="" tiga="" genotip="" (calr="" plus="" plus="" ,="" calr="" plus="" dan="" calr/).="" analisis="" perbandingan="" diwakili="" sebagai="" peta="" haba="" (fc=""><2 and="" fc="" >="">

2.4. Klasifikasi Ontologi Gen dan Analisis Rangkaian Interaksi Protein-Protein

Plot gunung berapi dan analisis carta pai menunjukkan bahawa perubahan ekspresi Calr mengakibatkan perubahan global dalam embrio.buah pinggangproteom (Tambahan Rajah S4). Untuk mendapatkan lebih banyak maklumat tentang mekanisme biologi yang berkaitan dengan embriobuah pinggangperubahan pembangunan dalam Calr/tikus, kami menggabungkan bioinformatik DAVID dengan maklumat tentang fungsi dugaan protein yang terdapat dalam pangkalan data UniProt dan GenBank. Klasifikasi protein yang dikenal pasti mengikut penglibatan mereka dalam proses biologi menghasilkan dua puluh kategori, dengan sembilan kategori yang sangat mewakili (Supplementary Figure S4D). Salah satu kategori utama ialah proses perkembangan, dengan lebih daripada 1000 protein yang dikenal pasti tergolong dalam kumpulan ini. Oleh kerana interaksi protein-protein adalah mekanisme utama untuk hampir semua proses biologi termasuk pembangunan, pengekstrakan maklumat tentang kemungkinan interaksi protein-protein dan peraturan laluan yang menghubungkan protein terkawal dalam Calr plus // dan Calr/ embryonicbuah pinggangmungkin menyampaikan maklumat penting tentang proses yang terjejas di bawah keadaan kekurangan Calr. Untuk tujuan ini, kami menyiasat rangkaian interaksi antara protein terkawal menggunakan STRING 11.0 (http://string.embl.de, diakses pada 24 Mac 2021). Analisis lanjut protein yang dinyatakan semata-mata dalam Calr plus / plus dan Calr plus // mendedahkan dua nod interaksi yang kuat daripada protein yang terlibat dalam dua proses utama, iaitu RNA-metabolisme dan fosforilasi oksidatif (Supplementary Figure S5A). Ini menunjukkan bahawa Calr / embriobuah pinggangmungkin mengalami kelainan dalam metabolisme RNA dan kekurangan tenaga. Penyiasatan rangkaian interaksi antara protein yang diekspresikan secara berlebihan dalam Calr plus / plus dan Calr plus // berbanding dengan Calr/ sangat menyokong andaian kami kerana rangkaian menunjukkan tiga nod interaksi yang kuat. Dua daripada nod terkumpul protein yang terlibat dalam RNA-metabolisme dan fosforilasi oksidatif, manakala nod ketiga melibatkan protein ribosom dan mendedahkan gangguan dalam pembentukan ribosom dan perolehan protein (Tambahan Rajah S5B). Pemeriksaan rapi terhadap protein ribosom yang didapati dikawal menunjukkan perubahan ketara protein daripada kedua-dua subunit ribosom besar dan kecil dan ini mendedahkan gangguan teruk dalam biogenesis ribosom dan sintesis protein (Rajah 6A-D).

2.5. Calr Kalah Mati Menghasilkan Perubahan dalam Ungkapan Protein Ribosom 

Analisis data transkriptom dan proteomik menunjukkan perubahan ketara dalam ekspresi protein ribosom dalam Calr / embrio tikus.buah pinggang. Analisis Western blot dan kuantifikasi MS embrionikbuah pinggangekstrak protein daripada ketiga-tiga genotip mengesahkan penurunan peraturan yang ketara iaitu Rp10, Rp19 dan Rp26buah pinggang(Rajah 7A) dan Rps12, Rps13, Rps14 Rps15, Rp17, dan Rps19 (Rajah Tambahan S6A,B) dalam Calr/ . Selain itu, pewarnaan embriobuah pinggangbahagian mengesahkan tahap perubahan dalam ekspresi protein ribosom; tiada Rps10 atau Rps6 dapat dikesan dalam Calr/ embriobuah pinggangbahagian (Rajah 7B). Untuk menyiasat hubungan antara kalah mati Calr dan ekspresi protein ribosom, kami menubuhkan model kalah mati Calr in vitro dalam MDCKbuah pinggangsel tubul menggunakan sistem endonuklease CRISPR/cas9. Analisis western blot mengesahkan regulasi rendah yang bergantung kepada dos ekspresi Calr dalam sel MDCK dan menunjukkan pengurangan ketara subunit ribosom 40S pengekodan protein Rps10 dan Rps19, yang mendedahkan gangguan dalam biogenesis ribosom. Selain itu, ungkapan komponen penting untuk sintesis protein, contohnya, pemanjangan, mendedahkan bahawa faktor permulaan eEIF5a menurun dengan ketara dalam sel MDCK kalah mati Calr (Rajah 7C). Kalah kalah mati Calr disertai dengan perubahan morfologi, proteomik dan transkriptom yang ketara. Penyiasatan in vivo dan in vitro kami menyerlahkan lagi bahawa penyimpangan ini disertai dengan penurunan ketara dalam biogenesis ribosom. Penurunan dalam ekspresi protein ribosom dalam kalah mati Calrbuah pinggangtidak terhad kepada peringkat embrio tetapi juga boleh ditunjukkan dalam sel yang diperoleh daripada orang dewasabuah pinggang, mendedahkan potensi peranan Calr dalam biogenesis ribosom.

