Calpastatin Mencegah Kecederaan Podocyte Pengantara Angiotensin II Melalui Penyelenggaraan Autophagy
Mar 17, 2022
untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com
Imane Bensaada1,3, Blaise Robin1,3, Joe¨lle Perez2, Yann Salemkour1, Anna Chipont1, Marine Camus1,Mathilde Lemoine1, Lea Guyonnet1, He´le`ne Lazaret1, Emmanuel Letavernier2, Carole He´nique1,Pierre-Louis Tharaux1dan Olivia Lenoir1
1Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Perancis; dan2Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Paris, Perancis
Nilai ramalan proteinuria yang kuat dalam penyakit glomerular kronik telah ditubuhkan dengan kukuh serta peranan patogenik angiotensin II menggalakkan perkembangan penyakit glomerular dengan halangan penapisan fi glomerular yang diubah, kecederaan podosit dan parut glomeruli. Di sini kami mendapati bahawa hipertensi yang disebabkan oleh angiotensin II kronik dihalangautophagyefluks dalam glomeruli tikus. PenghapusanAtg5 (gen yang mengekod protein yang melibatkan autophagy) khususnya dalam podosit mengakibatkan podocytopati yang disebabkan oleh dangio tensin II yang dipercepatkan, albuminuria yang menonjol dan glomerulosklerosis. Ini menunjukkan bahawa autophagy adalah mekanisme perlindungan utama dalam podosit dalam keadaan ini. Aktiviti calpain yang disebabkan oleh Angiotensin-II dalam podosit menghalangautophagyefflux. Podosit daripada tikus dengan ekspresi transgenik perencat calpain endogencalpastatinmenunjukkan podosit yang lebih tinggiautophagypada garis dasar yang tahan terhadap perencatan yang bergantung kepada angiotensin II. Juga, autophagy berterusan dengancalpastatinkerosakan podosit terhad dan albuminuria. Penemuan ini menunjukkan bahawa hipertensi mempunyai kesan patogenik pada struktur dan fungsi glomerular, sebahagiannya melalui pengaktifan calpains yang membawa kepada sekatan autophagy podocyte. Penemuan ini mendedahkan mekanisme asal di mana hipertensi pengantara angiotensin II menghalang autophagy melalui pengambilan calpain yang disebabkan oleh kalsium dengan akibat patogen sekiranya berlaku ketidakseimbangan olehcalpastatinaktiviti. Oleh itu, menghalang pengurangan pengantara calpain dalamautophagymungkin merupakan strategi terapeutik baharu yang menjanjikan untuk nefropati yang dikaitkan dengan aktiviti sistem renin-angiotensin yang tinggi.
KATA KUNCI: angiotensin II;autophagy; calpastatin; hipertensi; podosit
Pernyataan Terjemahan
Memandangkan peranan penting autophagy dalam pembangunanbuah pinggangpenyakit, modulasi farmakologiautophagymungkin strategi yang menjanjikan untuk pencegahan dan rawatan beberapabuah pinggangpenyakit. Secara selari, pengaktifan berlebihan aktiviti calpain dalam podosit didapati memainkan kesan buruk pada fungsi podosit manakala mekanisme tindakan yang merosakkannya tidak dikenalpasti. Di sini, kami menyediakan bukti bahawa calpain mengaitkan tindakan memudaratkan angiotensin II dengan sekatan yang memudaratkanautophagydalam podosit dan mencadangkan bahawa perencatan calpain boleh menjadi sasaran terapeutik yang menjanjikan untuk penyakit podocyte sebahagiannya melalui penyelenggaraan autophagy podocyte.
Klik untukCistanche deserticola ma untuk penyakit buah pinggang kronik
Hipertensi adalah yang kedua selepas diabetes sebagai penyebab utama penyakit kronik yang progresifbuah pinggangpenyakit1–3 malah peningkatan sederhana dalam tekanan darah merupakan faktor risiko bebas untuk penyakit buah pinggang peringkat akhir.4 Peningkatan bilangan kajian eksperimen telah menekankan kepentingan podosit dalam pembangunanbuah pinggangkecederaan. Kehilangan progresif podosit dan perubahan mikrovaskular muncul lebih awal dengan kemerosotan buah pinggang berfungsi dalam nefropati hipertensi eksperimen.5 Pada pesakit, perkumuhan podosit yang berdaya maju melalui kencing ditunjukkan sebagai penanda yang sensitif dan khusus untuk preeklampsia,6,7 dan pesakit dengan nefrosklerosis mempunyai peningkatan yang ketara. ketumpatan podosit glomerular yang lebih rendah daripada yang dilakukanbuah pinggangpenderma.8,9 Tambahan pula, peranan patogenik angiotensin II (AngII) yang menggalakkan perkembangan penyakit glomerular adalah mantap, bukan sahaja dalam keadaan hipertensi tetapi juga dalam beberapa penyakit glomerular.10–21
Hipertensi glomerular mengakibatkan regangan kapilari glomerular, kerosakan endothelial, dan penapisan protein glomerular yang tinggi menyebabkan keruntuhan glomerulus dan glomerulosklerosis. Ia juga melakukan tindakan langsung pada struktur glomerular, menyebabkan tindak balas pengawalseliaan isyarat bertujuan untuk mengimbangi. Sistem renin-angiotensin-aldosteron (RAAS) sistemik dan tempatan yang diaktifkan memupuk hiperplasia mesangial dan sintesis faktor kebolehtelapan vaskular. Pada masa yang sama, podosit memaparkan isyarat kalsium22,23 dan mengubahsuai bentuknya pada stimulasi bergantung kepada reseptor AngII jenis 1 (AT1).24–28 Mekanisme penyesuaian ini menjadi maladaptif dalam jangka panjang, akhirnya membawa kepada glomerulosklerosis. AT1 mengantara penglibatan RAAS yang menonjol untuk tekanan darah dan homeostasis garam dan air. Inhibitor enzim penukar angiotensin dan penyekat AT1 digunakan secara klinikal untuk rawatan hipertensi dan kegagalan jantung pada pesakit. Menariknya, kedua-dua penyekat juga menunjukkan kesan perlindungan padabuah pinggangfungsi.
Autophagy telah ditunjukkan sebagai penting untuk mengekalkan homeostasis selular, terutamanya dalam sel postmitotik29,30 dan terutamanya dalam podosit.31–34Autophagyialah sistem degradasi yang berkaitan dengan lisosom untuk protein sitoplasma yang berumur panjang dan organel yang tidak berfungsi35,36 dan melibatkan penyerapan protein dan organel dalam autofagosom. Pembentukan autofagosom bergantung kepada induksi beberapa gen termasuk Map1lc3a/b, Beclin 1, dan Tag. 37 Terdapat bukti yang semakin meningkat bahawa disregulasi laluan autofagik terlibat dalam patogenesis penuaan buah pinggang dan beberapabuah pinggangpenyakit seperti kecederaan buah pinggang akut, penyakit buah pinggang polikistik, penuaan, dan nefropati diabetik.31,32,38–41
Peraturan bagiautophagydalam podosit, fisiologi dan, di atas semua, dalam konteks patologi, tidak diketahui dengan baik. Kami baru-baru ini menunjukkan bahawa autophagy podocyte adalah bebas daripada sasaran mekanistik peraturan rapamycin (mTOR) dalam keadaan fisiologi, menjadikan jenis sel ini pengecualian.42 Pengaktifan AT1 merangsang sintesis protein dan perolehan protein dalam sel. Oleh itu, kami berpendapat bahawa pengaktifan RAAS juga boleh mempengaruhi rangsangan perolehan protein dan proteostasis.
Dalam kajian ini, kami memberi tumpuan kepada peranan AngIIsignaling dalam podocyteautophagyperaturan. Kami mengenal pasti protease yang diaktifkan kalsium calpains yang mengantarkan kesan penyekatan kronik AngII pada podositautophagy. Selanjutnya, kami mendapati bahawa perencat calpain endogencalpastatinmampu menghalang perencatan autophagy yang bergantung kepada AngII dan kecederaan podosit semasa hipertensi.
Penemuan ini mendedahkan mekanisme asal di mana hipertensi yang dimediasi AngII menghalangautophagymelalui pengambilan calpain yang disebabkan oleh kalsium dengan akibat patogen sekiranya berlaku ketidakseimbangan oleh aktiviti calpastatin.
KAEDAH
Haiwan
Calpastatintikus transgenik (CSTTg) telah disediakan oleh Dr. E. Letavernier.43 Tikus dengan gangguan spesifik podocyte gen Atg5 (Nphs2.cre Atg5lox/lox) telah dijana seperti yang diterangkan sebelum ini31 dengan menyeberangi Nphs2.cre mice44 dengan Atg5lox/lox tetikus45 pada latar belakang C57BL6/J. Tikus Nphs2.cre Atg5lox/lox dan jantan kawal sampah, berumur 10 hingga 12 minggu, telah digunakan dalam kajian ini. Model hipertensi diinduksi oleh infusi sc AngII (Sigma-Aldrich, A9525) pada dos 1 mg/kg/min selama 4 hingga 6 minggu melalui pam mini osmotik (Alzet Corp, model 2006). Pam telah ditanam sc di belakang antara tulang belikat dan pinggul. Tikus menerima suplemen garam (3 peratus NaCl) dalam makanan. Tikus atg5lox/lox (jenis liar [WT]) digunakan sebagai kawalan dalam semua kajian. Untuk garam deoxycorticosterone acetate (DOCA) dengan model pengurangan nefron, tikus jantan dewasa menjalani nefrectomy kiri unilateral. Dua minggu selepas nefrektomi, mereka menerima pelet DOC dengan 21-hari keluaran (Penyelidikan Inovatif Amerika) ditanam sc Pelet kedua telah diimplan 3 minggu selepas implan pertama. Semua tikus menerima 0.9 peratus NaCl dalam air minuman ad libitum dan dibunuh selepas 6 minggu pentadbiran DOC.46 Eksperimen telah dijalankan mengikut garis panduan veterinar Perancis dan yang dirumuskan oleh Komuniti Eropah untuk kegunaan haiwan eksperimen (L358-86/ 609EEC) dan telah diluluskan oleh Kementerian Penyelidikan Perancis dan jawatankuasa etika penyelidikan universiti tempatan (APAFIS-7646 dan -22373).