Rajah 7. Kekurangan Calr dikaitkan dengan regulasi turun dalam ekspresi protein ribosom. (A): Analisis Western blot bagi protein ribosom Rps10, Rps19 dan Rps26 dalam ekstrak protein daripada Calr plus / plus , Calr plus // , dan Calr // embrionikbuah pinggang. Buah pinggang embrio dituai daripada tiga tikus Calr plus /- hamil yang berbeza. Selepas genotaip, embrio daripada ibu dan genotip yang sama dikumpulkan bersama dan embrionyabuah pinggangekstrak protein dikumpulkan bersama. Selepas anggaran protein, analisis blot Barat dilakukan dalam tiga kali ganda untuk setiap protein yang disiasat. Untuk analisis perbandingan sampel, ANOVA sehala telah digunakan. Keputusan dibentangkan sebagai min ± sd daripada sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas. Perbezaan dianggap signifikan secara statistik apabila p < 0.05.="" (b):="" pewarnaan="" imunofluoresensi="" terhadap="" rps10="" dan="" rps6="" dalam="" bahagian="" tisu="" buah="" pinggang="" calr="" plus="" plus="" dan="" calr悆="" mbrionik="" dengan="" pembesaran="" 20="" ×.="" (c):="" analisis="" western="" blot="" ekstrak="" protein="" daripada="" sel="" mdck="" (kiri)="" dan="" kuantifikasi="" mrna="" selepas="" kalah="" mati="" calr="" dalam="" sel="" mdck="" (kanan).="" calr="" telah="" tersingkir="" menggunakan="" sistem="" crispr/cas9="" dengan="" dua="" sgrna="" berbeza.="" western="" blot="" telah="" disiasat="" dengan="" antibodi="" calr,="" gapdh,="" rps10,="" rps19,="" dan="" eif5a.="" kuantifikasi="" mrna="" calr="" dan="" rps10="" dalam="" sampel="" sgcalr{11}}="" telah="" dijalankan="" menggunakan="" qpcr.="" down-regulation="" calr="" menggunakan="" sistem="" crispr/cas9="" mendedahkan="" perkaitan="" antara="" kekurangan="" calr="" dan="" perubahan="" dalam="" ekspresi="" protein="" ribosom.="" perbezaan="" ketara:="" (**)="" p="">< 0.01,="" (***)="" p="">< 0.001,="" (****)="" p=""><>