Eksperimen kultur podosit utama
Podosit primer yang dibezakan telah dikultur seperti yang diterangkan sebelum ini.47,48 Secara ringkas, korteks buah pinggang yang baru diasingkan telah dicampur dan dihadam oleh kolagenase I (Gibco, 17100-017) di Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies, 61870-044). Tisu kemudiannya disalurkan melalui penapis sel 70 mm dan 40 mm (BD Falcon, 352340 dan 352350). Glomeruli, yang melekat pada penapis sel 40 mm, telah dikeluarkan dengan garam penimbal fosfat (PBS; Life Technologies, 10010023) þ 0.5 peratus albumin serum lembu (Eurobio, HALALB07-65) yang disuntik di bawah tekanan dan kemudian dibasuh dua kali dalam PBS. Glomeruli yang baru diasingkan disalut dalam 6-hidangan perigi di Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) ditambah dengan 10 peratus serum anak lembu janin dan 1 peratus penisilin/streptomycin (Life Technologies, 15140122) untuk membolehkan glomeruli keluar daripada glomeruli. dan berkembang. Pengayaan podocyte telah disahkan oleh analisis blot Barat seperti yang diterangkan sebelum ini 31, 48, 49 (Tambahan Rajah S1). Podocytes dibiakkan jika tiada atau kehadiran bafilomycin A1 (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) selama 4 jam. Untuk eksperimen imunofluoresensi, podosit primer disalut pada 4 label hidangan (Dutcher, 055071). Podosit kemudiannya ditetapkan dalam paraformaldehid 4 peratus selama 10 minit dan diproses untuk imunofluoresensi.
Ujian aktiviti Calpain
Aktiviti calpain intraselular ditentukan dalam podosit primer, seperti yang diterangkan sebelum ini.50–52 Sebanyak 100,000 sel telah dikultur dalam 24-hidangan kultur tisu telaga di Roswell Park Memorial Institute 1640 ditambah dengan 10 peratus janin serum anak lembu dan 1 peratus penisilin/streptomisin. Selepas tempoh kultur yang dinyatakan, medium telah digantikan dengan larutan Krebs-Ringer HEPES bikarbonat (KRH) (pH 7.4) yang mengandungi 4 mM CaCl2, dengan atau tanpa 10 mM calpain inhibitor-1 dan diinkubasi selama 10 minit sebelum penambahan daripada substrat calpain 50 mM N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metil kumarin (Sigma-Aldrich, S6510). Selepas 90-tempoh inkubasi minit, aktiviti calpain ditentukan sebagai perbezaan antara pendarfluor FL (diukur pada pengujaan 360 nm dan pelepasan 430 nm) dengan dan tanpa perencat calpain-1.
penghapusan Barat
Podosit utama dicakar dengan 8{8}} ml penimbal ujian radioimunopresipitasi yang mengandungi perencat fosfatase dan protease. Kepekatan protein diukur dengan BCA Protein Assay Kit (Merck Biochemistry, 71285). Dua puluh mikrogram protein telah dielektroforesis pada gel pratuang Kriteria XT (12 peratus Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Protein telah dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida (Thermo Fischer Scientific, 88518). Selepas menyekat dalam 5 peratus susu dalam Tris Buffer Saline 0.1 peratus Tween (TBS-T), membran diinkubasi dengan anti-LC3 poliklonal arnab (1:1000, Teknologi Isyarat Sel, 2575), poliklonal arnab anti-ATG5 (1:2000, Teknologi Isyarat Sel, 2630), guinea pig polyclonal anti-Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62 (1:10,000, PROGEN, GP62), arnab poliklonal anti-calpain 1 domain IV (1:1000, Abcam, ab39170 ), arnab poliklonal anti-calpain 2 terminal amino akhir domain I (1:1000, Abcam, ab39165), tetikus monoklonal IgG1 anti-calpain 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), arnab anti podocin (1:1000, Abcam, ab50339), anti-nefrin guinea pig (1:500, PROGEN, GP-N2), dan antibodi anti-tubulin monoklonal tikus (1:5000, Abcam,ab6160). Selepas mencuci, membran diinkubasi dengan antibodi berkaitan peroksidase lobak pedas (1:2000, Teknologi Isyarat Sel, 7074, 7076, 7077). Pengesanan isyarat khusus telah dilakukan menggunakan Kit Chemiluminescent ECL (Bio-Rad, 170-5070) pada peranti LAS 4000 (Fuji). Analisis densitometri dengan perisian ImageJ (National Institutes of Health) telah digunakan untuk kuantifikasi.
Pengukuran tekanan darah dan penilaian fisiologi
Tekanan darah sistolik tikus direkodkan menggunakan kaedah tail-cuff (Visitech Systems Inc., BP-2000). Sepuluh ukuran daripada setiap tetikus telah diambil, dan kemudian nilai min ditentukan. Tekanan darah sistolik diukur pada peringkat awal (umur 12 minggu) dan kemudian setiap minggu sehingga akhir tempoh rawatan. Semua tikus diletakkan dalam sangkar metabolik dengan akses percuma kepada air untuk 6-jam pengumpulan air kencing. Kreatinin urin dan kepekatan urea plasma dianalisis secara spektrofotometri dengan menggunakan kaedah kolorimetrik (Olympus, AU400). Perkumuhan albumin kencing diukur menggunakan ujian imunosorben berkaitan enzim khusus untuk penentuan kuantitatif albumin dalam air kencing tikus (Crystal Chem, 80630).
Histologi
buah pinggangtelah dituai dan ditetapkan dalam 4 peratus formalin penimbal PBS. Bahagian tertanam parafin (tebal 3-mm) telah diwarnai oleh Masson'strichrome untuk menilai morfologi buah pinggang. Keabnormalan pada buah pinggang digredkan berdasarkan kehadiran dan keterukan keabnormalan komponen, termasuk glomerulosklerosis, pengembangan mesangial, atrofi atau tuangan tiub, dan fibrosis. Perkadaran glomeruli sklerotik dinilai dengan pemeriksaan buta sekurang-kurangnya 50glomeruli setiapbuah pinggangbahagian.
Pewarnaan imunofluoresensi pada bahagian buah pinggang dan podosit primer
Podosit primer tetap telah disekat dalam albumin serum lembu TBS-T 3 peratus dan diinkubasi semalaman pada suhu 4 darjah dengan anti-badan babi guinea primer anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) dan anti arnab -protein pendarfluor FL hijau (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Selepas pembilasan TBS-T, antibodi sekunder konjugasi FL fluorophore-conjugated keldai anti-guinea pig IgG AF594-antibodi konjugat (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) dan IgG AF anti-arnab keldai488-antibodi konjugat ( Invitrogen, A21206) telah digunakan. Imej diambil menggunakan mikroskop pendarfluor Zeiss 2 kaki, AxioCam HRccamera dan perisian Axiovision 4.3.
Untuk parafin tetap formalin (FFPE)buah pinggang, bahagian(3 mm) telah dinyahparafinkan dan terhidrat dan pengambilan semula antigen dilakukan dalam penimbal sitrat yang dipanaskan (pH 6). Bahagian kemudiannya diresapi dengan Triton 0.1 peratus (Euromedex) dan disekat dalam albumin serum lembu TBS-T 3 peratus sebelum pengeraman antibodi semalaman pada 4 C. Kami menggunakan anti-nefrin kambing (1:100, PROGEN, GP -N2), guinea pig anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), arnab anti-GFP(1:1000, Abcam, ab290), kambing anti-Podocalyxin (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556), dan antibodi anti-Wilmʼs Tumor 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192) arnab. Antibodi sekunder ialah antibodi konjugat Alexa488– dan Alexa 568 daripada Invitrogen. Nukleus diwarnakan dengan warna biru menggunakan Hoechst. Slaid telah dipasang menggunakan medium pelekap pendarfluor (Dako, S3023). Fotomikrograf telah diambil dengan fotomikroskop Zeiss Axiophot dan perisian Axiovision. Kuantifikasi separa automatik di Fiji digunakan untuk kuantifikasi kawasan nefrin-positif dan PODXL setiap bahagian glomerular pada sekurang-kurangnya 30 glomeruli setiap tetikus. Podocytenumber dikira sebagai bilangan nukleus WT1 setiap bahagian glomerular pada sekurang-kurangnya 30 glomeruli setiap tetikus.
Prosedur mikroskop elektron penghantaran
Cebisan kecil korteks buah pinggang (1 mm3) telah ditetapkan dalam gred glutaraldehid 3 peratus (Sains Mikroskopi Elektron) selama 1 hingga 30 hari dan dibasuh tiga kali dalam PBS. Sampel telah dicantumkan dalam 1 peratus osmium tetroksida 0.1 M (Sains Mikroskopi Elektron) dalam 0.1 M PBS (pH 7.4) dan dicuci dalam air. Sampel telah dehidrasi dalam gred alkohol dan 100 peratus propilena oksida (Sains Mikroskopi Elektron). Penyusupan resin dilakukan seperti berikut: campurkan Epikote 812 dan propilena oksida dalam nisbah 1:1 selama 30 minit diikuti dengan campuran Epikote 812dan propilena oksida dalam nisbah 1:2 untuk suhu bilik semalaman. Sampel dibenamkan dalam kapsul gelatin 4 mm dalam 100 peratus Epikote 812 dan dipolimerkan dalam ketuhar yang dipanaskan hingga 60 C. Bahagian ultrathin dipotong dengan ultramikrotome UFC7 (Leica MicrosystemsGmbH) dan dibuang pada Gilder Grids 200 mesh (Sains Mikroskop Elektron). Mereka diwarnai balas dengan uranil asetat 7 peratus (Pengagihan LFG) dan sitrat utama Reynold (LFG). Sampel telah diperiksa dalam mikroskop elektron penghantaran JEM1011 (JEOL) dengan kamera Orius SC1000 CCD (Gatan), dikendalikan dengan perisian Digital Micrograph (Gatan) untuk pemerolehan.
Penyakit cistanche-buah pinggang
Susunan tindak balas rantai polimerase kuantitatif
Glomeruli yang baru diasingkan dibekukan dalam reagen QIAzol Lysis (Qiagen) pada -80 darjah . Jumlah pengekstrakan RNA menggunakan kaedah berasaskan fenol telah diproses mengikut cadangan pengeluar. cDNA telah disintesis menggunakan Kit Strand Pertama RT2 (Qiagen, 330401), dan tindak balas rantai polimerase masa nyata (PCR) dilakukan menggunakan Susunan PCR Profiler RT2 Tersuai (Qiagen, CLAM36771C) dengan RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502) . Plat PCR kuantitatif dijalankan pada kitar Applied Biosystems StepOnePlus. Setiap tatasusunan mengandungi kawalan kualiti untuk kecekapan transkripsi terbalik dan pencemaran DNA genom. Analisis PCR kuantitatif telah dilakukan menggunakan kaedah 2-DDCT dengan bantuan Pusat Analisis Data GeneGlobe (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) dan menyatakan apabila lipatan Log2 berubah dalam ekspresi gen.
Dalam analisis proteomik silico
Ramalan dalam silico tapak belahan calpain dilakukan dengan DeepCalpain (//deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (//ccd.biocuckoo.org), dan CaMPDB (// calpain.org/) alatan dalam talian. Urutan asid amino protein tikus diperoleh daripada Uniprot (https://www.uniprot.org). Keputusan disambung semula dalam Jadual Tambahan S1 dan S2.
Analisis statistik
Semua graf mewakili nilai individu dan min±SEM. Analisis statistik dilakukan menggunakan perisian GraphPad Prism, versi 9. Perbandingan antara 2 kumpulan dilakukan menggunakan ujian-t parametricStudent apabila sampel melepasi ujian normaliti Anderson-Darling dan D'Agostino dan ujian F untuk kesamaan varians. Jika tidak, ujian Mann-Whitney bukan parametrik telah digunakan. Perbandingan antara berbilang kumpulan telah dilakukan menggunakan analisis 1-cara atau 2-cara bagi varians diikuti dengan ujian perbandingan berbilang dengan pembetulan Simak. Nilai P < 0.05="" dianggap="" penting.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>
Rajah 1|Angiotensin II (AngII) D diet tinggi garam (HSD)–disebabkan hipertensi menghalang glomerularautophagy. (a–c) Imunofluoresensi Podocalyxin (PODXL; merah) dan P62 (hijau) dalam glomeruli (a,a0 ) daripada tikus jenis liar (WT), (b,b0 ) daripada Tikus WT selepas 6 minggu AngII þ HSD, dan (c,c0 ) daripada tikus Nphs2.cre Atg5lox/lox menunjukkan pengumpulan P62 dalam podosit semasa hipertensi dan dalam ATG khusus podosit{{1{{12 }}}}tikus kekurangan. Anak panah menunjukkan titik P62þ dalam WT dalam (a0 ). Nukleus telah diwarnakan balas dengan Hoechst (biru). Subbahagian rajah dengan perdana menunjukkan pembesaran yang lebih tinggi. Bar{13}} mm. (d) Kuantifikasi berkaitan kawasan P62þ dinyatakan sebagai peratusan kawasan glomerular. n=4 tikus WT dan n=5 WT dengan AngII þ HSD dan Nphs2.cre Atg5lox/lox tikus. Nilai dibentangkan sebagai plot individu dan min±SEM. Ujian Mann-Whitney: *P=0.0159. Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www.buah pinggang-international.org.
KEPUTUSAN
Hipertensi akibat diet tinggi garam AngII D menghalang autophagy podocyte
Podosit membentangkan tahap tinggiautophagydalam vivo , seperti yang ditunjukkan oleh ekspresi GFP yang kuat dalam tikus transgenik dengan gabungan GFP kepada LC3 (tikus GFP-LC3), penanda utama autophagy (Rajah Tambahan S2A). Autophagy adalah proses dinamik dengan pembentukan berterusan autofagosom dan degradasi autophagolysosomes. Menyekat degradasi autophagosomal dengan klorokuin mengakibatkan pengumpulan titik GFPþ, menunjukkan efluks autofagik yang tinggi dalam podosit (Angka Tambahan S2A dan B). Pengesahan bahawa titik GFP adalah autofagosom ditunjukkan oleh pendarfluor imuno-FL berganda untuk GFP dan SQSTM1/P62, protein pendamping yang direndahkan olehautophagy(Rajah Tambahan S2C dan D). Sekali lagi, rawatan klorokuin mendorong pengumpulan titik GFP P62, menunjukkan pengeluaran autofagik yang penting dalam podosit. Akhirnya, efluks autofagik yang tinggi telah dipelihara secara in vitro seperti yang ditunjukkan oleh ekspresi GFP dan P62 dalam podosit primer yang diasingkan daripada tikus GFP-LC3 dan pengumpulan kuat titik GFPþ dan P62þ di bawah rawatan bafilomycin A1, satu lagi penghalang degradasi autophagosomal (Rajah Tambahan S2E-H) .
Kapasiti hipertensi untuk memodulasi tindak balas autofagik podocyte kemudian dinilai pada tikus yang diselitkan dengan AngII dengan diet garam tinggi (HSD) selama 6 minggu dan dalam kawalan bukan hipertensi. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1, AngII þ HSD menyebabkan pengumpulan P62 dalam glomeruli dengan mulasi terkumpul yang kuat dalam podosit, dengan itu menunjukkan bahawa AngII þ HSD bertanggungjawab untuk podositautophagysekatan (Rajah 1a–d). Menariknya, pengumpulan P62 dalam podosit adalah serupa dengan yang diperhatikan pada tikus yang kekurangan autophagy podocyte (Nphs2.cre Atg5lox/lox tikus). Dalam model hipertensi lain, model DOC-garam, kami juga memerhatikan pengumpulan P62 progresif dalam podosit sepanjang tempoh penyakit (Tambahan Rajah S3).
Pemadaman Atg5 secara khusus dalam podosit mengakibatkan peningkatan albuminuria, kehilangan podosit dan kecederaan glomerular dalam model AngII D HSD
Kami kemudian memeriksa sama adaautophagysekatan hanya dalam podosit (tikus Nphs2.cre Atg5lox/lox) menjejaskan kecederaan glomerular dalam model AngII þ HSD. Kami mula-mula mengesahkan bahawa Nphs2. cre Atg5lox/lox tikus mempunyai tekanan darah normal, normalbuah pinggangfungsi, dan tiada lesi histologi glomerular sehingga umur 10 bulan, seperti yang dilaporkan sebelum ini (Tambahan Rajah S4).32 Kemudian, Atg5lox/lox (WT) dan Nphs2. cre Atg5lox/lox tikus telah diselitkan dengan AngII dengan HSD selama 6 minggu. Yang penting, tekanan darah sistolik adalah serupa dalam 2 kumpulan selepas infusi AngII semasa kajian (Rajah 2a), walaupun kaedah tail-cuff yang digunakan untuk mengukur tekanan darah mungkin tidak mempunyai keupayaan untuk menyelesaikan perbezaan tekanan darah yang kecil. Infusi AngII dengan HSD dengan ketara meningkatkan nisbah albumin-ke-kreatinin kencing dalam tikus WT, dan kesan ini meningkat lagi dengan ketara dalam tikus Nphs2.cre Atg5lox/lox (Rajah 2b). Tikus Nphs2.cre Hipertensi Atg5lox/lox juga menunjukkan peningkatan ketara sklerosis glomerular jika dibandingkan dengan rakan sampah WT (Rajah 2c–e). Dalam persetujuan dengan proteinuria yang diukur, tuangan protein dan dilatasi tiub adalah lebih ketara pada tikus dengan kekurangan podosit dalam ATG5 (Rajah 2f-h).
Rajah 2|Penghapusan Atg5 khususnya dalam podosit mengakibatkan peningkatan ketara dalam albuminuria,buah pinggangkecederaan, dan kehilangan podosit selepas 6 minggu infusi angiotensin II (AngII) D diet garam tinggi (HSD). (a) Tekanan darah sistolik dalam tikus Atg5lox/lox dan Nphs2.cre Atg5lox/lox selama 36 hari AngII þ HSD. n=9 tikus setiap genotip. Nilai dibentangkan sebagai min±SEM. Analisis varians dua hala (ANOVA): ns. Dalam (b–m), n=10 tikus setiap genotip. Dalam (b,g,h,k), nilai dibentangkan sebagai plot individu dan min±SEM. (b) AngII þ HSD (bersambung)
Rajah 2|(bersambung) mengakibatkan peningkatan dramatik albuminuria dalam Nphs2. cre Atg5lox/lox tikus berbanding tikus kawalan Atg5lox/lox. ANOVA dua hala: genotip, P=0.013; masa, P=0.0018. (c–f) Imej perwakilan bahagian glomeruli yang diwarnai trichrome Masson daripada kawalan Atg5lox/lox dan tikus Nphs2.cre Atg5lox/lox selepas 6 minggu AngII þ HSD. Bar{13}} mm dalam (c,d). Bar=100 mm dalam (e,f). (g, h) Perbandingan (g) perkadaran glomeruli sklerotik dan (h) bilangan tuangan tiub setiap medan mikroskopik. Ujian Mann-Whitney: **P=0.0026 dalam (h), ***P=0.0003 dalam (g). (i, j) Imej imunofluoresensi perwakilan ekspresi Wilm's Tumor 1 (WT1; merah) dan Podocalyxin (PODXL; hijau) dalam glomeruli daripada kawalan Atg5lox/lox dan Nphs2.cre Atg5lox/lox tikus selepas AngII þ HSD selama 6 minggu. Nukleus telah diwarnai dengan Hoechst (biru). Bar{26}} mm. (k) Kuantifikasi bilangan sel WT1þ setiap bahagian glomerular. Ujian Mann-Whitney: **P=0.0029 in (l,m). Imej imunofluoresensi perwakilan ekspresi CD44 (hijau) dalam glomeruli daripada kawalan Atg5lox/lox dan Nphs2.cre Atg5lox/lox tikus selepas AngII þ HSD selama 6 minggu. Nukleus telah diwarnai dengan Hoechst (biru). Bar{36}} mm. (n,o) Fotomikrograf mikroskop elektron penghantaran wakil bagi bahagian glomeruli daripada kawalan Atg5lox/lox dan Nphs2.cre Atg5lox/lox tikus selepas AngII þ HSD selama 6 minggu, menunjukkan penyingkiran proses kaki podocyte (anak panah) dalam Nphs2 hipertensi. cre Atg5lox/lox tikus. Bar{43}} mm. n=3 tikus setiap genotip. Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www.kidney-international.org.
Rajah 3|Ekspresi dan aktiviti Calpain dalam podosit. (a) Analisis Western blot bagi ungkapan calpain-1, calpain-2 dan calpain-4 dalam podosit primer. Ekspresi tubulin berfungsi sebagai normalisasi. (b) Aktiviti calpain diukur pada podosit primer yang dirawat atau tidak dirawat dengan angiotensin II (AngII; 100 nM) selama 24 jam dengan atau tanpa calpeptin (10 mM). n=5 percubaan bebas. Nilai dibentangkan sebagai plot individu dan min±SEM. Analisis varians sehala (ANOVA): rawatan, P=0.0035. Ujian perbandingan berbilang Sidak: *P=0.0128 untuk AngII berbanding garis dasar, ##P=0.0056 untuk AngII þ calpeptin lawan AngII. ( c ) Aktiviti Calpain diukur pada podosit primer daripada jenis liar (WT) ataucalpastatintikus transgenik (CSTTg) dirawat atau tidak dirawat dengan AngII (100 nM) selama 24 jam. n=7 percubaan bebas. Nilai dibentangkan sebagai plot individu dan min±SEM. ANOVA dua hala berpasangan untuk rawatan: genotip, P=0.0483. Ujian perbandingan berbilang Sidak: ***P=0.0009 untuk WT AngII lawan garis dasar, *P=0.0420 untuk CSTTg AngII lawan garis dasar, #P=0.0424 untuk WT lawan CSTTg AngII. Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www.buah pinggang-international.org.