3. Perbincangan

Thebuah pinggangberkembang melalui morfogenesis percabangan yang merupakan proses yang melibatkan proses pertumbuhan dan pembezaan yang kompleks dan didorong oleh isyarat yang datang dari sel-sel sekeliling dalam petak mesenchymal yang baru lahir [16]. Pada tahun-tahun yang lalu, beberapa gen dan laluan utama masukbuah pinggangpembangunan telah dikenalpasti. Faktor trofik, terutamanya GDNF, protein morfogenetik tulang (BMP), dan faktor pertumbuhan fibroblast (FGF) terlibat dalambuah pinggangpertumbuhan dan pembezaan. Mereka mengawal isyarat yang terlibat dalam morfogenesis cawangan UB serta dalam penyelenggaraan dan pembezaan mesenkim nefrogenik dalam embrio.buah pinggang[17]. Kalah kalah mati Calr menyebabkan kematian embrio akibat perkembangan jantung yang tidak berfungsi [15]. Peningkatan kepekatan Ca2 plus sitoplasma diperlukan dalam kardiomiosit normal untuk memacu myofibrilogenesis jantung. Perubahan yang sangat diperlukan dalam kepekatan Ca2 tambah ini bergantung kepada Calr dan tidak wujud dalam keadaan kekurangan Calr [18]. Peranan fungsi ER chaperone dan protein pengikat kalsium Calr dalam nefrogenesis belum lagi diterokai. Untuk menyiasat potensi peranan Calr dalam embriobuah pinggangpembangunan dan kesan kekurangan Calr terhadap nefrogenesis, kami melakukan analisis transkriptik dan proteomik perbandingan. Secara keseluruhan, kekurangan Calr mengakibatkan keterlambatan perkembangan buah pinggang dan perubahan transkriptom dan protein yang tidak ketara. Selain itu, data kami mendedahkan bahawa kekurangan Calr mencetuskan gangguan teruk dalam laluan nefrogenesis kerana perubahan ekspresi ketara protein utama isyarat Wnt (cth, Wnt7a, Wnt11, Wnt10b, Fzd10, Fzd9, Prkcb, Prkcq, dan Kremen2) telah dikenalpasti. Isyarat induktif antara epitelium tunas ureter dan mesenchyme metanephric terutamanya dikawal oleh isyarat maklum balas Wnt [19,20]. Walaupun Calr adalah sebahagian besar homeostasis kalsium selular, ia pada masa yang sama merupakan pendamping ER yang penting untuk pelipatan dan pemerdagangan glikoprotein dan protein yang terlibat dalam isyarat sel dan ekspresi gen [21]. Kalah kalah mati Calr boleh mengakibatkan gangguan lipatan protein dan tekanan ER, yang menyebabkan gangguan pada jentera translasi. Ini mungkin menjelaskan keterlambatan yang diperhatikan dalam perkembangan buah pinggang dalam tikus homozigot.

Salah satu aspek yang mengejutkan dan menarik yang diserlahkan oleh data kami ialah perubahan dalam ekspresi protein ribosom. Kami menunjukkan pengurangan hampir lengkap beberapa protein subunit ribosom 40S dan 60S. Selain itu, eksperimen in vitro kami mengesahkan korelasi antara downregulation Calr dan kemerosotan ekspresi protein ribosom. Biogenesis ribosom tersusun dengan baik dan menjalani peraturan yang ketat. Kajian baru menunjukkan bahawa ribosom memainkan peranan penting bukan sahaja dalam fisiologi sel normal tetapi juga dalam tindak balas terhadap rangsangan dan dalam patogenesis penyakit. Selain itu, biogenesis ribosom mengawal pertumbuhan sel, dan percambahan dan perubahan dalam ribosom dicerminkan dalam penyimpangan percambahan sel, penangkapan kitaran sel, apoptosis, dan manifestasi patologi [22,23].

Sebagai tambahan kepada peranannya dalam biogenesis ribosom, protein ribosom telah didapati menjalankan fungsi ribosom tambahan yang pelbagai, contohnya, dalam pertumbuhan dan percambahan sel, dalam pembaikan DNA, dan dalam pembezaan dan perkembangan selular [24-31]. Kemerosotan fungsi protein ribosom dikaitkan dengan gangguan hematologi dan metabolik dan mungkin mengakibatkan penyakit kardiovaskular dan kanser [32-36]. Mutasi dalam pengekodan gen untuk protein ribosom dikaitkan dengan keabnormalan erythropoiesis yang mengakibatkan sindrom klinikal, contohnya, anemia Diamond–Blackfan (DBA) [37] dan 5q-sindrom [38]. Mutasi dalam RPS10 dikaitkan dengan anemia Diamond-Blackfan dan 30 peratus daripada pesakit ini mempunyai ladam atau sigmoid.buah pinggang[39]. Menariknya, pesakit Diamond-Blackfan mempunyai peluang yang lebih tinggi untuk mengembangkan sindrom myelodysplastic, yang dikaitkan dengan mutasi gen Calr exon 9 [40-42]. Pengubahsuaian jentera translasi ini menyebabkan penyimpangan besar-besaran dalam proses perkembangan dan menjejaskan bukan sahaja urogenital tetapi juga sistem peredaran darah dan pembiakan, akhirnya menyebabkan kematian embrio apabila kekurangan calreticulin. Data kami mendedahkan biogenesis ribosom yang mengganggu dalam Calr/embrionikbuah pinggangdan menyerlahkan peranan substantif Calr dalam biogenesis protein. Kami percaya bahawa pemahaman yang lebih baik tentang hubungan antara kekurangan Calr dan perubahan ekspresi protein ribosom akan memberikan pandangan baharu untuk memahami cara Calr memberi kesan kepada biogenesis dan embrio ribosom.buah pinggangpembangunan dan membenarkan pandangan baru tentang proses yang mengawal perkembangan organ.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Haiwan

Calreticulin heterozigot (Calr plus // ) dan wildtype (Calr plus / plus ) tikus sampah dalam latar belakang genetik C57BL/6J yang sama diperoleh daripada Profesor Marek Michalak, Universiti Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada. Tikus dibiakkan di bawah keadaan perumahan bebas patogen tertentu dan genotip seperti yang diterangkan sebelum ini dalam Michalak et al. [15]. Untuk kajian kami, tikus hamil Calr plus // telah dikorbankan pada peringkat perkembangan embrio yang berbeza (hari embrio 13.5: E13.5; 14,5: E14.5; dan 16.5: E16.5), embrio dituai, danbuah pinggangtelah dibedah. Untuk genotaip, sekeping ekor embrio digunakan. Thebuah pinggangtelah disediakan untuk sama ada pewarnaan histokimia atau transkriptomi atau analisis proteomik. Semua prosedur percubaan telah dilakukan mengikut perundangan penjagaan haiwan dan etika Jerman (standard NIH) dan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika tempatan Pusat Perubatan Universiti Göttingen, Jerman (33.14-42502-04-11/0598).

CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI SAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG

4.2. Pewarnaan Histokimia

Untuk pewarnaan histologi embriobuah pinggang, yang dipotongbuah pinggangtelah ditetapkan semalaman dalam larutan formaldehid tertimbal 4 peratus dan seterusnya tertanam dalam blok parafin. Bahagian tertanam parafin telah dinyahparafin dan dihidrat semula serta diwarnakan dengan larutan hematoksilin Gill III dan larutan eosin Y (Merck, Darmstadt, Jerman) mengikut protokol pengeluar.

4.3. Kultur Organ Ex-Vivo Buah Pinggang Embrio

Kultur organ ex vivo telah dijalankan mengikut Davies et.al [43]. Tikus hamil telah dikorbankan pada peringkat E13.5 perkembangan embrio, embrio dituai, danbuah pinggangtelah dibedah. Selepas genotaip, 6buah pinggangasas daripada setiap genotip (Calr plus / plus , Calr plus // , dan Calr/ ) disadur pada membran PET lutsinar dengan 0.4 µM saiz liang (24 sumur, BD Falcon). Membran diletakkan di dalam satu telaga daripada 24 plat telaga, yang mengandungi 400 µLbuah pinggangmedium kultur (KCM, DMEM, 10 peratus FCS tidak aktif). Ini membolehkanbuah pingganguntuk menghubungi medium tanpa menenggelamkannya. Di bawah keadaan ini, adalah mungkin untuk mengekalkanbuah pinggangdikultur pada 37 ◦C dan 5 peratus CO2 selama sekurang-kurangnya 144 jam.

4.4. Pewarnaan Imunofluoresensi Buah Pinggang yang Dikultur dan Analisis Imunohistologi Bahagian Buah Pinggang

Embriobuah pinggangtelah dikultur ex vivo selama 72 jam, selepas itu,buah pinggangasas telah difiksasi dalam metanol sejuk pada t 20 ◦C selama 30 minit. Langkah penetapan diikuti dengan 3 langkah mencuci setiap satunya selama 5 minit dalam PBS. Antibodi anti-laminin monoklonal arnab utama (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Amerika Syarikat) telah dicairkan dalam PBS dan diinkubasi pada suhu 4 ◦C semalaman. Yang berbudayabuah pinggangasas telah dibasuh dalam PBS selama 4 jam dan antibodi sekunder (Molecular Probes Alexa Fluor 555 kambing anti-arnab IgG (1: 500)) ditambah semalaman pada 4 ◦C. UB telah diwarnakan menggunakan lectin Dolichos biflflorus agglutinin (DBA) selama sekurang-kurangnya 3 jam. Selepas pengeraman,buah pinggangtelah dibasuh dalam PBS selama 3 jam dan dibenamkan untuk analisis mikroskopik. Imunostaining bagi embrio yang terdeparafin dan terhidrat semulabuah pinggangbahagian dilakukan untuk mengesan ekspresi dan pengedaran beberapa protein. Bahagian tersebut dirawat dengan larutan pengambilan antigen (1.8 µM asid sitrik dan 8.2 µM natrium sitrat) yang telah dipanaskan terlebih dahulu dalam pengukus makanan selama 25 minit. Bahagian tersebut disekat dengan 10 peratus serum kambing dalam PBS selama 1 jam satu diinkubasi semalaman pada suhu 4 ◦C dengan antibodi primer (Antibodi primer berikut digunakan: arnab monoklonal anti-Calbindin-1, anti-Wt1, anti- Six2, anti-Pax2, anti-Calr (Abcam, Cambridge, UK), arnab monoklonal anti-Rps6, antiRps10 (Invitrogen), dan antibodi anti-Sod1 monoklonal arnab (Abnova, Taipei, Taiwan). Antibodi utama dikesan dengan pendarfluor berlabel antibodi sekunder (Molecular Probes Alexa Fluor 555 kambing anti-tikus IgG antibodi dan Alexa Fluor 555 kambing anti-arnab IgG) selama 1 jam pada suhu bilik. Untuk kawalan negatif, bahagian tisu diinkubasi hanya dengan antibodi sekunder. Slaid telah dipasang dengan slip penutup dalam medium pelekap Vectashield dengan DAPI untuk mengotorkan nukleus (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).