Nombor podocyte per glomerulus telah berkurangan dengan ketara dalam Nphs2. cre Atg5lox/lox tikus dirawat dengan AngII þ HSD (Rajah 2i–k). Kecederaan podocyte dalam tikus Nphs2.cre Atg5lox/lox dengan infusi AngII þ HSD malah berkembang menjadi glomerulosklerosis fokus dan segmental seperti yang ditunjukkan oleh ekspresi penanda pengaktifan sel epitelium parietal (PEC) CD44 dalam glomeruli (Rajah 2l dan m). Analisis mikroskop elektron mengenal pasti perubahan ketara yang berkaitan dengan kekurangan ATG5 apabila infusi AngII kronik dengan HSD, termasuk penyingkiran proses kaki dalam Nphs2 hipertensi. cre Atg5lox/lox tikus. Sebaliknya, beberapa kecacatan ultrastruktur ditemui dalam podosit daripada tikus WT walaupun selepas 10 minggu penyerapan AngII dengan HSD (Rajah 2n dan o), menunjukkan bahawa aktiviti autofagik podosit diperlukan untuk ketahanan mereka terhadap kerosakan yang disebabkan oleh AngII þ HSD. Secara keseluruhannya, keputusan kami menunjukkan bahawa dalam model AngII þ HSD,autophagyperencatan memburukkan lagi kecederaan dan kehilangan podosit dan mendorong glomerulosklerosis fokus dan segmental seterusnya.
AngII D HSD mengaktifkan aktiviti calpain dalam podosit yang menyumbang kepada sekatan autophagy
Oleh kerana aktiviti calpain didapati (i) diaktifkan oleh AngII dalam beberapa jenis sel dan (ii) untuk membelah beberapaautophagyprotein yang berkaitan,53 kami tertanya-tanya sama ada sekatan autophagy yang dimediasi AngII þ HSD boleh dikaitkan dengan peningkatan aktiviti calpain yang disebabkan oleh AngII. Kami mula-mula mendapati bahawa podosit primer menyatakan 3 bentuk calpain yang ada di mana-mana (Rajah 3a). Kami kemudian menunjukkan bahawa AngII merangsang aktiviti calpain dalam podosit primer. Peningkatan aktiviti calpain ini telah disekat oleh perencat calpain terpilih (Rajah 3b). Kami menggunakan tetikus ketuk masuk dengan tambahancalpastatinekspresi transgen (yang membawa kepada penurunan aktiviti calpain)43 untuk menilai peranan calpains dalam AngII þ HSD-pengantarabuah pinggangkecederaan dan sekatan autophagy. Podosit utama daripada tikus CSTTg menunjukkan penurunan aktiviti calpain sebagai tindak balas kepada AngII jika dibandingkan dengan podosit daripada tikus kawalan (Rajah 3c). Oleh itu,calpastatinEkspresi berlebihan dalam podosit mengurangkan pengaktifan calpain yang dimediasi AngII.
Kami seterusnya menilaiautophagytahap dalam podosit daripada tikus CSTTg. Kami menjana tikus CSTTg dengan transgene GFP-LC3. LC3-Pemberita GFP membenarkan pengiraan autofagosom sebagai titik GFPþ/P62þ. P62 akan terkumpul dalam agregat dalam sel apabila efluks autofagik disekat. Pada keadaan asas, kami mengira lebih sedikit titik GFPþ P62þ (Rajah 4a, b, dan e) dan kurang pengumpulan P62 (Rajah 4c, d, dan f) dalam podosit tikus CSTTg GFP-LC3 berbanding podosit tikus GFP-LC3 biasa , mencadangkan peningkatan pengeluaran autofagik dalam podosit tikus dengan kelimpahan calpastatin yang tinggi.
Rajah 4|Penilaian pengeluaran autofagik dalam podosit daripadacalpastatintikus transgenik (CSTTg). (a, b) Imej imunofluoresensi perwakilan bagi ekspresi protein pendarfluor FL hijau (GFP) (hijau) dan P62 (merah) dalam glomeruli daripada 12-tikus GFP-LC3 dan CSTTg GFP-LC3 yang berusia 12-minggu. Anak panah menunjukkan GFPþ P62þ autofagosom. (c, d) Imej imunofluoresensi perwakilan bagi ekspresi P62 (hijau) dan Podocalyxin (PODXL; merah) dalam glomeruli daripada 12-tikus GFP-LC3 dan CSTTg GFP-LC3 12-minggu. Subbahagian rajah dengan perdana menunjukkan pembesaran yang lebih tinggi. Nukleus telah diwarnai dengan Hoechst (biru). Bar{15}} mm. (e) Kuantifikasi bilangan titik LC3þ P62þ setiap podosit. Ujian Mann-Whitney: **P= 0.0065. (f) Kuantifikasi kawasan P62þ setiap bahagian glomerular. Ujian Mann-Whitney: *P=0.0420. Dalam (e,f), n=5 tetikus GFP-LC3 dan n=8 tetikus CSTTg GFP-LC3. Nilai dibentangkan sebagai plot individu dan min±SEM. Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www.buah pinggang-international.org.
Pengaliran autofagik boleh dipantau dengan pengukuran penukaran bentuk sitoplasma LC3, LC3-I, kepada bentuk terbelah autophagosomal dan fosfatidyletanolamin– LC3, LC3-II, pada Western blot . Podosit daripada tikus CSTTg menunjukkan peningkatan penukaran LC3-I kepada LC3-II dan penurunan ekspresi P62, dengan kehadiran dan ketiadaan bafilomycin A1 (Rajah 5a dan b), menunjukkan peningkatan pengeluaran autofagik dalam podosit dengan ekspresi berlebihan calpastatin. Akhirnya, pengumpulan titik GFPþ P62þ dalam podosit selepas pentadbiran klorokuin adalah lebih penting dalam tikus CSTTg GFP-LC3 daripada tikus GFP-LC3, dengan itu mengesahkan bahawacalpastatinEkspresi berlebihan mendorong pengeluaran autofagik dalam podosit dalam vivo (Rajah 5c-e). Secara keseluruhannya, data kami mencadangkan bahawa AngII merangsang aktiviti calpain dalam podosit, ituautophagydihalang oleh calpain dalam podosit, dan perencatan aktiviti calpain endogen oleh overexpression calpastatin adalah mencukupi untuk merangsang efluks autofagik dalam podosit.
Tikus CSTTg dilindungi daripada kecederaan podosit yang disebabkan oleh AngII D HSD
Tikus CSTTg tidak menunjukkan sebarangbuah pinggangperubahan sehingga sekurang-kurangnya 12 bulan (Tambahan Rajah S5). Kami menganalisis kecederaan podosit dalam tikus CSTTg semasa rawatan AngII þ HSD. Walaupun tikus WT mengalami kecederaan glomerulosklerosis dan podocyte ringan selepas 4 minggu hipertensi, seperti yang ditunjukkan oleh ekspresi abnormal podocalyxin dan nephrin, tikus CSTTg menunjukkan lebih sedikit lesi glomerular sklerotik (Rajah 6a dan b) dan mengekalkan ekspresi podocalyxin dan nephrin (Rajah 6c-h) . Perbezaan dalam fenotip podosit seperti itu diperhatikan pada peringkat di mana ketumpatan nukleus podosit tidak berbeza antara WT dan tikus CSTTg hipertensi (Rajah 6i-k).
Rajah 5|Menyekat degradasi autofagosom mengesahkan peningkatan efluks autofagik podosit masukcalpastatintikus transgenik (CSTTg). ( a ) Analisis blot Barat bagi ekspresi LC3, Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62, dan ATG5 dalam podosit primer daripada tikus jenis liar (WT) atau CSTTg. Ekspresi tubulin berfungsi sebagai normalisasi. Podosit telah dirawat atau tidak dirawat dengan bafilomycin A1 (BafA1; 100 nM) selama 4 jam sebelum penahanan budaya. (b) Kuantifikasi nisbah LC{{10}}II/tubulin dan P62/tubulin. n=10 tikus WT dan n=8 tikus CSTTg. Nilai dibentangkan sebagai plot individu dan min±SEM. Analisis dua hala bagi varians yang dipasangkan untuk rawatan: untuk LC3-II/tubulin: genotip, P=0.{{30}}008; rawatan, P <0.0001; untuk="" p62/tubulin:="" genotip,="" p="0.0884;" rawatan,="" p=""><0.0001. ujian="" perbandingan="" berbilang="" sidak:="" untuk="" lc3-ii/tubulin:="" ***p="">< 0.0001="" untuk="" wt="" campur="" bafa1="" berbanding="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0.0001="" untuk="" csttg="" tambah="" bafa1="" berbanding="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" untuk="" wt="" þ="" bafa1="" berbanding="" csttg="" þ="" bafa1;="" untuk="" p62/tubulin:="" ***p=""><0.0001 untuk="" wt="" campur="" bafa1="" berbanding="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p=""><0.0001 untuk="" csttg="" tambah="" bafa1="" berbanding="" csttg="" þ="" bafa1.="" (="" c,="" d="" )="" imej="" imunofluoresensi="" perwakilan="" bagi="" ekspresi="" protein="" pendarfluor="" fl="" hijau="" (gfp;="" hijau)="" dan="" p62="" (merah)="" dalam="" glomeruli="" daripada="" 12-="" tikus="" gfp-lc3="" dan="" csttg="" gfp-lc3="" minggu.="" subbahagian="" rajah="" dengan="" perdana="" menunjukkan="" pembesaran="" yang="" lebih="" tinggi.="" nukleus="" telah="" diwarnai="" dengan="" hoechst="" (biru).="" bar{54}}="" mm.="" tikus="" telah="" dirawat="" dengan="" klorokuin="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" 4="" jam="" sebelum="" dibunuh.="" anak="" panah="" menunjukkan="" gfpþ="" p62þ="" autofagosom.="" (e)="" kuantifikasi="" bilangan="" titik="" lc3þ="" p62þ="" setiap="" podosit.="" n="5" tikus="" setiap="" genotip.="" nilai="" dibentangkan="" sebagai="" plot="" individu="" dan="">±SEM. Ujian-t tidak berpasangan dengan SD yang sama: *P=0.0302. Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www.buah pinggang-international.org.