4.5. Kultur sel

Anjing Madin–Darbybuah pinggang(MDCK) sel diperoleh daripada American Type Culture Collection (ATCC) dan disebarkan dalam Dulbecco's Modifified Eagle's Medium (DMEM), 10 peratus serum lembu janin (FBS), 1 peratus Penicillin/Streptomycin, dan 1 peratus L-Glutamine pada 37 ◦C dalam 5 peratus CO2-atmosfera. Sel dibiakkan dalam kelalang T25 dan dibelah dua kali dalam seminggu. Untuk laluan sel, sel MDCK telah trypsinized untuk jangka masa yang singkat untuk mengelakkan perubahan struktur sel.

4.6. Penjanaan Sel Kalah Mati

Urutan sgRNA Calr (XM8622117) untuk spesies canis lupus telah direka bentuk menggunakan alat dalam talian BlueHeronBio (Origene, Herford, Jerman). Jujukan sgRNA 50 GTAGATGGCGGGTTCGGCAG 30 telah dimasukkan ke dalam plasmid pLenti-Cas-Guide (plasmid Addgene #3931646) dengan enzim sekatan BamHI dan BsmBI untuk menjana pLenti-Cas9-konstruk penjujukan Calr kemudiannya disahkan oleh penjujukan Sanger. Untuk mengalahkan Carl dalam sel MDCK, pLenti-Cas9-Transfeksi sementara Calr telah dilakukan. Sehari sebelum pemindahan, 200,000 sel/mL telah disemai dalam 6 plat perigi dengan medium MEM. Sebelum pemindahan, medium kultur ditukar kepada medium Opti-MEM tanpa FCS. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) digunakan untuk memindahkan sel. Campuran DNA plasmid lipofectamine telah disediakan dengan OptiMEM berdasarkan protokol pengajar. Untuk pemindahan 6 plat telaga, 4 µg DNA plasmid telah ditambah kepada 250 µL medium Opti-MEM secara berasingan dan diinkubasi selama 10 minit pada suhu bilik. Selepas itu, campuran DNA telah ditambah ke dalam campuran Lipofectamine 2000 dan diinkubasi selama 30 minit sebelum dimasukkan ke dalam sel. Kejayaan pemindahan telah dinilai menggunakan Western blot.

4.7. Analisis Transkriptom

Untuk penyiasatan transkrip, 3 tikus hamil Calr plus // telah digunakan. Embrio (8–10/tikus hamil) telah dituai danbuah pinggangtelah diasingkan. Selepas genotaip,buah pinggangdaripada genotip yang sama dan ibu yang sama dikumpulkan bersama dan diproses untuk pengekstrakan RNA. Jumlah RNA telah diasingkan daripada Calr plus / plus , Calr plus // , dan Calr / embryonicbuah pinggangmenggunakan kaedah Trizol (Invitrogen) mengikut cadangan pengilang. Sampel kemudian dirawat dengan DNAse I (Sigma) untuk menghilangkan pencemaran DNA. Kualiti RNA dipastikan menggunakan elektroforesis mikrobendalir Agilent 21{{10}}0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Untuk penjujukan, sampel RNA disediakan menggunakan "Kit Persediaan Sampel RNA TruSeq" mengikut protokol pengilang (Illumina, San Diego, CA, Amerika Syarikat). Penjujukan bacaan tunggal (50} bp) telah dijalankan menggunakan HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, Amerika Syarikat). Jujukan itu diselaraskan dengan jujukan rujukan genom Mus Muscullus (Ensembl genome assembly 3.2.1; https://www.ensembl.org/info/genome/genebuild/assembly. html, diakses pada 24 Mac 2021) menggunakan penjajaran STAR perisian (Cold Spring Labaro tory, Cold Spring Harbor, USA) (versi 2.3.0e, https://github.com/alexdobin/STAR, diakses pada 24 Mac 2021) [44] membenarkan 2 ketidakpadanan dalam 50 pangkalan. Pakej SAMtools (versi 0.1.18) dan HTSeq (versi 0.6.1p1) digunakan untuk menapis hits dan pengiraan unik [45,46]. Gen calon telah ditapis kepada sekurang-kurangnya 2-perubahan kali ganda dan nilai p diperbetulkan FDR < 0.05.="" anotasi="" gen="" dilakukan="" menggunakan="" mus="" muscullus="" daripada="" ensembl="" v78="" (www.ensembl.org,="" diakses="" pada="" 1="" mac="" 2019)="" melalui="" pakej="" biomart="" (versi="" 2.24.0)="" [47].="" analisis="" pengayaan="" go="" untuk="" gen="" calon="" telah="" dijalankan="" dengan="" pakej="" goseq="" (versi="" 1.2)="" [48]="" menggunakan="" parameter="">

4.8. Lisis Buah Pinggang, Pengekstrakan Protein dan Elektroforesis Gel Dua Dimensi (2-DE)

Untuk elektroforesis gel 2D, embrio daripada 6 Calr plus // betina (8–10 embrio/wanita) telah digunakan. Untuk pengekstrakan protein untuk elektroforesis gel 2D (2-DE), yangbuah pinggangdaripada embrio pada peringkat embrio yang sama dan daripada genotip dan perempuan yang sama (8–10 embrio/wanita hamil) dikumpulkan, terganggu dengan penimbal lisis (9.5 M urea, 2 peratus CHAPS (w/v), 2 peratus amfolit (w /v), 1 peratus DTT), dan vorteks. Selepas menambah penimbal telisis, sampel diinkubasi pada 4 ◦C selama 30 minit. Untuk mengeluarkan serpihan sel, sentrifugasi dilakukan pada 13,000 × g dan 4 ◦C selama 30 minit. Supernatan telah dikis baru selama 30 minit tambahan pada suhu 13,000× g dan 4 ◦C untuk mendapatkan ketulenan maksimum. Supernatan dikumpul dan pelet dibuang dan sampel yang terhasil digunakan serta-merta atau disimpan pada –80 ◦C sehingga digunakan. Untuk mengurangkan pencemaran garam dan memperkayakan protein, pemendakan metanol-kloroform menurut Wessel dan Flügge [49] telah dilakukan. Pelet telah dikeringkan dan dilarutkan dalam penimbal lisis. Jumlah kepekatan protein ditentukan menggunakan ujian protein Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat) mengikut Bradford. BSA (Sigma, Steinheim, Jerman) digunakan sebagai standard. Untuk menjamin kebolehulangan percubaan, kami menghasilkan gel tiga kali ganda daripada setiap satubuah pinggangkolam. Pemisahan protein 2D telah dijalankan seperti yang diterangkan sebelum ini [50]. 2-Gel DE telah diwarnakan dengan pewarnaan gel pendarfluor Flamingo (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) mengikut arahan pengilang. Selepas pewarnaan, gel telah diimbas pada resolusi 50 µm pada pengimbas Fuji FLA-5100. Imej digital dianalisis menggunakan Delta 2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Jerman). Untuk visualisasi protein, 2-gel DE juga diwarnakan semalaman dengan koloid Coomassie blue, Roti-Blue (Roth, Karlsruhe, Jerman).