Rajah 6 |Calpastatinekspresi berlebihan menghalang kecederaan podosit yang dimediasi angiotensin II (AngII) D diet garam tinggi (HSD). ( a, b ) Imej perwakilan bahagian glomeruli yang diwarnai trichrome Masson daripada tikus jenis liar (WT) dan calpastatin transgenik (CSTTg) selepas 6 minggu AngII þ HSD. Bar =50 mm. ( c, d, f, g ) Imej imunofluoresensi perwakilan bagi ekspresi (c, d) Podocalyxin (PODXL) dan (f, g) nephrin (NPHS1) dalam tikus WT dan CSTTg selepas 6 minggu AngII þ HSD dan (e ,h) kuantifikasi yang berkaitan. Bar=50 mm. (i, j) Imej imunofluoresensi perwakilan ekspresi Tumor Wilm 1 (WT1; hijau) dan PODXL (merah) dalam glomeruli dari tikus WT dan CSTTg selepas 6 minggu AngII þ HSD dan (k) kuantifikasi yang berkaitan dengan bilangan WT1þ sel setiap bahagian glomerular. Nukleus telah diwarnai dengan Hoechst (biru). Bar{11}} mm. Dalam (e, h, k), nilai dibentangkan sebagai plot individu dan min ± SEM. n=9 tikus WT dan n=7 tikus CSTTg. Ujian-t tidak berpasangan dengan SD yang sama: **P=0.0095 dalam (e), *P=0.0249 dalam (h), P=0.7891 dalam (k). Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www.buah pinggang-international.org.
Begitu juga, selepas 6 minggu hipertensi, tikus GFP-LC3 dan CSTTg GFP-LC3 menunjukkan kecederaan podosit tetapi lesi lebih menonjol dalam tikus GFP-LC3 (Rajah 7). Nisbah albumin-ke-kreatinin kencing adalah lebih tinggi dalam tikus GFP-LC3 selepas 4 minggu AngII þ HSD (Rajah 7a). Nombor podocyte tidak berbeza antara 2 genotip, tetapi ekspresi nefrin telah berkurangan dengan ketara dalam tikus GFP-LC3 (kawalan) (Rajah 7b-e). Menghubungkaitkan dengancalpastatin-perlindungan pengantara, analisis ultrastruktur menunjukkan penyingkiran proses kaki podosit yang ringan dan fokus dalam tikus GFP-LC3 yang dirawat dengan AngII þ HSD dengan pemeliharaan yang lebih baik bagi penyingkiran proses kaki dalam tikus CSTTg, walaupun kuantiti global bilangan proses kaki setiap ruang bawah tanah glomerular panjang membran (GBM) tidak berbeza secara statistik, kemungkinan besar kerana kecederaan podosit adalah fokus dan segmental dalam model kami (Rajah 7f-h). Nota, penyusupan makrofaj dan T-limfosit dalambuah pinggangtidak berbeza antara kumpulan (Tambahan Rajah S6). Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan itucalpastatinmenghalang kecederaan podosit yang disebabkan oleh AngII þ HSD.
Ekspresi berlebihan Calpastatin memulihkan efluks autofagik dalam podosit daripada tikus selepas rawatan AngII D HSD
Akhirnya, kami tertanya-tanya sama adacalpastatin-perlindungan glomerular pengantara dalam model AngII þ HSD melibatkan penyelenggaraan autophagy dalam podosit. Menariknya, pengumpulan P62 yang disebabkan oleh AngII þ HSD dalam podosit telah dihalang dalam tikus CSTTg dan GFP-LC3 CSTTg (Rajah 8a-d), menunjukkan bahawa calpastatin menghalang sekatan podositautophagy. Daripada perhatian, bilangan titik GFP P62 yang pelabelan autofagosom adalah serupa dalam podosit daripada tikus GFP-LC3 dan GFP-LC3 CSTTg hipertensi, dengan itu menunjukkan bahawa AngII þ HSD menyebabkan kelembapan efluks autofagik podocyte dan bukannya penangkapan lengkap (Rajah 8e- g).
Ramalan dalam silico tapak belahan calpain dalam protein podocyte
Kami menggunakan beberapa alat dalam silico untuk meramalkan sasaran calpain yang berpotensi dalam podosit (Jadual Tambahan S1 dan S2). Tiga pangkalan data dalam talian telah dibandingkan: GPS-CCD, 54 CaMPDB, 55, dan DeepCalpain.56 Dalam analisis siliko mengenal pasti beberapa protein podosit, nefrin dan podosin di antaranya, yang boleh dibelah oleh calpains. Oleh itu,calpastatin-perlindungan glomerular yang dimediasi boleh dikaitkan dengan pengurangan aktiviti enzimatik calpain, yang membawa kepada pengurangan degradasi beberapa protein podosit.
Tambahan pula, sekurang-kurangnya 3autophagy-protein berkaitan adalah sasaran langsung calpains. ATG5 dibelah oleh calpains, yang membawa kepada gangguan dalam pembentukan kompleks ATG12-ATG5.57,58 Pentadbiran perencat calpain dalam vivo juga menghalang pembelahan protein autophagy Beclin-1.59 Analisis silico bagi tapak belahan diduga pada protein berkaitan autophagy menyokong hipotesis bahawa calpain boleh mengawal autophagy melalui pembelahan enzimatik protein autophagy.
Fungsi cistanche-buah pinggang
Ekspresi mRNA retikulum endoplasma (ER) dan penanda tekanan oksidatif dalam glomeruli daripada tikus yang dirawat dengan AngII ditambah HSD
Kami menilai tekanan retikulum endoplasma (ER) dan tekanan oksidatif oleh PCR kuantitatif dalam glomeruli semasa rawatan AngII þ HSD (Jadual 1). Pada peringkat awal, kami tidak melihat sebarang perubahan dalam ekspresi mRNA gen yang dianalisis dalam glomeruli daripada tikus WT dan Nphs2.cre Atg5lox/lox (Tambahan Rajah S7). Selepas 6 minggu hipertensi, glomeruli daripada Nphs2. cre Atg5lox/lox tikus menunjukkan profil mRNA gen yang berbeza bagi tekanan ER dan laluan tekanan oksidatif dengan peningkatan ekspresi Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1, dan Hsp90b1 berbanding dengan glomeruli WT, dengan itu mencadangkan bahawaautophagypengurangan dalam podosit disukai AngII þ tekanan ER yang disebabkan oleh HSD dan tekanan oksidatif. Sebaliknya, glomeruli daripada tikus CSTTg membentangkan downregulation beberapa gen bagi tekanan ER dan laluan tekanan oksidatif serta penurunan ekspresi beberapa gen pro-apoptosis (Rajah 9).
Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan bahawacalpastatinoverexpression boleh menghalang kecederaan glomerular dengan mengurangkan AngII þ HSD-induced ER dan tekanan oksidatif.
PERBINCANGAN
Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa dalam hipertensi yang disebabkan oleh AngII þ HSD, autophagy podocyte dikurangkan dengan ketara. Tambahan pula, tikus dengan penghapusan khusus podosit Atg5 lebih terdedah kepada glomerulosklerosis yang disebabkan oleh AngII þ HSD dan kehilangan podosit, dengan itu menunjukkan bahawaautophagydalam podosit menghalang perkembangan nefropati hipertensi, menonjolkan peranan kritikal autophagy dalam kecederaan podosit yang disebabkan oleh AngII þ HSD. Sedikit yang diketahui tentang rangsangan ekstraselular yang mengawal autophagy selular, dan keputusan ini memberi penerangan tentang peraturan patofisiologi autophagy podocyte oleh AngII.
Dalam kebanyakan glomerulopati manusia, penyingkiran proses kaki podosit adalah ciri kecederaan glomerular yang membawa kepada proteinuria. Autophagy mungkin memainkan peranan penting dalam mengekalkan fungsi podosit kerana sel-sel yang dibezakan secara terminal ini memaparkan kadar yang tinggiautophagywalaupun tanpa tekanan. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa AngII menggalakkan autophagy melalui penjanaan spesies oksigen reaktif dalam barisan sel podosit murine yang diabadikan secara bersyarat.60 Pengeluaran spesies oksigen reaktif sememangnya merupakan inducer umum autophagy dalam banyak jenis sel dan sebab untuk percanggahan tersebut dengan penemuan kami adalah tidak jelas. Tidak seperti kajian terakhir ini, kami menggunakan podosit kultur utama murine yang mengekalkan ekspresi podocin dan nephrin dan pendekatan in vivo dan bukan garisan sel murine. Kami mengesahkan laporan terdahulu bahawa podosit postmitotik mempamerkan tahap konstitutif yang luar biasa tinggiautophagy. Pengukuran jumlah peningkatan LC3-II selepas rangsangan AngII dengan kehadiran atau ketiadaan perencat lisosom adalah perlu untuk menentukan sama ada efluks autofagik meningkat atau disekat. Kajian terdahulu telah mengabaikan fenomena ini.60
Rajah 7 |Calpastatinekspresi berlebihan menghalang angiotensin II (AngII) D diet garam tinggi (HSD) – kecederaan podosit pengantara dalam protein pendarfluor FL hijau (GFP)–LC3 tikus. (a) AngII þ HSD mengakibatkan peningkatan dramatik albuminuria dalam tikus GFP-LC3 berbanding tikus GFP-LC3 CSTTg (calpastatin transgenik). n=8 hingga 13 tikus setiap genotip. Nilai dibentangkan sebagai plot individu dan min±SEM. Analisis varians dua hala: genotip, P=0.0429; masa, P=0.0165. Ujian perbandingan berbilang Sidak: *P=0.0453 untuk GFP-LC3 berbanding tikus CSTTg GFP-LC3 pada hari ke-28. (b,c) Imej imunofluoresensi perwakilan bagi ekspresi Tumor Wilm 1 (WT1; hijau) dan nefrin (NPHS1) (merah) dalam glomeruli daripada 18-tikus GFP-LC3 dan CSTTg GFP-LC3 seminggu selepas 6 minggu infusi AngII þ HSD. Nukleus telah diwarnai dengan Hoechst (biru). Bar{30}} mm. Kuantiti (d) kawasan NPHS1þ setiap bahagian glomerular dan (e) bilangan sel WT1 setiap bahagian glomerular dalam 18-tikus GFP-LC3 dan CSTTg GFP-LC3 seminggu selepas 6 minggu infusi AngII þ HSD. n=19 tetikus GFP-LC3 dan n=25 tetikus CSTTg GFP-LC3. Nilai dibentangkan sebagai plot individu dan min±SEM. Ujian-t tidak berpasangan dengan SD yang sama: **P=0.0010 dalam (d), P= 0.1158 dalam (e). ( f, g ) Penghantaran imej mikroskop elektron glomeruli daripada tikus GFP-LC3 dan CSTTg GFP-LC3 selepas 6 minggu AngII þ HSD. Anak panah menunjukkan penyingkiran proses kaki. Bar{56}} mm. (h) Kuantifikasi bilangan proses kaki setiap mikrometer membran bawah tanah glomerular (GBM). n=3 tikus setiap genotip. Nilai dibentangkan sebagai plot individu dan min SEM. Setiap plot mewakili purata bilangan podosit setiap mikrometer GBM pada 1 panjang berterusan GBM. Ujian-t tidak berpasangan dengan SD yang sama: P=0.7512. Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www.buah pinggang-international.org.