4.9. Analisis Spektrometri Jisim dan Pengenalpastian Protein

Tompok terkawal dengan ketara dikeluarkan daripada gel dan pencernaan dalam gel tryptik dan pengekstrakan peptida dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini oleh Dihazi et al. [51]. Secara ringkas, bintik-bintik gel dibilas dua kali dalam 25 mM ammonium bikarbonat (amBic) dan sekali dalam air, dikecutkan dengan 100 peratus asetonitril (ACN) selama 15 minit dan dikeringkan dalam SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Syarikat) selama 20–30 min. Semua bintik yang dikeluarkan telah diinkubasi dengan 12.5 ng/µL penjujukan gred trypsin (Roche Molecular Biochemicals, Basel, CH) dalam 25 mM amBic semalaman pada 37 ◦C. Pengekstrakan peptida dilakukan dua kali dengan pertama menggunakan 50 peratus ACN/1 peratus asid trifluoroacetic (TFA) dan kemudian 100 peratus ACN. Semua ekstrak dikumpulkan dan volum dikurangkan menggunakan SpeedVac. Peptida tryptic tertakluk kepada penjujukan spektrometri jisim menggunakan spektrometer jisim Q-TOF Ultima Global (Micromass, Manchester, UK) yang dilengkapi dengan semburan ESI Z aliran nano. Pengenalpastian protein telah dijalankan dengan enjin carian Mascot terhadap pangkalan data MSDB dan Swissprot dengan menggunakan toleransi jisim peptida dan toleransi serpihan 0.5 Da.

CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI KEGAGALAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG

4.10. Pengekstrakan Protein, SDS-PAGE, dalam Pencernaan Gel Tryptic, dan Analisis Spektrometri Jisim

Untuk kuantifikasi spektrometri jisim perubahan protein dalam Calr/buah pinggang, sampel daripada genotip yang sama dan ibu yang sama dikumpulkan bersama. Untuk menjana kolam yang mencukupi dan untuk memastikan replikasi biologi dan eksperimen, kami menggunakan 6 Cal plus // mengandung yang berbeza dengan 8–10 embrio/tikus. Embriobuah pinggangdaripada tiga genotip telah dituai daripada embrio dan pengekstrakan protein telah dijalankan menggunakan penimbal lisis seperti yang diterangkan di atas. Ekstrak protein diasingkan oleh SDS-PAGE, gel diwarnakan dengan Coomassie Blue, setiap lorong dipotong dan dipotong menjadi 20 kepingan yang sama saiz dan kepingan tertakluk kepada pencernaan dalam gel dengan trypsin. Untuk analisis spektrometri jisim, sampel telah diperkayakan pada pralajur fasa terbalik-C18 yang dibungkus sendiri (0.15 mm ID × 20 mm, Reprosil-Pur120 C{{11} }AQ 5 µm, Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Jerman) dan dipisahkan pada lajur fasa terbalik analitikal-C18 (0.0ID 75 mm × 200 mm, Reprosil-Pur 120 C{ {21}}AQ, 3 µm, Dr. Maisch) menggunakan kecerunan linear 30 minit 5–35 peratus asetonitril/0.1 peratus asid formik (v:v) pada 300 nl min-1). Eluen dianalisis pada spektrometer jisim quadrupole/orbitrap hibrid Q Exactive (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Jerman) yang dilengkapi dengan sumber NanoSpray FlexIon dan dikendalikan di bawah perisian Excalibur 2.4 menggunakan kaedah pemerolehan bergantung kepada data. Setiap kitaran percubaan adalah dalam bentuk berikut: satu imbasan MS penuh merentasi julat 350–1600 m/z telah diperoleh pada tetapan resolusi 70,000 sasaran FWHM dan AGC sebanyak 106 dan masa pengisian maksimum 60 ms . Sehingga 12 prekursor peptida yang paling banyak keadaan cas daripada 2 hingga 5 di atas ambang 2 × 104intensiti kemudian diasingkan secara berurutan pada lebar pengasingan 2.0 FWHM, dipecahkan dengan nitrogen pada tetapan tenaga perlanggaran normal sebanyak 25 peratus dan spektrum ion produk yang terhasil. telah direkodkan pada tetapan resolusi 17,500 FWHM dan terdapat sasaran AGC sebanyak 2 × 105 dan masa pengisian maksimum 60 ms. Nilai prekursor m/z yang dipilih kemudiannya dikecualikan untuk 15 s berikut. Dua replika teknikal bagi setiap sampel telah diperolehi. Senarai puncak telah diekstrak daripada data mentah menggunakan perisian Raw2MSMS v1.17 (Institut Biokimia Max Planck, Martinsried, Jerman). Pengenalpastian protein dicapai menggunakan perisian MASCOT 2.5.1 (Matrixscience, London, UK). Protein telah dikenal pasti terhadap proteome rujukan tetikus UniProtKB v2017.09 (16930 entri protein) bersama-sama dengan set 51 bahan cemar yang biasa dikenal pasti dalam makmal kami. Pencarian dilakukan dengan trypsin sebagai enzim dan iodoacetamide sebagai agen penyekat sistein. Sehingga dua belahan tryptic terlepas dan pengoksidaan metionin sebagai pengubahsuaian berubah telah dibenarkan. Toleransi carian ditetapkan kepada 10 ppm untuk jisim prekursor dan 0.05 Da untuk jisim serpihan dan ESI-QUAD-TOF ditentukan sebagai jenis instrumen. Perisian Scaffold versi 4.8.9 (Proteome Software Inc., Portland, OR, USA) telah digunakan untuk mengesahkan pengenalan peptida dan protein berasaskan MS/MS. Pengenalpastian peptida diterima jika ia boleh diwujudkan pada kebarangkalian lebih daripada 95.0 peratus oleh algoritma Percolator. Pengenalpastian protein telah dipotong kepada kadar penemuan palsu sebanyak 1 peratus pada sekurang-kurangnya 2 peptida yang dikenal pasti dengan yakin. Hit protein yang mengandungi peptida yang serupa dan, selanjutnya, tidak dapat dibezakan berdasarkan analisis MS/MS sahaja telah dikumpulkan untuk memenuhi prinsip parsimoni. Protein yang berkongsi bukti peptida penting telah dikumpulkan ke dalam kelompok. Kelimpahan protein dianggarkan oleh Kiraan Spektrum mereka berikutan jumlah normalisasi antara semua replika.

4.11. Analisis Western Blot

Analisis Western blot telah dilakukan mengikut Towbin et al. [52]. Jumlah protein yang sama (50–75 µg) dipisahkan oleh elektroforesis gel poliakrilamida (SDS-PAGE) dan dipindahkan pada membran nitroselulosa (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK). Membran telah disekat dalam 5 peratus susu kering tanpa lemak dalam penimbal TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.4 150 mM NaCl 0.1 peratus Tween 20) dan diinkubasi dengan antibodi primer (anti-Calr, anti -Rps10, anti-Rps19, anti-Rps26, dan anti-eIF5A) semalaman pada suhu 4 ◦C. Untuk menggambarkan jalur protein, antibodi sekunder berlabel pendarfluor digunakan. Untuk mengesahkan pemuatan protein yang sama, tompok telah dirawat dengan antibodi anti-Actb atau anti-GAPDH (Sigma, Taufkirchen, Jerman).

4.12. Bioinformatik

Pengelasan protein yang dikenal pasti mengikut fungsi yang diketahui dan dipostulatkan telah dijalankan menggunakan bioinformatik DAVID (//david.abcc. ncifcrf.gov, diakses pada 21 Februari 2019) [53, 54]. Simbol gen digunakan untuk menyiasat dan mengkategorikan anotasi ontologi gen (GO) (proses biologi dan fungsi molekul). Analisis rangkaian interaksi protein-protein yang diketahui dan diramalkan bagi protein yang dikenal pasti telah dilakukan menggunakan STRING (alat carian untuk Retrieval of Interacting Gens/Proteins) [55].

4.13. Analisis statistik

Untuk {{0}}DE, imej yang didigitalkan telah dianalisis dan padanan titik merentas gel dan normalisasi dilakukan menggunakan Delta2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Jerman). Delta2D mengira nilai "kualiti titik" untuk setiap tempat yang dikesan. Nilai ini menunjukkan sejauh mana titik mewakili bentuk loceng Gaussian 3D yang "ideal". Berdasarkan nisbah isipadu titik purata, titik yang ungkapan relatifnya telah diubah sekurang-kurangnya 2-kali ganda (bertambah atau berkurang) dalam tiga kali ganda antara sampel yang dibandingkan dianggap penting. Untuk menganalisis kepentingan pengawalan protein, ujian-t Pelajar telah dilakukan dan kesignifikan statistik diandaikan untuk nilai P kurang daripada 0.05. Semua bintik telah dikira menggunakan perisian ImageJ. Data telah disusun dengan pakej perisian GraphPad Prism, versi 8 (San Diego, CA, USA). Perisian ini digunakan untuk persembahan grafik dan analisis sama ada dengan taburan-t Pelajar atau ANOVA sehala. Keputusan dibentangkan sebagai min ± sd daripada sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas. Perbezaan dianggap signifikan secara statistik apabila p <0.05. petua="" tunas="" ureter="" dan="" nefron="" dikira="" secara="" manual="" dan="" data="" telah="" disusun="" dengan="" pakej="" perisian="" graphpad="" prism,="" versi="">