Di sini, kami menggunakan model hipertensi berdasarkan perfusi AngII dan HSD. Podosit mempamerkan reseptor AT1 dan terdedah kepada peptida yang ditapis secara bebas seperti AngII.13,16,26,61–65 Diandaikan bahawa kesan renoprotektif yang diperhatikan perencatan RAAS mungkin—sekurang-kurangnya sebahagiannya—disebabkan sekatan podosit ini. RAAS tertentu. Begitu juga, kajian in vivo mengesahkan kesan AngII pada kecederaan podocyte dan penyasaran gen spesifik podocyte AT1 menunjukkan bahawa pengaktifan reseptor AT1 dalam glomerulus dalam lupus nefritis eksperimen adalah mencukupi untuk mempercepatkan.buah pinggangkecederaan jika tiada hipertensi.66,67 Calpain-mediatedautophagydisregulasi dalam model kami boleh dikaitkan dengan mengarahkan isyarat AngII-AT1 pada podosit atau menjadi akibat hipertensi. Kami mungkin memberikan jawapan awal kepada soalan ini. Malah, dalam model garam DOC, kami juga mendapati pengumpulan P62 dalam podosit daripada tikus hipertensi (Tambahan Rajah S3). Ini menunjukkan bahawa sekatan autophagy berlaku dalam podosit dalam model ini, yang sepatutnya bebas daripada AngII.68 Kajian lanjut menilai kecederaan podosit yang berkaitan dengan aktiviti calpain dan efluks autofagik pada tikus yang kekurangan AT1 dalam podosit secara selektif akan diperlukan untuk menggambarkan jika peraturan tersebut. autophagy podocyte bergantung kepada kesan langsung atau tidak langsung AngII.
Rajah 8 |Calpastatinekspresi berlebihan menghalang angiotensin II (AngII) D diet garam tinggi (HSD)–disebabkanautophagydownregulation dalam podosit. ( a, b ) Imej imunofluoresensi perwakilan ekspresi P62 (hijau) dan Podocalyxin (PODXL; merah) dalam glomeruli daripada protein pendarfluor FL hijau (GFP) -LC3 dan CSTTg (calpastatintransgenik) tikus GFP-LC3 selepas 6 minggu AngII þ HSD. Subbahagian rajah dengan perdana menunjukkan pembesaran yang lebih tinggi. Nukleus telah diwarnai dengan Hoechst (biru). Bar =50 mm. (c, d) Kuantifikasi kawasan P62þ setiap bahagian glomerular. n=9 tikus jenis liar (WT) dan n=7 tikus CSTTg dalam (c) dan n=16 tikus GFP-LC3 dan n=16 tikus CSTTg GFP-LC3 dalam (d). Nilai dibentangkan sebagai plot individu dan min±SEM. Ujian Mann-Whitney: **P=0.0033 dalam (c), **P=0.0011 dalam (d). ( e, f ) Imej imunofluoresensi perwakilan ekspresi GFP (hijau) dan P62 (merah) dalam glomeruli daripada tikus GFP-LC3 dan CSTTg GFP-LC3 selepas 6 minggu AngII þ HSD. Subbahagian rajah dengan perdana menunjukkan pembesaran yang lebih tinggi. Anak panah menunjukkan GFPþ P62þ autofagosom. (g) Kuantifikasi bilangan titik LC3þ P62þ setiap podosit. n=11 tetikus GFP-LC3 dan n=16 tetikus CSTTg GFP-LC3. Nilai dibentangkan sebagai plot individu dan min±SEM. Ujian-t tidak berpasangan dengan SD yang sama: P=0.1014. Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www.buah pinggang-international.org.
Jadual 1|Tatasusunan PCR Profiler RT2 Tersuai
Calpain-1 dan calpain-2 ialah protease pro-radang di mana-mana, yang aktivitinya dikawal olehcalpastatin, perencat khusus mereka. Sesungguhnya, calpastatin secara selektif menghalang calpains dan tiada protease lain setakat ini. Pengaktifan Calpain telah dipautkan baru-baru ini kepadabuah pinggangkecederaan dalam beberapa konteks patologi.69,70 Saluran berpotensi reseptor sementara pengangkut saluran kalsium C6 didapati mengaktifkan calpain-1 dalam podosit melalui pengaktifan Ca2þ/calcineurin. Buah pinggang pesakit dengan glomerulosklerosis fokus dan segmental telah meningkatkan ekspresi saluran C6 potensi reseptor sementara, peningkatan aktiviti calpain dan calcineurin serta mengurangkan ekspresi talin sasaran calpain-1, yang penting untuk kestabilan sitoskeletal podocyte.71 Saluran potensi reseptor sementara C6 juga mengikat secara langsung kepada calpain-1 dan calpain-2. Interaksi ini penting untuk pengawalan pembelahan talin{11}} dan mengawal motilitas podosit.72
Tikus transgenik mengekspresikan secara berlebihancalpastatindilindungi daripada pembentukan semula vaskular dan keradangan yang bergantung kepada AngII73; terhadap keradangan dalam model glomerulonephritis, 43 sepsis, 74 atau penolakan allograf75; dan terhadap keradangan yang berkaitan dengan usia.76 Kecederaan podocyte pada tikus ini belum diterokai. Peltier et al. menunjukkan bahawa ekspresi berlebihan daripadacalpastatinmenghalang keradangan perivaskular yang bergantung kepada AngII dalam buah pinggang.43 Oleh itu, perlindungan buah pinggang dalam tikus CSTTg boleh dimediasi, sekurang-kurangnya sebahagiannya, oleh mekanisme anti-radang. Kami menilai penyusupan makrofaj dan limfosit dalam model kami dan mendapati tiada perbezaan yang ketara dalambuah pinggangkeradangan antara CSTTg dan tikus kawalan apabila menganalisis globalbuah pinggangpenyusupan leukosit (Tambahan Rajah S6).
Calpain terlibat baru-baru ini dalam peraturan autophagy (disemak baru-baru ini dalam Weber et al.53) dengan ciri-ciri menarik dan bioprotektif perencatan calpain dalam konteks diabetes melalui pemulihanautophagy.77 Di sini, kami melaporkan bahawa perencatan calpain melaluicalpastatinoverexpression (i) menghalang kecederaan podosit semasa hipertensi dan (ii) memulihkan autophagy dalam podosit, dengan itu menonjolkan peranan baru yang merosakkan pengaktifan calpain semasa hipertensi melalui perencatanautophagy.
Hampir semua protein ATG ditunjukkan untuk dibelah oleh calpains secara in vitro. 78 Di sini kami mengandaikan bahawaautophagypenyelenggaraan dalam tikus CSTTg hipertensi telah dimediasi oleh perencatan calpain. Untuk menyokong hipotesis kami, kami menunjukkan bahawa podosit daripada CSTTg mempunyai aktiviti calpain yang menurun apabila dicabar dengan AngII in vitro (Rajah 3c). Kami mendapati peningkatan tahap protein ATG5 dalam podosit daripada tikus CSTTg, yang menunjukkan bahawa overexpression calpastatin menghalang belahan ATG5 yang dimediasi calpain dalam konteks ini (Rajah 5a). Sebaliknya, ia telah ditunjukkan bahawacalpastatin-pengantara perencatan calpain boleh bebas daripada perencatan aktiviti protease mereka79; Oleh itu, kita tidak boleh mengecualikan peraturan autophagy oleh calpastatin bebas kepada aktiviti enzimatik calpain.
Ringkasnya, penemuan ini mendedahkan peranan yang tidak diiktiraf sebelum inicalpastatindalam pengawalan podositautophagydan memberikan petunjuk untuk penyiasatan strategi terapeutik baru untuk meningkatkan kemandirian podosit semasa nefropati hipertensi.
PENDEDAHAN
Semua pengarang mengisytiharkan tiada kepentingan bersaing.
PENGHARGAAN
Kerja ini disokong oleh Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) dan Université de Paris. IB disokong oleh persekutuan siswazah daripada Ministère de l'EducationNationale, de la Recherche et de la Technologie. OL dibiayai melalui anugerah Yayasan Eropah untuk Kajian Diabetes (EFSD) yang disokong oleh Program EFSD/Novo Nordisk untuk Penyelidikan Diabetes di Eropah dan geran daripada Société Francophone duDiabète (SFD). BR dan CH dibiayai oleh Starting Grant 107037 daripada Majlis Penyelidikan Eropah dan Kesatuan Eropah (P-LT). YS disokong oleh persekutuan siswazah dari Fondation de France.
Kami mengucapkan terima kasih kepada Elizabeth Huc, Nicolas Perez, Corina Suldac, dan pasukan ERIU970 (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Perancis) atas bantuan dalam penjagaan dan pengendalian haiwan, Nicolas Sorhaindo untuk pengukuran biokimia (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat , Paris, Perancis), dan Alain Schmitt dan Jean-Marc Massefor mikroskop elektron penghantaran (Institut Cochin, Paris, Perancis). Kami berterima kasih kepada Morgane Le Gall (fasiliti proteomik Cochin 3P5, Paris, Perancis) atas bantuan dalam analisis siliko. Kami mengiktiraf sokongan pentadbiran daripada Véronique Oberweis, Bruno Pillard dan Cyrille Mahieux(Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Perancis).
BAHAN TAMBAHAN
Fail Tambahan (PDF)
Rajah S1. Kultur podosit primer mengekspresikan penanda podosit. Analisis blot Barat mengenai ekspresi penanda podosit NPHS1 dan NPHS2 dalam budaya podosit primer dari tikus WT dan CSTTg. Tubulin (TUBA) berfungsi sebagai kawalan pemuatan. Wakil n{3}} tikus setiap genotip.
Rajah S2. Tahap basal podosit yang tinggiautophagy. (A, B) Imej imunofluoresensi perwakilan bagi ekspresi GFP (hijau) dan NPHS1 (merah) dalam glomeruli daripada tikus GFP-LC3 yang dirawat atau tidak dengan CQ (80mg/kg) 4 jam sebelum dibunuh. Anak panah menunjukkan autofagosom GFPþ. (C, D) Imej imunofluoresensi perwakilan ekspresi GFP (hijau) dan P62 (merah) dalam glomeruli daripada tikus GFP-LC3 yang dirawat atau tidak dengan CQ (80mg/kg) 4 jam sebelum membunuh. Anak panah menunjukkan GFPþ P62þ autofagosom. (A–D) (0 ) mewakili pembesaran yang lebih tinggi. Nukleus telah diwarnai dengan Hoechst (biru). Bar{12}} mm. N{13}} tikus setiap keadaan (E–H) Imej imunofluoresensi perwakilan bagi ekspresi GFP (hijau) dan P62 (merah) dalam podosit primer daripada tikus GFP-LC3 yang dirawat (F, H) atau tidak (E, G ) dengan Bafifilomycin A1 (100 nM) selama 4 jam. N=5 tikus setiap keadaan.
Rajah S3. P62 terkumpul dalam podosit dalam model hipertensi DOC-garam. (A-C) Imej imunofluoresensi perwakilan ekspresi P62 (hijau) dan PODXL (merah) dalam glomeruli daripada tikus WT selepas 2 hingga 6 minggu model DOC-garam. (0 ) mewakili pembesaran yang lebih tinggi. Nukleus telah diwarnai dengan Hoechst (biru). Bar ¼ 50 mm. (D) Kuantifikasi kawasan P62 setiap kawasan podosit ( peratus ). N=5–6 tikus setiap keadaan. Analisis varians sehala: masa P=0.0059, ujian perbandingan berbilang Sidak: D42 lawan D14 **P=0.0055, D28 lawan D14 P=0.8590.
Rajah S4. Podositautophagyadalah perlu untuk pembangunan podosit. (A) Tekanan darah sistolik, (B) nisbah albumin-ke-kreatinin air kencing, dan (C) paras nitrogen urea darah dalam tikus Atg5lox/lox dan Nphs2.cre Atg5lox/lox. N=5–6 tikus setiap genotip. Nilai dibentangkan sebagai plot dan cara individu±SEM. Ujian Mann-Whitney: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) dan P=0.6623 (C). (D–E) Imej perwakilan bahagian glomeruli yang diwarnai trichrome Masson daripada tikus Atg5lox/lox dan Nphs2.cre Atg5lox/lox. (F–G) Imej imunofluoresensi perwakilan bagi ekspresi PODXL (hijau) dan WT1 (merah) dalam tikus Atg5lox/lox dan Nphs2.cre Atg5lox/lox. Nukleus telah diwarnai dengan Hoechst (biru). (D–G) Bar=50 mm. N ¼ 6 tikus setiap genotip. (H–I) Fotomikrograf perwakilan bahagian mikroskop elektron penghantaran glomeruli daripada tikus Atg5lox/lox dan Nphs2.cre Atg5lox/lox. Bar{19}} mm. N=3 tikus setiap genotip.
Rajah S5.Calpastatinekspresi berlebihan tidak mempengaruhibuah pinggangberfungsi pada garis dasar. (A) nitrogen urea darah dan (B) paras albumin plasma dalam 12-tikus GFP-LC3 dan CSTTg GFP-LC3 seminggu. N=5 GFP-LC3 dan N=6 CSTTg GFP-LC3. Nilai dibentangkan sebagai plot dan cara individu±SEM. Ujian Mann-Whitney: P=0.6623 (A) dan P=0.9307 (B). (C, D) Imej perwakilan bahagian glomeruli yang diwarnai trichrome Masson daripada tikus GFP-LC3 dan CSTTg GFP-LC3. (E-H) Imej imunofluoresensi perwakilan ekspresi PODXL (E, F) dan NPHS1 (G, H) dalam tikus GFP-LC3 dan CSTTg GFP-LC3. (C–H) Bar=50 mm. (I, J) Kuantifikasi berkaitan kawasan PODXL dan NPHS1 setiap bahagian glomerular. N=5 GFP-LC3 dan N=6 CSTTg GFP-LC3. Nilai dibentangkan sebagai plot dan cara individu±SEM. Ujian Mann-Whitney: P=0.1898 (A) dan P=0.8413 (B).
Fungsi cistanche-buah pinggang
Rajah S6.Calpastatinekspresi berlebihan tidak mempengaruhi keradangan buah pinggang global. Imunohistokimia perwakilan ekspresi F4/80 (A, B) dan CD3 (D-E) dalam tikus GFP-LC3 dan CSTTg GFP-LC3 selepas 6 minggu Angiotensin II þHSD. Bar=200 mm. (C, F) Kuantifikasi bersekutu bagi kawasan F4/80 dan CD3 setiapbuah pinggangbahagian. N=7 CSTTg GFP-LC3 dan N=8 GFP-LC3 tetikus. Nilai dibentangkan sebagai plot individu dan bermaksud SEM. Ujian Mann-Whitney: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).
Rajah S7. Podositautophagydeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.
Jadual S1. Dalam prevision silico tapak belahan calpain. Tapak belahan Calpain telah diramalkan dalam protein yang berkaitan dengan podocyte dan autophagy dengan GPS-CCD (//ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP:// calpain.org) dan DeepCalpain Predict (//deepcalpain. cancerbio. info/help.php). Fail Tambahan (Excel)
Jadual Tambahan S2. Fail penuh prevision in silico tapak belahan calpain. Tapak belahan Calpain telah diramalkan dalam podocyte-related danautophagy-protein berkaitan dengan GPS-CCD (http://ccd. biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org), dan DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php). Tapak belahan ramalan disambung semula untuk setiap protein untuk GPS-CCD dan DeepCalpain Predict.
RUJUKAN
1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA, et al. Kelaziman kronikbuah pinggangpenyakit di Amerika Syarikat. JAMA. 2007;298:2038–2047.
2. Collins AJ, Vassalotti JA, Wang C, et al. Siapa yang patut disasarkan untuk pemeriksaan CKD? Kesan diabetes, hipertensi, dan penyakit kardiovaskular. Am J Ginjal Dis. 2009;53:S71–S77.
3. Chang TI, Li S, Chen SC, et al. Faktor risiko untuk ESRD pada individu dengan anggaran GFR yang dipelihara dengan dan tanpa albuminuria: hasil daripada Program Penilaian Awal Buah Pinggang (KEEP). Am J Ginjal Dis. 2013;61:S4–S11.
4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J, et al. Tekanan darah tinggi dan risiko penyakit buah pinggang peringkat akhir dalam subjek tanpa penyakit buah pinggang asas. Arch Intern Med. 2005;165:923–928.
5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S, et al. Kecederaan podocyte mendasari glomerulopati tikus hipertensi garam Dahl dan diterbalikkan oleh penyekat aldosteron. Hipertensi. 2006;47:1084–1093.
6. Garovic VD, Wagner SJ, Turner ST, et al. Penyingkiran podosit urin sebagai penanda untuk preeklampsia. Am J Obstet Gynecol. 2007;196, 320.e321–e327.
7. Craici IM, Wagner SJ, Bailey KR, et al. Podocyturia mendahului proteinuria dan ciri klinikal praeklampsia: kajian prospektif membujur. Hipertensi. 2013;61:1289–1296.
8. Wang G, Lai FM, Kwan BC, et al. Kehilangan podocyte dalam nefrosklerosis hipertensi manusia. Am J Hipertensi. 2009;22:300–306.
9. Wang G, Kwan BC, Lai FM, et al. Ekspresi intrarenal miRNA pada pesakit dengan nefrosklerosis hipertensi. Am J Hipertensi. 2010;23:78–84.
10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G, et al. Nefropati proteinurik kronik: hasil dan tindak balas terhadap rawatan dalam kohort prospektif 352 pesakit dengan corak kecederaan buah pinggang yang berbeza. Am J Ginjal Dis. 2000;35:1155–1165.
11. Fukuda A, Wickman LT, Ahli Parlimen Venkatareddy, et al. Kehilangan podosit berterusan yang bergantung kepada Angiotensin II daripada glomeruli yang tidak stabil menyebabkan perkembangan peringkat akhirbuah pinggangpenyakit. Buah Pinggang Int. 2012;81:40–55.
12. Tuncdemir M, Ozturk M. Kesan penyekat reseptor angiotensin-II pada kerosakan podosit dan apoptosis glomerular dalam model tikus eksperimen nefropati diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin. Acta Histochem. 2011;113:826–832.
13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG, et al. Angiotensin II menyumbang kepada kecederaan podosit dengan meningkatkan ekspresi TRPC6 melalui laluan isyarat maklum balas positif pengantara NFAT. Am J Pathol. 2011;179:1719–1732.
14. Kumpulan Kajian EUCLID. Percubaan terkawal plasebo rawak lisinopril dalam pesakit normotensif dengan diabetes yang bergantung kepada insulin dan normoalbuminuria atau mikroalbuminuria. Lancet. 1997;349:1787–1792.
15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH, et al. Proteinuria, sasaran untuk renoprotection pada pesakit dengan nefropati diabetes jenis 2: pelajaran dari RENTAL. Buah Pinggang Int. 2004;65:2309–2320.
16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. Perubahan dalam selektiviti perm glomerular yang disebabkan oleh angiotensin II membayangkan disfungsi podosit dan penyusunan semula protein diafragma celah. Semin Nephrol. 2004;24:131–140.
17. Wang L, Flannery PJ, Spurney RF. Pencirian subtipe reseptor angiotensin II dalam podosit. J Lab Clin Med. 2003;142:313–321.
18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ, et al. Proteinuria dan ekspresi protein diafragma celah podocyte, nephrin, dalam nefropati diabetik: kesan perencatan enzim penukar angiotensin. Diabetologia. 2002;45:1572–1576.
19. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S, et al. Kesan perencat enzim penukar angiotensin, antagonis reseptor angiotensin II dan antagonis kalsium pada podosit kencing pada pesakit dengan nefropati IgA. Am J Nephrol. 2000;20:373–379.
20. Henger A, Huber T, Fischer KG, et al. Angiotensin II meningkatkan aktiviti kalsium sitosol dalam podosit tikus dalam kultur. Buah Pinggang Int. 1997;52: 687–693.
21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C, et al. Kesan berfaedah jangka panjang perencatan enzim penukar angiotensin pada pesakit dengan proteinuria nefrotik. Am J Ginjal Dis. 1992;20:240–248.
22. Nitschke R, Henger A, Ricken S, et al. Angiotensin II meningkatkan aktiviti kalsium intraselular dalam podosit glomerulus yang utuh.buah pinggangInt. 2000;57:41–49.
23. Gloy J, Henger A, Fischer KG, et al. Angiotensin II memodulasi fungsi selular podosit. Bekalan Int Buah Pinggang 1998;67:S168–S170.
24. Miceli I, Burt D, Taraba E, et al. Regangan mengurangkan ekspresi nefrin melalui mekanisme yang bergantung kepada angiotensin II-AT(1) dalam podosit manusia: kesan rosiglitazone. Am J Physiol Fisiol Renal. 2010;298:F381–F390.
25. Endlich N, Endlich K. Regangan, ketegangan dan lekatan—mekanisme penyesuaian sitoskeleton aktin dalam podosit. Biol Sel Eur J. 2006;85:229–234.
26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K, et al. Pengaktifan sistem angiotensin tisu tempatan dalam podosit oleh ketegangan mekanikal. Buah Pinggang Int. 2004;65:30–39.
27. Riser BL, Cortes P, Heilig C, et al. Daya regangan kitaran secara selektif mengawal selia mengubah isoform faktor pertumbuhan-beta dalam sel mesangial tikus yang dikultur. Am J Pathol. 1996;148:1915–1923.
28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. Kerosakan podocyte adalah langkah kritikal dalam perkembangan glomerulosklerosis dalam tikus hipertensi uni nephrectomized-desoxycorticosterone. Arkib Virchows. 1994;425:181–193.
29. Jung HS, Chung KW, Won Kim J, et al. Kehilangan autophagy mengurangkan jisim sel beta pankreas dan berfungsi dengan hiperglikemia yang terhasil. Metab Sel. 2008;8:318–324.
30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M, et al.Autophagyadalah penting dalam homeostasis pulau kecil dan peningkatan pampasan jisim sel beta sebagai tindak balas kepada diet tinggi lemak. Metab Sel. 2008;8:325–332.
31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C, et al. Sel endothelial dan podocyte autophagy secara sinergistik melindungi daripada glomerulosklerosis yang disebabkan oleh diabetes. Autophagy. 2015;11:1130–1145.
32. Hartleben B, Godel M, Meyer-Schwesinger C, et al. Autophagy mempengaruhi kerentanan penyakit glomerular dan mengekalkan homeostasis podosit dalam tikus yang semakin tua. J Clin Invest. 2010;120:1084–1096.
33. Sato S, Kitamura H, Adachi A, et al. Dua jenis autophagy dalam podosit dalam spesimen biopsi buah pinggang: kajian ultrastruktur. J Submicrosc Cytol Pathol. 2006;38:167–174.
34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I, et al. MAP-LC3, penanda autophagosomal yang menjanjikan, diproses semasa pembezaan dan pemulihan podosit daripada nefrosis PAN. FASEB J. 2003;17:1165–1167.
35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al.Autophagypenyakit fiights melalui pencernaan diri selular. alam semula jadi. 2008;451:1069–1075.
36. Yang L, Li P, Fu S, et al. Autophagy hepatik yang rosak dalam obesiti menggalakkan tekanan ER dan menyebabkan rintangan insulin. Metab Sel. 2010;11:467–478.
37. Xie Z, Klionsky DJ. Pembentukan autofagosom: jentera teras dan penyesuaian. Nat Cell Biol. 2007;9:1102–1109.
38. Kume S, Thomas MC, Koya D. Penderiaan nutrien, autophagy, dan nefropati diabetik. kencing manis. 2012;61:23–29.
39. Kume S, Uzu T, Maegawa H, et al. Autophagy: sasaran terapeutik novel untukbuah pinggangpenyakit. Clin Exp Nephrol. 2012;16:827–832.
40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B, et al. Peranan yang munculautophagydalam fungsi buah pinggang, penyakit dan penuaan. Autophagy. 2012;8:1009–1031.
41. Weide T, Huber TB. Implikasi autophagy untuk penuaan dan penyakit glomerular. Res Tisu Sel. 2011;343:467–473.
42. Bork T, Liang W, Yamahara K, et al. Podosit mengekalkan tahap asas autophagy yang tinggi bebas daripada isyarat mtor. Autophagy. 2020;16:1932– 1948.
43. Peltier J, Bellocq A, Perez J, et al. Pengaktifan dan rembesan Calpain menggalakkan kecederaan glomerular dalam glomerulonephritis eksperimen: bukti daripadacalpastatin-tikus transgenik. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–3423.
44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A, et al. Ekspresi spesifik podocyte Cre recombinase dalam tikus transgenik. Kejadian. 2003;35:39–42.
45. Hara T, Nakamura K, Matsui M, et al. Penindasan autophagy basal dalam sel saraf menyebabkan penyakit neurodegeneratif pada tikus. alam semula jadi. 2006;441: 885–889.
46. Lazareth H, Henique C, Lenoir O, et al. Tetraspanin CD9 mengawal penghijrahan dan percambahan sel epitelium parietal dan perkembangan penyakit glomerular. Nat Commun. 2019;10:3303.
47. Bollee G, Flamant M, Schordan S, et al. Reseptor faktor pertumbuhan epidermis menggalakkan kecederaan glomerular dan kegagalan buah pinggang dalam glomerulonefritis bulan sabit yang progresif dengan cepat. Nat Med. 2011;17:1242–1250.
48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A, et al. Tindakan langsung endothelin-1 pada podosit menggalakkan glomerulosklerosis diabetik. J Am Soc Nephrol. 2014;25:1050–1062.
49. Henique C, Bollee G, Lenoir O, et al. Faktor nuklear erythroid 2-faktor berkaitan 2 memacu ekspresi spesifik podosit bagi reseptor diaktifkan proliferator peroksisom g penting untuk penentangan terhadap GN sabit. J Am Soc Nephrol. 2016;27:172–188.
50. Perez J, Dansou B, Herve R, et al. Calpain yang dikeluarkan oleh limfosit T membelah TLR2 untuk mengawal ekspresi IL-17. J Immunol. 2016;196:168–181.
51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S, et al. Calpain/calpastatinsistem mempunyai peranan yang bertentangan dalam pertumbuhan dan penyebaran metastatik melanoma. PLoS One. 2013;8:e60469.
52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D, et al. Calpains menyumbang kepada pembaikan vaskular dalam bentuk glomerulonefritis yang progresif dengan cepat: peranan potensi eksternalisasi mereka. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012;32:335–342.
53. Weber JJ, Pereira Sena P, Penyanyi E, et al. Membunuh dua burung marah dengan satu batu:autophagypengaktifan dengan menghalang calpains dalam penyakit neurodegenerative dan seterusnya. Biomed Res Int. 2019;2019:4741252.
54. Liu Z, Cao J, Gao X, et al. GPS-CCD: program pengiraan novel untuk ramalan tapak belahan calpain. PLoS One. 2011;6:e19001.
55. duVerle D, Takigawa I, Ono Y, et al. CaMPDB: sumber untuk calpain dan proteolisis modulasi. Maklumat Genom. 2010;22:202–213.
56. Liu ZX, Yu K, Dong J, et al. Ramalan tepat tapak belahan calpain dan penyimpangannya yang disebabkan oleh mutasi dalam kanser. Genet Depan. 2019;10: 715.
57. Yousefifi S, Perozzo R, Schmid I, et al. Pembelahan Atg5 yang dimediasi Calpain menukar autophagy kepada apoptosis. Nat Cell Biol. 2006;8:1124–1132.
58. Xia HG, Zhang L, Chen G, et al. Kawalan autophagy basal oleh belahan pengantara calpain1 ATG5.Autophagy. 2010;6:61–66.
59. Russo R, Berliocchi L, Adornetto A, et al. Pembelahan Beclin-1 dan penyahkawalseliaan autophagy yang dimediasi Calpain berikutan kecederaan iskemia retina dalam vivo. Kematian Sel Dis. 2011;2:e144.
60. Yadav A, Vallabu S, Arora S, et al. ANG II mempromosikanautophagydalam podosit. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;299:C488–C496.
61. Flannery PJ, Spurney RF. Transaktivasi reseptor faktor pertumbuhan epidermis oleh angiotensin II dalam podosit glomerular. Nephron Exp Nephrol. 2006;103:e109–e118.
62. Harrison-Bernard LM, Navar LG, Ho MM, et al. Penyetempatan imunohistokimia reseptor ANG II AT1 pada tikus dewasabuah pinggangmenggunakan antibodi monoklonal. Am J Physiol. 1997;273:F170–F177.
63. Liebau MC, Lang D, Bohm J, et al. Ekspresi fungsional sistem renin angiotensin dalam podosit manusia. Am J Physiol Fisiol Renal. 2006;290:F710–F719.
64. Anugerah Pavenstadt H. Franz Volhard 2000: isyarat angiotensin II dalam podocyte. Res Tekanan Darah Buah Pinggang 2000;23:156–158.
65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. Sistem aldosteron renin-angiotensin dalam podosit. Semin Nephrol. 2012;32:377–384.
66. Jia J, Ding G, Zhu J, et al. Infusi Angiotensin II mendorong perubahan ekspresi nefrin dan apoptosis podosit. Am J Nephrol. 2008;28:500–507.
67. Crowley SD, Ahli Parlimen Vasievich, Ruiz P, et al. Reseptor angiotensin jenis 1 glomerular menambah kecederaan buah pinggang dan keradangan dalam nefritis autoimun murine. J Clin Invest. 2009;119:943–953.
68. Lagu K, Stuart D, Abraham N, et al. Pengumpulan renin saluran tidak mengantara tekanan darah tinggi garam DOCA atau kecederaan buah pinggang. PLoS One. 2016;11: e0159872.
69. Liu Z, Ji J, Zheng D, et al. Peranan pelindung kalah mati calpain endothelial dalam akut yang disebabkan oleh lipopolysaccharidebuah pinggangkecederaan melalui pengecilan laluan p38-iNOS dan pengeluaran NO/ROS. Exp Mol Med. 2020;52:702–712.
70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. Aktiviti Calpain-10 mendasari pengeluaran aldosteron yang disebabkan oleh angiotensin II dalam model sel rulosa glom adrenal. Endokrinologi. 2015;156:2138–2149.
71. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Calpain protease yang bergantung kepada kalsium-1 memautkan aktiviti TRPC6 kepada kecederaan podosit. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–2109.
72. LK Petani, Rollason R, Whitcomb DJ, et al. TRPC6 mengikat dan mengaktifkan calpain, bebas daripada aktiviti salurannya, dan mengawal sitoskeleton podosit, lekatan sel, dan motilitas. J Am Soc Nephrol. 2019;30: 1910–1924.
73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A, et al. Menyasarkan sistem calpain/calpastatin sebagai strategi baharu untuk mencegah pembentukan semula kardiovaskular dalam hipertensi yang disebabkan oleh angiotensin II. Circ Res. 2008;102:720–728.
74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C, et al.Calpastatinmengawal sepsis polimikrob dengan mengehadkan pembebasan mikrozarah prokoagulan. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185:744–755.
75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M, et al. Peranan kritikal keseimbangan calpain/calpastatin dalam penolakan allograf akut. Eur J Immunol. 2011;41: 473–484.
76. Hanouna G, Mesnard L, Vandermeersch S, et al. Perencatan calpain khusus melindungibuah pinggangterhadap keradangan. Sci Rep. 2017;7:8016.
77. Ong SB, Lee WH, Shao NY, et al. Perencatan Calpain dipulihkanautophagydan menghalang pemecahan mitokondria dalam model iPSC manusia liopati endo diabetes. Rep. Sel Stem 2019;12:597–610.
78. Norman JM, Cohen GM, Bampton ET. Pembelahan in vitro protein tinggi oleh protease kematian sel. Autophagy. 2010;6:1042–1056.
79. De Tullio R, Averna M, Pedrazzi M, et al. Peraturan pembezaan kompleks calpain-calpastatin oleh domain L bagicalpastatin. Biochim Biophys Acta. 2014;1843:2583–2591.
